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Identificationdosagedescannabinodesdanslesangtotal

Identificationandquantificationofcannabinoidsinwholeblood

P.KINTZ*(1),V.CIRIMELE(1),G.PEPIN(2),P.MARQUET(3),M.DEVEAUX(4),PMURA(5)

TOXICORAMA1996,n2

(1)InstitutdeMdecineLgale,STRASBOURG
(2)Laboratoired'expertisesToxlab,PARIS
(3)ServicedePharmacologieetToxicologie,CHRUDupuytren,LIMOGES
(4)InstitutdeMdecineLgale,LILLE
(5)LaboratoiredeBiochimieetToxicologie,CHUPOITIERS

*Auteurquiadresserlacorrespondance:P.KINTZ
InstitutdeMdecineLgale11,rueHumann67000STRASBOURG

RSUM

Cet article prsente une mthode de chromatographie gazeuse couple la spectromtrie de masse pour
l'identification et la quantification du delta9THC et de son mtabolite principal l'acide 11nor delta 9 THC
COOHdanslesangtotal,2mldesangsontextraitsdansuneverreriepralablementsilanise,parlemlange
hexaneactate d'thyle (9: 1, v/v) en milieu acide (acide actique 10 %) en prsence de standards internes
deutrs.Aprsvaporation,l'extraitestmthyl,puisinjectdansunecolonnecapillaireHP5MS.Lesionsm/z
285,313et328sontutilisspourl'identificationetlaquantificationduTHCetlesionsm/z313,357et372pour
cellesduTHCCOOH.Leslimitesdequantificationsontrespectivementde1.0et0,5ng/mlpourleTHCetleTHC
COOH.

Motscls:Cannabis,dosage,sang,GC/MS.

SUMMARY

Amethodforcannabistestinginhumanwholebloodispresented.Theprocdureinvolvesacidextractionof2
mlspecimeninasilanizedvialinpresenceofdeuteratedinternalstandardsintohexaneethylacetate.Limitof
quantificationis1.0and0.5ng/mlforTHCandTHCCOOH,respectively

Keywords:Cannabis,assayblood,GC/MS

Introduction

Le delta 9ttrahydrocannabinol (THC) est le principe psychoactif extrait des plants femelles de Cannabis
sativa.Hormisl'alcooletletabac,c'estladroguelapluslargementconsommeaumonde.Troisformessont
disponiblessurlemarchavecdesconcentrationsenTHCtrsvariables:l'herbe(0,210%),larsine(520%)
etl'huile(4080%).LeTHCn'estpasunalcalode,puisquelamolculenecontientpasd'atomed'azote.Dans
lecadredesrflexionssurladpnalisation,leseffetspharmacologiquesduTHCsontlargementdiscuts,mais
ilsemblequ'uneseulecigarettesoitcapabledemodifierlavigilanced'unsujetpendant24heures(1).Lavoie
principaledemtabolisationestlaformationdedrivshydroxylspolaires,commele11OHTHCoul'acide
11nordelta9THCcarboxylique (THCCOOH), la plupart des mtabolites urinaires sont sous forme
glucuronoconjugue(6080%).Aucontraire,danslesang,lesformescirculantessontessentiellementlibres.
Danscesconditions,ilneserapasncessaired'hydrolyserleschantillonsplasmatiquesousanguins.

Plusieurstudes,tantenFrance(2)qu'l'tranger(3)ontmontrlaprvalenceduTHCchezlesconducteurs
impliqusdansdesaccidentsdelaroute.AfinderpondreauxproccupationsdesForcesdel'Ordreetdela
Justice, le laboratoire de Toxicologie Strasbourg a dvelopp une procdure analytique permettant
l'identification et le dosage simultan dans le sang total ( partir des chantillons pour la dtermination de
l'alcoolmie)duTHC,duTHCCOOHetdu11OHTHC.

Matrieletmthode

Ractifs
L'hexane,letolune,I'isooctane,lemthanoletl'actated'thylesontdequalitHPLC.Touslesautresractifs
sontdequalitpouranalyse.LeTHC,leTHCd3,leTHCCOOHetleTHCCOOHd3onttobtenusauprsdela
socit Promochem (Molsheim, France). Le 11OHTHC a t achet chez Sigma. La solution d'hydroxyde de
ttramthylammonium (TMAH, Fluka 87741) est prpare par solubilisation de 2,49 g de la forme
pentahydratedans5mld'eau.

