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UNIVERSIDADNACIONALAUTNOMADEMXICO

INSTITUTODEBIOTECNOLOGA

MtodosfisicoqumicosenBiotecnologa

Trabajodeinvestigacin

CROMATOGRAFADEFASEREVERSA

Presentan

M.enC.EdgarErnestoEsquivelSoto

Q.F.B.LidiaIreneLealGuadarrama
Cromatografadefasereversa

JUNIO2004
CUERNAVACA,MORELOS

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Cromatografadefasereversa

CONTENIDO

INTRODUCCIN

TEORADELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Lafaseestacionaria
Retencindemodomixto
Lafasemvil
Elucinporgradiente
Parmetroscromatogrficos
Factordecapacidad
Eficiencia
Selectividad
Resolucin
Cromatografaporsupresininica
Cromatografasecuencial
Arreglopositivonegativo
Arreglonegativopositivo
Arreglonegativonegativo
Arreglopositivopositivo

APLICACIONESDELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Purificacindebiomolculas
Purificacindeprotenasypptidosnaturales
Purificacindepptidosyprotenasrecombinantes
Purificacindepptidosobtenidospordigestionesenzimticas
Purificacindepptidossintticos

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Cromatografadefasereversa

Purificacindeoligonucletidossintetizadosqumicamente
Purificacinagranescala
Desalado
Anlisiscuantitativo
Normalizacinderea
Calibracinconestndarexterno
Calibracinconestndarinterno
Adicindeestndar

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Cromatografadefasereversa

ALGUNOSASPECTOSPARAELDESARROLLODEUNANLISISDE
CROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Naturalezaqumicadelafaseestacionaria
Tamaoyformadepartcula
Tamaodelacolumna
VelocidaddeFlujo
Temperatura
Solventes
Desnaturalizacin
Gradientedeelucin
Acondicionamientodecolumna
Preparacindelasmuestras
Limpiezadelacolumna
Almacenamientodecolumna
Resolucindeproblemas

EQUIPODEHPLC
Sistemasparaeltratamientodelosdisolventes
Sistemasdebombeo
Sistemasdeinyeccindelamuestra
Columnas
Tiposderellenodelacolumna
Termostatos
Detectores
Detectoresdeabsorbancia
Detectoresdearreglosdediodos
Detectoresdeinfrarrojo
Detectoresdendicederefraccin
Detectordedispersindeluz(ELSD)
Detectoresdeespectrometrademasas

PROVEEDORES

COMENTARIOS

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Cromatografadefasereversa

BIBLIOGRAFA

INTRODUCCIN

Losavancesenelcampodelabiotecnologahanrequeridoelusodetcnicasmseficaces
para la separacin y purificacin de biomolculas. La cromatografa de lquidos ha
resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separacin de mezclas
complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de protenas y cidos
nucleicos.

En los inicios de la cromatografa de lquidos se utilizaban columnas de vidrio con


dimetrosde1a5cmylongitudesde50a500cm.Enestetipodecolumnasrealizsus
trabajos el botnico ruso Mikhail Tswett. l emple esta tcnica para separar varios
pigmentosvegetales,queaparecancomobandascoloreadasenlacolumna.Elrellenode
las columnas consista en partculas de 150 a 200 micras de dimetro. Ms tarde se
encontrquesepodaaumentarlaeficienciadisminuyendoeltamaodelaspartculasde
losrellenos.Afinalesdelosaossesentaselogrdesarrollarlatecnologaadecuadapara
producir y utilizar partculas del orden de las 3 a 10 micras. A esta nueva forma de
cromatografaselellamcromatografadelquidosdealtaresolucin,HPLCporsussiglas
eningls(HighPerformanceLiquidChromatography).

ElsistemacromatogrficodefasereversafueintroducidoporHowardyMarlinen1950.
Hasta ese momento,lacromatografa delquidos seutilizababsicamenteparaseparar
compuestospolares,siendolafaseestacionariadeuncarcteraltamentepolarylafase
mvilpocopolar.Estoscientficosrevirtieronlapolaridaddelasfasesconelobjetivode
separarcidosgrasos.Asfuecomosurgilacromatografadefasereversa;aquellaenla
que la fase estacionaria es no polar y la fase mvil es polar. Entonces, a la primera
modalidaddecromatografaseleempezaconocercomocromatografadefasenormal.

La tcnica de fase reversa, RPC (del ingles Reverse Phase Chromatography), se ha


convertidoeneltipodecromatografamsampliamenteutilizadaenHPLCeincluyecerca
delamitaddelosmtodosdecromatografadelquidosdescritosenlaliteratura.Esta
tcnicaproporcionaretencinyselectividadptimascuandolasmuestrastienenuncarcter
predominantementealifticooaromtico.

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Cromatografadefasereversa

Enelpresentetrabajosepretendedarallectorunpanoramadelateorayaplicacionesdela
cromatografaenfasereversa,ascomoalgunasconsideracionesimportantesduranteel
desarrollodeestatcnicacromatogrfica.Ydadoquelacromatografadefasereversase
aplicaenequiposdealtaresolucin(HPLC),tambinseincluyeunaseccinenlaquese
describebrevementesufuncionamiento.

TEORADELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA

Todaslasformasdecromatografadelquidossonprocesosdemigracindiferencial,donde
loscomponentesdelamuestrasonselectivamenteretenidosporunafaseestacionariay
eludos secuencialmente mediante el cambio de polaridad de la fase mvil. En la
cromatografadefasereversa(RPC)seutilizaun empaque hidrofbico,usualmenteun
grupofuncionaloctadecilouoctiloyunafasemvilpolar.

Lafaseestacionaria

Lafaseestacionariaparacromatografadefasereversaconsisteenunamatrizporosae
insolublealaqueselehanunidoqumicamentecompuestoshidrofbicos.Lossoportes
para casi todos los rellenos se preparan con slica rgida, formada por partculas
mecnicamenteresistentes,porosasyuniformes,condimetrosde3,5o10micras.

Lasuperficiedelaslicaestconstituidaporgrupossilanol(SiOH)qumicamentereactivos
queabarcanunasuperficiecercanaalos8mol/m2.(Figura1)

Si OH

Si
O
Si CH3
Si O Si (CH2)17 CH3
CH3

CH3

Si O Si CH2 CH3

CH3

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Cromatografadefasereversa

Figura1.Grupossilanollibresygrupossilanolderivatizados.

Laslicapresentalasventajasderesistirlaaplicacindealtaspresionessincontraerse,yde
noexpandirsealcontactoconlossolventes.Perotieneladesventajadeserqumicamente
inestable;aunpHmenorde3losligandosunidosalaslicapuedenserremovidosyaun
pHmayorde7.5,laslicasesolubiliza.

Adiferenciadelaslica,lasmatricesdepoliestirenosonmuyestablesinclusoenpHsque
vandesde1hasta12,locualpermitelavaryregenerarlacolumnaconhidrxidodesodio
que es el agente ms efectivo para la remocin de protenas fuertemente unidas a la
superficiedelafaseestacionaria.Adems,elpoliestirenotieneuncarcterhidrofbicoper
se(Figura2)porloqueyanorequiereserderivatizado,evitndoseaselinconvenientede
procesos ineficientes de unin de ligandos. Sin embargo, presenta la desventaja de
expandirsealcontactoconlossolventesorgnicostpicamenteempleadosenRPC.

CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH

CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2
CH

CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH

CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH

CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH

Figura2.Estructuraqumicadelasmatricesdepoliestireno.

Elacoplamientodelosligandosalaslicageneralmenteseefectausandoreactivosdetipo
clorotrialquilsilanos.(Figura3)Enestareaccin,notodoslosgrupossilanolreaccionanya
quelascadenasalquilogeneranunimpedimentoestricoqueprevieneladerivatizacin
completadetodoslosgruposdisponibles.Elrecubrimientodelasuperficieporsililacinse

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Cromatografadefasereversa

limitaa4moles/m2.Losgrupossilanolresidualesimpartenunapolaridadindeseableala
superficie,ysonresponsablesdelefectoderetencindemodomixto.Parareducireste
efecto,losgrupossilanolresidualessehacenreaccionarconcompuestoscloroalquilsilanos
mspequeoscomoelclorotrimetilyclorotrietilsilano.Aesteprocesoseleconocecomo
endcappingobloqueo.

CH3 CH3

Si OH+Cl Si (CH2)17 CH3 SiO Si (CH2)17 CH3+HCl

CH3 CH3

Figura3.Alquilacindegrupossilanol.

Porlogeneral,elgrupoalquilodelsiloxanoenestosrecubrimientosesunacadenaC8(n
octilo)ounacadenaC18(noctadecilo).(Figura4)

CH3

A) O Si CH2 CH3

CH3

CH3

B) O Si CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH3

CH3

C) O Si CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH3

CH3

Figura4.Ejemplosdegrupossiloxanos.A)Grupoalquilode2carbonos
B)Grupoalquilode8carbonosC)Grupoalquilode18carbonos.

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Cromatografadefasereversa

Puede considerarse que la RPC es un proceso de particin en donde los solutos estn
distribuidosentreunafaseestacionarianopolaryunafasemvilpolar.Lossolutosno
polarestiendenaadsorberseenlafaseestacionariaysemuevenatravsdelsistemams
lentamentequelossolutospolares.

