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I. INTRODUCCIN

La tcnica de cultivo de tejidos vegetales consiste en aislar un explante

y proporcionarle artificialmente condiciones fsicas y qumicas; para que las clulas
expresen su potencial intrnseco; es necesaria la adicin de hormonas y la adopcin
de procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminacin
microbiana.

La expresin cultivo in vitro de plantas significa cultivar fragmentos de

plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivo
tiene dos caractersticas fundamentales: la asepsia (ausencia de grmenes), y el
control de los factores que afectan el crecimiento. La micropropagacin o
propagacin clonal es una de las aplicaciones ms generalizadas del cultivo in vitro;
a travs de la micropropagacin, a partir de un fragmento (explante) de la planta
madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genticamente
idnticas, denominadas clones. El explante ms usado para los procesos de
propagacin in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. En esta prctica
daremos a conocer los procedimientos y establecimiento de explantes.

Objetivos

Familiarizarse con los procedimientos de establecimiento in vitro y

siembra de explante (Semilla de Capirona Calycophyllum
spruceanum).
Conocer las normas para el trabajo asptico en el rea de siembra.
Identificar los puntos clave para disminuir la contaminacin por
manipulacin.
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II. REVISIN DE LITERATURA

2.1. Cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in Vitro de tejidos vegetales, es

una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir
de un pequeo segmento inicial de tejido (explante) es posible regenerar en poco
tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando
a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas
controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las tcnicas tradicionales de
cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagacin de grandes volmenes
de plantas en menor tiempo; as como el manejo de las mismas en espacios
reducidos. Por otro lado, la tcnica es de gran utilidad en la obtencin de plantas
libres de patgenos; plantas homocigotas, en la reproduccin de plantas en peligro
de extincin, en estudios de ingeniera gentica, etc.

2.1.1. Explante

Parte separada de un vegetal, por ejemplo: protoplasto, clula, tejido u

rgano, que al ser cultivado en medio adecuado puede permitir la regeneracin de
plantas completas La eleccin de un explante apropiado constituye el primer paso
para el establecimiento exitoso del cultivo de tejidos; dicha eleccin estar en
funcin del objetivo perseguido y de la especie vegetal utilizada.
El tamao del explante es otro factor a considerar y que tambin va a
depender del objetivo y de la especie vegetal.
 3

2.1.2. Asepsia

La asociacin explante-medio y las condiciones fsicas en que

normalmente se incuban los cultivos conforman un ambiente propicio para la
proliferacin de microorganismos (bacterias, hongos), los cuales pueden destruir
tales cultivos, competir con el explante por el medio de cultivo o modificarlo. Evitar
las contaminaciones con microorgansmos es un aspecto bsico que se debe tener
en cuenta para el xito. Para establecer cultivos aspticos es necesario:
a) trabajar en ambientes adecuados;
b) esterilizar los medios de cultivo;
c) desinfectar superficialmente los explantes, para liberarlos de microorgansmos
exgenos y
d) Manejar adecuadamente las normas de asepsia.

2.1.3. Medio de cultivo

Componentes:
a. Carbono
b. Nutrientes minerales
c. Vitaminas
d. Agente gelificante (en el caso de medios semislidos)
e. Sustancias reguladoras del crecimiento.
f. Otros compuestos.
Fuentes de Carbono: la sacarosa (2 al 5 %) es la ms utilizada, puede reemplazarse
por glucosa y en menor medida por fructosa.
Nutrientes minerales: el medio de cultivo debe proveer macro y micronutrientes a
los explantes. La composicin vara segn la especie vegetal, el tipo de explante y
los resultados esperados. Entre los medios ms usados estn: MS=Murashige et
al., 1962; B5=Gamborg et al., 1968; N6=Chu et al., 1975; Wh = Chite, 1943.
Vitaminas: en general los medios contienen varias vitaminas, siendo esencial la
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incorporacin de tiamina. Agente gelificante: en los medios semislidos

comnmente se adiciona agaragar (0.6 al 1.0 %), pero es importante considerar la
calidad del mismo.
Un medio de cultivo puede ser definido como una formulacin de sales inorgnicas
y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos.
Roca y Mroginski (1991) y Murashige (1974), recomiendan que un medio de cultivo
ideal deber contener macrosales, microsales, acompaadas de carbono,
vitaminas, agente gelificante y sustancias reguladoras de crecimiento.