Silanisationdelaverrerie:Afind'viterl'absorptiondescannabinodessurlaverrerie,ilconvientdemasquer
lessitesactifsparsilanisation.Prparerunesolutiondedimthyldichlorosilane(SigmaD3879)5%dansdu
tolune.Danslesflaconsextractionoudrivation,introduire13ml(selonlataille)decettesolution.Agiter
pendant10min.Rincerensquencepar5mldetolune,puismthanol,toluneetenfinmthanol.Scher20
min.80C.

Extraction:Dans un tube extraction pralablement silanis, ajouter successivement 2 ml de sang, 20 ng de


THCd3 et THCCOOHd3, 0,2 ml d'acide actique 10 % et 5 ml d'hexaneactate d'thyle (9: 1, v/v). Aprs
agitationpendant10mnetcentrifugation,laphaseorganiqueestrecueilliedansuntubesilanisetvapore
sec. Les cannabinodes sont alors drivs par mthylation. L'extrait sec est repris par 200 I du mlange:
solution de TMAH dimethylsulfoxide (DMSO) (1: 20, v/v) prpar extemporanment, pendant 2 mn
temprature ambiante. 50 I d'iodure de mthyle sont alors ajouts, et incubs 15 mn temprature
ambiante,Laractionestarrteparajoutde200IHCl0,1Npuislescannabinodessontextraitsdans1ml
d'isooctane.Aprsagitationetcentrifugation,laphaseorganiqueestvaporesec.L'extraitestreprispar25
Id'isooctaneet2linjectsdanslacolonne.

Instrumentation: Le systme de chromatographie consiste en un injecteur automatique HP 6890, un


chromatographeenphasegazeuseHP5890etundtecteurdemasseHP5972.Lacolonnecapillaire,detype
HP5MS(30mx0,25mm)esttraversepardel'hliumultrapur(N55)dbitcontrlde1ml/min.,avecune
rampedetempratureallantde60C(1min.)295C(5min)par30C/min.L'injecteur,enmodesplitlessest
chauff270C.L'acquisitiondesdonnessefaitenmodeSingleIonMonitoringsurlesionsqualifiantsdes3
compossetdesstandardsdeutrs(tableau1).

RsuItats

L'ensembledesparamtresdevalidationestprsentdansletableau11.LalimitedequantificationduTHC1
ng/mlsembleraisonnableetsuffisantecomptetenudestudesantrieures.Laquantificationsimultanedu
THCetduTHCCOOHpermetd'accrotrelaspcificitdelamthode.Enoutre,leratioTHCCOOH/THCpermet
d'approcher le moment de la dernire exposition, selon l'quation Log T (en heures) = (0,576 x log THC
COOH/THC))0,176(4).

Larptabilitdelamthodeatvalueenanalysant8chantillonssurchargs5ng/mlenTHCetTHC
COOH.Lecoefficientdevariationestde8,9%pourleTHCetde6,3%pourleTHCCOOH.

Tableaul:Tempsdertentionetionsqualifiants

Composs Tempsdertention(mn) ions(m/z)


THC 9.39 285,313,328
THCd3 9,38 316,331
11OHTHC 10,11 313,314,358
THCCOOH 10,71 313,357,372
THCCOOHd3 10,70 316,360,375

Lesionssoulignssontutilisspourlaquantification

TableauIl:Paramtresdevalidation

Composs linarit(ng/ml) coefficientdecorrlation limitededtection(ng/ml) %d'extraction


THC 120 0,998 0.4 93.1
THCCOOH 0.540 0.999 0.2 91.4

Rfrences:

(1)V.LeirerJ.Yesavage,D.Morrow
Marijuanacarryovereffectsonaircraffpilotpeformance.
Aviat.SpaceandEnviron.Med.,199,62,221.

(2)J.M.Schermann.
Evaluationdurisqued'accidentdelacirculationlil'absorptiondedroguesillicites.ConventionDirectionde
lascuritroutire.
Rapportfinal.23dcembre1992.

(3)J.Garriott,V.DiMaio,R.Rodriguez.
Detectionofcannabinoidsinhomicidevictimeandmotorvehiclefatalities.
J.ForensicSci.,1986,31,1274.

(4)M.Huestis,J.Henningfield,E.Cone.
Bloodcannabinoids.II.Modelsforthepredictionoftimeofmarijuanaexposurefromplasmaconcentrations
ofTHCandTHCCOOH.
J.Anal.Toxicol.,199216,283.

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