Elmecanismoquesehapropuestoparaexplicarelmecanismoporelcualestassuperficies
retienenalossolutoseselsiguiente.Cuandounsolutosedisuelveenagua,lasfuerzasde
atraccinentrelasmolculasdeaguasedistorsionanoserompen.nicamentelossolutos
altamentepolaresoinicospuedeninteraccionarconlaestructuradelagua.Lossolutosno
polarescasinointeractanconestasestructurasycomoconsecuenciaabandonanlafase
mvil para adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de la
retencinnoeslainteraccinfavorabledelsolutoconlafaseestacionaria,sinoelefectode
repulsindeldisolventeporelsoluto.

Lafasemvil

Laretencinhidrofbicadelsolutoenlafaseestacionariapuededisminuirseaadiendoun
disolventeorgnicoalafasemvilacuosa.Aldecrementarlapolaridaddelafasemvil,la
distribucindelossolutossecambiahacialafasemvil.

Lacantidaddemuestraqueseunealafaseestacionariadependedelaconcentracindel
ligandoinmovilizado,delaspropiedadesqumicasyfsicasdelamolculaquevaaser
adsorbidaydelapolaridaddelafasemvilyestacionaria.As,conformemenospolarsea
lafasemvil,menorserlaadsorcindelamuestraalafaseestacionaria.

Respectoa lascaractersticasqumicasdelligando,esdifcilpredecirqutipodecadena
hidrocarbonadasermejorparadeterminadaaplicacin.

Enprincipio,entremenospolarsealamolculaquesevaapurificar,serequerirunafase
estacionariamshidrofbica.Sinembargo,silamuestraresultasermuyafnalamatriz,la
elucinsedificultara.Asquedebehacerseunanlisiscuidadosodelamolculadeinters
ydeterminarlanaturalezaqumicadeloscontaminantesasociados.

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Cromatografadefasereversa

Laporosidaddelaspartculasdelafaseestacionariatambinesunfactorimportanteque
influyeenlacapacidaddeunin.Losporosgrandesfacilitanlainteraccindelsolutoconel
ligando.Cuandoserequieraunacapacidaddeuninmxima,deberescogerseunamatriz
que contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las molculas de
inters.

Retencindemodomixto

El modo mixto de retencin resulta de la interaccin de los grupos silanol cargados


negativamente expuestos en la superficie de la matriz con los grupos cargados
positivamente de las molculas de la muestra. Genera ensanchamiento de picos e
incrementodelostiemposderetencin.

Losgrupossilanolexpuestosenlasuperficiedelamatrizpuedenprovenirdeunend
cappingineficienteodeldeteriorodelascolumnas.Lasuperficiedelamatrizseerosiona
porelusodelacolumna,loqueresultaenlaexposicindelosgrupossilanol.Eluso
prolongadodesolucionesacuosastambinpuedeacelerarelenvejecimientodelacolumna.
El uso de fases mviles de bajo pH, suprime la ionizacin de los grupos silanol, sin
embargo,nohayqueolvidarqueunpHmenorde3puedehidrolisarlosligandosdela
matriz.

Elmecanismodeseparacinencromatografadefasereversasebasaenladistribucindel
solutoentrelafasemvilylaestacionaria.Laelucinoelarrastredelsolutomediantela
fasemvil,seiniciaconuneluyentedeelevadapolaridadcomoeselcasodeunasolucin
acuosa;aestafasemvilinicialseledenominafaseA.Hayquetomarencuentaquela
polaridaddelafasemvilAdebesersuficientementebajacomoparadisolveralsolutode
carcterhidrofbicoysuficientementealtacomoparapermitirqueelsolutoseunaala
matrizhidrofbica.

Para lograr la desorcin secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye la


polaridaddelafasemvil.Estosehacemediantelaadicingradualdesolventesorgnicos
alafasemvilAcomosonelmetanoloelacetonitrilo.Lafasemvilfinal,denominada
faseB,eslaquepresentamenorpolaridadytieneelmayorpoderdeelucin.Lafuerzadel
solventeestdefinidacuantitativamenteporelparmetro .(Tabla1)Generalmenteel
pHdelafasemvilinicialyfinalpermanececonstante.

Elacetonitriloyelmetanolsonlossolventesmscomunespuestoqueambostienenbaja
viscosidad yno absorbenluz UV. El isopropanol es undisolvente conalto poder de

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Cromatografadefasereversa

elucin,sinembargo,noesdelosmsempleadosdebidoasuincrementadaviscosidadque
resultaenbajatransferenciademasadelsolutoentrelasfasesyelevacindepresinanen
bajosflujos.

Paradescribircuantitativamentelapolaridaddelosdisolventes,Synderdesarrollelndice
depolaridadP.(Tabla1)Enestaescala,losvaloresdepolaridadvarande10.2paraun
compuestomuypolarcomoelaguahasta2paralosmuypocopolares.Cualquierndice
depolaridadquesedeseeentreesoslmitessepuedeconseguirmezclandodosdisolventes
adecuados.Deestemodo,lapolaridadPABdeunamezcladedisolventesAyBestdada
por:

PAB=APA+BPB

Donde son las fracciones en volumen de cada solvente y P son los parmetros de
polaridaddecadasolvente.

ndicede Viscosidad ndicede Fuerza


Disolvente UV refraccin cP polaridadP eluyente0

nm a25C

Ciclohexano 200 1.424 1.00 0.2 ND


Dietilter 215 1.352 0.24 2.8 **0.43
Tetrahidrofurano 212 1.472 0.55 4.0 *3.7
Cloroformo 245 1.445 0.57 4.1 **0.26
Etanol 210 1.359 1.08 4.3 ND
Metanol 205 1.328 0.55 5.1 *1
Acetonitrilo 190 1.341 0.38 5.8 *3.1
Isopropanol 205 1.377 2.40 3.9 *8.3
Agua 190 1.333 1.00 10.2 *Alta
Lafuerzadeleluyenteseestablecienbaseaunacolumna:*C18,**silica.
ND=Nodeterminado

Tabla1.ndicedepolaridaddeSnyder.

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Cromatografadefasereversa

Elucinporgradiente

Las separaciones isocrticas usan la misma composicin de fase mvil a travs de la


separacin. Las eluciones isocrticas se usan cuando la mezcla a separar no es muy
compleja o cuando los componentes de la mezcla tienen tiempos de retencin muy
diferentes.

Peroparasepararmezclasdeprotenas,generalmenteserequieredeungradientedeelucin
en el quelacomposicin de la fase mvil cambia atravs del anlisis comose indic
anteriormente.

Elgradientedeelucinserecomiendageneralmentepara:
Muestrasquetengantiemposderetencinsemejantes.
Muestrasdepesomolecularmayora1000.
Muestrasdeorigenbiolgico.

An cuandosepienseutilizarunaelucinisocrtica,esrecomendablehacerunprimer
anlisisporgradienteparadeterminarelporcentajedelsolventemsadecuado.

Encuantoalostiposdegradiente,loshaylineales,curvosyescalonadososegmentados.
(Figura5)
Lineal Curvo Segmentado

%B %B %B

Tiempo Tiempo Tiempo

Figura5.Formasdelosgradientesmscomunes

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Cromatografadefasereversa

Parmetroscromatogrficos

Elcomportamientoderetencindeuncompuestoreflejaladistribucindelsolutoentrela
fasemvilylaestacionaria.Laconcentracinencadafaseestdadaporelcoeficiente
termodinmicodereparticin.CuandoK=1,elsolutoseencuentraigualmentedistribuido
entrelasdosfases.

CE
K =
CM

DondeCE yCM sonlasconcentracionesdesolutoenlafaseestacionariaylafasemvil


respectivamente.

Factordecapacidad

Laraznderepartoorazndecapacidad,k,relacionaelequilibriodedistribucindela
muestradentrodelacolumna,esdecir,eslarelacindeltiempotranscurridoenlafase
estacionariacontraeltiempotranscurridoenlafasemvil. Matemticamentesedefine
comoelcocientedelosmolesdeunsolutoenlafaseestacionariaentrelosmolesenlafase
mvil:

CE V E
k '=
CM V M

Elfactordecapacidadpuedesercalculadoparacadapicousandolasiguienteecuacin:

t R t 0
k '=
t0

DondetReseltiempoderetencindelamuestrayt0eseltiempoderetencindeunsoluto
que no interacta con la fase estacionaria, tambin conocido como tiempo muerto. El

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Cromatografadefasereversa

tiempoderetencintranscurredesdelainyeccindelamuestrahastaqueelcompuesto
alcanzaeldetector.Elprimercomponenteeludodeberteneruntiempoderetencindel
dobledeltiempomuerto.

Dichodeotramanera,laraznderepartoeseltiempoadicionalqueunsolutorequierepara
eluir,encomparacinconunsolutonoretenido,paraelcualk=0.

Lafasemvilseleccionadadebedarvaloresdekqueestnenelrangode1a20.Valores
mayores de k generan tiempos de retencin largos que resultan en tiempo analtico
desperdiciado; y los valores menores que la unidad no proporcionan una resolucin
adecuadaentrelossolutos.

