Tesis203 PDF

VALIDACIN DEL MTODO DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN
AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT
AUTORES:
ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA
AURA MARA LOZANO CAICEDO
TRABBAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C. DICIEMBRE DE 2008
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia
AUTORES
APROBADO
DRA. JEINNY ROMERO TORRES DRA. JANETH ARIAS PALACIOS

Microbiloga Industrial Bacteriloga MSc
DIRECTOR ASESOR
___________________________ __________________________
CINDY MARLENE FERNANDEZ ZULMA VALBUENA
Microbiologa industrial Bacteriologa
JURADO JURADO
AUTORES:
APROBADO
INGRID SCHULER JANETH ARIAS

Biloga, Ph D. Bacteriloga, Msc.
DECANA ACADEMICA DIRECTORA CARRERAS
MICROBIOLOGIA
DEDICATORIA
A Dios, porque nunca nos abandono en el largo andar de nuestro aprendizaje, porque
cuando mas necesitamos de su ayuda, el estuvo all, sostenindonos entre sus brazos
para que no nos doliera el caminar en los momentos difciles.
A nuestras familias porque gracias a su eterno amor para cada una de nosotras, llenaron
nuestros corazones de fortaleza para que este largo andar, se hiciera mas corto y
placentero; por su apoyo incondicional sin importar las circunstancias, porque pece a
todos los momentos vividos, siempre estn presentes para brindarnos el amor que
reconforta nuestro ser.
Aura y Marcela
A mi padre que esta en el cielo porque mientras estuvo a mi lado fue un ejemplo de
sabidura y superacin, un apoyo incondicional, un padre lleno de esperanza y amor
para conmigo y porque ahora que esta en el cielo se que desde all ilumina todos mis
caminos, ayudndome a seguir siempre por el mejor y porque se que este donde este
siempre velara mis sueos.
Aura M
AGRADECIMIENTOS
A Dios por acompaarnos siempre y por estar a nuestro lado en los buenos y malos momentos.
A la Dra. Janeth Arias, asesora, por su entrega, compromiso, comprensin y apoyo

incondicional.
Al Dr. Juan Carlos Jimnez, Director Administrativo de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.,

por brindarnos la oportunidad de compartir en su empresa los conocimientos adquiridos y por
el prstamo de las instalaciones y recursos econmicos para llevar a cabo este trabajo de
grado.
A la Dra. Jeinny Romero, nuestra directora por aceptar guiarnos en la realizacin de este
trabajo, por llenarse de paciencia, por transmitirnos su conocimiento y experiencia, por ser mas
que una amiga, por su colaboracin y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.
A INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., especialmente al rea de microbiologa, a Diana,

Consuelo y Zamaira por su colaboracin y apoyo.
RESUMEN
La validacin realizada en este trabajo de grado tuvo como propsito utilizar el agar Chromocult,
como mtodo alternativo en la deteccin de microorganismos indicadores de la calidad del agua
potable, gracias a su fcil manejo y rpida recuperacin para reducir costos y desarrollar
procedimientos con mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA
Ltda, basados en la USP 31, realizando un anlisis que garantice resultados confiables y la
disminucin de los riesgos de reanlisis que aumentan el tiempo de anlisis y los costos.
Se realiz una revisin y recopilacin bibliogrfica, para obtener toda la informacin necesaria y se
verific que el programa de calibracin y mantenimiento de los equipos, estuviera vigente, para de
esta manera poder garantizar el procedimiento realizado y los resultados obtenidos. Luego se
realizaron pruebas preliminares en donde se llevo a cabo la estandarizacin de los inculos,
realizando diluciones de un cultivo de 24 horas y comparando con el tubo 1 de la escala de Mac
farland para E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048, posteriormente se estandariz la tcnica filtracin por membrana con tres muestras
de tres replicas cada una y despus de obtener los resultados esperados (30 UFC\ml
aproximadamente) se realiz la metodologa para la validacin de la tcnica filtracin por membrana,
analizando diez muestras de agua potable diferentes, con tres replicas para cada una, mediante
las cuales se realizaron recuentos de cada uno de los microorganismos con los cuales fueron
contaminadas las muestras de agua, bajo condiciones alternadas, variando los analistas y los das
de anlisis; se llevo acabo el anlisis de una prueba estndar (agua estril para inyeccin, inoculada
con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella
typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), una solucin de prueba (agua
potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739,
Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), un control negativo
(agua potable con tiosulfato de sodio al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de
agua con los microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella
typhimurium ATCC 14028; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes
ATCC: 13048; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
) de esta manera se obtuvieron, 30 recuentos por da para un total de 300 recuentos por analista,
por lo tanto se obtuvieron 600 datos en total, por los dos analistas, luego de obtener todos los datos,
se procedi a realizar el anlisis y se determinaron los parmetros cuantitativos para la validacin
del mtodo.
La metodologa se llevo a cabo con muestras de agua potable, provenientes del acueducto de
Bogot que cumplen con las especificaciones descritas segn la resolucin 2115 de 2007
Finalmente se logro concluir que el mtodo es reproducible y repetible, tambin se logro establecer
que el mtodo es especifico para la demostracin de coliformes Fecales, debido a que para este
grupo de microorganismos indicadores se logro obtener un porcentaje de recuperacin superior al
96%, comparado con los otros microorganismos.
ABSTRACT
The corroboration undertook in this examination paper pretended to utilize the agar chromocult
as an alternative method in the detection of indicating micro-organisms of drinking waters
quality thanks to its handling capability and short period ability to recuperate in order to reduce
costs and to develop more efficient and safer procedures at INTHERPHARM DE COLOMBIA
Ltda. laboratories, based on the USP 31, and developing the montage which warranties reliable
results and a decrease in repetition risks which generate an increase in analysis time and costs.
As a start up, a bibliographic revision and compilation took place in order to obtain the required
amount of information. The tune-up and maintenance of the equipment was also verified aiming
to warranty the undertook procedure and the obtained results. Then, some preliminary testing
were developed for the standardization of the inocules, also effecting dilutions of a 24 hours
crop with Pipe 1 of Mac Falrlands scale for E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC:
14028, Enterobacter aerogenes ATCC: 13048. Later, the set up of the membrane filtration
technique was standardised analyzing ten different samples of drink water with three replicas
for each one in which it was determined the keeping of the contaminating micro-organisms in
the membrane filters with a pore size of 0.45um under alternated conditions, with variation of
annalists and days; it also took place the analysis of and standard test (sterilized water,
inoculated with each of the micro-organisms to be evacuated Escherchia coli, Salmonella
typhimurium y Enterobacter aerogenes), a test solution (drinking water inoculated with the
micro-organisms used for the test Escherchia coli, Salmonella typhimurium y Enterobacter
aerogenes ), a negative control (Drinking water with 1% thiosulfate without inoculation) and a
test combining the sample water with the micro-organisms to be examined (drinking water +
Escherchia coli + Salmonella typhimurium; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter
aerogenes; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter aerogenes ) in which way 30
recounts were obtained for an aggregated amount of 310 recounts per analyst, amounting to a
total data of 620, between the two analysts. After obtaining all the data, the next step consisted
in determining the quantitative parameters for the validation of the method.
The methodology was undertaken with drinking water samples taken from Bogotas water
purification plant which follow the specifications prescribed by Resolution 2115/07. Finally, it
was possible to conclude that the utilized method is reproducible and repeatable; in addition, it
was ascertained that the method is specific for the demonstration of fecal coliforms, ought to the
fact that for this group of indicating micro-organisms it was possible to obtain a recuperation
percentage superior to 96%, compared with other micro-organisms.
TABLA DE CONTENIDO
PAG.
1. INTRODUCCIN..1
2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA..2
2.1. AGUA POTABLE.2
2.1.1 Caractersticas del agua potable..3
2.1.2. Anlisis microbiolgico del agua..3
2.1.3. Proceso de potabilizacin del agua.4
2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable4
2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA.5
2.2.1. Coliformes Totales..5
2.2.1.1. Enterobacter aerogenes..6
2.2.2. Coliformes Fecales....7
2.2.2.1. Escherichia coli..8
2.2.3. Salmonella spp9
2.3. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES10
2.3.1. Filtros de membrana..11
2.3.2. Tipos de filtros de membrana...12
2.3.2.1. Filtros de profundidad..12
2.3.2.2. Filtros de superficie o membrana..12
2.3.2.2.1. Membrana de nitrato de celulosa..13
2.3.2.2.2. Membrana de acetato de celulosa...13
2.4. MEDIOS DE CULTIVO.14
2.4.1. Medios cromgenos.15
2.4.1.1. Medio Chromocult para Coliformes..15
2.4.1.2. Ventajas de los medios cromgenos frente a los
convencionales...16
2.5. VALIDACIN..16
2.5.1. Parmetros de desempeo de la validacin ..............17
2.5.1.1. Especificidad.17
2.5.1.2. Eexactitud 18
2.5.1.3. Precisin ......18
2.5.2 Datos requeridos para la validacin....18
I
2.6. VALIDACIN Y SELECCIN DE MTODOS DE ENSAYO
MICROBIOLGICO.19
2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o
Ausencia de microorganismos.20
2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos..20
2.6.3 Mtodos normalizados..21
2.6.4. Mtodos desarrollados por el laboratorio..21
2.6.5. Mtodos normalizados con modificaciones..21
2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIN21
2.7.1. Monitoreo ambiental.21
2.7.2. Escala de Mc Farland..24
2.7.3. Medios de cultivo..24
2.7.3.1. Esterilizacin del medio de cultivo24
2.7.3.2. Incubacin25
2.7.3.3. Control de autoclave..25
2.7.4. Documentacin.26
2.7.5. Desarrollo del protocolo de validacin..26
2.7.6. Informe Final de Validacin27
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN..28
3.1. FORMULACIN DEL PROBLEMA....28
3.2. JUSTIFICACIN DEL PROBLEMA...28
4. OBJETIVOS..29
4.1 OBJETIVO GENERAL...29
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS.29
5. MATERIALES Y MTODOS.30
5.1 DISEO EXPERIMENTAL.....30
5.2. POBLACIN DE ESTUDIO Y MUESTRA POBLACION DE ESTUDIO..30
5.3. VARIABLES DE ESTUDIO..31
5.4. PRUEBAS PRELIMINARES32
5.4.1. Recopilacin de la informacin...32
5.4.2. Calibracin y mantenimiento de equipos..32
5.4.3. Preparacin del inoculo32
5.4.4. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo ..33
5.4.5. Prueba de promocin de crecimiento33
5.5. MATERIALES Y METODOS EN LA EVALUACION DE PARAMETROS
CUANTITATIVOS...34
5.5.1. Materiales..34
5.5.2. Microorganismos Estndar.35
5.5.3. Mtodos.35
5.5.3.1. Control de ambiente, superficie y operarios.....35
II
5.5.3.2. Control negativo-muestra..36
5.5.3.3. Prueba Estndar37
5.5.3.4. Solucin de prueba38
5.5.3.5. Solucin de prueba combinando los microorganismos39
5.6. VARIABLES DE ESTUDIO..41
5.7. RECOLECCION DE LA INFORMACION..41
5.8. ANALISIS DE LA INFORMACION.42
5.8.1. Anlisis de datos...42
5.8.1.1. Media....42
5.8.1.2. Desviacin Estndar..42
6. RESULTADOS.44
6.1. ESTANDARIZACION DE LOS INOCULOS DE TRABAJO..44
6.2. VERIFICACION DE PROGRAMA DE CALIBRACION Y MANTENIMIENTO
DE EQUIPOS.46
6.3. PRUEBAS PRELIMINARES46
6.3.1. Prueba de Esterilidad de los medios de cultivo...46
6.3.2. Prueba de Promocin de crecimiento47
6.3.3. Controles microbiolgicos durante el proceso.47
6.4. METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA DETECCION DE

COLIFORMES FECALES Y TOTALES..49
6.5. RECUENTO COMBINADO DE LOS MICROORGANISMOS EVALUADOS
EN EL ENSAYO.61
7. DISCUSIN DE RESULTADOS...70
8. CONCLUSIONES75
9. RECOMENDACIONES...76
10. BIBLIOGRAFA.77
11. ANEXOS.82
ANEXO 1...82
III
LISTA DE TABLAS
PAG.
TABLA 1. Caractersticas fsicas del agua potable...3
TABLA 2. Caractersticas qumicas de sustancias presentes en el agua.3
TABLA 3. Caractersticas microbiolgicas del agua.4
TABLA 4. Comparacin de pruebas bioqumicas de E. coli y E. aerogenes...7
TABLA 5. Caractersticas de coliformes totales y E. coli.9
TABLA 6. Aplicaciones de los filtros de membrana14
TABLA 7. Datos requeridos para la validacin19
TABLA 8. Parmetros de validacin por tipo de prueba microbiolgica.20
TABLA 9. Lmites microbiolgicos ambientales, rea de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda...22
TABLA 10. Lmites microbiolgicos de superficies, rea de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.23
TABLA 11. Lmites microbiolgicos de dotacin guantes, rea de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda....23
TABLA 12. Caractersticas morfolgicas y enzimticas de los microorganismos evaluados..41
TABLA 13. Estandarizacin de inculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes
ATCC: 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 1.....44
TABLA 14. Estandarizacin de inculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 2...45
TABLA 15. Programa de Calibracin y mantenimiento de los equipos utilizados
en la validacin..46
TABLA 16. Prueba de promocin de crecimiento......47
TABLA 17. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante
los ensayos realizados. Analista 1 .47
TABLA 18. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante
los ensayos realizados. Analista 2. 48
TABLA 19. Resutados control Negativo. Analista 1.....49
TABLA 20. Resultados control Negativo. Analista 2....49
TABLA 21. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739en la solucin de
prueba (analista 1) .....50
TABLA 22. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solucin de
prueba (Analista 1).52
TABLA 23. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de
prueba (Analista 1)...54
TABLA 24. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739 en la solucin de prueba
IV
(Analista 2)...56
TABLA 25. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solucin de

