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PRCTICA 4: TINCIN DE WRIGHT

Introduccin:

Las tinciones hematolgicas pueden clasificarse segn distintos criterios: a)


atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas a colorear: vitales y no vitales y b)
considerando el momento en el que empezaron a ser utilizadas para el
diagnstico hematolgico: tradicionales y especiales.

Tinciones vitales y no vitales


Vitales y supravitales: se practican sobre clulas que estn vivas.

Vitales: se efectan sobre clulas vivas, mediante la introduccin de un colorante


en la circulacin de un organismo vivo. El azul de metileno es un ejemplo de este
tipo

Supravitales: se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero aislados del


organismo del que proceden.
No vitales: se ejecutan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas
requiere un proceso previo de fijacin; tiene por objeto el mantener inalterada su
estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin
puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o
metanol.

Tinciones tradicionales y especiales


Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que
con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clsicas). Estos
colorantes se renen en 4 grupos:

a) cidos: tienen especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas,
como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.

b) Bsicos: poseen especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas,
como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.

c) Neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo


de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de
metileno.

d) Indiferentes: no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son


insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias con un poder de
disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin
colorante. Uno de ellos es el Sudn III empleado para teir las grasas.

Tambin existen combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones


polcromas. Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente
sustancias colorantes neutras y pancrmica cuando se aplican todas las
sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una
de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematolgicos
utilizados en la actualidad suelen derivar del que l prepar.

Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y de


colorantes bsicos (tiacinas): stas ltimas son el azul de metileno y sus
derivados obtenidos por desmetilacin oxidativa (colorantes - tipo azur). Las
tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, ms frecuentemente
empleadas en el diagnstico hematolgico, son la de Wright y la de Giemsa
(utilizada sola o en combinacin con la de May-Grnwald).

Existen tinciones panpticas rpidas para producir una coloracin fcil y rpida de
las estructuras celulares. Las tinciones especiales slo se usan en circunstancias
especficas. Son de dos clases:

Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos). stos se fijan a las


clulas y cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin

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visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase
de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.

Tinciones citoqumicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la


ausencia de determinadas sustancias, localizadas en el interior de los grnulos
citoplasmticos de los leucocitos. Sirven para reconocer clulas leucocitarias
(normales o anmalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de
otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua
oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente
permite atribuir el origen de unas clulas leucocitarias inmaduras a la lnea
granuloctica o a la monoctica.

Tincin de Wright

Es una tincin de tipo Romanowsky, la cual consiste en azul de metileno y sus


productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B. La accin combinada de
estos colorantes produce el efecto Romanowsky es decir, da una coloracin
prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y da color
rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina
Y.

Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los


colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina
Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos celulares
y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico. La eosina Y,
colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de
hemoglobina y a las protenas bsicas.

La tincin de Wright es usada en histologa para facilitar la diferenciacin de los


tipos de clulas de la sangre, y as teir frotis de sangre, punciones medulares, y
as examinarse al microscopio. En citogentica tambin con la finalidad de teir

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cromosomas, facilitar el diagnstico de sndromes y enfermedades. Lleva el
nombre de James Homer Wright, su descubridor, obtenida modificando la tincin
de Romanowsky, en 1902.

Dicha tincin, ayuda a distinguir fcilmente las clulas de la sangre convirtindose


as en una tcnica muy usada para el conteo de los glbulos blancos y rutinaria
usada cuando hay sospecha de infecciones.

Materiales: Material de apoyo:


1 Lpiz con lanceta.
2 Portaobjetos. Cuaderno y pluma.
1 Torundero con alcohol. Guantes desechables.
1 Papel seda para lentes. Gafas de seguridad.
1 Charola de tincin.
1 Piseta con agua destilada.
Equipo: Reactivos:
1 Microscopio ptico. 1 Colorante de Wright.
1 Buffer de Wright pH 6.4.
Aceite de inmersin.
Sangre capilar.

Desarrollo / Procedimiento:

Mtodo de Tincin de Wright


1. Realizar un frotis de sangre.
a) Preparar el material a utilizar y colocarse los guantes.
b) Proceder a desinfectar el dedo del cual extraeremos el frotis sanguneo (por
lo general ndice o el anular).
c) Pinchar con lanceta en el pulpejo del dedo, sobre la zona anterior o lateral.
Una vez hecho, apretar el dedo para bombear sangre haca afuera. Una
vez se haya formado una gota la acercar al portaobjetos poco a poco para
pasar a ste.
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d) Limpiar el dedo y colocar una tirita, desechar las lancetas y torundas
utilizadas al contenedor de R.P.B.I. Realizar la extensin del frotis
sanguneo.