Lossolventesfuertesproveenpequeosvaloresde k,mientrasquelossolventesdbiles
danvaloresdekmsaltos.Sehavistoqueporcada2unidadesdediferenciaenelvalorde
polaridad de un mezcla de disolventes, el factor de capacidad k cambia un orden de
magnitud aproximadamente, lo que significa que la retencin del compuesto en una
columnaparticularpuedevariarsesimplementemediantelamodificacindelossolventes
delafasemvil

Eficiencia

Una caracterstica importante de un sistema cromatogrfico es su eficiencia, expresada


como una cantidad adimensional llamada nmero de platos tericos. Eltrmino plato
tericoprovienedeunestudiotericoenelquesetrataunacolumnacomosiestuviera
constituidadenumerosas,discretasycontiguascapasdenominadasplatostericos.Refleja
elnmerodevecesqueelsolutosereparteentrelasdosfasesdurantesupasoatravsdela
columna.Entremsgrandeseaelnmerodeplatostericosdeunacolumna,mayorsersu
eficienciayportantosepodrlograrunamayorresolucin.

Laeficienciadeunacolumnapuededeterminarseapartirdeunpicodelcromatograma
mediantelasiguienteecuacin:

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Cromatografadefasereversa


2
tR
N =5. 54
W 1/2

DondetReseltiempoderetencindelpicoyW1/2esanchodelpicomedidoalamitaddela
alturadelmismo.(Figura6)

tR
Altode
pico
Absorbancia

W1/2

Tiempo

Figura6.Determinacindelaeficienciadeunacolumnaenbaseaunpicodeuncromatograma.

Elnmerodeplatostericosalgunasvecesesreportadocomoplatospormetrodecolumna.
Enestaexpresin,laalturaequivalenteaunplatotericoHestdadaporlaecuacin:

L
H=
N

DondeLeslongituddecolumnayNeselnmerodeplatostericos.

La eficiencia depende principalmente de las propiedades fsicas de la matriz y de la


columna.Laeficienciamejoramuchoaldisminuireldimetrodelacolumna,alaumentar
sulongitudyalreducireltamaodepartculadelempaqueoalbajarlaviscosidaddel
disolvente.

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Cromatografadefasereversa

Selectividad

Laselectividadserefierealacapacidaddelmtodoparadistinguirlaspropiedadesdelos
componentesanivelmolecularyquepermitediferenciarlos.Esimportantedeterminarlas
caractersticasdelamolculaquenospermitirnsepararla,yaseapesomolecular,carcter
cidobase,polaridad,tamao,actividadbioqumica,ptica,etc.

La selectividad puede ser fsica o qumica, dependiendo de la naturaleza de las


interacciones entreelgrupofuncional yelmediodeseparacin.Las interacciones que
involucranfuerzasdedispersin,dipolosyfuerzasdehidrgenoseconsideranfsicas.Por
otro lado, un equilibrio cidobase o la formacin de complejos se clasifican como
selectividadesqumicas.

LaselectividadfsicaeslaquepredominaenRPCporqueenestemtodoloscomponentes
sonseparadosdeacuerdoasuspolaridades.EstosignificaquelaRPCpuedeusarsepara
separargruposdecompuestosdeacuerdoasuestructuraqumica.Laspequeasdiferencias
en las estructuras moleculares de dos compuestos resultan en grandes diferencias de
adsorcinyporlotantopermitesuseparacinporRPC.

Laselectividad() esequivalentealaretencinrelativadelospicosdelamuestrayest
dadaporlasiguienteexpresin:

k '2 V2
= =
k '1 V1

Donde V1 y V2 sonlosvolmenesderetencin, k1 y k2 sonlosfactoresdecapacidad


paralospicos1y2respectivamente.

Resolucin

Laresolucindeunacolumnaconstituyeunamedidacuantitativadesucapacidadpara
separardossolutos.

Losparmetrosquecontribuyenenlaresolucin(Rs)delospicossonlaselectividad(),
laeficienciaonmerodeplatostericos(N)yelfactorderetencink.(Figura7y8)

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Cromatografadefasereversa

Estosparmetrosserelacionanenunaecuacindelasiguientemanera:

1 k'
Rs= N
4 1k '

V2

V1

V2 V 2
Rs =
W 2 + W 1/ 2

W1 W2

Figura7.Determinacindelaresolucinenunpardepicosdeuncromatograma.

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Cromatografadefasereversa

B
A A B
B

95%A95%B 99%A99%B

Rs = 1 Rs= 1. 5

Figura8.Resolucindepicosendiferentescromatogramas.Enelsegundo
cromatogramahaymayorresolucinporquelospicosestnmsseparadosunodeotro.

Paramejorarlaresolucindeunacolumnasepuedenvariarcadaunodelossiguientes
parmetros:

Factordecapacidad: eselelementomsmanipulabledebidoaquedependedela
polaridaddelafasemvil.Paraunaresolucinptima, k debeestarenelintervalo
entre2y5.

Nmerodeplatostericos:losnmerosdeplatostericosseincrementanaumentando
lalongituddelacolumna.Sinembargo,unaconsecuenciaadversaesunincrementodel
tiemponecesarioparalaseparacin.La relacinentre N y Rs est definidapor el
cuadradodeN.Porejemplo,unincrementoenelnmerodeplatostericosNde100a
625aumentarlaresolucinporunfactorde2.5ynoporunode6.25.Otraformade
mejorar la resolucin consiste en reducir la altura de los platos lo cual puede
conseguirsedisminuyendoeltamaodepartculadelrellenoobajandolaviscosidaddel
disolvente.

Selectividad:implicamodificarlascaractersticasqumicasdelrellenodelacolumna.

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Cromatografadefasereversa

Cromatografaporsupresininica

Lacromatografadeparesinicosocromatografaporsupresininica esuntipode
cromatografadefasereversaqueseutilizaparalaseparacindeespeciesionizables.Se
recomiendaelusodeestetipodecromatografaespecialmenteparamolculascargadasde
granpesomolecularcomolasprotenasoloscidosnucleicos.

Enestemododecromatografa,seaadealafasemviluncompuestoinicoqueaportaun
contrainorgnicogrande;laconcentracindeestosagentesestenunrangode0.01%a
0.03%.

Elmecanismoexactodelacromatografadeparesinicosnosehaestablecidoclaramente,
sinembargo,existendosmodelosfundamentales.

Elprimeropostulaquelamolculadelsolutoformaunparinicoconelcontrainenla
fasemvilydeestamaneraaumentalahidrofobicidaddelamuestra.(Figura9)Elgrado
enelquelamuestraionizadayelcontrainformanelcomplejodeparinico,ascomola
fuerzadeunindelcomplejoconlafaseestacionaria,afectaaltiempoderetencindela
muestra.Alaumentarlaconcentracindelcontrain,aumentalaretencinhastaunlmite
quegeneralmenteestdadoporlasolubilidaddelcontrainenlafasemvil.

El otro mecanismo postula que el contrain se retiene en la fase estacionaria que es


normalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase estacionaria cargada puede
entoncesformarcomplejosconlosionesorgnicosdecargaopuesta.Esmuyprobableque
elmecanismorealinvolucreaambospostulados.

Luego,laelucindelosparesinicosseconsiguemedianteunafasemvilquecontenga
metanoluotrodisolventeorgnicomiscibleenagua.

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Cromatografadefasereversa

Pp tid oscargad os p ositivam ente

+ + + +

+

+ +
+
+
Agentes su p resores d eiones cargad os negativamente

Oligonu cletid oscargad os negativam ente


+ +


+ +
+


+
Agentes su p resores d eiones cargad os p ositivam ente

Figura9.Supresindecargasdeprotenasydecidosnucleicos.

Elagentemsusadoparalasupresindecargasenprotenaseselcidotrifluoroacticoy
paraloscidosnucleicoseslatrietilamina.

El control del pH es el parmetro ms importante en este tipo de cromatografa. La


retencinaumentaconformeelpHmaximizalaconcentracindelaformainicadelos
solutos.UnpHbajoaseguraquelasbasesfuertesestnensuformainicaprotonadayque
los cidos dbiles presentes estn en su forma no inica. La fase mvil es preparada
generalmenteconcidotrifluoroactico(TFA)oelcidoortofosfricoquemantienenel
pHcercanoa3.

ElmayorbeneficiodelospHsbajosusadosenlacromatografadesupresininicaesla
eliminacindelefectodemodomixtoquegeneraunincrementoeneltiempoderetencin
yunensanchamientodepicos.Peroalmismotiempo,elmtododesupresininicaest
limitado a un intervalo de pH de 3.0 a 7.5, debido a la inestabilidad de las fases
estacionariasfueradeesteintervalodepH.

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Cromatografadefasereversa

Cromatografasecuencial

Enestetipodecromatografalascolumnasseacoplandemanerasecuencial,esdecir,se
conectaunacolumnadespusdeotra.Deestamaneraloscompuestosaanalizarinteractan
demaneraindependienteconcadasoporteylosmecanismosderetencinsondiferentesen
cadacolumna.