2.2. Desinfectantes empleados en la micropropagacin de tejidos

vegetales

La finalidad de los desinfectantes es destruir o inhibir el crecimiento de

microorganismos patgenos, sin alterar la estructura celular de los tejidos vivos. El
desinfectante interacta con la membrana celular del microorganismo, seguida de
la penetracin dentro de la clula y luego su accin sobre un blanco, alterando las
funciones normales del microorganismo.
2.2.1. cido Hipocloroso
El cloro es un potente agente germicida con amplio espectro de
actividad, frente a bacterias, esporas, hongos, virus y protozoos. Presenta efectos
bactericidas rpidos, es un agente oxidante que inactiva protenas enzimticas.
(Snchez et al., 2005) El hipoclorito tiene como mecanismo de accin sobre los
microorganismos la inhibicin de las reacciones enzimticas y desnaturalizacin de
las protenas. (Snchez et al., 2005). Este compuesto acta como un solvente de
materia orgnica, especialmente de cidos grasos, a quienes transforma en sales
de cidos grasos (jabones) y glicerol, reduciendo la tensin superficial de la solucin
remanente. Adems, el hipoclorito de sodio neutraliza los aminocidos, formando
agua y sales. Con la disminucin de iones hidroxilo (OH), mediante la formacin 7
de agua, se reduce el pH, estimulando la presencia de cido hipocloroso que en
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contacto con componentes orgnicos acta como solvente, libera cloro que se
combina con el grupo amino de las protenas, formando cloroaminas. El cido
hipocloroso y los iones hipoclorito (OCl-1 ) llevan a la degradacin e hidrlisis de los
aminocidos.

2.2.2. Alcoholes
Son compuestos orgnicos del agua, conocidos desde la antigedad y
usados como antispticos de limpieza y desinfeccin. Adems de la actividad
antimicrobiana, son un buen solvente de otros productos, entre ellos muchos
antispticos y desinfectantes, potenciando su actividad. (Snchez et al., 2005) Los
alcoholes poseen una rpida accin y amplio espectro de actividad, actuando sobre
bacterias gramnegativas y grampositivas, incluyendo micobacterias, hongos y virus,
pero no son esporicidas. (Snchez et al., 2005). El mecanismo de accin consiste
en destruir la membrana celular y desnaturalizar las protenas. Su eficacia Su
eficacia est basada en la presencia de agua, esto se debe a que estos compuestos
acuosos penetran mejor en las clulas y bacterias permitiendo as el dao a la
membrana y rpida desnaturalizacin de las protenas con la consiguiente
interferencia en el metabolismo y lisis celular.
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III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Lugar de ejecucin

La presente prctica se realiz en el Laboratorio de Biotecnologa y

Diversidad Molecular de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS)
ubicado polticamente en el distrito Rupa-Rupa, provincia Leoncio Prado, regin
Hunuco Per.

3.2. Materiales/equipos empleados

Una cmara fotogrfica

Un cuaderno de apuntes
La gua de prcticas

3.2.1. Material vegetativo y suministros

Semillas de Calycophyllum spruceanum (Capirona).

Frascos con medio de cultivo MS, sumplementado con BAP 1 mg/l y
AIA 0,5 mg/l.

3.3. Metodologa

3.3.1. Da anterior a la siembra

a) Preparar los materiales necesarios.
b) Aplicar leja 1% en la cabina de flujo, suelo y reas de trabajo.
c) Encender la luz UV (OJO: radiacin cancergena, NO VER
DIRECTAMENTE Y DESALOJAR EL REA INMEDIATAMENTE).
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3.3.2. En la siembra:
a) Apagar la luz UV y esperar 10 minutos antes de entrar.
b) Encender la cabina de flujo laminar 15 minutos antes de iniciar las
actividades de siembra.
c) Aplicar alcohol 70 en toda la superficie del interior de la cabina.
d) Desinfectar con alcohol 70 los materiales antes de colocarlos en el
interior de la cabina de flujo.
e) Esperar que se disipe el alcohol y encender el mechero.
f) Colocarse lentes de proteccin si se va a trabajar por periodos
prolongados.
g) Retirarse los relojes o pulseras.
h) Quitar el papel envoltorio de los instrumentos, frascos, etc. afuera de la
cabina de flujo laminar.
i) Aplicar alcohol 70 en las manos frecuentemente, para evitar
contaminacin por tocar superficies o instrumentos fuera de la cabina.
j) Flamear en todo momento los instrumentos quirrgicos.
k) En caso de quemaduras, interrumpir inmediatamente la siembra y aplicar
los primeros auxilios o al servicio mdico.