Figura 1. Extensin de frotis sanguneo.


e) Tras realizar la extensin, se obtienen tres partes de la muestra:
Cabeza (con demasiados eritrocitos).
Cuerpo (zona ptima para la observacin, existe un reparto equilibrado de
clulas).
Cola (eritrocitos en escaso nmero).

Figura 2. Partes del frotis sanguneo.

El objetivo de realizar una extensin de sangre perifrica o frotis sanguneo es


obtener una delgada capa de sangre sobre un portaobjetos, que luego se tie con
una coloracin especifica con el fin de poder evaluar la proporcin de cada
leucocito (formula leucocitaria relativa) y la morfologa de las clulas sanguneas
(leucocitos eritrocitos y plaquetas).

Los frotis sanguneos deben realizarse inmediatamente cuando se utiliza sangre


fresca, o dentro de las 2-3 horas de la extraccin si se aade anticoagulante
(preferiblemente EDTA, pues no produce deformacin de las clulas).
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2. Tras dejar secar el frotis, fijarlo con metanol, dejarlo reposar aproximadamente
por tres minutos o hasta que est seco.
3. Colocar el frotis de forma horizontal en la rejilla de tincin.
4. Cubrir el frotis completamente con el colorante de Wright y esperar de 3 - 4
minutos.
5. Agregar igual volumen de buffer de Wright pH 6.4 distribuido en todo el frotis.
6. Enjuagar con agua destilada en forma horizontal mximo 30 segundos.
7. Dejar secar.
8. Aadir 1 gota pequea de aceite de inmersin.
9. Observar con objetivo de inmersin 100x.

Examen Microscpico
1. Revisar que el frotis teido se encuentre seco para su examen al microscopio.
2. El observador debe ajustar el banco y la mesa de tal forma que se encuentren
a una altura permitiendo el uso del microscopio en posicin vertical y de manera
confortable.
3. Limpiar las lentes de los oculares y objetivos con el papel seda especial.
4. Ajustar los objetivos a la distancia interpupilar para observar con comodidad
utilizando ambos ojos.
5. Bajar la platina hasta el punto mximo de descenso.
6. Colocar el frotis sobre la platina y sujetarlo con la pinza.
7. Encender la fuente de iluminacin.
8. Acoplar el objetivo 4x con ayuda del revlver y enfocar la imagen a travs de
los oculares usando los tornillos macro y micromtrico.
9. Por tratarse de un objetivo de mnimo aumento requiere de poca luz, por lo
tanto el lente y condensador deben colocarse hasta el tope inferior y el diafragma
cerrarse.
10. Rotar el revlver para colocar el objetivo de 40x (seco fuerte), sin mover la
platina y enfocar la imagen usando los tornillos macro y micromtrico. En este
caso subir el condensador a la mitad y abrir el diafragma a la mitad.
11. Recorrer la laminilla para observar algn campo interesante y elegir un rea

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para observar con mayor aumento.
12. Evitando mover la platina, con cuidado rotar el revlver hasta que el haz de
luz quede entre el objetivo 40x y 100x y aadir al frotis 1-2 gotas de aceite de
inmersin.
13. Colocar con ayuda del revlver el objetivo de inmersin (100x) sin importar
que el mismo se sumerja en el aceite.
14. Subir el condensador a su tope superior y abrir totalmente el diafragma pues
se requiere de la mxima luz posible.
15. Se recomienda evitar tocar el tornillo macromtrico, debido a que sube y baja
la platina grandes distancias y en ese momento la laminilla ya est pegada al
objetivo. Existe el riesgo de romper la laminilla si se sube demasiado. Usar
exclusivamente el tornillo micromtrico.
Resultados:

Conclusiones:

Referencias:

Ayala, Snchez, Ma. Ins Araceli. (2013). Manual de Prcticas de Laboratorio


Microbiologa Mdica.
Universidad Xochicalco Campus Ensenada. Mxico.

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Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga FL. (2009). Tcnicas en histologa y biologa
celular.
2nd ed. Madrid Spain: Elsevier.
Forbes BA, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scott. (2009). Diagnstico
microbiolgico.
12a ed. Editorial Mdica. Panamericana S.A.
H.K. Hamilton, M.B. Rose. (2005). Diagnstico Clnico.
5 Edicin, Editorial Interamericana.
Jawetz, Melnick, Adelberg. (2010). Microbiologa Mdica.
25 Edicin. Editorial Manual Moderno.
Koneman, Allen, Dowell, Sommers. (2006). Diagnostico Microbiolgico.
Sexta Edicin. Texto Atlas Color, Editorial Panamericana.
Manual de Prcticas de Laboratorio Microbiologa General. (2012). Divisin de
Ciencias Biolgicas y de la Salud. Universidad Autnoma Metropolitana.
Unidad Iztapalapa. Mxico.
Murray, Patrick R. (2013). Microbiologa Mdica.
Elsevier Espaa. Espaa.