Laconsideracinmsimportanteeneldiseodeacoplamientodecolumnasinvolucrala
compatibilidad de la fase mvil con cada columna. El eluyente debe facilitar la unin
selectivadeloscompuestosdeintersenunaoambascolumnas.

Lascolumnaspuedenacoplarsedemaneraqueloscontaminantesquedenretenidosenla
primeraoenlasegundacolumna.Estamodalidadesempleadamsfrecuentementeparala
purificacindeprotenas.Acontinuacinserevisanlostiposdeacoplamiento.

Arreglopositivonegativo

En un acoplamiento de columnas positivonegativo, la protena de inters se une a la


primeracolumnayloscontaminantesfluyensininteractuar.Enlasegundacolumnalos
contaminantesquedanretenidos,perolaprotenadeintersno.Enlossiguientespasosse
cambialapolaridaddelafasemvilgenerandolaelucindelaprotenadeunamanera
concentrada.

Generalmentelasprotenasestnpresentesenmuybajasconcentracionesenlasmuestras
biolgicas,asquelaestrategiams eficientees utilizarunacolumnaqueretengaala
protenaylaconcentre.

Arreglonegativopositivo

Lacolumnainicialretienealoscontaminantes,mientrasquelasegundacolumnauneala
protenadeinters.Enestearreglo,laprimeracolumna(llamadanegativaporqueno

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Cromatografadefasereversa

retienealaprotenaocomponentedeinters)generalmenteseremueve,luegoseprocedela
elucin de la protena de la segunda columna (positiva) sin que los contaminantes
interfieranpuestoquefueroneliminadosalretirarlaprimeracolumna.

Unadelasdesventajasdeestearregloesquelaprimeracolumnadebeuniralamayorade
loscompuestoscontaminantes.

Arreglonegativonegativo

La protena de inters no tiene ningn tipo de interaccin con ninguna columna. La


desventajadeestearregloesquelaprotenasevadiluyendoconformeatraviesaelsistema
cromatogrfico.

Arreglopositivopositivo

Eselarregloquegeneralamayorselectividadpueslaprotenaesretenidatantoen la
primeracolumnacomoenlasegunda,asquedealgunamaneralaprotenasesometeados
pasosdepurificacin.Laprotenaseunealacolumnainicialyloscontaminantespasande
largo.Cuandolaprotenaeluyedelaprimeracolumnapasaalasegundadondeesretenida.
Enestecasoserequieredeunsegundoprocesodeelucinparaliberaralaprotena.

23
Cromatografadefasereversa

APLICACIONESDELACROMATOGRAFADEFASE
REVERSA

Lacromatografadefasereversafuedesarrolladaen1950yfueideadaparalaseparacin
depequeasmolculasorgnicas. Mstarde,conlaaparicindenuevossoportesparala
faseestacionariaynuevosdetectores,seconvirtienunaherramientaindispensableparala
separacindebiomolculascomoprotenas,pptidosyoligonucletidos.

Purificacindebiomolculas

Enlaactualidad,laRPCseusademanerageneralizadaparasepararlossiguientesgrupos
debiomolculas:
Protenasypptidosdeorigennatural
Protenasypptidosrecombinantes
Pptidosobtenidospordigestinenzimtica
Pptidossintetizadosqumicamente
Oligonucletidossintticos

A continuacin se sealan algunas consideraciones generales para lograr estrategias de


purificacincorrectas.

Purificacindeprotenasypptidosdeorigennatural

La purificacin de pptidos y protenas a partir de sus fuentes naturales requiere de


diferentestcnicascromatogrficasdebidoalacomplejidaddelamezclaoriginal.Parael
ltimopasodepurificacinseusalaRPCylafiltracinporgeldealtorendimiento.Sin
embargo,laRPCnoesunmtodo tanapropiadoparasepararpptidos yprotenas de
fuentesbiolgicasdebidoalapresenciadelpidosyotrossolutosaltamentehidrofbicos
queseunenfuertementealafaseestacionaria,dificultandosuseparacindelacolumna.

Hay varios puntos a considerar cuando se utiliza la RPC para purificar molculas
provenientesdemezclasbiolgicascomplejas.Enprimerlugar,siunaprotenaopptidose
vaautilizarenestudiosfuncionales,debemosasegurarnosquelaactividadbiolgicase

24
Cromatografadefasereversa

mantienedespusdecadapasodepurificacin.Estenoesunproblemacrticocuandose
tratadepptidosoprotenaspequeas,perolasprotenasgrandestiendenadesnaturalizarse
bajolascondicionesdelaRPC.
Laeleccinadecuadadelmediodefasereversaylascondicionesdeelucin,incluyendoel
tiempodeexposicinacondicionespotencialmentedesnaturalizantes,deberoptimizarsea
findemantenerlaintegridadfuncionaldelamolcula.Adems,lapresenciadeproteasas
enlasmuestraspuededificultarlapurificacindepolipptidos,porloqueesaconsejable
trabajar conagilidaddurantelas primeras etapasdepurificacinafinde minimizar el
tiempodecontactoentrelasproteasasylamuestra.Unamaneradeevitarladegradacinde
protenasesadicionandoalasolucinamortiguadorainhibidoresespecficosdeproteasas.

Otro problemacomn depurificacinapartirdemezclas naturales esel fenmeno de


agregacin.Losagregadossolublescomodmerosotrmerospuedenserseparadosdelos
monmerosporfiltracinengel.

Purificacindepptidosyprotenasrecombinantes

Ladificultadparaaislarpptidosoprotenasdesusfuentesnaturales,sepuedesuperara
travs de la produccin de stas con tcnicas recombinantes. Los polipptidos
intracelularessonmsdifcilesdepurificar,yaqueesnecesariolisarlasclulasparasu
obtencin. En cambio, las protenas o pptidos secretados al medio son relativamente
fcilesdepurificaryengeneral,nosonsusceptiblesalasproteasasintracelulares.

Lapurificacindepptidosrecombinantesdelmedioextracelularpuededificultarseporlos
volmenes tangrandes que seobtienenporlo queserequieredeunpasoinicial para
concentrar la muestra. Este inconveniente se puede resolver si se une al pptido una
secuenciaterminalespecficacomoprotenaA,glutatintrasferasa,opoliaminocidos,lo
que permitir una purificacin cromatogrfica por afinidad. Una vez concentrado y
purificadoelpptidoser necesarioremoverelasa atravs demtodos enzimticos o
qumicos.LapurificacindepptidosrecombinantespuedemonitorearsemedianteRPC,
anlisis de amino cidos, mapeo de eptopes, bioensayos o electroforesis en gel de
poliacrilamida.

Purificacindepptidosobtenidospordigestionesenzimticas

25
Cromatografadefasereversa

La digestindeunaprotenaconproteasas,usualmentetripsina,generaunamezcla de
pptidosquepuedenserseparadosporRPCparaobtenerunmapapeptdicodelaprotena.
Incluso puede asignarse la posicin de los puentes de disulfuro al comparar los
cromatogramasdeunadigestinendondelospuentesdedisulfuropermanezcanintactosy
los cromatogramas de otra digestin en donde los puentes de disulfuro hayan sido
reducidosconmercaptoetanol.
Purificacindepptidossintticos

En la actualidad, la sntesis qumica de pptidos menores de 20 amino cidos es un


procedimiento de rutina en muchos laboratorios. Las cantidades sintetizadas van de
miligramos hasta gramos. La generacin de pptidos sintticos genera contaminantes
adyacentescomopptidostruncadosoconmodificacionesenlasecuenciadeaminocidos.
Tambin se encuentran presentes pequeas molculas orgnicas como fenol y tioles,
producidosalsepararelpptidosintticodelafaseestacionariaosoporte.

Lospptidosconmenosde20aminocidos,engeneral,sepuedenobtenerconunalto
gradodepureza usandosolamenteRPC.Parapurificarmicrogramosdemuestrapodra
utilizarseunempaqueconpartculasde5 m,perosiserequierencantidadesmayores
sernecesarioutilizarunamatrizde15a30m.

Purificacindeoligonucletidossintetizadosqumicamente

Lasntesisdefaseslidaautomatizadaesunprocedimientocomnmenteutilizadopara
generaroligonucletidosde20a30paresdebasesdelargo.

El carcter hidrofbico de las bases nitrogenadas disminuye en el orden


adenina>timina>guanina>citosina.Entonces,losoligonucletidosricosenadeninatendern
aeluirmslentoqueaquellosricosencitosina.

Losprincipalescontaminantessonsecuenciastruncadasjuntoconpequeascantidadesde
oligonucletidosquedifierenenlasecuencia.Laseparacinentrelassecuenciascompletas
delasincompletassepuedesimplificarsilapurificacinsellevaacabousandogrupos
protectores 5 tritilo que poseen tres anillos de benceno; de esta manera slo los
oligonucletidoscompletostendrnlahidrofobicidadsuficienteparapermaneceranclados
alafaseestacionaria.

26
Cromatografadefasereversa

Purificacinagranescala

La purificacin a gran escala de pptidos y oligonucletidos sintticos o protenas


recombinantesporcromatografadefasereversarequieredeunaaltaresolucinparala
separacin de estos compuestos. En estos casos, la purificacin a escala analtica se
optimizausandounamatrizdefasereversadepartculaspequeasyseescalautilizando
unamatrizconunaselectividadsimilarperohechoconpartculasmsgrandes.

