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CAPTULO 1

HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS

Marcelo Guerra
Departamento de Botnica UFPE

A tcnica de hibridizao in situ (HIS) consiste basicamente no pareamento de


determinado segmento de DNA ou RNA com uma seqncia de nucleotdeos
complementar situada dentro da clula, visando verificar se a clula possui essa
seqncia e qual a sua exata localizao. Para visualizar o segmento de DNA ou
RNA hibridizado necessrio que ele esteja marcado com alguma molcula de fcil
identificao, funcionando como uma sonda para detectar a seqncia com-
plementar de nucleotdeos chamada seqncia-alvo. O hbrido sonda/alvo pode
ser DNA/DNA, RNA/RNA ou DNA/RNA.
A HIS tem sido utilizada para localizar as mais diversas seqncias de
nucleotdeos, como um gene de cpia nica, molculas de RNA mensageiro ou um
DNA viral inserido no cromossomo. Neste captulo, sero revisados alguns aspectos
gerais da hibridizao de sondas de DNA com o DNA cromossmico. Um maior
detalhamento da bioqumica de hibridizao dos cidos nuclicos pode ser
encontrado em Lara (2002).

O PRINCPIO G ERAL DA TCNICA


A tcnica baseia-se no fato de que o DNA formado por duas fitas complementares,
as quais podem ser facilmente separadas em fitas simples, ou desnaturadas, e
posteriormente renaturadas, voltando ao estado de fita dupla. Se, durante a
renaturao do DNA cromossmico, houver sonda disponvel no meio em torno do
cromossomo, as cpias da sonda competiro com as fitas do DNA cromossmico e
podero ser hibridizadas in situ, isto , no stio exato onde aquela seqncia ocorre
naturalmente. A Figura 1.1 esquematiza as principais etapas da tcnica de HIS.
Essa tcnica foi utilizada pela primeira vez por Gall e Pardue (1969) para
anlises cromossmicas e por Buongiorno-Nardeli e Amaldi (1969) em cortes
histolgicos. Graas sua alta especificidade e aos melhoramentos tcnicos
introduzidos nos anos seguintes, a HIS se transformou em uma das tcnicas mais
informativas e elegantes da citologia, sendo aplicada em reas to diversas quanto
2 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

a biologia do desenvolvimento, a citotaxonomia, a citogentica clnica e o


melhoramento gentico.

Figura 1.1 Principais etapas da tcnica de hibridizao in situ. A marcao da sonda (a)
feita independentemente da preparao da lmina (b). Em seguida, a sonda e o DNA
cromossmico so desnaturados (c, d) e, quando colocados em contato, a sonda hibridiza
in situ (e) com o DNA-alvo. A marcao da sonda pode ser detectada por anticorpos ligados
a fluorocromos (f) e visualizada diferencialmente ao microscpio (g).

Muitos artigos, especialmente os iniciais, descrevem extensamente a meto-


dologia empregada (veja, por exemplo, Gall e Pardue, 1969; Ambros et al., 1986).
Dois textos gerais, muito didticos e bastante informativos dos princpios da tcnica
e dos protocolos mais freqentemente utilizados, foram publicados por Leitch et
al. (1994) e Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000). Uma descrio das variantes
empregadas na HIS, incluindo seu uso na microscopia eletrnica e em cortes
histolgicos, o uso de sondas de RNA e de marcao com radioistopos, pode ser
encontrada em Polak e McGee (1990). As principais aplicaes e alguns dos
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resultados mais importantes obtidos em diversas reas da citogentica sero


apresentados nos demais captulos deste livro.

A PREPARAO DA LMINA
Embora permita alcanar os objetivos em poucos experimentos e apresente boa
repetibilidade de resultados, a HIS um procedimento relativamente longo e
dispendioso, exigindo controle rigoroso da qualidade das lminas. Lminas com
muitas metfases e com cromossomos bem espalhados so fundamentais para se
obterem resultados inequvocos e tornar a tcnica economicamente vivel. A
preparao das lminas segue os mesmos procedimentos utilizados na preparao
de lminas para a colorao com fluorocromos, apresentados detalhadamente por
vrios autores (veja, por exemplo, Guerra e Souza, 2002).
Para controlar a qualidade das lminas, antes de serem utilizadas na HIS, elas
podem ser analisadas na microscopia de contraste de fase, que permite visualizar os
cromossomos sem corantes, ou aps colorao rpida, por exemplo, com DAPI
(abreviatura do corante fluorescente 4-6-diamidino-2-phenilindole). As melhores
lminas devem ser descoradas e estocadas secas em caixas hermeticamente fechadas
a 20 ou 80 oC. Nessas condies, as lminas podem ser conservadas por alguns
meses antes de serem utilizadas para HIS. Em alguns organismos nos quais a tcnica
de preparao de lminas produz um grande nmero de boas metfases, como em
humanos e mamferos em geral, esse controle de qualidade simplificado ou
dispensado.