prueba (Analista 2) 58
TABLA 26. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de
prueba (Analista 2)......60
TABLA 27. Recuento de E. coli ATCC 8739 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de
prueba (analista 1)...62
TABLA 28. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y S. typhimurium ATCC 14028 en la
solucin de prueba (Analista 1) .......................63
TABLA 29. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y E. coli ATCC 8739 en la solucin de
prueba (analista 1) ......64
TABLA 30. Recuento de E. coli ATCC 8739 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de
TABLA 31. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y S. typhimurium ATCC 14028 en la
Solucin de prueba (Analista 2)... .....66
TABLA 32. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y E. coli ATCC 8739 en la solucin de
V
LISTA DE FIGURAS
PAG.
FIGURA 1. Fuente de agua..2
FIGURA 2. Enterobacter aerogenes..6
FIGURA 3. E. coli en agar EMB..9
FIGURA 4. Salmonella en agar XLD....10
FIGURA 5. Trampa de filtracin....11
FIGURA 6. Filtros de profundidad.12
FIGURA 7. Filtros de membrana o superficie..13
FIGURA 8. Preparacin de inoculos ....33
FIGURA 9. Diagrama de flujo de Control negativo-muestra.36
FIGURA 10. Diagrama de flujo de la Prueba estndar..37
FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solucin de Prueba 38
FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solucin de prueba combinando los
Microorganismos.40
FIGURA 13. Porcentaje de recuperacin de E. coli (analista 1)..51
FIGURA 14. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes (analista 1).53
FIGURA 15. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium (analista 1).....55
FIGURA 16. Porcentaje de recuperacin de E. coli (analista 2)...57
FIGURA 17. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes (analista 2).59
FIGURA 18. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium (analista 2)..61
FIGURA 19. Prueba de promocin de crecimiento de E. coli en agar chromocult....68
FIGURA 20. Prueba de promocin de crecimiento de E. aerogenes en agar chromocult..68
FIGURA 21. Prueba de promocin de crecimiento de S. typhimurium en agar chromocult69
FGURA 22. Solucin de prueba: E coli....69
FIGURA 23. Solucin de prueba S. typhimurium69
VI
VII
1. INTRODUCCIN
El agua es una de las principales fuentes de vida en nuestro planeta, son infinitos los
usos del agua, para consumo humano, para labores domesticas y en la industria
farmacutica, es utilizada en las diferentes actividades como el lavado de materiales,
utensilios, reas accesorias, de anlisis, y como base para la preparacin de
medicamentos y/o cosmticos, en este caso el agua debe cumplir unos estndares mas
estrictos y su sistema de purificacin debe ser muy eficiente, para obtener un alto grado
de pureza y estar libre de contaminantes que puedan afectar la calidad del producto
terminado y ms an, la salud del paciente a quien se le suministren los medicamentos
elaborados. (Walter, J. 2003).
As mismo, el agua puede ser uno de los principales transmisores de enfermedades

entricas si se llegara a consumir en estado contaminado; entre los microorganismos
indicadores del agua potable, se pueden encontrar las bacterias del grupo coliforme,
perteneciendo a este grupo, gneros como: Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella
spp y Citrobacter spp; los cuales, generalmente se pueden encontrar en la capa
superficial del agua o en los sedimentos del fondo (OMS, 1995).
Es por esto, que los laboratorios de anlisis microbiolgico, buscan validar las tcnicas
desarrolladas para el anlisis de este tipo de aguas, que en la mayora de los casos
buscan detectar bacterias coliformes totales y fecales, mediante la tcnica de filtracin
por membrana, tcnica que es aceptada y utilizada a nivel nacional e internacional por
entes reguladores, debido a su fcil manejo y empleo y de esta manera contribuir a que
el agua suministrada al consumo humano sea de excelente calidad y que su sistema de
potabilizacin logre eliminar la mayor cantidad de organismos contaminantes que
puedan llegar a afectar la salud de los consumidores. (Walter, J. 2003).
Con el fin de cumplir con las reglamentaciones gubernamentales y ayudar a mejorar la

calidad del agua para consumo humano, en el presente trabajo de grado se realiz la
validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable
utilizando agar chromocult gracias a su fcil manejo y rpida recuperacin como un
mtodo alternativo para reducir costos y mejorar tiempos en el laboratorio INTERPHARM
DE COLOMBIA Ltda.
1
2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA
2.1. AGUA POTABLE
Es aquella que por cumplir las caractersticas fsicas, qumicas y microbiolgicas, es apta
para el consumo humano; se utiliza en bebida directa, en la preparacin de alimentos o
en la higiene personal (Resolucin 2115, 2007).
Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios pblicos de agua, un

suministro etc. El agua potable se puede usar en las primeras etapas de limpieza de los
equipos de fabricacin farmacutica y de componentes en contacto con los productos,
tambin es usada en la preparacin de sustancias oficiales y otros ingredientes
farmacuticos a granel (USP 31, 2007)
El peligro mas comn y ms difundido relativo al agua potable es el de su contaminacin,

sea esta directa o indirecta, debido al efecto de aguas servidas, de otros desechos o de
las excretas del hombre o de los animales. Si dicha contaminacin es reciente y entre los
factores que contribuyen a ella se hallan agentes portadores de enfermedades entricas
transmisibles, es posible que estn presentes algunos de los organismos vivos causales
de las mismas. Beber agua contaminada o emplearla en la preparacin de soluciones
puede producir mayor nmero de casos de infeccin. (OPS, 1997)
Figura 1: Fuente de agua
Fuente: quincher.wordpress.com/2008/06/30/el-agua/
2
2.1.1 Caractersticas del agua potable
El agua potable no debe contener en ningn caso microorganismos considerados

patgenos y debe estar libre de bacterias indicadoras de contaminacin fecal (OPS,
1997). En el caso de plaguicidas la concentracin mxima aceptable presente en el agua
deber ser de 0.0001mg/L.
No debe contener substancias o cuerpos extraos de origen biolgico, orgnico,

inorgnico o radiactivo en cantidades tales que la hagan peligrosa para la salud. Deber
presentar sabor agradable y ser prcticamente incolora, inodora, lmpida y transparente.
(Resolucin 2115, 2007)
Tabla 1. Caractersticas fsicas del agua potable
Fuente: Resolucin 2115 de 2007
Tabla 2. Caractersticas qumicas de sustancias presentes en el agua
Fuente: Resolucin 2115 de 2007.
2.1.2. Anlisis microbiolgico del agua
Se define anlisis microbiolgico a cada uno de los procedimientos de laboratorio que

se efectan a una muestra de agua para el consumo humano para evaluar la presencia o
ausencia, tipo y cantidad de microorganismos. (Resolucin 2115/ 2007)
En cuanto a microorganismos indicadores, ninguna muestra de agua podr contener
E.coli en 100cm3, independientemente del tipo de anlisis utilizado. Como prueba
complementaria se recomienda realizar la determinacin de microorganismos mesfilos
cuyo valor mximo ser de 100 UFC/ 100cm 3 (Resolucin 2115, 2007).
3
Tabla 3. Caractersticas microbiolgicas del agua potable
Tomado de: Resolucin 2115 de 2007.
2.1.3. Proceso de potabilizacin del agua
El cloro fue descubierto en 1774 por el qumico sueco Karl Wihellm Scheele como
producto de la reaccin entre cido hipoclorhdrico y dixido de manganeso. Es una
sustancia tan energtica y activa que solo existe en la naturaleza en combinacin con
otros elementos, es aplicado en exceso de manera que pueda satisfacer la demanda
para oxidar compuestos como nitritos, iones de hierro, plomo, sulfuros y eliminar
bacterias, de manera que as se reste una cantidad de cloro residual en los ductos del
agua; parte de este cloro residual queda para continuar desinfectando el agua desde que
sale de la planta de tratamiento hasta que llega al consumidor.
Debe ser aplicado en el agua a tratar en forma gaseosa o como un slido ionizado; al ser
adicionado al agua, este reacciona con el amonaco y materia orgnica formando
cloraminas y compuestos rgano clorados, los cuales son reducidos a un valor mnimo y
queda como resultado el cloro residual libre (Ocasio, N et al., 2004).
Segn la resolucin 2115 de 2007, el valor aceptable del cloro residual en cualquier
punto de la distribucin del agua potable, debe ser comprendido entre 0.3 y 2.0 mg/L.
2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable

La cloracin de aguas de suministro sirve principalmente para destruir o desactivar
microorganismos que pueden causar enfermedades.
El compuesto utilizado para inactivar el cloro en el agua es el tiosulfato de sodio, el cual

esta compuesto por tiosulfato, que a su vez se compone de sales de cido tiosulfrico,
estables en medios con pH bsico y neutro; se descomponen bajo formacin de azufre
elemental, dixido de azufre trazas de otros compuestos azufrados en presencia de
cido (Walter, J. 2003).
4
2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA
Varios organismos patgenos de transmisin fecal-oral pueden estar presentes en el

agua cruda (agua natural que no ha sido sometida a proceso de tratamiento para su
potabilizacin), entre ellos bacterias como Salmonella sp, Shigella sp, coliformes totales
y fecales, los cuales han sido encontradas en abastecimientos de aguas. (Ocasio y
Lopez, 2004)
Las bacterias coliformes, son el principal indicador de la adecuacin del agua para uso
domstico, industrial, o de otro tipo. La experiencia ha demostrado que la densidad del
grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminacin y por tanto, de la
calidad sanitaria (APHA - AWWA - WPCF, 2000)
Desde hace tiempo, se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen
indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son
fciles de detectar y enumerar en el agua. La presencia de E. coli en muestras de agua
potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de tratamiento de aguas, integridad,
sistema de distribucin y por tanto es una evidencia de contaminacin de diferentes
orgenes: suelo, superficies de agua dulce y tracto digestivo (Organizacin
Panamericana de la Salud, 1987)
Cabe sealar sin embargo, que aunque se reconoce que la determinacin de la

concentracin de estas bacterias en el agua es un elemento crtico para determinar el
riesgo de enfermedades relacionadas al consumo de la misma, no existe una relacin
simple entre el nivel de coliformes en el agua con la presencia de patgenos en la misma
y el riesgo de enfermedades. (Perdomo C.H. et al. 2001)
2.2.1. Coliformes Totales
El grupo coliforme se define como todas las bacterias Gram negativas en forma bacilar
que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37 C, produciendo cido y gas (CO2) en
24 horas, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y
presentan actividad enzimtico de la B-galactosidasa (Ministerio de salud, 1998). Entre
ellos se encuentran los diferentes Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.
(Organizacin Panamericana de la Salud, 1987)
La prueba mas relevante utilizada para la identificacin del grupo Coliformes, es la

hidrlisis de la lactosa. El rompimiento de este disacrido es catalizado por la enzima B-
5
D- Galactosidasa. Ambos monosacridos (la galactosa despus es transformada en
glucosa por reacciones bioqumicas) posteriormente son metabolizados a travs del ciclo
glicoltico y ciclo del citrato. Los productos metablicos de estos ciclos son cidos y/o
CO2. Para la determinacin de la B- Galactosidasa se utilizan medios cromgenos tales
como chromocult. (MANAFI, 1998).
2.2.1.1. Enterobacter aerogenes

Genero de bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, de la familia de
Enterobacterias, muchas son patgenas y son causa de infecciones oportunistas en
huspedes comprometidos generalmente hospitalizados, causa infeccin del tracto
urinario y de tracto respiratorio. (Loessner M, et al. 1993)
Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque tambin libremente en el suelo y

agua; sus colonias son grandes y mucosas, algunas cepas llegan a formar cpsula,
como fuente de carbono pueden utilizar glucosa y lactosa, no forman sulfato de
hidrogeno. (Shekhar N.C et al. 2007)
Figura 2. Enterobacter aerogenes
Fuente: www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgid=379...
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, son dos bacterias idnticas en muchas

formas superficiales, ambas fermentan lactosa produciendo cido y gas, son bacilos
Gram negativos pero en agar EMB, E.coli produce un subproducto del metabolismo de
dicho azcar que reacciona produciendo un brillo metlico en la luz reflejada y
Enterobacter aerogenes no lo hace, en cuanto a pruebas bioqumicas se presenta la
siguiente comparacin:
6
Tabla 4. Comparacin de pruebas bioqumicas de E.coli y E. aerogenes
Prueba Bioqumica E.coli Enterobacter aerogenes
Produccin de Indol + -
Rojo de Metilo + -
Voges Proskauer - +
Citrato - +
Lisina descarboxilasa +
Hidrlisis de la esculina +
Utilizacin de malonato - +
Arginina deshidrolasa +
Fuente: Gamazo .C, et al. 2005
2.2.2 Coliformes Fecales
Los coliformes fecales tambin denominados coliformes termotolerantes, llamados as

porque soportan temperaturas hasta de 45C, comprenden un grupo muy reducido de
microorganismos los cuales son indicadores de calidad, ya que son de origen fecal. En
su mayora estn representados por el microorganismo E. coli pero se pueden encontrar,
entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae estos ltimos
hacen parte de los coliformes termotolerantes, pero su origen se asocia normalmente
con la vegetacin y solo ocasionalmente aparecen en el intestino. (HAYES; 1993)
Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes totales, pero se diferencian de
los dems microorganismos que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su
rango de temperatura ptima de crecimiento es muy amplio (hasta 45C) y son mejores
indicadores de higiene en alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia
de contaminacin fecal de origen humano o animal, ya que las heces contienen dichos
microorganismos, presentes en la flora intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son
E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este
porcentaje disminuye hasta un 59%. (GOMES; 1999).
7
2.2.2.1 Escherichia coli
Originalmente llamada Bacterium comune, fue aislada por primera vez en 1985 a partir
de heces de nios; son bacilos estrechos de 1,1 a 1,5 m de dimetro y de 2 a 6 m de
longitud, se encuentran solos o en parejas, Gram negativos, mviles por flagelos
pertricos o inmviles, anoxignicos facultativos, poseen metabolismo respiratorio y
fermentativo. (LEMINOR, 1994).
Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes capaces de producir indol a

partir de triptfano, en 21 +/- 3 horas a 44 +/- 0.5C. Tambin poseen la enzima B-
Galactosidasa, que reacciona positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden
descarboxilar el cido L- glutmico, pero no son capaces de utilizar citrato como nica
fuente de carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio (KCN). (MILLIPORE;
2005).
E. coli es la nica especie dentro de las Enterobacterias que presenta la enzima B-D-
Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil--D-glucornico (MUG),
formando 4-metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia
azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta. (MANAFI, 1998).
E.coli presenta caractersticas bioqumicas importantes que permiten la diferenciacin

con otros coliformes, como ser positivo para la prueba de indol.
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano.

Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La prueba de indol est
basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo
aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de
Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano
(HOPKINS,K.L y HILTON, A.C. 2000)
8
Figura 3. Escherichia coli en Agar EMB
Fuente: science.kukuchew.com/category/microbiology/
Tabla 5. Caractersticas de Coliformes Totales y E. coli

COLIFORMES TOTALES E. COLI
Bacterias Gram Negativas Bacterias Gram negativas
No esporulados No esporulados
Anaerobios facultativos Anaerobios facultativos
Fermentadores de la lactosa con Fermentadoras de la lactosa con
produccin de cido y gas a 36+/- 1C en produccin de cido y gas a 36 +/- 1C en
24-48 horas 24-48 horas y 44.5 +/- 0.2C en 24 horas
Hbitat: Tracto gastrointestinal de animales Caractersticas de heces de animales
de sangre caliente (bacterias entricas) homeotermos
son comunes en otros ambientes (suelos,
vegetales, agua)
Fuente: Memorias seminario internacional: El agua y los riesgos para la salud
2.2.3. Salmonella spp.

