BIO303 Rdig par Chringel

Les Milieux de Culture en

Bactriologie

Les Milieux de Culture

Glose au Ctrimide - milieu slectif
Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : peptone
Glucide et drivs : /
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : ctrimide (antiseptique), acide nalidixique
Divers : /
Indicateurs de pH : /
Ions minraux : chlorure de magnsium MgCl 2, sulfate de potassium K2PO4,
hydrognophosphate de potassium
Agar : oui
Eau : oui

Caractristiques
Milieu proche du King A, favorise la production de pyocyanide.
Milieu relativement pauvre.
Acide nalixidique : inhibiteur des Gram
Ctrimide : inhibiteur des Grams + donc des Gram par extension.
Ensemencement en cadran.

Usage
Recherche des Pseudomonas, notamment Pseudomonas earuginosa.

Lecture
Incubation 24h 37C :
Dveloppement Pseudomonas aeruginosa et ventuellement Pseudomonas putida,
Pseudomonas stutzeri et Pseudomonas maltophilia.
Incubation 24h 42C :
Dveloppement presque exclusif de Pseudomonas aeruginosa.
Pyocyanine : milieu bleu
Pyoverdine : milieu jaune-vert indicateur de la prsence de Pseudomonas

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Glose de Chapman milieu slectif

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : Peptones, extrait de viande
Glucides et drivs : /
Autres molcules carbones : mannitol
Indicateur S2- : /
Inhibiteurs : NaCl 75g/L
Divers : /
Indicateurs de pH : rouge de phnol
Ions minraux : NaCl
Agar : oui
Eau : oui

Caractristiques
Permet la croissance des bactries halophiles.
Trs forte concentration en NaCl permettant linhibition des Gram-
Permet ltude de lattaque du mannitol (si baisse du pH, alors teinte jaune)
Ensemencer richement en stries ou cadran.
Incubation : 24-48h

Usage
Isolement de Staphylococcus aureus.
Numration des staphylocoques.

Lecture
Si Staphylococcus aureus : colonie jaunes avec halo clair. Mannitol +
Les autres colonies sont Mannitol -.
Contamination possible par Enterococcus et certains Bacillus.

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Drigalski milieu slectif

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : Peptones, extraits de viande et levure
Glucide et drivs : Lactose
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : Cristal violet, Dsoxycholate de sodium
Divers : /
Indicateurs de pH : Bleu de Bromothymol
Ions minraux : Thiosulfate de sodium
Agar : oui
Eau : oui

Caractristiques
Cristal violet : inhibe les bactries Gram +
Dsoxycholate de sodium : inhibe les bactries Gram +
Slectionne les bactries Gram
Inoculation en cadran.

Usage
Isolement des entrobactries.

Lecture
Bactries lactose + : colonies jaunes (utilisation du lactose)
Bactries lactose - : colonies bleu-vert

Lexique
Mannitol : utilis pour tudier sa voie dattaque par les bactries (fermentation).
Bleu de Bromothymol : vert (basique) et jaune (acide)
Entrobactries : bactries se trouvant dans les cavits internes des tres vivants comme
lappareil digestif.
Rouge de phnol : rouge (basique) jaune (acide)

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Hektoen milieu slectif

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : Peptones, extraits de levure
Glucide et drivs : salicine, lactose, saccharose
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : citrate de fer
Inhibiteurs : sels biliaires
Divers : /
Indicateurs de pH : Bleu de bromothymol, fuschine acide
Ions minraux : Thiosulfate de sodium, NaCl
Agar : oui
Eau : oui

Caractristiques
Sels biliaires : limitent le dveloppement des Gram +
Fuschine : vire au rose sil y a production daldhyde.
Favorise Salmonelle et Shigella du fait des peptones.
Mise en vidence de la production dH2S

Usage
Isolement des entrobactries pathognes : principalement pour vrifier la prsence de
Shigella et Salmonella.