TIPOS DE S ONDAS
Sondas so seqncias de DNA isoladas que se encontram representadas no
cromossomo uma nica vez ou que apresentam milhares de cpias em cada
cromossomo. Essas seqncias repetidas podem estar organizadas no cromossomo
em tandem, ou seja, uma em seguida outra, formando blocos relativamente grandes
de DNA-alvo, ou podem se encontrar dispersas no complemento cromossmico,
intercaladas com diversos outros tipos de seqncias.

SONDAS DE SEQNCIAS REPETITIVAS ORGANIZADAS EM TANDEM


Os primeiros trabalhos com HIS utilizaram como sonda seqncias de DNA que
se encontravam repetidas em tandem. Entre essas, as mais fceis de serem isoladas
e localizadas so os DNAs satlite, o gene que codifica o RNA ribossomal 5S e a
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seqncia que codifica o precursor 45S dos RNAs ribossomais 28S, 18S e 5,8S,
geralmente referidos como DNAr 5S e 45S, respectivamente.
Uma caracterstica importante dos DNAr 5S e 45S que a seqncia de
nucleotdeos desses genes muito conservada evolutivamente, o que significa que
elas so muito similares em todos os eucariotas. Por exemplo, uma sonda de DNAr
45S produzida a partir do genoma de trigo, denominada pTa71 (Gerlach e
Bedbrook, 1979), foi utilizada para localizar o DNAr em muitas outras plantas,
inclusive gimnospermas e pteridfitas (veja, por exemplo, Kawakami et al., 1999;
Murray et al., 2002), e at mesmo em organismos to diferentes quanto peixes
(Pendas et al., 1993) e gafanhotos (Rocha, 2002).
O DNA ribossmico 45S, geralmente referido apenas como DNAr, uma
seqncia moderadamente repetitiva, que forma blocos com muitas repeties, em
um ou mais pares cromossmicos. Cada unidade de repetio contm trs genes
(DNAr 18S+5,8S+28S) e seus espaadores, sempre transcritos juntos em um
nico RNAm. Os stios do DNAr 45S correspondem s constries secundrias,
observadas por tcnicas de colorao convencional. Entretanto, stios muito
pequenos ou pouco ativos podem no ser visveis com essas tcnicas mas serem
detectados com HIS. No feijo caupi (Vigna unguiculata), por exemplo, apenas um
ou dois cromossomos so observados com constries secundrias, enquanto com
HIS aparecem blocos de DNAr 45S em cinco dos seus 11 pares cromossmicos
(Guerra et al., 1996). No homem, os genes de DNAr 45S esto nas constries
secundrias dos cromossomos acrocntricos 13, 14, 15, 21 e 22, havendo cerca de
150 a 200 cpias no genoma.
A seqncia do DNAr 5S um pouco mais varivel que a do DNAr 45S.
Cada espcie possui, geralmente, uma s seqncia de DNAr 5S repetida muitas
vezes em tandem em um nico par de stios cromossmicos ou, menos freqente-
mente, em dois ou mais pares. No homem, os genes do DNAr 5S esto localizados
no cromossomo 1 (200-300 cpias). Em algumas espcies podem ocorrer seqn-
cias de DNAr 5S ligeiramente diferentes, formando blocos de repeties distintas,
localizadas por HIS em diferentes regies do genoma (veja, por exemplo, Martins
e Galetti, 2001).
Afora o DNA ribossmico, duas outras seqncias repetitivas, organizadas em
tandem e de funo conhecida, tm sido amplamente estudadas. A primeira, e mais
conservada, a seqncia do DNA telomrico (Richards et al., 1993). Esse DNA
ocorre caracteristicamente nas regies terminais de cada cromossomo, embora
excepcionalmente seja encontrado em outras regies cromossmicas, princi-
palmente prximo aos centrmeros de alguns animais (veja discusso no Captulo
4) e plantas (Guerra e Kenton, 1996; Kondo e Tagashira, 1998). A segunda, menos
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conservada evolutivamente, a seqncia do DNA centromrico, que marca apenas


a regio do centrmero. A regio centromrica particularmente complexa,
contendo geralmente grande diversidade de seqncias distintas (Tyler-Smith e
Floridia, 2000).
Diversos outros tipos de seqncias repetidas em tandem tm sido utilizados
como sondas, destacando-se os DNAs satlite e os microssatlite (Heslop-Harrison,
2000). O DNA satlite est composto por unidades formadas por poucas centenas
de pares de bases, repetidas um milho de vezes ou mais em cada genoma.
Geralmente, o genoma eucaritico apresenta vrias seqncias satlite diferentes,
podendo algumas seqncias ser exclusivas de uma nica espcie ou de um grupo
de espcies relacionadas. Sua localizao freqentemente coincide com a dos blocos
de heterocromatina detectados pela tcnica de bandeamento C. Entretanto,
diferentes bandas C, ou mesmo uma nica banda C, podem ser formadas por
diferentes seqncias satlite. Os microssatlite so formados por unidades com
apenas 1 a 5 nucleotdeos, repetidas um nmero variado de vezes em muitas regies
do genoma. Alguns desses stios alcanam um nmero de repeties suficientes
para serem visualizados por HIS (veja, por exemplo, Vanzela et al., 2002).