Bacilo corto (1.2 um). Gram negativo, no esporulado y generalmente mvil con flagelos
pertricos. El gnero Salmonella contiene unas 2000 cepas distintas (denominadas
serovares o serotipos) de acuerdo a sus antgenos O y H.
Salmonella spp se caracteriza bioqumicamente por su capacidad de fermentar la

glucosa con produccin de cido y gas y por su capacidad de hidrolizar la lactosa y la
sacarosa. Su temperatura ptima de crecimiento, como la de la mayora de las bacterias
causantes de toxiinfecciones alimentarias esta prxima a los 37C; son relativamente
9
fotosensibles y se destruyen a 60C en unos 15 20 minutos, siendo incapaces de
crecer por debajo de los 7 u 8C (Doyle; et al.; 1997)
Figura 4. Salmonella spp en agar XLD
Fuente: bioinfo.bact.wisc.edu/.../Salmonella.html
2.3. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE

COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Para la determinacin de coliformes totales y fecales en agua potable, la legislacin

colombiana en la resolucin 2115 de 2007, recomienda entre otras tcnicas, la de
filtracin por membrana.
La tcnica de filtracin por membrana utiliza un mecanismo mediante el cual se atrapan

en la superficie de una membrana microorganismos cuyo tamao es mayor que el
tamao del poro (0.45 um); esto gracias a una bomba elctrica que ejerce una presin
diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los microorganismos de
tamao menor que el especfico del poro pasan la membrana o quedan retenidos en su
interior, las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego esta es llevada a
un medio enriquecido, selectivo o diferencial, quien a travs de intercambio metablico y
una incubacin, evidencian el crecimiento de microorganismos y Unidades Formadoras
de Colonia. (APHA - AWWA - WPCF, 2000).
Esta tcnica es altamente reproducible y proporciona resultados numricos, es una

manera rpida y simple de estimar las poblaciones bacterianas en el agua, y
especialmente til al evaluar grandes volmenes o al realizar diariamente muchas
pruebas de Coliformes (HACH, 2000).
10
El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plstico resistente a autoclave,
porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo, unido a una base por un artefacto
de cierre que se mantiene en su lugar mediante una fuerza magntica. El diseo debe
permitir que la membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa, sin que
sufra dao mecnico, de manera que todo el lquido pase a travs de la membrana
durante la filtracin. (APHA, 1992)
Figura 5. Trampa de filtracin
Fuente. fbio.uh.cu/educacion_distancia/laboratorios_virtuales/Laboratorio%20Virtual%20
micro.pps
2.3.1. Filtros de membrana
Se deben utilizar filtros de membrana con un dimetro de poro que permita una completa
retencin de las bacterias coliformes. Solo se emplean filtros en los que se haya
comprobado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por garanta del
fabricante, que permita una retencin de las bacterias coliformes. (APHA, 1992).
Se debe tener en cuenta, que dichos filtros deben ser libres de qumicos susceptibles de
inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtracin
satisfactoria, ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de +/-
0.2 unidades) y que no produzcan un aumento en el nmero de colonias confluentes o
expansivas, en comparacin con los filtros de membrana de control (APHA, 1992).
Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen

que la tcnica de esterilizacin no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades
fsicas o qumicas de la membrana, si estas se esterilizan en el laboratorio se deben
someter al autoclave por 10 minutos a 121C. (APHA, 1992).
El mecanismo de accin es muy simple: retienen todas las partculas que posean un
tamao mayor que los poros, estos poros quedan formados por los espacios que
11
resultan de la superposicin de las fibras de las distintas capas que forman la
membrana, as algunas partculas de menor tamao son retenidas por otros mecanismos
como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partculas retenidas previamente
(PEARCE, 2007)
2.3.2. Tipos de filtro de membrana
2.3.2.1 Filtros de profundidad

Estn elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al
azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vas tortuosas donde
pueden quedar retenidos la mayora de los contaminantes presentes.
Presenta ventajas como la alta capacidad de retencin de partculas sobre su superficie

y a travs de toda su estructura y que permiten filtrar grandes volmenes. Presenta
desventajas en cuanto a que no presentan un tamao de poro uniforme y existe la
liberacin, hacia el material filtrado, de partculas y microorganismos que hayan crecido
dentro del filtro. (http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf)
Figura 6. Filtros de profundidad
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
2.3.2.2 Filtros de superficie o membrana

Elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa, contienen poros
de tamao uniforme. Se pueden saturar rpidamente y la velocidad de filtracin a travs
de ellos es lenta. (http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf)
12
Figura 7. Filtros de membrana o superficie.
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
2.3.2.2.1 Membrana de nitrato de celulosa

La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricacin de filtros
de membrana. Estas membranas son de naturaleza hidroflica, con una microestructura
muy uniforme lo que permite excelentes niveles de retencin de partculas y un
comportamiento perfecto en pruebas microbiolgicas. (http://fanoia.com/filterlab/micro-8-
15.pdf)
Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente retencin y
un ptimo crecimiento microbiolgico en muestras de agua, bebidas, frmacos
(PEARCE, 2007).
2.3.2.2.2 Membrana de acetato de celulosa

Son de naturaleza hidroflica, presentan una excelente estabilidad trmica, permiten gran
capacidad de carga y altas velocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para la
esterilizacin y clarificacin de soluciones acuosas, alcohlicas y aceites.
Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazados por la superficie de
la membrana y el remanente permanece o se concentra all. El volumen del fluido y otras
partculas finas de menor tamao del poro pueden pasar a travs de la membrana al sitio
de filtrado (PEARCE, 2007).
13
Tabla 6. Aplicaciones de los filtros de membrana
Filtros de nitrato de celulosa Filtros de acetato de celulosa
Filtracin de aguas Esterilizacin de muestras de protenas
Anlisis microbiolgico Esterilizacin de fluidos biolgicos
Anlisis gravimtrico Filtracin de alcoholes
Anlisis cualitativos de partculas Filtracin de aceites
Esterilizacin de muestras Filtracin de muestras de aguas
Determinacin de protenas
Identificacin de cidos nucleicos
Pre filtracin de muestras
Clarificacin de muestras
Fuente. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
2.4. MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en donde crecen, y se

multiplican los microorganismos, con el objetivo de aislar diferentes especies de
microorganismos que induzcan al desarrollo de estrategias complementarias de
identificacin, cuantificacin, caracterizacin de la microflora (Tortora, G. 1993). De la
inocuidad y de la capacidad de recuperacin del medio de cultivo, as como de su
posterior manipulacin dependen en gran medida los resultados de una prueba
microbiolgica. (Tortora, G. 1993).
Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:

Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos
Segn su finalidad:
No selectivos: contienen los nutrientes suficientes para soportar el crecimiento
de gran variedad de microorganismos.
Selectivo: permite el crecimiento de solo un tipo de microorganismo
Enriquecido: son medios no selectivos a los que se le agregan sustancias como
sangre, suero, albumina, etc., para microorganismos exigentes.
Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre
diferentes tipos de microorganismos. (ISO\TS 11133-2: 2003)
La composicin qumica del medio de cultivo debe proveer los requerimientos

nutricionales bsicos para el crecimiento de microorganismos, sin embargo un medio de
cultivo debe cumplir con dos caractersticas muy importantes. La selectividad y la
14
productividad. Su productividad se refiere a la formulacin bsica del medio de tal forma
que favorezca el crecimiento de microorganismos con las caractersticas macroscpicas
y microscpicas esperadas. (Tortora, G. 1993).
Adems de las caractersticas anteriormente mencionadas, existen otras pruebas de

control de calidad que se realizan a los medios de cultivo, entre ellas podemos
encontrar: propiedades bioqumicas (diferenciales y diagnosticas), propiedades fsicas
(pH, volumen) y la especificidad (cuando se trate de medios con caractersticas de
diferenciales) (ISO\TS 11133-2: 2003)
2.4.1. Medios cromgenos
Basados en sustancias qumicas que aadidas al medio dan un precipitado coloreado

que demuestra la presencia de una enzima especifica, si el microorganismo posee el
sistema enzimtico para utilizar el sustrato, se produce un cambio de color visible en las
colonias. Son medios rpidos, sencillos y fiables para detectar actividades enzimticas
especificas de varios organismos. (Tortora, G. 1993).
2.4.1.1. Medio Chromocult para Coliformes

Es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en muestras de
aguas y alimentos. Por la accin conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampn de
fosfatos se garantiza un rpido crecimiento tambin de coliformes con daos
sublaterales. El contenido de lauril sulfato inhibe el crecimiento de bacterias Gram
positivas sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de los coliformes. La
formacin simultnea de coliformes totales y E. coli se hace posible por la nueva
formacin de dos sustratos cromgenos: el sustrato Salmon Gal es separado por la
enzima -D-galactosidasa caracterstico de coliformes y provoca una coloracin roja de
las colonias de coliformes. (MERCK, 1998).
La formacin de la -D-Glucoronidasa caracterstica para E. coli tiene lugar mediante el

sustrato X- glucornido, que al ser cortado por la encima produce una coloracin azul
para las colonias positivas. Ya que E. coli separa tanto Salmon-Gal como X-
Glucornido, las colonias se tien de violeta azul oscuro y debido a ellos se pueden
diferenciar de los coliformes restantes que se presentan de color rojo. (MERCK, 1998).
El contenido de triptfano mejora la reaccin de indol para la confirmacin adicional de

E. coli que se d con el reactivo de kovacs y aumenta con ello la confirmacin de la
reaccin Salmon -Gal y la reaccin X-Glucornido (MERCK, 1998).
15
2.4.1.2. Ventajas de los medios cromgenos frente a los convencionales.
La identificacin bacteriana se basa generalmente en una extensa batera de pruebas
bioqumicas convencionales, que permiten determinar sus caractersticas de desarrollo y
de metabolismo; estos mtodos requieren una colonia bacteriana pura, tomada de una
placa de aislamiento primario, su siembra en diferentes medios y su posterior lectura e
interpretacin. En la mayora de los casos el diagnstico lleva tiempo y varios pasos de
manipulacin.
Los sustratos enzimticos sintticos realizan la identificacin de microorganismos por

medio de la formacin de color que ponen de manifiesto la presencia de enzimas
especficas para cada especie.
En general se distinguen grupos de compuestos cromognicos que han sido usado en

reacciones bioqumicas para estudiar la cintica de enzimas especificas, de acuerdo al
principio, que el sustrato es hidrolizado por la enzima especifica, liberando un cromforo,
permiten identificar un microorganismo especfico en un tiempo, evitando una cantidad
de pasos que hacen mas tedioso el trabajo de identificacin, logrando visualizar de forma
rpida especies diferentes en una misma muestra analizada. (Moreno. C. 2004)
2.5. VALIDACIN
Validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso especifico producir de forma consistente productos que
reunirn las caractersticas de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA, 1987). Este
proceso adems ofrece evidencia de que un mtodo es capaz de servir para su
propsito planteado, para tal fin se deben reflejar las condiciones reales de ensayo, esto
puede conseguirse usando productos contaminados o productos inoculados con un
nmero conocido de microorganismos (ENAC, 2002; GTC 84, 2003).
El proceso de validacin se inicia con las actividades de pre validacin, las cuales
consisten en la recopilacin de la informacin relacionada con el proceso, en la revisin
de las evaluaciones de riesgos, la calificacin tcnica a las instalaciones locativas y a los
equipos, existencia de procedimientos para las tareas u operaciones y el entrenamiento
a los trabajadores. Posteriormente se procede a elaborar los protocolos en donde se
define los objetivos especficos de las evaluaciones a efectuar, las responsabilidades de
cada una de las reas involucradas en la validacin, se establecen las variables de
16
inters que se quieren monitorear y el plan de monitoreo respectivo, adems de incluir
los criterios de aceptacin que no son otra cosa que la comparacin de los resultados
con los niveles permisibles o los resultados esperados. (Estrada C, 1999)
A continuacin se desarrolla la validacin propiamente dicha en donde se realiza una

evaluacin de una muestra representativa, en nmero de lotes de produccin si la
produccin es por lotes o en tiempo si esta es continua. Durante esta fase se recopilan
las muestras de las variables que se desean medir y se realizan los anlisis o clculos
respectivos. Finalmente con los resultados arrojados por el proceso anterior se hacen las
recomendaciones respectivas y conclusiones, que despus de cumplir un plan de accin
se cierran y se procede a declarar el proceso como validado. (Estrada C, 1999)
Para la recuperacin e identificacin microbiana, los anlisis microbiolgicos, son

ajustables a veces, a mtodos alternativos a los descritos en la USP por diversas
razones: econmicas, de produccin, y tiempo. Por tanto estos mtodos requieren ser
validados. (USP 31, 2008) En Los mtodos microbiolgicos alternativos es importante
tener en cuenta un cierto grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas
microbiolgicas por conteo en placa convencional, se puede llegar a encontrar
resultados con porcentajes de desviacin estndar relativa de 15 a 35 ya que muchos
mtodos microbiolgicos convencionales estn sujetos a errores de muestreo, de
dilucin, de incubacin y del operador. (USP 31, 2008).
Incluso cuando se haya realizado la validacin, el laboratorio tendr que verificar

peridicamente que se cumplen los parmetros documentados, utilizando por ejemplo
muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices ms
representativas. (ENAC, 2002).
2.5.1. Parmetros de Desempeo de la Validacin
Son las propiedades, caractersticas o capacidades del mtodo.
2.5.1.1. Especificidad
Capacidad de un mtodo de determinar inequvocamente un analto/parmetro en
presencia de los otros componentes de la muestra. La especificidad puede ser afectada
por la presencia de interferentes (como precursores de sntesis, impurezas, productos de
degradacin, entre otros). (OGA-016,2004).
17
2.5.1.2. Exactitud
La exactitud, es la cercana de un resultado al valor verdadero por comparacin con los
valores de referencia de un material caracterizado (material de referencia). Los valores
de referencia deberan ser trazables a las normas internacionales; los materiales de
referencia certificados (MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal que el
material de referencia sea de matriz natural lo mas similar posible a las muestras de
inters. (RODRGUEZ, 2004). Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje
de recuperacin de los microorganismos mediante el mtodo de validacin. (USP 31,
2008).
2.5.1.3. Precisin
Las dos medidas ms comunes de la precisin, que generalmente se define en trminos
de desviacin estndar o el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa) son la
repetibilidad y la reproducibilidad. La repetibilidad, da una idea de la variabilidad que se
espera cuando un proceso es aplicado por un solo analista en un equipo durante un
periodo corto (anlisis por duplicado). La reproducibilidad, es la que representa la
variabilidad que se obtiene cuando un proceso es analizado por diferentes analistas, lo
cual tiene un valor ms amplio. La precisin intermedia y ms til en casos especficos
se obtiene cuando se evala reproducibilidad entre analistas en un mismo laboratorio.
(RODRGUEZ, 2004).
2.5.2. Datos requeridos para la validacin
Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varan desde valoraciones analticas muy
rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia
variedad, es lgico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes
esquemas de validacin. Las categoras ms habituales para las que se exigen datos de
validacin son:
Categora I: Los procedimientos analticos para la cuantificacin de componentes
principales de frmacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en
productos farmacuticos terminados.
Categora II: Los procedimientos analticos para la determinacin de impurezas en
frmacos a granel o productos de degradacin en productos farmacuticos terminados.
Estos procedimientos incluyen anlisis cuantitativos y pruebas de lmite.
Categora III: Los procedimientos analticos para la determinacin de las caractersticas
de desempeo.
Categora IV: Pruebas de identificacin
18
Para cada categora, se requiere de diferente informacin analtica. La validez de un
procedimiento analtico puede verificarse slo mediante estudios de laboratorio. Por lo
tanto, la documentacin final de dichos estudios constituye un requisito bsico para
determinar si un procedimiento es adecuado para sus aplicaciones previstas. (USP 31,
2008)
Tabla 7. Datos requeridos para la validacin
DATOS REQUERIDOS PARA LA VALIDACIN