Hayesencialmentetresetapasenlapurificacindeunabiomolculaapartirdeextractoso
muestrasnaturales:lacaptura,purificacinintermediayelpulido.

El propsito de la captura es aislar, concentrar y estabilizar la molcula blanco de la


muestracrudaenformarpidayconunbuenporcentajederecuperacin.Lacapturanose
esperaqueseaunpasoaltamenteresolutivo,peroesnecesariaparaaislarlamolculade
inters de distintas sustancias contaminantes; es decir, es un proceso de separacin de
grupo.

Lafaseintermediadepurificacinseenfocaensepararalamolculablancodelamayora
de las impurezas como protenas, pptidos, cidos nucleicos, endotoxinas y virus. La
capacidad de resolver componentes similares es de suma importancia en esta etapa de
purificacindadoqueloscontaminantespresentescompartencaractersticasfuncionalesy
estructuralesconlamolculablanco.

Elpulidoeselltimopasoparalaobtencindeunproductopuro,esteprocedimientose
utiliza para remover el resto de los contaminantes e impurezas, de tal manera que el
productofinalpuedaserobtenidopuroparasuposterioruso.Loscontaminantesenesta
etapasonamenudomuysimilaresalamolculablanco.Losmscomunesincluyena
variantesestructuralesyconformacionalesdelapropiamolcula.

Desalado

Ladesalacinesunprocedimientoderutinaenellaboratorioyconsisteenlaseparacinde
contaminantesdebajopesomoleculardelasbiomolculasdemayorpesomolecular.Aeste
procedimientoenocasionestambinseledenominacambiodebuffer.Lastcnicasno
cromatogrficasparadesalarincluyenalaultrafiltracinyaladilisis.

27
Cromatografadefasereversa

Las protenas, pptidos y cidos nucleicos pueden desalarse adecuadamente usando la


cromatografadefasereversapuestoquelasmuestraspuedenrecuperarseyreconstituirse
envolmenespequeosydeestamaneraevitarelfenmenodedilucinqueresultadela
filtracinporgel.

Una vez que se ha procesado toda la muestra, el soluto se eluye usando volmenes
pequeosdefasemvildebajapolaridad,tpicamenteacetonitrilo.Sielsolventeutilizado
es voltil, ste puede ser removido por evaporacin y la muestra residual podr ser
resuspendidaenelvolumendeseadodeotrosolventeosolucin.

Anlisiscuantitativo

La cromatografa de fase reversa tambin puede proporcionar informacin cuantitativa


acercadelasespeciesseparadas,locualledaunimpactodeaplicacinanmayoraesta
tcnica. La cuantificacin en RPC se basa en la comparacin del rea del pico del
compuestoproblemaconlasdeunoomsestndares.

Losinstrumentoscromatogrficosestnequipadosconintegradoreselectrnicosdigitales,
loscualespermitenunaprecisaestimacindelasreasdepico.

Haycuatrotcnicasprincipalesparalacuantificacin:normalizacinderea,calibracin
conestndarexterno,estndarinternoylaadicindeestndar.

Normalizacinderea

Elreadelospicossereportacomounporcentajedereatotal.(Figura10)statcnicaes
muy empleada para estimar las cantidades relativas de impurezas en una muestra; la
desventajaesqueasumequetodosloscomponentestienenelmismonivelabsorcinala
longituddeondaquesemonitorea.

28
Cromatografadefasereversa


93%

2.8%
2.2%
0.8% 1.2%

Tiempo

Figura10.Ejemplodenormalizacinderea.

Calibracinconestndarexterno

Implicaprepararsolucionesdelestndarconunaconcentracinconocida.Seinyectael
mismovolumendecadasolucinyseconstruyeunacurvadecalibracinenfuncindela
concentracinylasreasdepico.Laconcentracindelosestndaresdebeserparecidaala
concentracinqueseesperaparalasmuestras.Lasmuestrasdeconcentracindesconocida
sepreparan,inyectanyanalizandelamismamanera.Laconcentracindelasmuestrasse
obtieneapartirdelacurvadecalibracin.

A este mtodo se le llama estndar externo porque los estndares se analizan en


cromatogramasseparadosdelasmuestras.
Calibracinconestndarinterno

Consisteenlaadicindeuncompuestodiferentealanalitoacadaunadelasolucionesque
sevanaanalizar.Seanalizansolucionesdemuestradediferentesconcentracionesalasque
sehaaadidolamismacantidaddeestndarinterno.

29
Cromatografadefasereversa

Requerimientosparaunestndarinterno:
Tenerbuenaresolucin(Rs>1.25)
Factordecapacidadsimilaralcompuestoproblema
Elcompuestoqueseutilicecomoestndarinternonodebeestarpresenteen la
muestraoriginal
Quetengaaltogradodepureza

Adicindeestndar

Estemtodoseusaparaanlisisdetrazas.Diferentescantidadesdelanalitoquesedesea
medirseadicionanalasolucinproblema,lacualcontieneunaconcentracindesconocida
deanalito.Alacuantificacintotalselerestaelvalordelacantidadadicionada;deesta
manerasepuedecalcularlaconcentracindesconocida.

30
Cromatografadefasereversa

ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN


ANLISISDECROMATOGRAFADEFASEREVERSA

Enlasiguienteseccinsetratarnalgunasconsideracionesquehayquetomarencuentaen
laaplicacindelacromatografadefasereversaparalaseparacindebiomolculascomo
eslaseleccindecolumna,lafasemvil,lascondicionesdeelucin,preparacindelas
muestras,manejodelascolumnas,ascomolaresolucindeproblemasmscomunes.

Naturalezaqumicadelafaseestacionaria

Paralaseparacindeprotenasgrandeshayunapreferenciaausarslicasconligandosn
butiloynoctilosobrelosalquilosnoctadeciloyaquelasbiomolculasnosoncapacesde
intercalarseenlascapasnalquilolargascomolohacenlasmolculaspequeas;adems,
nosegeneraunaadsorcintanfuertedelasprotenasenlascadenasalquilopequeasypor
consiguienteserequieremenorcantidaddesolventesorgnicosparalaelucin,locual
disminuyeelriesgodedesnaturalizacindelaprotena.

Tamaoyformadepartcula

Laaccesibilidaddelamuestraalamatrizdependeengranmedidadeltamaodeporo.Los
empaquescontamaosdeporomenoresde300armstrongsseusanparalaseparacinde
pptidos y oligonucletidos. Generalmente se recomiendan tamaos de poro de 300
armstrongs o mayores para la separacin de protenas porque como se mencion
anteriormente,losporosgrandesgeneranmejorresolucinparabiomolculasmslargas.

Eltamaodelapartculatambindifiereentreunaseparacinanalticayunapreparativa.
Lasseparacionesanalticassedesarrollanencolumnasconpartculasde3a5micras,las
preparativas conpartculas de10a30micrasylas separaciones agranescalautilizan
partculasde40a50micras.Elinconvenienteesqueamayortamaodepartcula,la
columnasevuelvemsfrgilyportantosereducesutiempodevida.

31
Cromatografadefasereversa

Respectoalaformadelaspartculas,lascolumnasconempaquedepartculasirregulares
son menos caras que las partculas esfricas y son ms comnmente empleadas en
aplicacionesdegranescala.
Tamaodelacolumna

Laresolucindebiomolculasdealtopesomolecularenlasseparacionesdefasereversa,
es menos sensible al largo de la columna que la resolucin de molculas orgnicas
pequeas,detalmaneraqueloscidosnucleicos,protenasypptidoslargospuedenser
purificadoseficientementeencolumnascortas.Elincrementarellargodelascolumnasen
generalnoincrementalaresolucinsignificativamenteyspodradaaralasprotenas
porque la prdida deactividad biolgica es proporcional al tiempo deresidencia de la
protenaenlacolumna.

Porotraparte,lasseparacionesanalticasgeneralmenteusancolumnasde100a250mmde
largo x 4 mm de dimetro; y las separaciones preparativas requieren columnas con
dimetrosmsanchos,porejempo,de9mmaproximadamente.

VelocidaddeFlujo

Lavelocidaddeflujoesunfactorimportanteparalaresolucindemolculaspequeas,ya
que la tendencia de las molculas a difundirse disminuye al incrementar el flujo,
produciendopicosmsangostosyporlotanto,mejoralaresolucin.Lasprotenastienen
menordifusibilidadquelasmolculaspequeas,porloqueseobtieneunabuenaeficiencia
anconflujosbajos.

Generalmente las separaciones en columnas de 100 a 250 mm de largo x 4.6 mm de


dimetro se eluyen con un flujo de 1 ml/min y las separaciones preparativas que se
desarrollanencolumnasde250mmx9.4mmdedimetroutilizanflujosde4ml/min.

Las variaciones en la velocidad de flujo son especialmente significativas en las


separacionesagranescala,peronoescrticaenlosexperimentosanalticos.