SONDAS DE DNA REPETITIVO DISPERSO


Alm das seqncias repetitivas organizadas em tandem, h um grande nmero de
seqncias moderadas a altamente repetitivas dispersas ao longo dos cromossomos.
Essas seqncias esto geralmente relacionadas aos elementos transponveis. No
homem, e na maioria dos eucariotas, grande parte do genoma derivada de
elementos transponveis, principalmente as seqncias conhecidas como LINEs,
SINEs (predominantemente Alu), retrotransposons LTR e transposons de DNA.
A seqncia mais abundante no genoma humano, Alu, possui cerca de 280 pb
formando um dmero com subunidades ligeiramente diferentes. Essa seqncia est
representada por mais de um milho de cpias espalhadas por todos os cro-
mossomos, ocorrendo, em mdia, uma cpia a cada 3 kb (Strachan e Read, 1999).
Em plantas, destacam-se os retrotransposons, que so seqncias longas de DNA
que podem ser transcritas para RNA pelo sistema de transcrio normal da clula
e novamente transcritas para DNA pelo gene da transcriptase reversa do
retrotransposon. Na forma de DNA livre, o retrotransposon pode se inserir noutro
lugar do cromossomo, aumentando assim o nmero de repeties no genoma. Essas
seqncias representam uma frao considervel do genoma das plantas, princi-
palmente aquelas com grandes cromossomos (Brandes et al., 1997).
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Algumas seqncias repetitivas dispersas so to abundantes que, quando


hibridizadas in situ, marcam uniformemente todo o genoma. Essas seqncias
podem ser utilizadas para distinguir os cromossomos de uma espcie, em um hbrido
interespecfico, ou para distinguir o genoma de um ancestral diplide em uma
espcie alopoliplide. Por exemplo, em aveia, um hexaplide com 2n = 42, foi
encontrada uma seqncia repetitiva que marca igualmente um tero (14) de seus
cromossomos e marca tambm os 14 cromossomos de uma espcie prxima
diplide. Isso sugere que esse diplide, ou uma espcie muito prxima dele, seja
um dos ancestrais da aveia hexaplide (Linares et al., 1998).

SONDAS DE SEQNCIAS NICAS OU DE POUCAS CPIAS


Com o aprimoramento dos mtodos de isolamento, amplificao e deteco de
sondas, muitas seqncias nicas ou de poucas cpias tm sido localizadas in situ.
Essas seqncias podem ser a cpia complementar de um RNA mensageiro
(DNAc), um clone de uma biblioteca genmica, o DNA viral inserido no
cromossomo, fragmentos de restrio do tipo RFLP, etc. O pequeno tamanho o
principal fator limitante na deteco de seqncias de cpia nica, mas diferentes
estratgias foram desenvolvidas para detectar esse tipo de seqncia (veja, por
exemplo, Pedrosa et al., 2002, 2003).

SONDAS GENMICAS
Em plantas, principalmente, tm sido muito utilizadas as chamadas sondas genmicas,
formadas pelo DNA genmico total de uma espcie. A sonda genmica, constituda
por um grande nmero de seqncias nicas e repetitivas, funciona da mesma
maneira que uma seqncia repetitiva dispersa por todo o genoma, marcando todos
os cromossomos igualmente, com a vantagem de ser muito mais facilmente obtida.
Essa tcnica, denominada de hibridizao genmica in situ ou GISH (Genomic In Situ
Hybridization), tem sido aplicada com sucesso na anlise de hbridos interespecficos
e no estudo evolutivo de diversas espcies poliplides (Stace e Bailey, 1999). Em
animais, as sondas genmicas tambm tm sido utilizadas (veja, por exemplo,
Svartman e Vianna-Morgante, 1999), embora esse tipo de sonda encontre aplicao
maior no estudo dos poliplides raros em animais.
Por exemplo, para distinguir os cromossomos das duas espcies que deram
origem a um tetraplide natural, como o tabaco, o DNA total de um dos supostos
pais diplides extrado, marcado e hibridizado com os cromossomos do poliplide
(Figura 1.2). Se a espcie da qual se extraiu o DNA for realmente um dos pais do
tabaco, metade do conjunto cromossmico tetraplide dever ser diferencialmente
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marcada (no caso em que cada pai contribuiu com igual quantidade de cro-
mossomos que o mais freqente). Caso no haja marcao, uma indicao
de que aquela espcie no foi envolvida na formao do tetraplide. Por outro lado,
se todos os cromossomos hibridizarem com a sonda genmica de um diplide,
provvel que a espcie em questo seja um autopoliplide ou descenda de duas
espcies muito prximas (Figuras 1.2 e 2.9).

Figura 1.2 Teste de GISH para identificar a origem de um tetraplide. Primeiramente


feito controle positivo, para verificar se o DNA de cada um dos supostos pais (diplides AA
e BB), hibridija com seus prprios cromossomos (coluna esquerda), e um controle
negativo, para verificar se no marcam cromossomos da outra espcie (centro). Em seguida,
tenta-se hibridizar o DNA de A e o DNA de B com os cromossomos do tetraplide
(supostamente AABB). Se o tetraplide contiver os genomas AABB, metade dos
cromossomos marcaro com o DNA de A e a outra metade, com o DNA de B (em cima e
embaixo direita). Se o tetraplide for formado por outros genomas, por exemplo, CCDD,
no ser marcado por nenhuma das duas sondas.