Categora II
Caractersticas Categora anlisis Prueba Categora Categora
de Desempeo I cuantitativa de lmite III IV
analtico
Exactitud Si Si * * No
Precisin Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Lmite de No No Si * No
deteccin
Lmite de No Si No * No
Cuantificacin
Linealidad Si Si No * No
Fuente: USP 31, 2008.
2.6. VALIDACIN Y SELECCIN DE MTODOS DE ENSAYO MICROBIOLGICO
El anlisis microbiolgico tiene como fin proporcionar informacin confiable acerca de la

inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es por ello que es indispensable
la eleccin de un mtodo de ensayo adecuado.
Para decidir si un mtodo es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese mtodo es
aplicable a la muestra analizar a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el
ensayo, si usando esta metodologa se puede evaluar el cumplimiento de las exigencias
requeridas para el analto. El laboratorio debe elegir los mtodos que mejor se adecuen
a sus objetivos y debe documentarlos debidamente. (GUARNIZO, 2005).
19
Existen tipos principales de determinaciones propias de las pruebas microbiolgicas,
entre las que se incluyen: Pruebas para determinar si los microorganismos estn
presentes en una muestra y pruebas para cuantificar el nmero de microorganismos.
(USP 31, 2008)
2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o ausencia de

microorganismos
Este tipo de pruebas se caracteriza por el uso de turbidez en un medio lquido de

crecimiento como evidencia de la presencia de microorganismos viables en la muestra
de la prueba. (USP 31, 2008)
2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos
El mtodo de recuento en placa es el ejemplo ms comn de esta clase de pruebas que

se emplean para estimar el nmero de microorganismos viables en la muestra. (USP 31,
2008)
Tabla 8. Parmetros de Validacin por tipo de prueba microbiolgica.
Parmetro Pruebas Pruebas
cualitativas cuantitativas
Exactitud No Si
Precisin No Si
Especificidad Si Si
Lmite de deteccin Si Si
Lmite de cuantificacin No Si
Linealidad No Si
Robustez Si Si
Repetibilidad Si Si
Fuente: USP 31, 2008.
Un laboratorio debe validar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o
desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as como las
ampliaciones y las modificaciones de los mtodos normalizados, para confirmar que son
aptos para el fin previsto. La validacin debe ser tan amplia como sea necesario para
satisfacer las necesidades del tipo de aplicacin o del campo de aplicacin dados. El
laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la
20
validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto. (ENAC,
2002).
2.6.3. Mtodos normalizados
Son mtodos que el laboratorio aplica como ya esta descrito en un procedimiento o en

una norma, en este caso tambin es necesario anexar o volver a escribir bajo forma de
procedimientos las especificaciones reconocidas que tengan suficiente informacin para
realizar los ensayos (G-ENAC. 1997) .
El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los mtodos normalizados
antes de introducir los ensayos. Si el mtodo normalizado cambia se debe repetir la
confirmacin.
2.6.4. Mtodos desarrollados por el laboratorio
Elaborados en el laboratorio y no se encuentran en ningn documento oficial, debe ser

una actividad planificada y debe ser asignada a personal calificado y proveer los
recursos necesarios (G-ENAC. 1997)
2.6.5. Mtodos normalizados con modificaciones
Son mtodos tomados de una norma, pero con alguna modificacin, tal es el caso de
una filtracin con membrana utilizando otro medio de cultivo diferente; aqu se debe
realizar lo mismo a como si se estuviera realizando la validacin de un mtodo
desarrollado por el laboratorio, debido a que ya existe una modificacin sobre el mtodo
normalizado (G-ENAC. 1997).
2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIN
2.7.1. Monitoreo ambiental
La calidad microbiolgica del aire y las superficies de laboratorio son un indicador de la

efectividad de las tareas realizadas segn el programa de limpieza y desinfeccin.
21
El programa de muestreo para monitoreo ambiental incluye:
Determinacin cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente

(recuento total de determinado tipo de microorganismos, por ejemplo: hongos y
levaduras, mesfilos).
Determinacin cualitativa dependiendo de los ensayos que realiza el laboratorio
(ejemplo: Enterobacterias, coliformes, Salmonella spp).
El laboratorio debe definir los recuentos mximos de microorganismos que
considere aceptable y disponer de un procedimiento documentado en el que se
describan las acciones a tomar para corregir las situaciones en que sobrepasen
estos lmites.
Se recomienda realizar como mnimo los siguientes controles microbiolgicos, aunque es

importante resaltar que existe variedad de mtodos para llevarlos a cabo:
Monitoreo de la calidad del aire por exposicin de placas o equipos

muestreadores
Monitoreo de la calidad microbiolgica de las superficies de trabajo, por frotacin
con hisopos o por placas rodac
Control de dotacin y de personal (VILLOCH, C.A. 2002)
Tabla 9. Lmites microbiolgicos ambientales, rea de recuentos

INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Ambiente del rea / No. De microorganismos No. De microorganismos

60 minutos viables bacterias viables hongos y levadura
UFC/placa UFC/placa
Cabina flujo laminar
clase 100 0 0
rea Max. 12 Max. 12
No: Nmero
22
Tabla 10. Lmites microbiolgicos superficies, rea de recuentos
No. de microorganismos
Superficie del rea / No. de microorganismos viables hongos y levaduras
2
25cm viables bacterias UFC/ 25 cm2
UFC/ 25 cm2
Cabina flujo laminar Max. 0 Max. 0

clase 100
Mesa, Puerta o Pared Max. 12 Max. 12
No: Nmero
Tabla 11. Lmites microbiolgicos dotacin - guantes, rea de recuentos

Superficie del rea No. de microorganismos No. de microorganismos

/placa viables bacterias viables hongos y levaduras
UFC/placa UFC/placa
Guantes inicio Max. 3 Max. 1
Guantes final Max. 7 Max. 5
No: Nmero
Se debe limpiar y desinfectar el espacio de ambiente controlado, en el cual se desarrolla

el procedimiento. Este permitir a la empresa mantener un nivel mnimo consistente de
contaminacin, en pisos y mesn de muestras, es importante siempre tener en cuenta
que en las cabinas se exige cero contaminacin. Un mtodo eficiente es la desinfeccin
apropiada mediante un sistema de rotacin de desinfectantes, usando generalmente los
de tipo fenlicos, amonios cuaternarios, aldehdos, perxidos y haluros.
En el caso de algunos equipos que no se pueden esterilizar por los diversos mtodos
como: Equipos elctricos y electrnicos, balanzas, bateras, etc.; la desinfeccin de estos
equipos debe ser ms rigurosa debido a su potencial de contaminacin con un gran
nmero de microorganismos. (CARLENTON, 1999)
23
2.7.2. Escala de Mc Farland
La escala de Mc Farland, es utilizada como estndar de turbidez en la preparacin de

suspensiones de microorganismos. Los estndares de turbidez son preparados por la
mezcla de qumicos que se precipitan para formar una solucin de turbidez reproducible.
Son realizados adicionando cido sulfrico a una solucin acuosa de cloruro de bario,
del cual resulta la formacin de un precipitado de sulfato de bario (ZIMBRO Y POWER,
2003) Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl 2 de 0.048 M y
H2S04 0.6 M, la turbidez la da el BaCl 2, el cual va en cantidad creciente mientras al
cido sulfrico va disminuyendo la proporcin. (ESCOBAR, 2002)
Cada uno de los tubos del patrn de acuerdo con la turbidez, representa un nmero de
bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por recuentos
de colonias. De esta forma al comparar una emulsin de bacterias con el tubo del patrn
de Mc farland que ms se asemeje se puede saber aproximadamente el numero de
bacterias en la emulsin (ESCOBAR, 2002)
2.7.3. Medios de cultivo
Los medios de cultivo seleccionados debern ser evaluados con la prueba de promocin
de crecimiento de bacterias, mohos y levaduras. Las unidades de promocin de
crecimiento deben ser inoculadas con un nmero menor de 100 UFC. Si las pruebas de
promocin de crecimiento fallan, se debe investigar el origen de cualquier contaminacin
encontrada durante la simulacin y repetir la prueba. (ROGANTI, 2004)
2.7.3.1. Esterilizacin del medio de cultivo

El medio seleccionado debe ser esterilizado por uno de los dos mtodos primarios,
filtracin o esterilizacin por vapor. La esterilizacin por filtracin requiere que el medio
pase por un filtro de 0.22m a un contenedor previamente esterilizado; este mtodo
presenta dificultad debido a que los medios de cultivo son mezcla de varios materiales
naturales y una cantidad considerable de estos son slidos no solubles que se
encuentran presentes en la mezcla acuosa. (CARLENTON, 1999)
El proceso con vapor (autoclave) emplea la esterilizacin terminal del medio en un

contenedor del cual ser dispensado para el envase, este procedimiento terminal reduce
la necesidad de manipulacin post-esterilizacin que puede comprometer la esterilidad
del medio. (CARLENTON, 1999)
24
Despus de la esterilizacin del medio este debe ser manejado realizando las mismas
practicas usadas para las operaciones de produccin rutinarias. Algunas empresas
siguen algunos pasos adicionales como la preincubacin del medio antes de empezar la
corrida de la prueba, para asegurarse de la esterilidad del medio antes del envase de
este. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.2. Incubacin
Los medios se deben incubar en condiciones adecuadas de modo que se puedan
evidenciar los microorganismos que podran de otra manera ser difciles de cultivar. Se
deben establecer las condiciones de incubacin de acuerdo con las siguientes pautas
generales:
La temperatura y el tiempo de incubacin debe ser conveniente para la recuperacin de

la carga microbiana, en ningn momento deben estar fuera del rango de 20-35; y se
debe mantener dentro de +/- 2.5C de la temperatura requerida. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.3. Control de autoclave

Para verificar que el proceso de esterilizacin se realiza en forma adecuada, se realiza
un control por cada ciclo introduciendo un vial que contiene esporas de Bacillus
stearothermophilus en el autoclave. (I-DCM 008 USO Y MANEJO DE BIOINDICADOR
EN PROCESO DE ESTERILIZACIN Codificacin correspondiente al Sistema de
Gestin de Calidad de INTERPHARM de COLOMBIA Ltda.)
Esta prueba consiste en introducir en el autoclave viales de Bacillus stearothermophilus

en posiciones establecidas, junto con el material que se esta esterilizando en los
parmetros normales, cuando finaliza el proceso se incuba y se determina el crecimiento
o no por medio del cambio en el indicador de pH que se encuentra en la ampolleta. (NTC
- 4543, 1998). Adicionalmente el autoclave debe estar calificado (se debe tener en
cuenta la ultima fecha de la calificacin del autoclave), para de esta manera asegurar la
adecuada distribucin de calor para cargas y volmenes definidos, usualmente se
recomienda que se use un ciclo de autoclave de 121 durante 15 minutos (USP 31,
2008). Para llevar a cabo la calificacin del autoclave existen tres etapas fundamentales:
certificacin de la instalacin (CI), certificacin operativa (CO) y certificacin funcional
(CF).
En el caso de la certificacin de la instalacin, se debe registrar toda la informacin de

identificacin (nombre del equipo, descripcin, nmero de modelo e identificacin,
25
certificados de compra), ubicacin, requisitos de servicios bsicos y cualquier
caracterstica de seguridad del equipo (fcil acceso a todos los planos, manuales, listas
de repuestos, direccin del vendedor y numero telefnico de contacto).
En cuanto a la certificacin operativa: se debe describir toda la informacin necesaria en

la que conste que todos los componentes del equipo (autoclave), funcionan segn lo
especificado; esto se obtiene sometiendo a prueba todos los controles de operacin
normal, todos los puntos de alarma, todos los interruptores y dispositivos visualizadores.
Para finalizar el proceso de calificacin del autoclave, se realiza la certificacin

funcional, en la cual se describe el procedimiento necesario para demostrar que el
sistema del equipo funciona uniformemente y cumple las especificaciones exigidas
bajo la operacin cotidiana (OMS, 1998)
2.7.4. Documentacin
Es esencial que el programa de validacin este documentado y que la documentacin

sea mantenida correctamente. Es importante registrar los detalles del proceso (ej.
tiempo, equipo usado) y registrar los cambios que hayan ocurrido. Un registro del
mantenimiento puede ser til en la ejecucin de investigaciones de fallas referentes a un
lote especfico de fabricacin. Los datos de la validacin (junto con datos de pruebas
especficas) pueden tambin determinar la variacin prevista en las caractersticas del
producto o el equipo (RODRGUEZ, 2004).
2.7.5 Desarrollo del protocolo de validacin
El propsito del protocolo de validacin es demostrar que el proceso es reproducible y

est normalizado de manera que los resultados que provee sern comparables a los de
otro proceso en un lugar diferente y viceversa. (RODRGUEZ. 2004) El protocolo consta
de:
Identificacin del proceso que se va a validar
Criterios objetivos y que se pueden medir para una validacin exitosa
Duracin de la validacin
Turnos, operadores, equipo que se va a usar en el proceso
Identificacin de servicios para el equipo de proceso y la calidad de los servicios
Consideracin del mantenimiento y reparaciones de equipo de fabricacin
Identificacin de los operadores y calificacin del operador requerido
Descripcin completa del proceso
26
Cualquier control o condicin especial que se coloque en los procesos
precedentes durante la validacin
Parmetros de proceso que se van a monitorear, y mtodos para controlar y
monitorear
Caractersticas de producto o proceso que se van a monitorear y mtodos para
monitorear
Mtodos estadsticos para recoleccin y anlisis de datos
Se deben tener en cuenta las causas de variacin controlables en un proceso de

validacin como son: temperatura, humedad, variaciones de suministro elctrico,
vibracin, contaminantes ambientales, pureza del agua usada en el proceso, luz,
variabilidad de los materiales, desgaste del equipo, factores humanos (entrenamiento,
factores econmicos, tensin, etc.) (RODRGUEZ. 2004)
2.7.6 Informe Final de Validacin
Este informe resume y presenta todos los protocolos, resultados y deriva conclusiones
relacionadas con el estado de validacin del proceso. Debe ser revisado y aprobado por
el equipo de validacin y la administracin. (RODRGUEZ. 2004)
27
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
En el presente trabajo se realizo la validacin del mtodo de deteccin de coliformes

totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult segn POE DCM 046
DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT
(codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM DE
COLOMBIA Ltda.) estableciendo parmetros estndares de validacin tales como
especificidad, exactitud, precisin, repetibilidad, reproducibilidad. Todo lo anterior
teniendo en cuenta la necesidad de reducir tiempos y costos, adems de cumplir con los
requisitos tanto de la normatividad gubernamental como aquellos que puedan llegar a
dar reconocimiento al laboratorio.
3.2 JUSTIFICACIN DEL PROBLEMA
La validez en los resultados de los anlisis microbiolgicos se ven afectados por factores
como: La preparacin del inculo, la naturaleza de los microorganismos utilizados, las
condiciones especficas de la prueba, las condiciones de recuperacin, entre otros. Por
lo anterior, todos los mtodos y especialmente los relacionados con el anlisis
microbiolgico del agua potable, dada la importancia como materia prima, ingrediente y
disolvente en el procesamiento, formulacin, fabricacin de productos farmacuticos y
para el consumo humano, deben ser validados.
Por esta razn, en este trabajo de grado se demuestra que el mtodo de filtracin por
membrana utilizado por el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda, para la
deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, es
confiable, reduce costos y tiempo.
28
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de
coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, tcnica
empleada en el laboratorio de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Comprobar la efectividad del agar chromocult como un mtodo de deteccin

eficaz para coliformes totales y fecales en agua potable.
Demostrar mediante pruebas de enumeracin y recuperacin de los

microorganismos evaluados que el mtodo de filtracin por membrana para la
deteccin de coliformes fecales y totales, es apropiado para analizar muestras
de agua.
Comprobar si el mtodo cuantitativo de filtracin por membrana para la deteccin

de coliformes totales y fecales en agua potable es especifico, exacto,
reproducible, repetible y preciso.
Elaborar el protocolo de validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales

y fecales en agua potable utilizando agar chromocult.
29
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 DISEO EXPERIMENTAL
En el presente trabajo se realiza un estudio experimental, para obtener la validacin del

mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en
agua potable utilizando agar chromocult en el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA
Ltda.
5.2 POBLACIN DE ESTUDIO Y MUESTRA POBLACIN DE ESTUDIO
El estudio se realiza en el laboratorio de anlisis microbiolgico de la empresa

INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Ubicado en la Carrera 68 A # 19-79 de la ciudad
de Bogot, con muestras de agua potable del laboratorio, inoculadas con un nmero
conocido de microorganismos contaminantes.
Se utiliza agua potable, proveniente del acueducto de Bogot, a la cual el laboratorio le

realiza pruebas fisicoqumicas, para determinar el cumplimiento de las especificaciones
descritas para agua potable segn la resolucin 2115 de 2007 y segn el programa de
controles internos establecido en el laboratorio.
Se utilizan tres microorganismos:

Escherichia coli ATCC 8739
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Las cepas utilizadas corresponden al cuarto pase, (cepas de trabajo) segn POE DCM
013 MANEJO DEL CEPARIO (Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de
Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.)
Para la validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales, se analizan

diez (10) muestras diferentes de agua potable, provenientes de la misma fuente (llave de
agua - rea de lavado- laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda) las cuales se
analizan por dos analistas, en das diferentes. Cada da se evala una muestra de agua
diferente con tres rplicas, para cada prueba, realizando una prueba estndar(control
positivo), en la cual se evalu cada microorganismo por separado (agua estril para
inyeccin, inoculada con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli
ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC
30
13048), una solucin de prueba (agua potable inoculada con los microorganismos
utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC
14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ), un control negativo (agua potable con
tiosulfato al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de agua con los
microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella
typhimurium ATCC 14028); (agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 ) y (agua potable + Salmonella typhimurium ATCC: 14028 +
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtienen, 30 recuentos por
da para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto se obtienen 600 datos en
total por los dos analistas, para determinar posteriormente parmetros cuantitativos para
la validacin del mtodo.
Para llevar a cabo el anlisis de las muestras de agua se desarrolla la tcnica de

filtracin por membrana llevando a cabo el montaje del equipo de filtracin segn
instructivo I DCM 013 ARMADO DEL EQUIPO DE FILTRACIN (Codificacin
correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA
Ltda.) y se utilizan membranas de nitrato de celulosa, con poro de 0.45um y dimetro de
47 mm.
5.3 VARIABLES DE ESTUDIO
Para la validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales en agar

chromocult se determinan los siguientes parmetros cuantitativos:
Precisin
Repetibilidad
Reproducibilidad
Especificidad
Exactitud
31
5.4. PRUEBAS PRELIMINARES
5.4.1 Recopilacin de la Informacin
Para obtener toda la informacin que puede influir en la validez de la prueba se realiza
una revisin de los siguientes factores: personal, equipos e instalaciones, medios de
cultivos utilizados en la prueba, reactivos, entre otros.
5.4.2 Calibracin y mantenimiento de equipos
Se verifica que los equipos utilizados en la prueba, se encuentran calibrados y dentro de

los parmetros establecidos de funcionamiento. ( Ver tabla 15)
Los equipos utilizados fueron los siguientes:

Cabina de flujo laminar horizontal
Bomba de vaco
Balanza de platillo externo
Autoclave horizontal
Incubadora de 20-25C
Microscopio
Nevera
5.4.3 Preparacin de inculos
Se realizan aislamientos de los tres microorganismos prueba (Escherchia coli ATCC

8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048) en
agar casoy, incubando los medios durante 24 horas en un rango de temperatura entre
30 - 35 C, para luego obtener en cada caso colonias aisladas. Con las cepas obtenidas,
se realiza una suspensin de 9 ml en solucin salina, de cada uno de los
microorganismos de acuerdo al tubo N 1 de la escala de Mc Farland, el cual
8
corresponde a una concentracin de 3 x 10 UFC/ml. A partir de cada suspensin se
realizan diluciones seriadas hasta 3x10-8 (segn figura 8). De las tres ltimas diluciones
-6 -7 -8
(10 , 10 y 10 ) se siembra en superficie 0.1 ml y por duplicado en Agar Casoy,
incubando en un rango de temperatura entre 30-35C por 24 horas, transcurrido este
periodo de tiempo, se realiza recuento y se busca la dilucin en la se encuentran menos
32
de 100UFC\ml, para de esta manera iniciar la estandarizacin del inoculo con el cualk se
trabajar en la diferentes pruebas realizadas en la validacin; segn POE - DCM 043
PREPARACIN Y MANEJO DE INCULOS A PARTIR DE LA ESCALA DE MC
FARLAND (Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.).
Figura 8. Preparacin de inculo
0.1ml 1ml 1ml

1ml 0.1ml
1 2 3 4 5
Cultivo
de 24 Patrn 9.0 9.9 9.0 9.0
9.9 ml
horas 9.0 ml ml ml ml
ml
-6 -7 -8
-2 -4 3X10 3X10
3X10
-1
3X10 3X10 3X10
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml
UFC/ml
5.4.4 Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Se realiza la prueba de esterilidad a cada medio de cultivo preparado (agar chromocult)

para el desarrollo de la prueba. Tomando una muestra equivalente al 10% de cada
medio y llevndola a incubar por 24 horas (tiempo presuntivo en cual pueden crecer los
microorganismos contaminantes) a una temperatura entre 30-35C y de esta manera
evidenciar que no existe crecimiento alguno y que efectivamente el medio se encuentra
en condiciones optimas para su uso; cabe destacar que luego de transcurridas las 24
horas de incubacin, as no se evidencie crecimiento, las cajas con medio permanecen
en incubacin por otras 24 horas.
5.4.5. Prueba de promocin de crecimiento
La prueba de promocin de crecimiento se realiza a cada medio de cultivo preparado

(agar chromocult), para garantizar que el medio utilizado en la prueba, contiene los
nutrientes necesarios para los microorganismos evaluados logrando un ptimo
crecimiento; se realiza un aislamiento de la cepa de trabajo de cada microorganismo en
una caja de petri que contiene el medio a evaluar (agar chromocult), adems de
33
evidenciar las caractersticas tpicas de crecimiento de cada microorganismo, tambin se
realizan pruebas cuantitativas para evidenciar la recuperacin de las colonias, esta fase
de la prueba se realiza en la preparacin de cada inoculo de trabajo; en la cual se
inocula 0.1 ml de cada suspensin a utilizar (tubo # 5 que contiene una concentracin de
30 UFC\ml), tanto en agar chromocult, como en agar casoy.
5.5 MATERIALES Y MTODOS EN LA EVALUACIN DE PARMETROS

CUANTITATIVOS
La evaluacin de los parmetros cuantitativos, se obtiene a partir de procedimientos

establecidos y estandarizados, para el mtodo de filtracin por membrana para la
deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable, se utiliza el POE DCM 046
DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT,
del LABORATORIO INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
5.5.1. Materiales
Tiosulfato de Sodio al 0.1N
Colorantes de tincin de Gram.
Reactivo de Kovacks
Aceite de Inmersin
Alcohol al 70%
Alcohol al 96%
Frascos Schott por 250ml
Frascos Schott por 500ml
Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10ml
Cajas de petri desechables estriles
Bolsas de polietileno resistentes al calor
Membranas para filtracin con poro de 0,45 m y dimetro de 47mm
Guantes estriles
Pera pipeteadora
Agar Chromocult
Agar Casoy
Cepa de Escherichia coli ATCC 8739
Cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Cepa de Salmonella typhimurium ATCC 14028
Papel kraft
Pinzas de acero inoxidable estriles
34
Asa redonda
Asa recta
Cabina de flujo laminar horizontal
Microscopio
Equipo de filtracin
Bomba de vaco
Contador de colonias
Mangueras
Tijeras estriles
Vasos de filtracin
Autoclave
5.5.2 Microorganismos estndar
Los microorganismos utilizados son:

Enterobacter aerogenes ATCC 13048
5.5.3 Mtodos
5.5.3.1 Control de ambiente, superficie y operarios.

Para la realizacin de la validacin del mtodo filtracin por membrana para agua
potable en agar chromocult se evaluaron inicialmente los controles del proceso,
realizando monitoreo ambiental por sedimentacin por exposicin de placas durante 60
minutos en agar casoy y en agar saboureaud en la cabina de flujo laminar en donde se
realizo la prueba y sobre el mesn en el cual se ubican las muestras, tambin se llevo a
cabo el control del analista al inicio y al final de cada anlisis mediante la impresin de
los guantes en agar letheen; adicionalmente se desarrollo un control de superficies
mediante la impresin de placas rodac sobre la cabina de flujo laminar y la pare del rea
de recuentos.
35
5.5.3.2. Control negativo - muestra
Se toma una muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estril de 250 ml segn
I DCM 007 MUESTREO DE AGUA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO
procedente del rea de lavado del laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Posteriormente se lleva al rea de recuentos y bajo cabina de flujo laminar se adiciona
tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de
potabilizacin) y se deja actuar durante 30 minutos. A continuacin se adiciona la
muestra (100 ml) a la copa de filtracin y se hace pasar a travs de la membrana y una
vez filtrado todo el lquido se coloca la membrana sobre la superficie de una caja petri
con agar chromocult y se lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-
35C. Este procedimiento se realiza tres veces, por cada operario.
FIGURA 9. Diagrama de flujo del control negativo
Control Negativo
Armar equipo de
filtracin
Frascos schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno
Adicionar Tiosulfato de Adicionar Tiosulfato de Adicionar

sodio al 1% sodio al 1% Tiosulfato de
sodio al 1%
Filtrar 100 ml Filtrar 100 ml Filtrar 100 ml
Colocar membrana sobre superficie de caja de agar chromocult

Para microorganismo por separado
Incubar 24 horas 30 35C Realizar

coloracin
de Gram
Informar Realizar recuento
resultados
Fuente: Autor
36
5.5.3.3. Prueba estndar
Para la prueba estndar, a 100 ml de agua estril para inyeccin se adiciona 1 ml de la
dilucin 3x10-8 (30 UFC/ml) para cada uno de los microorganismos utilizados:
Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Escherichia coli ATCC 8739 y Salmonella
typhimurium ATCC 14028, para cada microorganismo por separado; seguidamente se
filtra y se coloca la membrana sobre la superficie de agar plate count, se lleva a incubar
durante 24 horas a una temperatura entre 30-35C, luego de este tiempo se realiza el
recuento, se evidencian las caractersticas tpicas de crecimiento y se realiza coloracin
de Gram a las colonias; este procedimiento se realiza por triplicado.
FIGURA 10. Diagrama de flujo de la prueba estndar
Prueba estndar
(Control positivo) Armar equipo de
filtracin
Frascos schott con 100 ml de agua estril para inyeccin cada uno
Adicionar 1 ml de Adicionar 1 ml de 3x10-8 Adicionar 1 ml de

3x10-8 (30 UFC/ml) (30 UFC/ml) de la 3x10-8 (30 UFC/ml)
de la suspensin suspensin de de la suspensin de
de Escherichia coli Enterobacter aerogenes Salmonella
ATCC 8739 ATCC 13048 typhimurium ATCC
14028
Filtrar 100 ml tres Filtrar 100 ml tres Filtrar 100 ml tres

veces veces veces
Colocar membrana sobre superficie de caja de agar plate count

Para cada microorganismo por separado
Realizar
Incubar 24 horas 30 35C coloracin
de Gram
Informar Realizar recuento

resultados
Fuente: Autor
37
5.5.3.4. Solucin de prueba
Para llevar a cabo la solucin de prueba, se toma una muestra de 100 ml de agua
potable en frasco schott estril de 200 ml y se adiciona tiosulfato de sodio al 1% (para
inactivar el cloro procedente del proceso de potabilizacin) y se deja actuar durante 30
minutos, transcurrido el tiempo, se adiciona 1 ml de la dilucin 3x10-8 (30 UFC/ml), de los
microorganismos a evaluar por separado: Enterobacter aerogenes ATCC 13048,
Escherichia coli ATCC 8739 y Salmonella typhimurium ATCC 14028; este procedimiento,
se realiza por separado para cada uno de los microorganismos utilizados y por triplicado.
A continuacin, se realiza la filtracin de 100 ml y se coloca cada una de las membranas

sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult (para un total de 3 cajas de
agar chromocult para cada microorganismo, por cada muestra analizada). Finalmente se
lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35C, transcurrido este
tiempo se realiza el recuento, se realiza la prueba de Indol, coloracin de Gram y se
informan los resultados.
FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solucin de prueba
Solucin de prueba Armar equipo

de filtracin
Frascos Schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno
Adicionar tiosulfato Adicionar tiosulfato Adicionar tiosulfato

de sodio 1% de sodio 1% de sodio 1%
Dejar actuar Dejar actuar durante Dejar actuar durante

durante 30 minutos 30 minutos 30 minutos
Adicionar 1 ml de Adicionar 1 ml de Adicionar 1 ml de

-8 -8 -8
dilucin 3x10 (30 dilucin 3x10 (30 dilucin 3x10 (30
UFC/ml) de la UFC/ml) de la UFC/ml) de la
suspensin de E. suspensin de E. suspensin de S.
coli aerogenes typhimurium
38
Filtrar 100 ml, Filtrar 100 ml, Filtrar 100 ml,
tres veces tres veces tres veces
Incubar 24 horas 30 35C Realizar la prueba

de Indol y coloracin
de Gram
Realizar recuento
Informar resultados
Fuente: Autor
5.5.3.5. Solucin de prueba combinando los microorganismos