Temperatura

La temperatura puede afectar profundamente a la cromatografa de fase reversa,


especialmente la utilizada para solutos de bajo peso molecular, pptidos pequeos y

32
Cromatografadefasereversa

oligonucletidos.Dadoqueeltransportedemasasensolucinentrelafasemvilylafase
estacionariaesunprocesocontroladopordifusin,incrementarlatemperaturadisminuyela
viscosidaddelsolventeyestogeneralmentefavorecelatransferenciademasasyporlo
tanto, mejora la resolucin. En cambio, cuando las protenas se desnaturalizan por un
incrementodelatemperatura, laestructuradestassedesdoblaytienemssitios de
interaccinconlafaseestacionaria,porlotantoseincrementaeltiempoderetencin.
Solventes

Todoslossolventes,solucionesamortiguadoras,sales,ascomoelaguausadaparapreparar
la fase mvil, deben serde altapureza qumica, libre de iones metlicos as como de
partculassuspendidas. LapurezaqumicaesimportanteenRPCpreparativapuestoque
cualquiercontaminanteenlafasemvilpuedeproducirpicosindeseables,ycontaminarla
biomolculapurificada.

Los solventes usados para preparar la fase mvil o la fase mvil ya preparada deben
desgasificarseenunbaodeultrasonidopor10a15minutosparaprevenirlaformacinde
gasqueafectaralaestabilidaddelacolumna.Tambinpuedendesgasificarseutilizando
vacoyburbujeandohelio.

Desnaturalizacin

Lasinteraccionesdelasprotenasconlossolventesorgnicos,engeneral,conduceacierta
prdidadelaestructuraterciariaquepuedegenerarvariosestadosconformacionalesycada
estado a su vez puede interactuar de manera diferente con la fase estacionaria. El
desdoblamientopuedeexponerlosresiduoshidrofbicosdelaprotenaconelconsecuente
incrementodelaretencin,loquepuedegenerarinsuficienterecuperacindelaprotena.
Loscomplejosenzimticosyprotenasdecomponentesmltiplessonmslbilesaperder
actividadquelospptidospequeos.Ahorabien,elprocesodedesnaturalizacinpresenta
unacinticalentaypuedereducirseesteprocesodisminuyendoeltiempoquelaprotena
permanece en la columna. En caso de que ocurriera cierta desnaturalizacin, la
conformacinpodraregenerarsealreincorporarlaprotenaasuscondicionesnativas.En
casodequeunaprotenaopptidofuerapurificadaconelfindedeterminarsuestructura
primaria,ladesnaturalizacinnoseraunproblema.

33
Cromatografadefasereversa

Gradientedeelucin

Laretencindelasprotenasdisminuyeexponencialmentealadicionaralafasemvilun
modificadororgnico.Estecomportamientodelasprotenasobligaalusodeelucionescon
gradienteparalaseparacindemezclasproteicas.
Cuandosepretendesepararporprimeravezloscomponentesdeunamezclacompleja,se
usaungradientegruesoparaunaseparacininicial,queservirparaajustarlaformadel
gradiente hasta llegar al punto ptimo. Esto usualmente implica la disminucin de la
pendientedelgradienteenellugardondeeluyenloscomponentesdeseadosydelaumento
delapendienteantesydespusdeesepunto.
La eleccin de la pendiente del gradiente depender de que tan prximos eluyan los
componentescontaminantesdelamolculablanco.Porlogeneral,cuandodisminuimosla
pendiente del gradiente incrementamos la resolucin, pero tambin aumentamos los
tiemposderetencin.

LosgradientesenRPCsiempreprovienendeunacondicindealtapolaridad(fasemvilA
altamenteacuosa)aunadebajapolaridad(fasemvilBconaltocontenidodesolvente
orgnico). Los gradientes o pendientes de gradiente se reportan usualmente como el
incrementoenelporcentajedelafasemvil Bporunidaddetiempo(%B/min) opor
unidaddevolumen(%B/ml).

Ungradientetpicovade0%Ba100%Ben10a30volmenesdecolumna.Conunflujo
de1ml/minparaunacolumnade1ml,correspondeungradientede3a10%B/min.

Acondicionamientodecolumna

Elacondicionamientodecolumnadeberealizarsesiemprequeseuseunacolumnapor
primeravez,despusdeunalmacenamientoprolongado,ycadavezquesedeseecambiarla
fasemvilparaunanlisis.

El acondicionamiento se lleva a cabo usando la misma fase mvil que la del anlisis
cromatogrfico.Elprocedimientogeneralparaelacondicionamientodelascolumnasesel
siguiente:

1. Lavar con 3 volmenes de columna de fase mvil B para eliminar posibles


contaminantesdelanlisisanterior.

34
Cromatografadefasereversa

2. Correr2a3volmenesdecolumnadeungradientelinealde100%faseBa100%
faseA.Nodebecambiarsedemaneraabruptalafasemvilporqueexisteelriesgo
dequelacolumnasedae.
3. EquilibrarconfaseAhastaquetodaslassealesdemonitoreoseanestables.

Cadavezquesecambielafasemvil,esimportantecorrerunblancoparacorroborarla
ausenciadeimpurezasyanalizarlaestabilidaddelsistema.
DespusdehaberequilibradolacolumnaconlafasemvilA,elsegundopasoesaplicarla
muestra a la columna. Enseguida se procede a eluir con la misma fase mvil A. La
molculadeintersdeberunirsealamatrizylossolutosindeseadossernarrastradospor
lafasemvil.

Preparacindelasmuestras

La muestra debe disolverse en la fase mvil que se emplear para hacer el anlisis
cromatogrfico. Si la muestra no es completamente soluble en la fase mvil, puede
adicionarsecidofrmico,acticooalgunasal;esteprocedimientomejoralasolubilidady
noafectalaseparacin,siempreycuandoestosagentesseencuentrenenbajoporcentaje.

Todaslasmuestrasdebencentrifugarsea10,000rpmpor10minutosantesdelainyeccin
ofiltrarseatravsdeunamembranade0.22micrasparaeliminarpartculas.

NoserecomiendaalmacenarlasfasesmvilesacuosasdepHneutropormsde3das
porqueexisteelriesgodecrecimientomicrobianoyademslamuestrapodraoxidarse.

Limpiezadelacolumna

Serecomiendalimpiarlacolumnaperidicamente,especialmentecuandosedetecteuna
elevacinenlapresinoprdidaderesolucin.Hayqueconsiderarquelaprdidade
resolucindebidoalensanchamientodelospicospuededebersealapresenciadegrupos
silanolenlasuperficiedelaslicaoinclusoaladisolucindelamatrizdebidoaluso
frecuentedefasesmvilesconpHporarribade7.

Unprocedimientocomndelimpiezaes:

35
Cromatografadefasereversa

1. Lavar abajo flujocon varios volmenes de columna utilizando0.1 % deTFA


(cidotrifluoroactico)enagua.
2. Correrungradiente,aproximadamente20a30volmenesdecolumna,desde0.1%
deTFAenaguahasta0.1%deTFAenisopropanol.Elisopropanolesmuyusado
paralalimpiezadecolumnasdebidoasualtopoderdeelucin.
3. Equilibrarcon100%deisopropanolconteniendo0.1%deTFAyluegollevarla
columnanuevamenteaaguacon0.1%deTFAempleandoungradiente.
4. UtilizarungradienteparaintroducirlafasemvilA.
5. EquilibrarconvariosvolmenesdecolumnadefasemvilAantesdeiniciarel
anlisis.

Paracolumnasdepoliestireno,unprocedimientoefectivodelimpiezaesequilibrarcon
variosvolmenesdecolumnaempleandohidrxidodesodio0.5M.Elhidrxidodesodio
esunagentedelimpiezamuyefectivo.
Almacenamientodelacolumna

Lascolumnasdefasereversahechasabasedeslicanodebenalmacenarseensoluciones
acuosasdebidoalainestabilidaddelaslicaencondicionesacuosas.Lascolumnasdeben
almacenarseensolventesorgnicoscomometanollibredeTFA.

Resolucindeproblemas

Acontinuacinsepresentanalgunassolucionesparalosproblemasmscomunesdurante
eldesarrollodeunanlisisporcromatografadefasereversa.

Sntoma Causa Solucin

36
Cromatografadefasereversa

Elflujodelacolumna Presenciadematerial Filtrelasmuestrasylafase


sehareducido. particuladoenlafasemvil. mvilantesdeusarlas.

Precipitacindeprotenasenla Reemplaceelfiltrodelafase
columna. mvil,laprecolumna,y/ola
columna.
Enamboscasoslimpiey
regenerelacolumna.

Nohayflujoporla Labombanofunciona. Revisequelabombaest


columna. funcionandoadecuadamente.
Verifiquesilabombaoel
Algunapieza,adaptadorotubo sistemapresentanfugasosihay
delsistemaestaobstrudo. obstrucciones.
Lapresinse Precipitacindelamuestraenla Limpieyregenerelacolumna.
incrementaduranteuna columna. Reemplaceelfiltrodelafase
ovariascorridas. mvil,laprecolumna,y/ola
columna.
Cambieeladitivousadopara
solubilizarlamuestra.
Filtrelasmuestrasylafase
mvilantesdeusarlas.