Como os dois genomas que formam um hbrido interespecfico geralmente so


muito semelhantes, o DNA marcado de um deles poder hibridizar indistintamente
com os dois genomas. Para evitar isso, geralmente se adiciona na hibridizao o
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DNA marcado de uma espcie junto com o DNA da outra espcie sem marcao
e em concentrao mais alta. Este ltimo DNA funcionar como bloqueador (ou
supressor) das seqncias exclusivas desta espcie e das seqncias comuns a ambas.
Dessa maneira, apenas o genoma oriundo do diplide que est sendo testado
aparecer marcado.

SONDAS CROMOSSMICAS
Um conjunto de seqncias gnicas ou nao-gnicas localizadas em determinado
cromossomo pode ser reunido para formar uma sonda capaz de pintar apenas
aquele cromossomo. Para isso necessrio reunir um bom nmero de seqncias
distintas e que estejam distribudas aleatoriamente por todo o cromossomo. Dessa
maneira, foram construdas sondas que marcam, distintamente, cada um dos 23
pares de cromossomos humanos em toda a sua extenso. Essa tcnica, chamada
de pintura cromossmica (chromosome painting), tem tido numerosas aplicaes na
citogentica clnica e no estudo da evoluo de aves e mamferos.
As sondas cromossomo-especficas levaram ao desenvolvimento de tcnicas
que permitem corar simultaneamente cada cromossomo humano em uma cor
diferente (ver Captulos 6 e 7). Para isso foi necessrio desenvolver tambm novos
equipamentos de microscopia, programas de anlise de imagens apropriados e
diversas outras melhorias na tcnica e nos reagentes utilizados (Schrck et al., 1996;
Eils et al., 1998). A hibridizao de sondas cromossomo-especficas humanas em
outros mamferos tornou possvel identificar regies cromossmicas homlogas em
espcies to diferentes quanto o homem e o cavalo, separados h 70-80 milhes
de anos (Raudsepp et al., 1996). A anlise comparada de caritipos de espcies distintas,
utilizando-se sondas cromossmicas, denominada Zoo-FISH (Captulo 4).
Essas sondas permitem tambm visualizar os cromossomos no ncleo
interfsico, onde se encontram descondensados, formando territrios cromossmicos
individualizados. Nesses casos, a anlise cromossmica geralmente feita em
microscopia confocal, que permite observar o ncleo em numerosos planos focais
distintos e integrar essas imagens em uma reconstruo tridimensional (veja, por
exemplo, Habermann et al., 2001).
Sondas do tipo pintura so tambm conhecidas para alguns outros mamferos,
aves e drosfila (Fuchs et al., 1998; Griffin et al., 1999). Em plantas no foi ainda
possvel pintar cada um dos cromossomos de um caritipo distintamente, mas j
so conhecidas pinturas para alguns poucos cromossomos (Schubert et al., 2001).
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OBTENO DA SONDA
O tipo de sonda mais fcil de ser obtido o utilizado na hibridizao genmica in
situ, formada pelo DNA total, fragmentado e marcado. Se a sonda desejada for um
DNA satlite, ela poder ser isolada do DNA total da espcie por intermdio de
um gradiente de densidade. Nesse caso, o DNA satlite separado do DNA principal
pela diferena na proporo de AT:GC entre essas duas fraes, que se reflete em
diferena de densidade entre elas.
Sondas de DNA satlite so mais facilmente obtidas por digesto do DNA
genmico com enzimas de restrio. Uma enzima de restrio que produza um corte
em uma unidade de repetio produzir cortes idnticos em todas as demais
unidades desse DNA repetitivo organizado em tandem. Isso resultar na formao
de fragmentos de DNA de igual tamanho, os quais aparecero em um gel de
eletroforese como uma banda caracterstica. Eventualmente, alguns monmeros
podero conter mutaes no stio de restrio, levando formao de dmeros,
trmeros, etc., produzindo no gel de eletroforese um padro de bandas em escada.
Esse padro tambm pode ser obtido quando se realiza digesto enzimtica por
tempo insuficiente para que ocorram todos os cortes (digesto parcial). Em ambos
os casos, o padro de bandas em escada constitui indicao clara de que o DNA
repetitivo se encontra em tandem. A banda produzida pela digesto total contendo
os monmeros poder ser recortada do gel e seu DNA poder ser extrado, marcado
e utilizado como sonda.
No caso do DNA repetitivo disperso, o isolamento dessa seqncia dever
ser feito a partir de uma biblioteca genmica (coleo de fragmentos de DNA
inseridos em vetores de clonagem que juntos cobrem todo o genoma de um
organismo), exigindo grande nmero de testes para encontrar a seqncia
repetitiva desejada.
Seqncias muito pequenas, como o DNA telomrico ou os microssatlite,
podem ser sintetizadas por encomenda a laboratrios especializados. Sondas para
genes especficos podem ser obtidas diretamente a partir do RNAm citoplasmtico,
transcrito para DNA (DNAc) por meio da enzima transcriptase reversa e
amplificado em um sistema de clonagem bacteriano. Diversas sondas podem
tambm ser obtidas por PCR, desde que se conheam as seqncias que flanqueiam
o DNA-alvo, de maneira a permitir escolher os iniciadores de sntese (primers)
corretos. Neste caso, a mistura de nucleotdeos que fornece a matria-prima para
a sntese das novas cadeias pode conter uma frao de nucleotdeos marcados,
permitindo que se faa amplificao e marcao da sonda simultaneamente.
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Muitas dessas seqncias podem ser obtidas comercialmente ou como