Para llevar a cabo la solucin de prueba combinando los microorganismos, se toma una
muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estril de 200 ml y se adiciona
tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de
potabilizacin) y se deja actuar durante 30 minutos, transcurrido el tiempo, se adiciona
-8
0.5 ml de la dilucin 3x10 (30 UFC/ml), de los microorganismos a evaluar por separado:
(Enterobacter aerogenes ATCC 13048 + Escherichia coli ATCC 8739); (Salmonella
typhimurium ATCC 14028 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048) y (Escherichia coli
ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028); este procedimiento, se realiza por
separado para cada una de las combinaciones utilizadas y por triplicado.
A continuacin se realiza la filtracin de 100 ml y se coloca cada una de las membranas

sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult (para un total de 3 cajas de
agar chromocult para cada combinacin, por cada muestra analizada). Finalmente se
lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35C, transcurrido este
tiempo se realiza el recuento, se realiza la prueba de Indol, coloracin de Gram y se
informan los resultados.
39
FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solucin de prueba combinando los
microorganismos
Solucin de prueba Armar equipo

combinada de filtracin
Frascos Schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno
Adicionar tiosulfato Adicionar tiosulfato Adicionar tiosulfato

de sodio 1% de sodio 1% de sodio 1%
Dejar actuar durante Dejar actuar durante Dejar actuar durante

30 minutos 30 minutos 30 minutos
Adicionar 0.5 ml de Adicionar 1 ml de Adicionar 1 ml de

dilucin 3x10-8 de la dilucin 3x10-8 de la dilucin 3x10-8 de la
suspensin de E. coli suspensin de E. coli y suspensin de S.
y 0.5 ml de dilucin 0.5 ml de dilucin typhimurium y 0.5 ml de
3x10-8 de la 3x10-8 de la suspensin dilucin 3 x10- de la
suspensin de E. de S. typhimurium suspensin de E.
aerogenes aerogenes
Filtrar 100 ml, Filtrar 100 ml, Filtrar 100 ml,

tres veces tres veces tres veces
Incubar 24 horas 30 35C
Realizar la prueba
de Indol y
Realizar recuento coloracin de Gram
Informar resultados
Fuente: Autor
40
5.6 VARIABLES DE ESTUDIO
Para llevar a cabo la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin
de coliformes totales y fecales en agua potable, utilizando agar chromocult y teniendo en
cuenta su carcter cuantitativo se analizan variables como: exactitud, repetibilidad,
reproducibilidad, especificidad.
Se determina la precisin de las tcnicas en trminos de reproducibilidad, repetibilidad, a

travs de la desviacin estndar y el coeficiente de variacin La repetibilidad se evala
en el proceso cuando este es desarrollado por un solo analista en un equipo durante un
perodo corto, y la reproducibilidad se evala por la variabilidad que se obtiene cuando
el proceso es llevado a cabo por diferentes analistas para un mismo proceso en
diferentes das. De esta manera se lleva a cabo una rotacin entre dos analistas en dos
das diferentes. Se realizan controles microbiolgicos de ambientes, superficies y
personal durante y al finalizar el proceso. Con esto se puede encontrar la precesin,
repetitividad y la reproducibilidad.
Tabla 12. Caractersticas morfolgicas y enzimticas de los microorganismos evaluados

Microorganismo Color de la Salmon-GAL X-glucoronido Indol
colonia
Escherichia coli Azul + + +
oscuro/violeta
Enterobacter Rojo/rosado + + +
aerogenes
Salmonella Incoloro - - -
typhimuium
Fuente: MERCK (Manual de medios de cultivo)
5.7. RECOLECCIN DE LA INFORMACIN
Se realiza una revisin bibliogrfica en la farmacopea oficial vigente de Estados Unidos

(USP 31), libros, artculos cientficos, revistas especializadas en el tema y normas
relacionadas con el control de calidad microbiolgico de aguas para uso farmacutico
(para nuestro caso agua potable, que es utilizada en la primera fase de produccin),
especficamente en la deteccin coliformes totales y coliformes fecales. As mismo, la
preparacin de reactivos, medios de cultivo y el desarrollo de los mtodos se realizan
segn Procedimientos Operativos Estndar de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
41
5.8 ANLISIS DE INFORMACIN
Para determinar el control del proceso, se realiza un anlisis de los resultados obtenidos
a lo largo de la validacin de la tcnica, adems de tener en cuenta los recuentos
obtenidos en los anlisis microbiolgicos de ambientes, superficies y personal.
5.8.1 Anlisis de datos
Los datos de los recuentos se analizan segn la media y desviacin estndar.
5.8.1.1 Media. ( )
Se define como un valor representativo de una serie de mediciones de un parmetro
determinado. Estas mediciones deben ser tomadas bajo las mismas condiciones de
modo tal que el valor resultante represente en forma objetiva dicho parmetro. Este
concepto seala la tendencia de centralizacin de los datos con respecto al valor
nominal de la especificacin. (Montgomery, 1991)
Numricamente se obtiene el coeficiente entre la sumatoria de todos los valores de la

serie y el nmero total de mediciones, es decir
= sumatoria
= media
N = nmero de elementos
X = valores o datos
5.8.1.2 Desviacin Estndar ()

Es una medida de la dispersin de una serie de mediciones de un determinado
parmetro, esto significa que no es un indicador de la variacin entre cada valor y la
media, se visualizan mejor cuando se presentan los datos en forma de una distribucin
de Frecuencia, es decir, ordenados por clase segn su magnitud (Montgomery. 1991)
Numricamente la desviacin estndar se obtiene de la raz cuadrada de la sumatoria de

todas los N cuadrados de la diferencia entre cada valor de una serie y su media, dividido
por el nmero total de mediciones, es decir:
42
: sumatoria
X: valor de la serie
: Media
N: nmero total de mediciones
43
6. RESULTADOS
6.1. ESTANDARIZACIN DE INCULOS DE TRABAJO

Analista 1: Aura Lozano
Analista 2: Marcela Carrillo
Tabla 13. Estandarizacin de inculos Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter

aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, La cantidad de inoculo
utilizada para el recuento fue de 0.1ml segn La figura 8 Analista 1
Recuento Recuento
Prueba microorganismo Tubo DILUCION UFC/ml UFC/ml
# Replica 1 Replica 2
-7
Escherichia 4 3x10 28x10=280 29x10=290
-8
coli 5 3x10 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 27x10=270 29x10=290
-8
typhimurium 5 3x10 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
Enterobacter 4 3x10-7 34x10=340 31x10=310

aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia 4 3x10-7 27x10=270 28x10=280

coli -8
5 3x10 2x10=20 3x10=30
ATCC 8739
-7
Salmonella 4 3x10 27x10=270 28x10=280
typhimurium
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
2 ATCC 14028
aerogenes -8
5 3x10 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia coli 4 3x10-7 29x10=290 29x10=290
ATCC 8739 -8
5 3x10 3x10=30 3x10=30
-7
Salmonella 4 3x10 28x10=280 27x10=270
typhimurium
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
3
aerogenes -8
5 3x10 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
44
Tabla 14. Estandarizacin de inculos Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, La cantidad de inoculo
utilizada para el recuento fue de 0.1ml segun La figura 8 Analista 2
Recuento Recuento
Prueba Microorganism Tubo DILUCION UFC/ml UFC/ml
o # Replica 1 Replica 2
-7
Escherichia 4 3x10 26x10=260 28x10=280
coli -8
5 3x10 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
-7
Salmonella 4 3x10 26x10=260 29x10=290
typhimurium
1 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
-7
Enterobacter 4 3x10 28x10=280 29x10=290
aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia 4 3x10-7 28x10=280 29x10=290
coli
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 26x10=260 29x10=290
typhimurium -8
5 3x10 3x10=20 3x10=30
2 ATCC 14028
aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia 4 3x10-7 28x10=280 28x10=180
coli
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
-7
Salmonella 4 3x10 29x10=290 28x10=280
typhimurium -8
5 3x10 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
3 Enterobacter 4 3x10
-7
29x10=290 28x10=280
aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
45
6.2. VERIFICACIN DE PROGRAMA DE CALIBRACIN Y MANTENIMIENTO DE
EQUIPOS DE INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Tabla 15. Programa de Calibracin y mantenimiento de los equipos utilizados en la

validacin.
EQUIPO MARCA/ ULTIMA PROXIMA PROVEEDOR

MODELO VERIFICACION VERIFICACION
Incubadora M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y

Hongos MEMMERT / balanzas E. U.
Rango 20-25 C U40
Incubadora PRECISION M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y

Bacterias SCIENTIFIC / balanzas E. U.
Rango 30-35 C CAT 31468
ICASA / M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y

Nevera NE balanzas E. U.
2-8 C
PAF / CF: 19-02-08 CF: 19-02-08 Interpharm de

Cabina de flujo NE Colombia Ltda.
laminar
OHAUS / M:06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y

Balanza 700-800 balanzas E. U.
mecnica
CARL ZEISS M:05-03-08 M: 05-03-09 Tecnibasculas y

Microscopio JENA / balanzas E. U.
BINOCULAR
M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y

pH-metro SCHOTT / CG balanzas E. U.
820
Fuente: INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
M: MANTENIMIENTO C: CALIBRACIN CF: CALIFICACIN N.E: NO EXISTE
6.3 PRUEBAS PRELIMINARES
6.3.1. Prueba de esterilidad del medio de cultivo
Para evaluar la prueba de esterilidad del agar chromocult, se escoge el 10% del medio
o
preparado y se lleva a incubar a temperatura 30-35 C, durante 24 horas, pasado el
tiempo de incubacin, no se observ ningn tipo de crecimiento microbiano, asegurando
el cumplimiento de la prueba de esterilidad para el agar chromocult.
46
6.3.2 Prueba de promocin de crecimiento
En la siguiente tabla se puede apreciar los resultados de la prueba de promocin de

crecimiento, segn el ensayo realizado de tipo cualitativo, los resultados del ensayo de
tipo cuantitativo, son los mismos de las tablas 13 y 14 en las cuales se encuentran
tabulados los resultados de la prueba de estandarizacin del inoculo.
Tabla 16. Prueba de promocin de crecimiento

MICROORGANISMO CARACTERSTICAS MACROSCPICAS EN
AGAR CHROMOCULT
Colonias pequeas, con pigmentacin morada
Escherichia coli debida a corta el sustrato X-glucoronido y Salmon
GAL.
Enterobacter aerogenes Colonias rosadas, pequeas, con pigmentacin
rosada debido a que solo corta el sustrato Salmon-
GAL.
Colonias pequeas, puntiformes y de coloracin
Salmonella typhimurium blanca debido a que no corta ningn sustrato del
medio.
6.3.3. Controles microbiolgicos durante el proceso
Tabla 17. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista

durante los ensayos realizados. Analista 1
AMBIENTE UFC/ hora SUPERFICIE UFC/25cm 2 ANALISTA UFC/placa

Pared Guantes Guantes
Cabina rea Cabina Recuentos Inicio Final
ENSAYOS M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL
0 0 Max Max 0 0 Max Max Max Max Max Max

12 12 12 12 3 1 7 5
Ensayo 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 1
Ensayo 3 0 0 BG- 1H 0 0 BG- 0 0 0 0 0
Ensayo 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CUMPLE SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI
47
M: bactrias mesfilas
L: Levadura
H: hongo
BG+: Bacilos Gram positivos
BG-: Bacilos Gram negativos
Tabla 18. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista

durante los ensayos realizados. Analista 2
AMBIENTE UFC/ SUPERFICIE ANALISTA
hora UFC/25cm2 UFC/placa
Pared Guantes Guantes
Cabina rea Cabina Recuentos Inicio Final
ENSAYOS M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL
0 0 Max Max 0 0 Max Max Max Max Max Max

12 12 12 12 3 1 7 5
Especificacin
Ensayo 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 1
Ensayo 3 0 0 BG- 1H 0 0 BG- 0 0 0 0 0
Ensayo 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI
CUMPLE
M: bactrias mesfilas
L: Levadura
H: hongo
BG+: Bacilos Gram positivos
BG-: Bacilos Gram negativos
Los resultados obtenidos para el control microbiolgico de ambientes, superficies y

dotacin de analistas CUMPLEN con las especificaciones establecidas por el laboratorio
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda
48
6.4. MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE
COLIFORMES TOTALES Y FECALES
6.4.1. Control negativo.
Los resultados del control negativo en la prueba, fueron satisfactorios, debido a que en
ningn anlisis realizado se presento crecimiento.
Tabla 19. Resultados control negativo. Analista 1
Muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Recuentos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
UFC/100ml
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabla 20. Resultados control negativo. Analista 2
Muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Recuentos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
UFC/100ml
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6.4.2. Prueba estndar y solucin de prueba
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la
solucin prueba mas E. coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo
49
Solucin de prueba: Agua potable + E.coli ATCC 8739
Analista 1: Aura Mara Lozano
Solucin Replica Solucin Prueba Porcentaje de Desviacin Coeficiente de
recuperacin estndar variacin
de prueba de prueba estandar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 32 34
1 2 29 31
3 34 31
Promedio 32 32 100 2.5 7.0
1 30 35
2 32 32
3 30 30
Promedio 31 32 97 1.1 3.0
2
1 28 31
2 27 33
3 31 30
Promedio 29 31 92 2.0 6.0
3
1 29 31
2 28 30
3 30 29
Promedio 29 30 93 1.0 3.0
4
1 31 28
2 29 29
3 28 30
Promedio 29 29 100 1.5 5.0
5
1 16 18
2 17 18
3 18 19
Promedio 17 18 94 1.0 5.0
6
1 30 31
2 31 33
3 28 29
Promedio 30 31 97 1.5 5.0
7
1 29 30
2 27 30
3 30 31
Promedio 29 30 97 1.5 5.0
8
1 30 31
2 31 33
3 29 29
Promedio 30 31 97 1.0 3.0
9
1 31 33
2 33 33
3 32 35
97 1.0 3.0
10 Promedio 32 33
Tabla 21. Comparativo del porcentaje de recuperacin E.coli ATCC 8739 en la solucin de
prueba y prueba estndar
50
FIGURA 13. Porcentaje de recuperacin de E.coli ATCC 8739
solucin prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
51
Solucin de prueba: Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Solucin Replica Solucin de Prueba Porcentaje de Desviacin Coeficiente de
de prueba prueba estndar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 29 30
1 2 30 35
3 28 33
Promedio 29 33 88 1.0 3.4
1 31 31
2 27 30
3 29 32
Promedio 29 31 93 2.0 6.8
2
1 30 30
2 25 30
3 28 31
Promedio 28 30 2.5 10
3 93
1 28 30
2 27 31
3 28 28
Promedio 28 30 0.5 1.7
4 93
1 29 32
2 29 29
3 27 28
Promedio 28 30 93 1.1 3.9
5
1 29 30
2 29 30
3 30 30
Promedio 29 30 96 0.5 1.7
6
1 32 36
2 30 35
3 29 30
Promedio 30 33 90 1.5 5.0
7
1 31 33
2 27 30
3 29 30
Promedio 29 31 93 2.0 6.8
8
1 30 30
2 26 29
3 29 30
Promedio 28 30 93 2.0 7.0
9
1 29 33
2 30 31
3 29 29
93 0.5 1.7
10 Promedio 29 31
Tabla 22. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Enterobacter aerogenes ATCC