Sntoma Causa Solucin


Lamuestranoeluyeen LaconcentracindelsolventeB Incrementelaconcentracindel
elgradienteusado. enelgradienteesmuybaja. solvente.
Elpoderdeelucindelsolvente
orgnicoesmuybajo. Sustituyalacolumnaporuna
conligandosmenoshidrofbicos.
Cambieelsolventeporotrode
mayorespropiedadesdeelucin.

37
Cromatografadefasereversa

Loscomponentesdela Lamuestranoeslo Incrementelaconcentracindel


muestraeluyenenla suficientementehidrofbicapara agentesupresordeiones.
fasedeequilibrio. adsorberseenlacolumna. Cambielacolumnaporunacon
ligandosmshidrofbicos.
Sustituyaelsolventeorgnico
porotroconmenorespropiedades
deelucin.
Disminuyalaconcentracindel
solvente.
Laconcentracininicialde
solventeesmuyalta.
Laresolucinesmenor Lapendientedelgradientees Useungradientemsbajo.
aloesperado. muyalta.
Bajaselectividad Adicioneoajustela
concentracindelagentesupresor
deiones.
Elvolumendelaceldade Cambielaceldadeflujo.
deteccinesmuygrande.
Lacolumnaestamalempacada. Determinelosplatostericosde
lacolumnaydesernecesario,
Protenasolpidosprecipitados cmbiela
enlacolumna. Limpieyregenerelacolumna.
Incrementelaconcentracinde
solventeenlafasemvilinicial.

Laconcentracindelamuestra Limpieyregenerelacolumna.
esdemasiadoalta. Disminuyaelvolumendecarga
delamuestra.
Solucin
Causa
Sntoma DisminuyaelpHparasuprimir
Haygrupossilanollibresenla laionizacindelosgrupossilanol
Laresolucinesmenor superficiedelafaseestacionaria. ocambiedecolumna.
aloesperado. Disminuyaelflujodeelucin.
Lavelocidaddelflujoesmuy
alta.

38
Cromatografadefasereversa

Ensanchamientode Lacolumnaestmalempacada. Determinarelnmerodeplatos


bandaoasimetra. tericos.Desernecesario
reemplacelacolumna.
Lacolumnaestsobrecargada. Limpieyregenerelacolumna.
Disminuyaelvolumendecarga
delamuestra.Nodebehaberms
de1mgdemuestraporgramode
faseestacionaria.
Incrementelavelocidaddeflujo.
Haydifusindelamuestra.
Nosepuedereproducir Lacolumnanoestequilibrada, Contineelacondicionamiento
unperfildeelucin faltaacondicionamiento. decolumnahastaquelalnea
previo. basalseaestable,
aproximadamente5a10
volmenesdecolumna.
Lafasemvilnoseprepar Preparenuevamentelafase
correctamenteoelsolventese mvil.
evapor.
Alteracindelamuestradurante Preparenuevamentelamuestra.
elalmacenaje.
Buenarecuperacinde Loscomponentesdelamuestra Disminuyaeltiempodecorrida
lamuestraperopoca estndesnaturalizadoso afindelimitarlaexposicindela
actividadbiolgica. inactivadosenlafasemvil. muestraalosreactivosdelafase
mvil.
Useunamatrizconligandos
menoshidrofbicospara
disminuirlaconcentracinde
solventeBenlafasemvilo
cambieelsolventedelafase
mvil.
Sntoma Causa Solucin

39
Cromatografadefasereversa

Lacantidaddemuestra Precipitacindelamuestra. Cambielacomposicindela


enlasfracciones fasemvilafindemantenerla
eludasesmucho estabilidad.
menoraloesperado. Lamuestrasehaadsorbido DisminuyaelpHdelafase
fuertementealacolumnapor mviloadicioneunagente
retencininica. supresordeiones.
Lamuestrasehadegradadopor Agregueinhibidoresde
proteasasonucleasas. proteasasonucleasasominimice
eltiempodeseparacin.

Picosmuypequeos Lamuestraabsorbepocoaesa Monitoreelamuestraadiferente


longituddeonda. longituddeonda.
Picos extraos en el Impurezasenlafasemvil. Usereactivosdemejorcalidad.
cromatograma. Lavelacolumna.
Elucin incompleta de la
corridaanterior.
Ruidoenel Burbujasdeaireatrapadasenla Elimineelgasdelafasemvil.
cromatograma columnaoenlaceldadel
detector.

Eltiempoderetencin Hayuncomportamientode DisminuyaelpHparasuprimir


paraunmismo modomixtodebidoagrupos laionizacindelosgrupos
componentedela silanolenlasuperficiedela silanol.Obien,cambiela
muestraaumentaconel slica. columna.
tiempo.

40
Cromatografadefasereversa

EQUIPODEHPLC

LatcnicadefasereversaeseltipodecromatografamsampliamenteutilizadaenHPLC
quesonlassiglasdelinglsHighPerformanceLiquidChromatography.Lacromatografa
delquidosdealtaresolucinutilizapresioneselevadasparahacerpasarunflujodefase
mvilatravsdeunacolumnaempacadaconpartculasmicromtricas.Sinlaaplicacinde
presinseraprcticamenteimposiblequeeleluyentepasaraatravsdelacolumna.

Dadaslascaractersticasdeunacolumnadecromatografadefasereversa,serequerirde
unequipodeHPLCpararealizarlaseparacin.Asqueesrelevantecomentardeforma
generalcmoestconformadoesteequipo.

UnequipodeHPLCbsicamentedebecontarconunsistemadebombeoqueimpulseel
flujodelafasemvilatravsdelacolumna,unacolumnaquesepareloscomponentesde
lamuestra,undetectorquemidaalgunacaractersticadedichoscomponentesconformevan
saliendodelacolumnayunprocesadorqueconviertalasealelectrnicadeldetectorenun
cromatograma.

Lafigura11muestraunesquemadeuncromatgrafodelquidosdealtaresolucintpico;
enseguidaseexplicarbrevementecadaunodeloscomponentes.
Fuent e de helio
regulada

Vlvulad e s alid a
A m o r t ig uad o r d e puls ac io ne s

Vlvulad e d r e naj e

Bomba

Vlvulad e e nt r ad a

Ent rada de j eringa


para cebar

Filt r o
Al det ect or Re g ulad o r d e
Transduct or de
c o nt r apr e s i n
presin
Co lum na
Vlvulad e iny e c c i n

41
Cromatografadefasereversa

Figura11.Diagramaquemuestralaspartesmsimportantesqueintegranuncromatgrafodelquidosde
altaresolucin.

Sistemasparaeltratamientodelosdisolventes

Los recipientes que contienen los solventes amenudo se equipan con un sistema para
eliminarlosgasesdisueltos,comooxgenoynitrgeno,queinterfierenformandoburbujas
enlossistemasdedeteccin.

Undesgasificadorpuedeconsistirenunsistemadebombeoporvaco,dispositivospara
calentaryagitarlosdisolventesosistemasdedifusinquepermitenarrastrarlosgases
disueltosfueradelasolucinmediantefinasburbujasdeungasinertedebajasolubilidad.

Para poderhacerelucionesporgradiente,losequiposdeHPLCmodernoscuentancon
recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relacin de los
disolventesenformaprogramadaymodificarlosvaloresdemaneralinealoexponencial.

Sistemasdebombeo

LasbombasutilizadasenelHPLCsonmuypotentesyprecisas.Elflujodebeserlibrede
pulsacionesyconuncaudalquepuedavariarentre0.1y10ml/min,lapresinpuedeser
hasta de 6000psi (lbs/in2) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosin.
Existentrestiposdebombas:bombasrecprocas,bombasdejeringaybombasdepresin
constanteoneumtica.

Labombasrecprocassonlasmsusadas,el90 % delosequiposdeHPLCmodernos
cuentanconestesistemadebombeo.Eldisolventeesexpulsadodeunacmaraporel
movimientodevaivndeunpistnaccionadoporunmotor.Lasbombasrecprocastienen
ladesventajadequeproducenunflujoconpulsacionesquesemanifiestacomoruidoenla
lneabasedelcromatograma.Entrelasventajasdeestasbombassepuedencitarsupequeo
volumeninterno(35a400l),susaltaspresionesdesalida(porencimadelas10,000psi),
su fcil adaptacin a la elucin con gradiente y sus caudales constantes que son
prcticamente independientes dela contrapresindelacolumna yde laviscosidad del
disolvente.Comounapartemsdelsistemadebombeoesta elrestrictor colocadoala

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Cromatografadefasereversa

salidadelabomba.Cualquierdiferenciaentrelasealyunvalorpreestablecido,seutiliza
paraaumentarodisminuirlavelocidaddelmotordelabomba.

Sistemasdeinyeccindelamuestra

Amenudo,elfactorlimitanteenlaprecisindelasmedidasencromatografadelquidos
porHPLC,eslareproducibilidadconquesepuedeintroducirlamuestraenlacolumna.El
problemaseagravaporelensanchamientodebandaqueacompaaalasobrecargadelas
columnas.Porello,losvolmenesqueseempleanhandesermuypequeos,de20 l
hasta500l.Adems,sehadepoderintroducirlamuestrasindespresurizarelsistema.