amostras cedidas por outros laboratrios. Algumas, como as de DNAr 5S e 45S,
foram inicialmente isoladas e amplificadas em um laboratrio e cordialmente
cedidas a pesquisadores de outros laboratrios, no existindo comercialmente.

OBTENO DE SONDAS PARA PINTURA CROMOSSMICA POR CITOMETRIA


OUMICRODISSECO
Para a obteno de uma sonda cromossomo-especfica necessrio primeiramente
isolar certa quantidade de cromossomos do tipo que se quer pintar. Para isso, as
tcnicas mais utilizadas so a de separao por fluxo e a microdisseco.
A separao por fluxo (flow sorting) uma variao de uma tcnica mais
amplamente utilizada, denominada citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi
inicialmente utilizada para distinguir e quantificar tipos de clulas ou ncleos em
soluo e, posteriormente, para identificar cromossomos (Melamed et al., 1990).
Neste caso, uma soluo com cromossomos corados impelida atravs de um canal
extremamente fino e liberada na forma de gotas minsculas, cada uma contendo
no mximo um cromossomo. Os corantes utilizados so geralmente fluorocromos,
principalmente o Hoechst 33258 (geralmente referido simplesmente como Hoechst),
o DAPI ou o iodeto de propdeo. Quando uma gota contendo um cromossomo
atravessa um feixe de raios laser, o cromossomo corado fluoresce e a quantidade
de luz emitida medida por um detector de fluorescncia (Figura 1.3). Como a
quantidade de fluorocromos ligados ao cromossomo proporcional sua quan-
tidade de DNA, cromossomos com diferentes quantidades de DNA podem ser
distinguidos por sua fluorescncia.
Se o caritipo contiver cromossomos muito semelhantes na quantidade de
DNA, a distino entre eles poder ser feita pela proporo de AT:GC que
apresentem. Para isso necessrio fazer uma dupla colorao, utilizando-se
simultaneamente um fluorocromo que se liga preferencialmente a regies ricas em
AT (o DAPI ou o Hoechst) e outro com maior afinidade por GC (geralmente a
cromomicina A3). Esses fluorocromos emitem luz com comprimentos de onda
diferentes, permitindo que a quantidade de cada um seja medida separadamente.
Dessa maneira, a proporo de AT:GC daquele cromossomo estimada, permitindo
sua identificao.
Uma vez que cada cromossomo possa ser reconhecido, o citmetro pode ser
programado para deslocar determinado cromossomo do fluxo de microgotas e
colet-lo em um recipiente parte (nesse caso, a tcnica ento denominada
separao por fluxo). Para isso, a microgota com o cromossomo especificado
receber uma carga eltrica, permitindo posteriormente desloc-la do fluxo por
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placas defletoras (Figura 1.3). Cromossomos humanos e de vrias espcies animais


e vegetais tm sido isolados por essa tcnica (Monard e Young, 1995; Dolezel et
al., 1999).

Figura 1.3 Esquema da separao cromossmica por fluxo. Gotas contendo determinado
cromossomo podem ser reconhecidas pela fluorescncia do cromossomo, marcadas com uma
carga eltrica e desviadas do fluxo normal para um coletor parte.

Os cromossomos podem tambm ser isolados por meio de microdisseco.


Nesse caso, determinado cromossomo isolado de algumas metfases espalhadas
em uma lamnula, utilizando-se um aparelho de micromanipulao. A
micromanipulao permite tambm isolar apenas um brao cromossmico ou
mesmo determinada banda C ou G (Senger et al., 1990; Cannizzaro, 1996). Dessa
maneira, possvel produzir sondas especficas para regies cromossmicas bem
pequenas.
Uma vez isolado um pequeno nmero de cromossomos iguais, suas diversas
seqncias de DNA devem ser amplificadas para produzir uma quantidade
adequada para hibridizao e para estoque. Essas seqncias amplificadas devem
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ser separadas por eletroforese, isoladas e testadas como sondas para HIS. Aquelas
que hibridizarem unicamente, ou predominantemente, em um cromossomo sero
utilizadas para compor a sonda cromossmica.