3.3.3. Despus de la siembra:

a) Retirar todos los materiales y limpiar la superficie de la cabina de flujo

laminar.
b) Devolver el alcohol de 70 a sus frascos respectivos.

3.3.4. Desinfeccin y siembra de los explantes:

1. Lavar generosamente (pero delicadamente) con agua y detergente
neutro los explantes. Usar un cepillo si es necesario.
2. Cortar, con una tijera limpia, los explantes de un tamao ideal para poder
sumergirlos completamente en el frasco.
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3. Sumergir por un tiempo determinado los explantes en alcohol 70.

4. Llevar a la cabina de flujo laminar.
5. Sumergir por un tiempo determinado la semilla en leja a una
concentracin definida.
6. Enjuagar 3 veces con agua destilada, por un mnimo 3 minutos cada
enjuague.
7. Usar las pinzas y bistures estriles.
8. Sembrar la cantidad de semillas segn el tamao del envase.
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IV. RESULTADOS

4.1 Familiarizacin con los procedimientos de establecimiento in vitro y

siembra de explante (Semilla de Capirona Calycophyllum
spruceanum).

El Laboratorio de Biotecnologa y Diversidad Molecular, se obtuvo

asesoramiento por parte del docente a cargo, as mismo con la ayuda de la gua de
prcticas, inicia con el lavado de los explantes, seguidamente de llevarlo a la cabina
de flujo laminar para finalmente sembrar la cantidad de semillas segn el tamao
del envase., para lo cual se obtuvo 14 muestras, la cual fueron desinfectadas con
alcohol de 70 (tubo de ensayo), la cuales fueron llevadas a cmara de siembra

4.2. Conocimiento de las normas para el trabajo asptico en el rea de

siembra.
En dicha prctica Se conocieron las normas que se tienen que realizar en el rea
de siembra, con las indicaciones del docente se debe tener en cuenta que el trabajo
se realiza siempre dentro de la cmara de flujo laminar, portando mascarilla,
guantes, etc., y la siembra del explante se realiza siempre a una distancia prudente
del fuego.

4.3. Identificar los puntos clave para disminuir la contaminacin por

manipulacin.

Como se menciona anteriormente, en la identificacin los puntos clave para

disminuir la contaminacin por manipulacin, para lo cual se trabaj con guantes,
 10

previo a un lavado de manos con alcohol, tambin el trabajar siempre a la misma

altura del fuego, un aspecto importante es no rosar la boca del tubo de ensayo, y
para tomar el explante se debe hacerlo con una pinza previamente esterilizada
 11

III. CONCLUSIONES

Se logr comprender los procedimientos previos establecimiento in vitro y siembra

de explante (Semilla de Capirona Calycophyllum spruceanum), la cual implica el
lavado de los explantes, la cual obtuvimos 14 muestras, que se desinfecto, para,
llevarlo a la cmara de siembra, as mismo se comprendi las normas, para poder
realizar dicha prctica, y no poder contaminar, en la hora de la manipulacin.
.
 12

IV. RECOMENDACIONES

Para una mejor, realizacin de prcticas, leer la gua de prcticas para tener en
conocimiento de lo que vamos a realizar.
Lavarse las manos antes de ingresar a la cmara de siembra.
As mismo desinfectar los guantes con alcohol de 70
Utilizar una mascarilla para evitar contaminacin en la hora de realizar la prctica.
No rosar con las pinzas la boca, del tubo de ensayo, o si no ya habr
contaminacin.
Mantener a una distancia prudente los materiales del fuego.
 13

V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

PERLA, H. 2007. Evaluacin de mtodos de desinfeccin y tipos de explante de la

especie vegetal piper oradendron trel. & standl., para el establecimiento de
su cultivo in vitro. Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de
ciencias qumicas y farmacia escuela de estudios de postgrados, Guatemala.