Elmtodomsampliamenteutilizadoparalaintroduccindelamuestrautilizadispositivos
enformadebucle,quepuedenintroducirlamuestraapresionesdehasta7000psiconuna
precisinaceptable.

Columnas

Comoseexplicenlaprimerapartedeestetrabajo,laseparacindeloscomponentesdela
muestraseproduceenlacolumna.

LamayoradelascolumnasparaHPLCseconstruyencontubosdeaceroinoxidablede
dimetrointernouniforme.Estaclasedetubosmidenentre10y30cm.Eldimetrointerno
delascolumnasesamenudode4a10mmylostamaosdelaspartculasdelosrellenos
mscomunesson3,5y10m.

Para aumentar la vida de la columna analtica se coloca delante una precolumna que
eliminalamateriaensuspensinyloscontaminantesdelosdisolventes.Lacomposicin
delrellenodelaprecolumnadebesersemejantealdelacolumnaanaltica;sinembargo,
eltamaodelapartculaesporlocomnmayorparaminimizarlacadadepresin.

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Cromatografadefasereversa

Tiposderellenodelacolumna

Elrellenopuedeserdedostiposdepartculasporosasopediculares.Elltimoconsisteen
bolasdevidrioodepolmero,noporosasyesfricasconunosdimetroscaractersticosde
30a40 m.Enlasuperficiedeestasbolassedepositaunacapadelgadadeslice.El
rellenopedicularseutilizaampliamenteenprecolumnasynoparacolumnasanalticas.

LosrellenosdepartculasporosasparaHPLCestnformadospormicropartculasporosas
con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao
determinado. La slice es el material ms comnmente empleado para este tipo de
columnas,debidoaquesepuedenproducirpartculascondimetrosmuyuniformes.

Termostatos

Enmuchasaplicacionesnosenecesitauncontrolestrictodelatemperaturaylascolumnas
trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, si se controla la temperatura de las
columnasseobtienenmejorescromatogramas.Lamayoradelosaparatosllevahornosque
controlan la temperatura en las columnas. Otra forma de controlar con precisin la
temperaturaescolocandolascolumnasencamisasconaguaqueprovengadeunbaode
temperaturaconstante.

Detectores

LosdetectoresencromatografadelquidoscomoHPLCsondedostiposbsicos.Los
detectoresbasadosenunapropiedaddelafasemvilquerespondenacambiosenelndice
derefraccin,laconstantedielctricaoladensidad,lascualessemodificanporlapresencia
delosanalitos.Porcontraste,losdetectoresbasadosenunapropiedaddelsolutoresponden
aalgunadelaspropiedadesdelamuestracomoeslaabsorcinenUV,fluorescencia,
actividadptica,etc.Algunosdeestosdetectoressedescribenacontinuacin.

Detectoresdeabsorbancia

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Cromatografadefasereversa

Sonlosdetectoresmsempleadosyaquetantolasprotenascomoloscidosnucleicos
absorbenluzdeestaregin.Laslongitudesdeondatpicamentemonitoreadasson:
210220 nm: corresponde a la absorcin de la unin peptdica. Se usa
principalmenteparamonitorearpptidosquecarecendeaminocidosaromticos.
228nmparaHis
240nmparaCys
254nmparaPhe
250260nmparamediroligonucletidos
280nmparaTrpyTyr

Losdetectoresdeabsorbanciaultravioletamssimplessonlosfotmetrosdefiltroscon
unalmparademercuriocomofuente.Ladesventajaquepresentanestosaparatosesqueel
efluentenosepuedemonitorearavariaslongitudesdeondaalmismotiempo.
Afindereducirelensanchamientodebanda,elvolumendeunacubetadeflujo(enforma
deZ)paramedirabsorbanciahadeserlomenorposible.Laslongitudesdelacubetavan
de2a10mm(Figura12)demodoquelosvolmenesselimitanporlocomnde1a10
l.Ademslapresinnodebesermayordeunos600psi.puesexisteelriesgoderomperla
cubetadeldetector.
De la columna

Vent anas de
cuarzo

Fuent e UV Det ect or

Al desecho

Figura12.Esquemadelacubetadeundetectordeabsorbancia.

Detectoresdearreglosdediodos

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Cromatografadefasereversa

Estetipodeinstrumentospermitenhacerbarridosadistintaslongitudesdeondadecada
uno de los componentes separados. De esta manera, se generan una coleccin de
cromatogramasadiferenteslongitudesdeondadecadapico.

Mediantelosarreglosdediodossepuededeterminarlamejorlongituddeondaalaque
debemonitorearseelcompuestodeinters.

Detectoresdefluorescencia

LosdetectoresdefluorescenciaparaHPLCsonsemejantesendiseoalosfluormetrosy
espectrofluormetros.Lafluorescenciasedetectapormediodeundetectorfotoelctrico
colocadoperpendicularmenterespectoalhazdeexcitacin.Unaventajadelosdetectores
deflorescenciaessualtasensibilidad,unastresrdenesdemagnitudmayoralaobtenida
pormtodosdeabsorbancia.
Detectoresdeinfrarrojo

Una de las mayores limitaciones del uso de detectores de infrarrojo se debe a la


interferenciageneradaporlosdisolventesqueseutilizan.Porejemplo,lasbandasanchasde
absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el uso de este
detectorparamuchasaplicaciones.

Detectoresdendicederefraccin

Son considerados detectores universales,pues elndice de refraccines una propiedad


fsicadetodosloscompuestos.Midenlasvariacionesenelndicederefraccindelafase
mvilcuandohaydiferentessolutospresentes.

Estosdetectorestienenladesventajadenosertansensiblescomolamayoradelosotros
detectores, por ejemplo, son dos a tres veces menos sensible que un detector de
absorbancia. Adems son muy inestables a los cambios de temperatura por lo que se
requiereunestrictocontroldesta.

Detectordedispersindeluz(ELSD)

El efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una nube


medianteunflujodenitrgenooaire.Lasgotitasviajanatravsdeuntubodeconduccin

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Cromatografadefasereversa

atemperaturacontroladadondetienelugarlaevaporacindelafasemvil,loqueorigina
unasfinaspartculasdelcompuestoproblema.Lanubedepartculasdeanalitopasaatravs
deunhazdelserymedianteunfotodiododesiliciosedetectalaradiacindispersada
perpendicularmentealflujo.

Unadelasmayoresventajasdeestetipodedetectoresquepuedeemplearsepara casi
todoslossolutosnovoltilesyesmssensiblequeeldetectordendicederefraccin.

Detectoresdeespectrometrademasas

Laespectrometrademasaseselmtododedeteccinmsrecienteycadavezsegeneraliza
mssuuso.
Lamuestraalsalirdelacolumnaesionizada.Luegolosionesseseparandeacuerdoasu
relacincarga/masa.

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Cromatografadefasereversa

PROVEEDORES

Acontinuacinsepresentanlosnombresydireccioneselectrnicasdelosproveedoresms
importantesdecolumnasyequiposcromatogrficos.

Compaa Pginadeinternet
ABI http://www.appliedbiosystems.com/
Alltech http://www.alltechweb.com/
Beckman http://www.beckman.com/
BioRad http://www.biorad.com/
Merck http://chrombook.merck.de/chrombook/index.jsp?j=1
J&WScientific http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/jandw.htm
J.T.Baker http://www.jtbaker.com/chromatography/
PerkinElmer http://las.perkinelmer.com/
VWR http://www.chromatography.co.uk/products/Default.htm
Waters http://www.waters.com/
Whatman http://www.whatman.com/

Otraspginasdeinternetdeinters

http://www.rpi.edu/dept/chemeng/BiotechEnviron/IONEX/be_index.htm

http://www.separationsnow.com/basehtml/SepH/1,1353,30000home00,00.html

http://ntri.tamuk.edu/fplc/rev.html

http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm

http://www.nestgrp.com/protocols/vydac/rpcbuffernote.shtml

http://www.biocompare.com/jump/2105/ReversePhaseChromatography.html

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Cromatografadefasereversa

COMENTARIOS

Sin duda, la cromatografa de fase reversa se ha convertido en una herramienta


indispensable en la investigacin biotecnolgica. Esta tcnica de separacin debe su
crecimiento a su rapidez, simplicidad, relativo bajo costo y versatilidad. Justamente la
adaptabilidad de la cromatografa de fase reversa permiti el surgimiento de la
cromatografaporsupresininicaylasecuencialqueserevisaronenelpresentetrabajo.
Tambinseprocurdarunavisindelasaplicacionesdelacromatografaenfasereversa
enelreadelabiotecnologayalgunosaspectosaconsideraralmomentodedesarrollar
unaseparacindefasereversa.

Con seguridad se seguirn implementando modificaciones de la tcnica que permitan


expandir an ms su uso. Ahora la tendencia es el empleo de columnas capilares que
mejorenlaresolucindelosanlisisascomoelacoplamientoadetectoresmssensibles
quegenerenmayorinformacindelcompuestoenestudiocomolosarreglosdediodosy
losespectrmetrosdemasas.

BIBLIOGRAFA

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WileyandSons,Canada,1973.
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ChromatographicScienceSeries,MarcelDekkerInc.,USA,1990.
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Cromatografadefasereversa

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