Lecture
Aspect des colonies :

Attaque Production
H2S
glucide aldhyde
Saumon - + +
Saumon et
+ + +
centre noir
Bleu-vert - - -
Bleu-vert
et centre + - -
noir
Interprtation :
o Saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Yersinia.
o Saumon et centre noir : Proteus vulgaris.
o Bleu-vert : suspicion de Shigella ou Salmonella.
o Bleu-vert et centre noir : suspicion de Salmonella.

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Hugh et Leifson milieu diffrentiel

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : peptones, extrait de levures
Glucide et drivs : glucose
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : bleu de bromothymol
Ions minraux : NaCl, K2HPO4
Agar : oui
Eau : oui

Usage
Dtermination de la voie dattaque des Glucides, utiliss comme principale source
dnergie par les bactries.
Lutilisation du glucose acidifie le milieu, le BBT va alors virer au jaune.

Technique
Rgnrer les 2 tubes : cration gradient doxygne.
Les ramener 45C.
Ajouter aseptiquement quelques gouttes dune solution de glucose strile.
Concentration finale dans le tube environ 10g/L.
Agiter le tout pour rpartir le glucose dans tout le tube.
Solidifier les deux tubes en les plongeant dans leau froide.
Ensemencer chaque tube par piqre centrale avec la pipette Pasteur.
Recouvrir lun des deux tubes de paraffine ou vaseline strile.
Incubation 24h 37C.
Tube recouvert = tube ferm
Tube non recouvert = tube ouvert
NE PAS REVISSER A FOND LES BOUCHONS.

Lecture
Il peut y avoir formation de gaz par les bactries.

Rsultats aprs
Interprtation
cultures 24h 37C
Le glucose est
dgrad en
arobiose et en
anarobiose :
bactrie
fermentative du
glucose.

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Le glucose est
dgrad en
anarobiose
uniquement :
bactrie
fermentative du
glucose.

Utilisation du
glucose
uniquement en
arobiose :
bactrie
oxydative.

La bactrie
nutilise pas le
glucose : elle est
inerte vis--vis du
glucose.

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King A et King B milieu diffrentiel

Composition King A
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : peptone
Glucide et drivs : glycrol
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : /
Ions minraux : MgCl2 (chlorure de magnsium), K2SO4 (sulfate de potasssium)
Agar : oui
Eau : oui

Composition King B
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : polypeptone
Glucide et drivs : glycrol
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : /
Ions minraux : MgSO4 (sulfate de magnsium), K2HPO4 (hydrognophosphate de
potassium)
Agar : oui
Eau : oui

Caractristiques
La glose est incline dans un tube.
Ensemencement en stries.
Le chlorure de magnsium et le sulfate de potassium favorisent la production de
pyocyanine.
Le sulfate de magnsium et le phosphate bipotassique favorisent la production de
pyoverdine.
King A : recherche de production de pyocyanine.
King B : recherche de production de pyoverdine.

Usage
Identification des Pseudomonas par la prsence de pyocyanine ou de pyoverdine.

Technique
Inoculer un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie mdiane la
surface de la glose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une glose.
Replacer la capsule sur chaque tube sans la reviser.

Lecture
Aspect aprs 24h minimum 30C :
o King A : culture colore en bleu-vert (pyocyanine +) et parfois en brun-rose
(pyoverdine +).

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En cas de doute, prlever leau de condensation la pipette Paster et verser

0,5mL de chloroforme sur la pente du milieu. Laisser 5 10min en position
incline. La pyocyanine colore le chloroforme en bleu.
o King B : culture colore en vert fluorescent (pyoverdine +).
Interprtation :
o Pyocyanine + : prsence de Pseudomonas aeruginosa.
o Pyoverdine + : prsence de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens
et Pseudomonas putida.

Glose de Mac Conkey milieu slectif

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : peptone
Glucide et drivs : lactose
Autres molcules carbones : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : Cristal violet, sels biliaires
Divers : /
Indicateurs de pH : Rouge neutre
Ions minraux : NaCl
Agar : oui
Eau : non

Caractristiques
Sels biliaires : inhibiteur des Gram +
Cristal violet : inhibiteur des Gram +
Si la bactrie fermente le lactose, le milieu devient rouge du fait de lacidification du
milieu.
Ensemencement en cadrans.
Incubation 18 24h 37C

Usage
Dtermine si la bactrie fermente le lactose ou pas.
Utilis pour Shigella et Salmonella.