AMPLIFICAO DA SONDA
Da mesma maneira que as sondas cromossomo-especficas, os demais tipos de
sonda precisam tambm ser amplificados, para se dispor de um estoque da sonda.
A amplificao geralmente feita pelos mtodos usuais de clonagem. Para isso a
seqncia a ser amplificada deve ser inserida em um vetor, por exemplo um
plasmdio bacteriano, que introduzido na Escherichia coli. A multiplicao da
bactria resulta na multiplicao do plasmdio e, conseqentemente, na ampli-
ficao do nmero de cpias da seqncia de DNA inserida, ou inserto. Quando
a colnia bacteriana suficientemente grande, as bactrias so lisadas e os
plasmdios (em nmero de milhes) so isolados. A sonda pode ser preparada com
o plasmdio inteiro (o DNA estritamente plasmidial no deve ter correspondncia
no DNA cromossmico e por isso no interfere na hibridizao) ou o inserto pode
ser retirado do plasmdio, por meio de enzimas de restrio, e separado por
eletroforese.
Os plasmdeos bacterianos aceitam geralmente insertos de at 10 kb de
tamanho. Para amplificar seqncias maiores poder ser necessrio utilizar outro
tipo de vetor, como os cosmdios (insertos de 30 a 44 kb), bacterifago P1 (70-100
kb), PACs (130-150 kb), BACs (at 300 kb) ou YACs (0,2 a 2 Mb).
A tcnica de PCR pode ser utilizada na amplificao de fragmentos de DNA
cuja seqncia de nucleotdeos conhecida, como o DNAr 5S ou 18S. No caso de
cromossomos isolados para obteno de sondas cromossomo-especficas, todo o DNA
precisa ser amplificado. Nesse caso, a amplificao feita por um tipo particular de
PCR, denominado DOP-PCR (degenerate oligonucleotide-primed PCR). Esta PCR
utiliza iniciadores de sntese com seqncias muito variadas, que iro se ligar em um
grande nmero de stios, amplificando qualquer DNA fornecido como molde.

TAMANHO DA SONDA
O tamanho dos segmentos a serem hibridizados crtico nos experimentos de HIS,
sendo o tamanho ideal entre 50 e 500 nucleotdeos. Seqncias maiores ou
menores podem ser utilizadas, mas apresentam problemas adicionais. Se a
seqncia a ser hibridizada contiver 20 kb, por exemplo, ela dever ser quebrada
em fragmentos menores, em torno de 400-500 pb. Seqncias muito pequenas,
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como os oligonucleotdeos, tm baixa estabilidade em razo do pequeno nmero


de pontes de hidrognio. Alm disso, tm maior chance de hibridizar com
seqncias no-alvo casualmente complementares (hibridizao cruzada). No caso
dos microssatlite, por exemplo, a sonda deve ser formada por algumas unidades
repetidas, como (GATA)7, (GAA)10 ou (AG)12.
Seqncias muito longas, alm de apresentarem menor acesso ao
cromossomo, em razo da maior dificuldade de penetrar na clula e alcanar o alvo,
tm freqentemente pequenas seqncias de DNA repetitivo disperso, respon-
sveis por pareamentos fora do DNA-alvo. Essas sondas devem ser fragmentadas,
desnaturadas e pr-hibridizadas em uma soluo contendo um excesso de cpias
do DNA repetitivo disperso (bloqueador ou supressor). Dessa maneira, os
fragmentos da sonda que apresentam DNA repetitivo vo formar fitas duplas com
o DNA repetitivo em excesso e sero bloqueados, enquanto os demais perma-
necero como fita simples e podero hibridizar com o DNA-alvo (Lichter e Cremer,
1992).

MARCAO DA SONDA
MARCAO COM ISTOPOS RADIOATIVOS
Inicialmente, as sondas de DNA ou RNA eram marcadas exclusivamente com
istopos radioativos, produzindo as chamadas sondas quentes. O istopo mais
comumente empregado o trtio (3 H), por emitir radiao de baixa energia,
garantindo melhor resoluo da sonda. Por outro lado, o trtio tem a desvantagem
de exigir exposio demorada, usualmente acima de duas semanas (compare esses
dados na Tabela 1.1). Em alguns experimentos prefervel utilizar um radioistopo
de mais alta emisso de energia, como o 32P, embora a resoluo da sonda seja
sensivelmente reduzida em decorrncia de maior disperso da radiao.

Tabela 1.1 Caractersticas principais dos radioistopos mais utilizados na HIS (baseada em
Leitch et al., 1994).

Energia de emisso Tempo de exposio


Istopo Resoluo (m) Meia-vida
mxima (MeV) aproximado (dias)
3H 0,018 0,5-1 15-100 12,4 anos
125I 0,004 1-10 12-20 60 dias
35S 0,167 10-15 12-20 87,4 dias
32P 1,710 20-30 2-5 14,3 dias
14 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

Na marcao com radioistopos, geralmente usa-se a dUTP ou a dATP


tritiada. Depois de hibridizada, a sonda localizada por autorradiografia. Para isso,
a lmina coberta com uma fina camada de uma emulso fotossensvel que
funciona como um filme fotogrfico. A radiao emitida pela sonda sensibiliza os
sais de prata da emulso, que depois de convenientemente revelados e fixados
aparecem como pequenas manchas pretas em cima do local onde a sonda se
encontra. Ao final os cromossomos so levemente corados, geralmente com
Giemsa, para permitir reconhecer a localizao das sondas.
Esse mtodo tem a vantagem de ser extremamente sensvel, permitindo
revelar a posio de seqncias-alvo muito pequenas. Por outro lado, o uso de
istopos radioativos apresenta uma srie de incovenientes. Os mais evidentes so
o perigo que representam para a sade do pesquisador, a maior instabilidade e baixa
meia-vida, a produo de lixo radioativo, menor resoluo e o fato de que exigem
tempo de exposio muito longo para a sensibilizao adequada do filme. Cionini
et al. (1982), por exemplo, utilizaram 100 a 150 dias de exposio para obter uma
localizao clara de uma marcao com trtio em cromossomos politnicos de
Phaseolus.