13048 en la solucin de prueba y prueba estndar
52
FIGURA 14. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC 13048
solucin prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados
53
Solucin de prueba: Agua potable + Salmonella typhimurium ATCC 14028
de prueba de prueba estndar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 26 31
1 2 27 29
3 29 33
Promedio 27 31 87 1.5 5.5
1 29 29
2 30 31
3 27 33
Promedio 29 31 93 1.5 5.0
2
1 27 31
2 29 30
3 28 29 93 1.0 3.5
3 Promedio 28 30
1 29 31
2 27 29
3 28 30
Promedio 28 30 93 1.0 3.5
4
1 30 30
2 29 29
3 27 28
Promedio 29 29 100 1.5 5.0
5
1 26 29
2 29 31
3 28 29
Promedio 28 30 93 1.5 5.0
6
1 27 30
2 29 32
3 28 29
Promedio 28 30 93 1.0 3.5
7
1 25 27
2 27 29
3 29 32
Promedio 27 29 93 2.0 7.4
8
1 29 30
2 26 31
3 26 28
Promedio 27 30 90 1.7 6.2
9
1 26 30
2 30 31
3 29 27
96 2.0 7.0
10 Promedio 28 29
Tabla 23. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Salmonella typhimurium

ATCC 14028 en la solucin de prueba y prueba estndar
54
FIGURA 15. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028
solucin prueba ms E.coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo
55
Solucin de prueba: Agua potable + E.coli ATCC 8739
Solucin Replica Solucin de Prueba Porcentaje de Desviacin Coeficiente
recuperacin estndar de variacin
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 35 31
1 2 29 32
3 29 30
Promedio 31 31 100 3.4 10.9
1 26 32
2 29 35
3 30 34
Promedio 28 34 82 2.0 7.1
2
1 29 30
2 29 32
3 30 30
Promedio 29 31 93 0.5 1.7
3
1 29 30
2 29 29
3 28 28
4 Promedio 29 29
100 0.5 1.7
1 27 29
2 28 29
3 29 31
5 Promedio 28 30
93 1.0 3.5
1 18 18
2 19 20
3 19 21
6 Promedio 19 20
95 0.5 2.6
1 29 30
2 28 29
3 30 32
7 Promedio 29 30
97 1.0 3.4
1 26 29
2 30 29
3 29 31
Promedio 28 30 93 2.0 7.1
8
1 29 30
2 30 30
3 28 28
9 Promedio 29 29
100 1.0 7.1
1 30 32
2 29 33
3 32 30
10 Promedio 30 32
94 1.5 5.0
Tabla 24. Comparativo del porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 873 en la

solucin de prueba y prueba estndar
56
FIGURA 16. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739
solucin prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo
57
Solucin de prueba: Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
de prueba de prueba estndar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 28 32
1 2 31 32
3 30 34
Promedio 30 33 91 1.5 5.0
1 29 30
2 27 31
3 29 33
Promedio 29 31 93 1.1 3.7
2
1 26 30
2 30 32
3 27 29
3 Promedio 28 30
90 2.0 7.1
1 29 30
2 29 29
3 27 30
Promedio 28 30 93
4 1.1 4.0
1 30 31
2 26 28
3 27 29
5 Promedio 28 29
96 2.0 7.1
1 32 36
2 33 35
3 29 30
6 Promedio 31 34
91 2.0 6.4
1 29 30
2 28 32
3 30 33
7 Promedio 29 32
91 1.0 3.4
1 31 33
2 31 33
3 29 31
8 Promedio 30 32
94 1.1 3.6
1 29 32
2 29 30
3 28 32
9 Promedio 29 31
93 0.5 1.7
1 29 30
2 27 33
3 29 30
10 Promedio 29 31
93 1.1 3.7
Tabla 25. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Enterobacter aerogenes

58
FIGURA 17. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC 13048
solucin prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados
59
Solucin de prueba: Agua potable + Salmonella typhimurium ATCC 14028
Solucin Replica Solucin de Prueba Porcentaje de Desviacin Coeficiente de
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 35 31
2 28 33
1 3 27 34
Promedio 30 33
91 4.3 14.3
1 26 31
2 28 30
3 29 34
2 Promedio 28 32
87 1.5 5.3
1 27 30
2 28 31
3 28 29
3 Promedio 28 30
93 0.5 1.7
1 27 30
2 26 27
3 29 31
4 Promedio 27 29
93 1.5 5.5
1 29 29
2 26 28
3 30 30
5 Promedio 28 29
96 2.0 7.1
1 27 28
2 29 30
3 30 32
6 Promedio 29 30
97 1.5 5.1
1 28 32
2 29 35
3 30 34
7 Promedio 29 34
85 1.0 3.4
1 33 34
2 30 32
3 29 31
8 Promedio 31 32
97 2.0 6.4
1 30 30
2 30 33
3 28 29
9 Promedio 29 31
93 1.1 3.7
1 29 29
2 29 32
3 30 30
10 Promedio 29 30
97 0.5 2.5
Tabla 26. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Salmonella typhimurium

60
FIGURA 18. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028
6.5. RECUENTO COMBINADO DE LOS MICROORGANISMOS EVALUADOS EN EL

MEDIO.
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de
-8
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10
(30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de Salmonella
typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril),
tambin llamada control positivo
61
Solucin Replica Solucin de Prueba Recuento Control (+)
de prueba prueba estndar UFC/100ml
S. typhimurium
E. coli UFC/100ml UFC/100ml
UFC/100ml
1 12 34 14 31
2 10 31 15 29
1
3 14 31 12 33
Promedio 12 32 13 31
1 15 35 12 29
2 17 32 14 31
3 12 30 11 33
2 Promedio 14 32 12 31
1 7 31 13 31
2 6 33 12 30
3 7 30 11 29
3 Promedio 6 31 12 30
1 15 31 16 31
2 13 30 14 29
3 10 29 12 30
4 Promedio 12 30 14 30
1 13 28 15 30
2 12 29 12 29
3 14 30 14 28
5 Promedio 13 29 13 29
1 15 18 12 29
2 12 18 16 31
3 13 19 14 29
6 Promedio 13 18 14 30
1 15 31 13 30
2 13 33 14 32
3 14 29 12 29
7 Promedio 14 31 13 30
1 12 30 15 27
2 16 30 12 29
3 15 31 11 32
8 Promedio 14 30 12 29
1 13 31 13 30
2 14 33 15 31
3 12 29 13 28
9 Promedio 13 31 13 30
1 14 33 12 30
2 15 33 14 31
3 11 35 11 27
10 Promedio 13 33 12 29
Tabla 27. Recuento Agua potable + Escherichia coli ATCC +

recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10-8
-8
(30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 de
Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo.
62
S. typhimurium
E. aerogenes UFC/100ml UFC/100ml
UFC/100ml
1 14 30 16 31
2 12 35 13 29
1
3 16 33 15 33
1 12 31 13 29
2 14 30 14 31
3 13 32 12 33
2 Promedio 13 31 13 31
1 12 30 16 31
2 14 30 15 30
3 14 31 16 29
3 Promedio 13 30 15 30
1 12 30 15 31
2 11 31 16 29
3 15 28 14 30
4 Promedio 12 30 15 30
1 12 32 16 30
2 14 29 15 29
3 11 28 15 28
5 Promedio 12 30 15 29
1 12 30 13 29
2 12 30 12 31
3 11 30 15 29
6 Promedio 11 30 13 30
1 14 36 12 30
2 13 35 13 32
3 13 30 11 29
7 Promedio 13 33 12 30
1 16 33 14 27
2 12 30 12 29
3 13 30 15 32
8 Promedio 13 31 13 29
1 17 30 13 30
2 13 29 16 31
3 12 30 11 28
9 Promedio 14 30 13 30
1 13 33 13 30
2 12 31 12 31
3 14 29 14 27
10 Promedio 13 31 13 29
Tabla 28. Recuento Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 +

Salmonella typhimurium ATCC 14028.
-8
(30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de
Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua
estril), tambin llamada control positivo.
63
E. coli
UFC/100ml
1 12 30 13 34
2 16 35 15 31
1
3 14 33 13 31
1 12 31 11 35
2 13 30 13 32
3 14 32 13 30
2 Promedio 13 31 12 32
1 12 30 9 31
2 15 30 7 33
3 12 31 8 30
3 Promedio 13 30 8 31
1 15 30 12 31
2 16 31 10 30
3 14 28 14 29
4 Promedio 15 30 12 30
1 10 32 15 28
2 10 29 16 29
3 10 28 14 30
5 Promedio 10 30 15 29
1 12 30 13 18
2 10 30 11 18
3 14 30 14 19
6 Promedio 12 30 12 18
1 8 36 12 31
2 10 35 12 33
3 9 30 15 29
7 Promedio 9 33 13 31
1 12 33 12 30
2 15 30 15 30
3 11 30 15 31
8 Promedio 12 31 14 30
1 13 30 12 31
2 12 29 13 33
3 14 30 13 29
9 Promedio 13 30 12 31
1 11 33 11 33
2 14 31 10 33
3 15 29 13 35
10 Promedio 13 31 11 33
Tabla 29. Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 +

-8
(30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de Salmonella
typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril),
tambin llamada control positivo.
64
Analista 2: Marcela carrillo
S. typhimurium
E. coli UFC/100ml UFC/100ml
UFC/100ml
1 13 31 16 31
2 10 32 14 33
1
3 12 30 13 34
1 12 32 15 31
2 11 35 12 30
3 14 34 11 34
2 Promedio 12 34 13 32
1 12 30 14 30
2 15 32 13 31
3 13 30 15 29
3 Promedio 13 31 14 30
1 15 30 14 30
2 17 29 13 27
3 13 28 11 31
4 Promedio 15 29 13 29
1 12 29 16 29
2 14 29 15 28
3 12 31 12 30
5 Promedio 13 30 14 29
1 13 18 14 28
2 12 20 12 30
3 15 21 10 32
6 Promedio 13 20 12 30
1 10 30 12 32
2 10 29 15 35
3 13 32 14 34
7 Promedio 11 30 14 34
1 13 29 13 34
2 12 29 12 32
3 14 31 15 31
8 Promedio 13 30 13 32
1 13 30 14 30
2 16 30 12 33
3 11 28 15 29
9 Promedio 13 29 14 31
1 12 32 11 29
2 15 33 14 32
3 10 30 14 30
10 Promedio 12 32 13 30
Tabla 30. Agua potable + Escherichia coli ATCC +

(30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de
Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo.
65
S. typhimurium
UFC/100ml
1 15 32 16 31
2 13 32 15 33
1
3 14 34 15 34
1 15 30 12 31
2 17 31 10 30
3 12 33 13 34
2 Promedio 15 31 12 32
1 13 30 16 30
2 12 32 15 31
3 11 29 12 29
3 Promedio 12 30 14 30
1 15 30 14 30
2 13 29 12 27
3 11 30 13 31
4 Promedio 13 30 13 29
1 14 31 13 29
2 12 28 16 28
3 10 29 10 30
5 Promedio 12 29 13 29
1 10 36 14 28
2 12 35 10 30
3 11 30 11 32
6 Promedio 11 34 12 30
1 13 30 12 32
2 15 32 14 35
3 12 33 13 34
7 Promedio 13 32 13 34
1 12 33 12 34
2 15 33 14 32
3 10 31 11 31
8 Promedio 12 32 12 32
1 12 32 13 30
2 14 30 11 33
3 13 32 10 29
9 Promedio 13 31 11 31
1 15 30 14 29
2 12 33 15 32
3 14 30 11 30
10 Promedio 14 31 13 30

-8
(30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 de
Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua
estril), tambin llamada control positivo.
66
E. coli
UFC/100ml
1 15 32 16 31
2 13 32 14 32
1
3 14 34 15 30
1 15 30 12 32
2 17 31 15 35
3 12 33 10 34
2 Promedio 15 31 12 34
1 13 30 14 30
2 12 32 15 32
3 11 29 12 30
3 Promedio 12 30 14 31
1 15 30 14 30
2 13 29 12 29
3 11 30 13 28
4 Promedio 13 30 13 29
1 14 31 16 29
2 12 28 16 29
3 10 29 14 31
5 Promedio 12 29 15 30
1 10 36 14 18
2 12 35 10 20
3 11 30 13 21
6 Promedio 11 34 12 20
1 13 30 12 30
2 15 32 14 29
3 10 33 13 32
7 Promedio 13 32 13 30
1 12 33 15 29
2 10 33 12 29
3 15 31 11 31
8 Promedio 12 32 13 30
1 14 32 13 30
2 12 30 10 30
3 10 32 14 28
9 Promedio 12 31 12 29
1 15 30 12 32
2 12 33 10 33
3 10 30 15 30
10 Promedio 12 31 12 32

67
FIGURA 19. Prueba de promocin de crecimiento de E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor
FIGURA 20. Prueba de promocin de crecimiento de E. aerogenes
Fuente: Autor
68
FIGURA 21. Prueba de promocin de crecimiento de S. typhimurium
Fuente: Autor
FIGURA 22. Solucin de prueba: E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor
FIGURA 23. Solucin de prueba: S. typhimurium en agar chromocult
69
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
Durante el procesamiento de las muestras, los resultados del control microbiolgico de

ambientes, superficies y dotacin de los analistas, fueron confiables. En las tablas 17 y
18, se observa que los controles microbiolgicos de ambientes y superficies para la
cabina de flujo laminar y el rea, cumplen con las especificaciones establecidas por
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., lo que asegura que las condiciones de trabajo en
las pruebas evaluadas, fueron ptimas. Al realizar las pruebas bajo condiciones
ambientales controladas se reducen falsos positivos por contaminacin microbiana
cruzada, esto se garantiza con el proceso de limpieza y desinfeccin para el rea de
recuentos y el laboratorio, siendo primordial para obtener resultados confiables durante
la validacin.
La calificacin y verificacin de equipos es de suma importancia dentro de la

metodologa por lo cual se evidenci que los equipos utilizados en la validacin y etapa
experimental con relacin a la fecha de calibracin, calificacin y verificacin, se
encontraban vigentes; por consiguiente se puede asegurar que los equipos utilizados
funcionan de acuerdo con sus especificaciones operacionales establecidas. (Tabla
No.15).
Para evaluar la prueba de esterilidad en cada uno de los medios de cultivo preparados y
utilizados, se escogi el 10% de los medios de cultivo preparados en cada prueba (USP,
31) y se llev a incubar a la temperatura y tiempo especficos (24 h a 30-35oC) para
cada uno de los medios, pasado el tiempo de incubacin no se observ ningn tipo de
crecimiento microbiano, asegurando que los resultados obtenidos en la prueba de
esterilidad de los medios es confiable dentro del proceso de validacin.
El control de calidad en la preparacin y evaluacin de los medios de cultivo es