Lecture
Lactose + : colonies rouges entoures dun halo opaque de la mme couleur d la
prcipitation des sels biliaires.
Lactose - : colonies jaunes ou incolores.

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Mannitol - Mobilit - Nitrate milieu diffrentiel

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : peptones trypsiques de viande
Glucide et drivs : /
Autres molcules carbones : mannitol
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : rouge de phnol
Ions minraux : KNO3
Agar : oui
Eau : oui

Caractristiques
Utilisable uniquement pour les bactries fermentives.
Ensemencement par piqre centrale au fil droit par pipette Pasteur.
Ne pas oublier de rgnrer le milieu et de le laisser refroidir.

Usage
Recherche de la dgradation du mannitol
Recherche de la mobilit de la bactrie.
Recherche de mobilit par prsence dune Nitrate rductase.

Lecture
Aspect aprs 24h
Interprtation
37C

Mannitol -
Mobilit -

Mannitol -
Mobilit +

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Mannitol +
Mobilit -

Mannitol +
Mobilit +

Dgradation des Nitrates :

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Ure Indole milieu synthtique

Composition
Mlanges dacides amins, facteurs de croissance : /
Glucide et drivs :
Autres molcules carbones : L-triptophane (noyau indole), thanol
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : rouge de phnol
Ions minraux : NaCl, K2HPO4 hydrognophosphate de potassium, KH2PO4
dihydrognophosphate de potassium
Agar : /
Eau : eau distille

Caractristiques
Il ny a pas de source de carbone : les bactries ne se multiplient pas. Il faut donc
lensemencer abondamment.
Absence de peptones : alcalinisation du milieu due lhydrolyse de lure.
Milieu complexe synthtique.
Fournit un ensemble de donnes permettant lidentification des entrobactries et
autres bactries.

Usage
Permet la recherche de 3 activits enzymatiques :
o Lurase
o La tryptophane dsaminase (TDA)
o La production dindole grce une tryptophanase.

Technique

Recherche dune Urase

Ensemencement riche partir de cultures solides.
Aspect aprs 24h 37C :

Interprtation :
Toutes les bactries hydrolysent lure : O=C(NH2)2 + H2O H2N-COOH + NH3
Seules les bactries ayant une urase trs active arrivent : H2N-COOH CO2 + NH3
Le CO2 et le NH3 se combinent pour former du carbonate dammonium : CO2 + NH3
2NH4+ + CO32-.

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Le carbonate dammonium est trs alcalin : la recherche de lurase constituera tester

lalcalinisation du milieu.
o Urase constitutive : urase + trs rapidement, 10min pour Proteus et Yersinia.
o Urase induite : urase + en plusieurs heures, pour Klebsiella.

Recherche dune Tryptophane Dsaminase (TDA)

Ensemencement :
o Classique : ensemencer richement le milieu ure-indole partir de culture en
milieu solide et incuber 24h 37C.
o Rapide : faire une suspension dense dans 10 gouttes de milieu ure-indole.
Agiter 10min lagitateur de Kahn.
Aspect aprs 24h 37C :

Interprtation :
En prsence de TDA, le tryptophane donne de lacide -indole peruvique. Ce dernier, en
prsence de perchlorure de fer donne une coloration brune.
o TDA + : coloration brune. Proteus, Providencia, Morganella
o TDA - : coloration jaune-orange.

Recherche de la Production dIndole

Ensemencement :
Ensemencer richement le milieu ure-indole partir de culture en milieu solide et
incuber 24h 37C.
Aspect aprs 24h 37C :

Interprtation :
Grce une tryptophanase, les bactries peuvent dgrader le tryptophane en indole,
acide pyruvique et NH3.
o Indole + : anneau rouge
o Indole - : anneau brnatre.

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