MARCAO NO -ISOTPICA
Atualmente, para HIS, usa-se apenas a marcao no-isotpica. Nesse caso, uma
molcula marcadora acoplada a um dos quatro tipos de nucleotdeos presentes
na sonda, a qual posteriormente reconhecida por mtodos imunolgicos ou
similares. Observe que as sondas radioativas possuem apenas substituies de
istopos, enquanto as no-isotpicas possuem acrscimos de molculas sonda.
H duas maneiras distintas de marcar uma sonda no-radioativa: a marcao
direta, que utiliza fluorocromos acoplados diretamente aos nucleotdeos, e a
marcao indireta, na qual os nucleotdeos so acoplados a uma molcula marcadora,
a qual posteriormente ligada a um fluorocromo ou a um outro sistema de
colorao. A marcaco indireta tem sido mais utilizada em razo de sua maior
sensibilidade e por permitir mais facilmente amplificar o sinal emitido pela sonda.
Entretanto, as sondas que podem ser compradas prontas no comrcio so marcadas
diretamente com fluorocromos e so muio eficientes.
As molculas marcadoras mais utilizadas na marcao indireta so a biotina
e a digoxigenina. A biotina um tipo de vitamina H, obtida da clara do ovo, que
pode ser ligada ao nucleotdeo pelo carbono 5 do anel pirimidnico. A digoxigenina
um alcalide extrado de plantas conhecidas como dedaleira (Digitalis purpurea
e D. lanata) e liga-se ao anel pirimidnico da mesma maneira que a biotina. Essa
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 15

ligao normalmente feita por meio de uma molcula espaadora longa, de forma
a evitar interferncia estereoqumica que afete o pareamento da sonda com o
DNA-alvo ou reduza a eficincia do reconhecimento posterior da molcula
marcadora (Figura 1.4). O tamanho da molcula espaadora depende basicamente
do nmero de tomos de carbono que ela possui, e isso geralmente vem indicado
junto com o nucleotdeo marcado. Por exemplo, a biotina 16-dUTP possui uma
molcula espaadora com 16 tomos de carbono separando a biotina do
nucleotdeo (Figura 1.4a).

Figura 1.4 Configurao bidimensional de algumas molculas marcadoras. (a) Biotina


ligada ao trifosfato de desoxiuracila (16-dUTP) por uma molcula espaadora (linha
sanfonada no centro da molcula). (b) Digoxigenina 11-dUTP. (c) Fotobiotina, mostrando
a biotina ( direita) ligada a um grupo azil arida por uma molcula espaadora. Na molcula
espaadora das trs figuras os tomos de carbono esto localizados nas dobras da cadeia.

A seguir, ser discutida apenas a marcao no-isotpica, em razo de sua


maior importncia na HIS, embora os princpios bsicos da tcnica sejam os
mesmos para ambos os tipos de marcadores. Sero enfatizados tambm os
procedimentos relacionados marcao indireta, por ser a mais utilizada.
16 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

MTODOS DE M ARCAO DA SONDA


A marcao da sonda pode ser feita por mtodos qumicos ou enzimticos. Em ambos
os casos, geralmente apenas um dos quatro tipos de nucleotdeos marcado, de forma
a evitar alteraes na estereoqumica da sonda que possam afetar sua capacidade de
ligao com o DNA-alvo. Na marcao por mtodos qumicos, a molcula marcadora
adicionada diretamente sonda. A fotobiotina, apresentada na Figura 1.4c, um
dos marcadores no-radioativos mais utilizados em mtodos qumicos. Essa molcula
se caracteriza pela presena de um grupo aril, situado numa extremidade de um brao
longo que a separa da biotina. Em presena de luz intensa, o grupo aril se torna
reativo, podendo se ligar citosina da sonda (Coulton, 1990).
Nos mtodos enzimticos, um dos tipos de nucleotdeos normais substitudo
por nucleotdeos previamente marcados. Essa marcao feita quase sempre pela
tcnica de nick-translation (deslocamento de corte) ou por PCR (discutida noutro
tpico) e, menos freqentemente, por random primers (iniciadores de sntese
aleatrios). Embora mais baratos, os mtodos qumicos so geralmente mais txicos
e menos especficos que os enzimticos e por isso s raramente so utilizados.