considerado como parte esencial y buena prctica de laboratorio, la cual es necesaria
para mantener el nivel y la ejecucin de cualquier tcnica microbiolgica. Por est razn,
se le confiere una gran importancia y est considerado como uno de los puntos crticos
de control en el anlisis microbiolgico, del cual depende la seguridad de los resultados
que emiten los laboratorios de ensayo. De esta manera un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios, adems de estar exento de
todo microorganismo contaminante, ya que de la inocuidad y capacidad del medio de
promover el crecimiento de los microorganismos depende un buen resultado en el
anlisis microbiolgico. (Ligthfood, 2002). Es as, como la prueba de promocin de
70
crecimiento demostr que el medio de cultivo (agar chromocult) contiene los nutrientes
necesarios para el desarrollo y crecimiento de coliformes totales y fecales debido a que
se obtuvo una recuperacin mayor del 70% de los microorganismos que fueron
inoculados; (tablas 21- 26) esto concuerda con lo establecido en la USP 31 (Seccin
1227 validacin de mtodos de neutralizacin comparaciones de recuperacin), en la
que se detalla claramente que el numero de UFC recuperadas del producto (para
nuestro caso muestras de agua) no debe ser menor del 70% del numero recuperado del
control del inoculo (prueba estndar control positivo); por otro lado como se puede ver
en cada una de las figuras los limites oscilan entre 50 y 200, debido a que segn la
USP 31 en su capitulo 61 EXAMEN MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS NO
ESTERILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO, especifica que para medios
slidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de dos a partir del
valor calculado para un inoculo estandarizado, lo cual concuerda con los resultados
obtenidos debido a que ningn recuento obtenido se sale se los limites establecidos, de
acuerdo con el limite de tendencia central obtenido gracias a los recuentos de nuestro
control positivo (prueba estndar 100%), los cuales sirvieron como base para la
comparacin con los recuentos obtenidos en la solucin de prueba, como se puede ver
en cada una de las graficas, los porcentajes de recuperacin en cada una de las pruebas
estn muy cercanos al valor central lo que nos indica que los resultados con muy
coherentes con los obtenidos en la prueba estndar.
Igualmente, al inocular las cepas ATCC sobre el agar chromocult se obtuvieron las
caractersticas macroscpicas tpicas de cada una (Ver tabla No 16) y tambin se realiz
coloraciones de Gram a las colonias para evaluar las caractersticas microscpicas.
Adems, el crecimiento de los microorganismos se obtuvo en un tiempo de 24 horas, de
esta manera, se establece que los medios cromognicos poseen una ventaja sobre los
medios tradicionales, debido a que la deteccin de coliformes totales y fecales se obtiene
de una manera rpida (M.A YANEZ et al., 2005); esto gracias a que los sustratos que
presenta el medio son los especficos para que las enzimas que presentan tanto E.coli
como Enterobanter aerogenes, sean escindidos y de esta manera se puede, se produzca
un reaccin rpida y sensible (Rompre,A et al., 2001).
En los ensayos estndar (control positivo) del mtodo de recuento para coliformes
fecales, (Escherichia coli ATCC 8739), coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC
13048) y Salmonella typhimurium ATCC 14028, la recuperacin de los microorganismos
fue de 16-36 UFC/100ml, tal como se puede ver en las tablas 21 26, donde se
compara la prueba estndar y la solucin de prueba. Cabe destacar que para la prueba
estndar, el vehculo de transporte de los microorganismos evaluados fue agua estril
71
para inyeccin, debido a que es un agua en la que no se va a encontrar ninguna
interferencia (como cloro u otros elementos) que impida el crecimiento, lo que nos
llevara a reportar falsos positivos y para la solucin de prueba se utiliz agua potable.
Debido a que validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de
evidencia documentada que un proceso especifico producir de forma consistente
productos que reunirn las caractersticas de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA,
1987) para tal fin, se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y
los pasos a seguir para el desarrollo de la validacin del mtodo de filtracin por
membrana empleado para la deteccin de coliformes totales y fecales en agar
chromocult para agua potable, en donde se emple una serie de datos para determinar
que realmente es eficaz y se obtienen resultados confiables; para esto se evaluaron
parmetros cuantitativos de validacin como: especificidad, precisin (repetitividad y
reproducibilidad), y exactitud.
La especificidad se obtuvo al comparar las medias y los datos del porcentaje de

recuperacin entre la prueba estndar y la solucin de prueba, para el recuento de
coliformes fecales (Escherichia coli ATCC 8739 ), el porcentaje de recuperacin es de
96.4%; para el recuento de coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC 13048) es
del 92.5% y para Salmonella typhimurium ATCC 14028 el porcentaje de recuperacin es
de 93.7%; los resultados anteriormente obtenidos concuerdan con los obtenidos en el
estudio de MAHEUX. A. et al. (2008), en el cual se obtuvieron porcentajes de
recuperacin para E .coli semejantes, por tanto se puede concluir que la recuperacin
de los coliformes fecales fue mayor que la de los otros dos microorganismos, lo anterior
se debe a que Escherichia coli es la nica especie dentro de las enterobacterias que
presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil--D-
glucornico (MUG) y el contenido de triptfano revela la reaccin de indl y aumenta con
ello la identificacin, en combinacin con la reaccin X-GAL y la reaccin MUG, siendo
esta una ventaja para el crecimiento de este microorganismo.
Los porcentajes de recuperacin anteriormente citados son reportados gracias a los

recuentos de colonias obtenidos por el conteo de colonias caractersticas para cada
especie gracias al color que tomaron las colinas, para este estudio la cepa de
Enterobacter aerogenes que fue el coliforme total seleccionado, tomo una coloracin
rosada roja; la colonia de E. coli tomo una coloracin azul-violeta y la colonia de
Salmonella typhimurium tomo una coloracin blanca, esto concuerda con los resultados
encontrados en el estudio realizado por M.A YANEZ et al. (2005), en el cual se
escogieron los mismos microorganismos y se presentaron las mismas coloraciones en
las colonias; las coloraciones caractersticas se deben principalmente a que los
72
coliformes totales solo pueden escindir uno de los sustratos, mientras que E. coli puede
escindir los dos sustratos.
Segn la USP 31, 2008 la repetibilidad es la medida de la precisin del mtodo cuando
ste se realiza por el mismo analista, el mismo da, mismos reactivos y mismo
instrumento, y la reproducibilidad se mide cuando el ensayo se realiza por diferentes
analistas, diferentes das y diferentes instrumentos, por lo tanto estos parmetros nos
indican la precisin del mtodo de recuento, la cual se mide con la dispersin de la
medida alrededor de un valor medio o central y mide la concordancia entre ensayos
individuales cuando el mtodo se aplica repetidas veces a muestras separadas e
idnticas, obtenidas del mismo lote de material homogneo ( en este caso muestras de
agua potable obtenidas de la misma fuente, la llave del rea de lavado del laboratorio).
De esta manera y de acuerdo a los resultados se determinaron los valores de las
medias, las desviaciones estndar y los coeficientes de variacin obtenidos en cada una
de los ensayos y con cada uno de los analistas.
Al establecer la reproducibilidad y la repetibilidad del mtodo, se demuestra que no hay

diferencia significativa entre los valores de las medias obtenidas por cada analista y
microorganismos evaluados, ni tampoco hay diferencia entre los valores de las medias
de cada analista, lo que muestra que el mtodo evaluado es reproducible y repetible, y
que los resultados no van a diferir si los mtodos son realizados por el mismo analista el
mismo da o por analistas diferentes en das diferentes.
De igual manera segn los resultados obtenidos de las medias determinadas por cada
muestra de agua y microorganismo, se establece que el mtodo es preciso (Tablas 21 -
26).
La exactitud de un mtodo analtico es la proximidad entre los resultados de la prueba

obtenidos mediante el mtodo y el valor verdadero (USP 31, 2008), este parmetro se
determin comparando el porcentaje de recuperacin de la solucin de prueba con los
porcentajes de recuperacin del ensayo estndar, determinando que en el mtodo de
filtracin por membrana para coliformes fecales el porcentaje de recuperacin de los
microorganismos inoculados para el agua potable fue mayor al 96% (figura 13), mientras
que para los coliformes totales fue menor (90%) (Figura 14). Adems se observ que
las desviaciones estndar y los coeficientes de variacin no son muy variables en la
solucin de prueba, y aunque existe un solo dato que sale del rango en cada una de las
tablas en los que se pueden encontrar los resultados obtenidos, este no tiene mucha
relevancia sobre los dems datos, debido a que no hay una dispersin notable; por otro
73
lado el coeficiente de variacin nunca supera un valor de 10, lo cual es un valor aceptado
y utilizado en la industria farmacutica (Tablas 21 - 26).
En la solucin de prueba la recuperacin de los microorganismos inoculados se

determin por la presencia de caractersticas macroscpicas en agar chromocult, esta
recuperacin fue del 96%, lo que indica que la adicin de tiosulfato de sodio al 1% logra
inactivar el cloro presente en el agua potable, logrando as, recuperar casi la totalidad de
los microorganismos presentes en la muestra de agua (Figuras 22 - 23).
74
8. CONCLUSIONES
Se realiz la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin

de coliformes totales y fecales para agua potable, utilizando agar chromocult en
el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Esta validacin cumple con
los parmetros establecidos.
Se demostr que el mtodo de filtracin por membrana para coliformes totales y

fecales para agua potable, en el LABORATORIO INTERPHARM DE COLOMBIA
Ltda. es repetible, reproducible, exacto y especfico, segn el POE DCM 046
DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR
CHROMOCULT.
Se comprob la efectividad del agar chromocult como un mtodo alternativo de

rpida recuperacin para reducir costos y desarrollar tcnicas con mayor eficacia
y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Se demostr que el medio cromognico utilizado en el mtodo validado,

contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos
evaluados gracias a la ptima recuperacin obtenida en la prueba de promocin
de crecimiento.
Se logro evidenciar mediante la realizacin de un pool de microorganismos que

el medio presenta los sustratos adecuados para diferenciar el crecimiento de
diversos microorganismos mediante la coloracin de las colonias.
75
9. RECOMENDACIONES
Aunque los resultados obtenidos en este trabajo de grado, estaban dentro

de los parmetros esperados; se recomienda utilizar inculos con un
nmero mayor de UFC/ml con el fin de evitar variaciones muy grandes en
los recuentos y por ende en los porcentajes de recuperacin.
Para prximos estudios de validacin del mtodo de deteccin de coliformes

totales y fecales, se debe tener en cuenta las pruebas preliminares de
promocin de crecimiento y esterilidad, las cuales se le deben realizar tanto
al medio que se esta evaluando (para este caso el agar chromocult), como a
los que se utilizan para la estandarizacin de los inculos de trabajo y los
utilizados en las pruebas de controles positivos.
Es aconsejable realizar una comparacin entre el mtodo a validar y el

mtodo oficial, para de esta manera poder comparar los resultados
obtenidos entre cada uno de ellos y as establecer las ventajas del nuevo
mtodo con respecto al tradicional
Para prximas validaciones seria importante utilizando adems de agar

chromocult, un medio de cultivo alterno, para tener una alternativa en caso
de que el laboratorio no cuente en un momento dado, con el medio que fue
validado el mtodo.
Es importante que para prximos estudios de validacin de este mtodo, se

realice adicionalmente pruebas bioqumicas para la identificacin de cada
uno de los microorganismos utilizados en los ensayos de validacin
Se aconseja, tener en cuenta algn cambio de los equipos a lo largo de la

validacin, ya que seria conveniente realizar una revalidacin, utilizando los
equipos cambiados.
76
10. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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81
11. ANEXOS
ANEXO 1. Composicin de los medios de cultivo (g/litro)
Agar Casoy: peptona de casena 15g, peptona de harina de soya 5g, cloruro
sdico 5g, agar-agar 15g.
Agar Chromocult: peptona 3.0g, cloruro sdico 5.0g, dihidrogenofosfatopotasico

1.7g, hidrogenofosfato di potsico 3.0g, piruvato sdico 1.0g, triptfano 1.0g,
agar-agar 12.0g, laurilsultafo sdico 0.1g, mezcla de cromgenos 0.2g.
Agar Plate Count: peptona de casena 5.0g, extracto de levadura 2.5g, D(+)-
glucosa 1.0g, agar-agar 14.0g
82

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VALIDACIN DEL MTODO DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN

AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

DRA. JEINNY ROMERO TORRES DRA. JANETH ARIAS PALACIOS

INGRID SCHULER JANETH ARIAS

A la Dra. Janeth Arias, asesora, por su entrega, compromiso, comprensin y apoyo

Al Dr. Juan Carlos Jimnez, Director Administrativo de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.,

A INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., especialmente al rea de microbiologa, a Diana,

6.4. METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA DETECCION DE

TABLA 25. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solucin de

As mismo, el agua puede ser uno de los principales transmisores de enfermedades

Con el fin de cumplir con las reglamentaciones gubernamentales y ayudar a mejorar la

2.1. AGUA POTABLE

Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios pblicos de agua, un

El peligro mas comn y ms difundido relativo al agua potable es el de su contaminacin,

Figura 1: Fuente de agua

El agua potable no debe contener en ningn caso microorganismos considerados

No debe contener substancias o cuerpos extraos de origen biolgico, orgnico,

Tabla 1. Caractersticas fsicas del agua potable

Fuente: Resolucin 2115 de 2007

Tabla 2. Caractersticas qumicas de sustancias presentes en el agua

Fuente: Resolucin 2115 de 2007.

2.1.2. Anlisis microbiolgico del agua

Se define anlisis microbiolgico a cada uno de los procedimientos de laboratorio que

Tomado de: Resolucin 2115 de 2007.

2.1.3. Proceso de potabilizacin del agua

2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable

El compuesto utilizado para inactivar el cloro en el agua es el tiosulfato de sodio, el cual

Varios organismos patgenos de transmisin fecal-oral pueden estar presentes en el

Cabe sealar sin embargo, que aunque se reconoce que la determinacin de la

2.2.1. Coliformes Totales

La prueba mas relevante utilizada para la identificacin del grupo Coliformes, es la

2.2.1.1. Enterobacter aerogenes

Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque tambin libremente en el suelo y

Figura 2. Enterobacter aerogenes

Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, son dos bacterias idnticas en muchas

2.2.2 Coliformes Fecales

Los coliformes fecales tambin denominados coliformes termotolerantes, llamados as

Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes capaces de producir indol a

E.coli presenta caractersticas bioqumicas importantes que permiten la diferenciacin

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano.

Tabla 5. Caractersticas de Coliformes Totales y E. coli

2.2.3. Salmonella spp.

Salmonella spp se caracteriza bioqumicamente por su capacidad de fermentar la

Figura 4. Salmonella spp en agar XLD

2.3. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE

Para la determinacin de coliformes totales y fecales en agua potable, la legislacin

La tcnica de filtracin por membrana utiliza un mecanismo mediante el cual se atrapan

Esta tcnica es altamente reproducible y proporciona resultados numricos, es una

Figura 5. Trampa de filtracin

2.3.1. Filtros de membrana

Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen

2.3.2. Tipos de filtro de membrana

2.3.2.1 Filtros de profundidad

Presenta ventajas como la alta capacidad de retencin de partculas sobre su superficie

2.3.2.2 Filtros de superficie o membrana

2.3.2.2.1 Membrana de nitrato de celulosa

2.3.2.2.2 Membrana de acetato de celulosa

2.4. MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en donde crecen, y se

Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:

La composicin qumica del medio de cultivo debe proveer los requerimientos