CARREO, N. 2013. Evaluacin de tratamientos de desinfeccin en segmentos

nodales de guadua angustifolia para el establecimiento del cultivo in vitro.
Universidad Nacional Abierta y a Distancia- UNAD Escuela de Ciencias
Agrcolas, pecuarias y del medio ambiente especializacin en biotecnologa
agraria Bogot, d.c. 2013

EN LINEA
https://www.researchgate.net/publication/304077770_ESTABLECIMIENTO_DE_U
N_PROTOCOLO_DE_DESINFECCION_PARA_EXPLANTES_DE_ORQUIDEAS_
DE_LA_RBC

http://cipotato.org/wp-content/uploads/2014/07/55485.pdf
 14

VI. ANEXO
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 16

INDICE GENERAL

Pg.
I. INTRODUCCIN ..................................................................................................... 1
II. REVISIN DE LITERATURA .................................................................................. 2
2.1. Cultivo de tejidos vegetales .................................................................................. 2
2.1.1. Explante ........................................................................................................... 2
2.1.2. Asepsia ............................................................................................................ 3
2.1.3. Medio de cultivo .............................................................................................. 3
2.2. Desinfectantes empleados en la micropropagacin de tejidos vegetales ......... 4
2.2.1. cido Hipocloroso .......................................................................................... 4
2.2.2. Alcoholes ......................................................................................................... 5
III. MATERIALES Y METODOS.................................................................................... 6
IV. RESULTADOS ........................................................................................................ 9
III. CONCLUSIONES .................................................................................................. 11
V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 13
VI. ANEXO .................................................................................................................. 14
 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

Departamento Acadmico de Ingeniera Forestal

PRCTICA N04
PROCEDIMIENTOS DE DESINFECCIN DE EXPLANTES. SIEMBRA
ASPTICA.
CURSO : Biotecnologa Forestal

ALUMNO : SANTOS FLORES, Cleide

PROFESOR : HEMERYTH BARTRA, Jhinmy

CICLO : 2017-I

TINGO MARA PER

2017
Cuestionario
1. Qu es la tasa de multiplicacin?

2. Por qu se utiliza alcohol 70 para desinfectar superficies o el material

vegetal?
Para evitar cualquier tipo de contaminacin, y para desinfectar.

3. Qu otras sustancias se utilizan para la desinfeccin de explantes?

Para la desinfeccin tenemos el cido Hipocloroso y Alcoholes

4. Cules son los errores ms frecuentes que causa la contaminacin en la

siembra in vitro?
Produce, un mal cultivo, con hongos o agentes contaminates, como se
mostr en la prctica anterior.

5. Qu son los filtros HEPA?

Los filtros HEPA son filtros de aire de alta eficiencia (estn especialmente
diseados para detener el paso de contaminantes muy pequeos que en
circunstancias normales pasaran por entre las fibras del filtro. Las partculas
ms pequeas que directamente no impactan contra las fibras del filtro son
detenidas y as aumenta la probabilidad de que sean detenidas por el filtro

Cul es la diferencia entre una cabina de flujo horizontal con una de flujo
vertical?
.En los modelos de flujo horizontal el aire filtrado atraviesa luego la cmara
principal de la cabina en una corriente de aire laminar horizontal
(unidireccional) y se expulsa por la abertura frontal de la cabina.
En los modelos de flujo vertical, el aire filtrado atraviesa luego la cmara
principal de la cabina en una corriente de aire laminar vertical (unidireccional)
antes de ser expulsado por la abertura frontal de la cabina.
En las cabinas de flujo laminar horizontal (AHC) hay un grado de turbulencias
ligeramente menor que en las cabinas de flujo vertical (AVC) debido a que el
flujo de aire no golpea la superficie de trabajo. Sin embargo, las cabinas de
flujo laminar vertical generan menos turbulencias alrededor de las piezas
grandes del equipo que las cabinas de flujo laminar horizontal.