MARCAO POR NICK-TRANSLATION

Na marcao por nick-translation, a sonda misturada com os quatro nucleotdeos


no-marcados (dNTP) e mais um deles marcado (dUTP ou dATP), alm de DNase
I e DNA-polimerase I. A DNase I uma endonuclease que corta cada uma das duas
cadeias do DNA em pontos aleatrios (Figura 1.5a, b). Se a reao for excessivamente
prolongada, a DNase I degrada inteiramente o DNA. Utilizando tempo e concentra-
o adequados, e na presena de ons Mg2+, ela gera uma srie de cortes em ambas
as fitas, a partir dos quais a DNA-polimerase I inicia a sntese das novas cadeias. A
DNA-polimerase I tem duas funes distintas: polimerizar o DNA no sentido 5'3'
e despolimerizar a cadeia no sentido 5'3' ou 3'5'. Entretanto, se houver um corte
em s uma das fitas, ela despolimerizar no sentido 5'3' e simultneamente realizar
nova polimerizao no mesmo sentido. Portanto, a DNA-polimerase I reconhece os
cortes simples deixados pela DNase I e atua no sentido 5'3', despolimerizando os
nucleotdeos sua frente e repolimerizando atrs de si (Figura 1.5c, d, e). O resultado
que o corte inicial vai sendo deslocado para o final 3' da fita. Esse processo ocorre
igualmente nas duas fitas e, ao final, ambas as fitas tero seus nucleotdeos
substitudos por novos, conservando a mesma seqncia original.
Observe que nesse processo a quantidade de sonda disponvel no final a
mesma do incio da reao. Durante a etapa da polimerizao, a enzima utiliza os
nucleotdeos existentes no meio, inclusive os nucleotdeos marcados. A concentrao
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 17

do nucleotdeo marcado deve ser mais alta que a desse mesmo nucleotdeo no-
marcado, para compensar sua menor receptividade pela DNA-polimerase.

Figura 1.5 Marcao da sonda por nick-translation. A sonda em fita dupla (a) inicialmente
atacada pela DNase, produzindo cortes aleatrios (setas) nas duas fitas (b). Molculas de
DNA polimerase se ligam aos stios cortados (c) e retiram os nucleotdeos sua frente no
sentido 5'-3' (d). Um novo nucleotdeo acrescentado extremidade 3' em cada um dos
espaos vazios criados pela DNA polimerase (e), ficando o corte um nucleotdeo adiante
no sentido 5'-3' (setas). Ao final, todos os nucleotdeos sero substitudos por novos e, em
ambas as fitas, alguns deles estaro marcados.

MARCAO POR RANDOM PRIMERS

Na tcnica de marcao por random primers, a sonda marcada produzida atravs


da sntese de uma nova cadeia de DNA. Para isso, a dupla hlice desnaturada e
uma DNA polimerase produz uma fita marcada complementar a cada uma das fitas
originais. Nesse caso, utiliza-se unicamente uma parte da DNA-polimerase I
(conhecida como fragmento Klenow), contendo apenas o stio responsvel pela
atividade polimersica 5'3'. Para ocorrer a sntese da cadeia complementar,
necessrio, alm do fragmento Klenow, os nucleotdeos normais e marcados e os
18 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

iniciadores de sntese, que parearo com a fita desnaturada e permitiro enzima


iniciar a sntese a partir do terminal 3 livre. Neste caso, usa-se um conjunto de
iniciadores, cada um formado por seis nucleotdeos, contendo praticamente todas
as combinaes de A, T, G e C possveis, de maneira que a sntese poder iniciar
em qualquer ponto do DNA. Durante a sntese da nova fita, haver a incorporao
de nucleotdeos marcados, ficando cada dupla-hlice com uma fita marcada e outra
no-marcada (Figura 1.6).

Figura 1.6 Marcao da sonda por random primers. Para iniciar a reao necessrio reunir
a sonda, os nucleotdeos marcados e no-marcados e os iniciadores de sntese (a), alm da
polimerase (no representada). Os iniciadores paream com regies complementares da
sonda desnaturada (b). A partir dos terminais 3' dos iniciadores, novas fitas complementares
s originais so sintetizadas contendo nucleotdeos marcados (c).
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 19

Esse mtodo recomendado para marcar pequenas quantidades de DNA e


seqncias muito curtas, como as utilizadas para DNA telomrico e microssatlite.
Sua principal desvantagem na HIS que a cadeia no-marcada compete pelo alvo
com a marcada, diminuindo sua eficincia.

A HIBRIDIZAO IN SITU

A etapa de hibridizao in situ propriamente dita aquela em que a sonda e os


cromossomos so desnaturados e hibridizados sob condies controladas. A
desnaturao geralmente feita por aquecimento da sonda e das lminas a
temperaturas prximas de 70-80 C. A lmina com os cromossomos desnaturados
coberta com a soluo de hibridizao contendo a sonda, recoberta com uma
lamnula e deixada geralmente temperatura de 37 C, por 18 horas ou mais,
durante as quais ocorrer a hibridizao propriamente dita.
Em seguida, retira-se a lamnula e a lmina passa pelos chamados banhos ou
lavagens ps-hibridizao, em que eliminado o excesso de sonda, incluindo aquelas
parcialmente pareadas e mais instveis. Para isso, as lminas so mergulhadas em
uma cubeta com uma mistura de soluo salina-citrato (SSC) e formamida, as quais
possuem efeito antagnico: a soluo salina contribui para estabilizar a dupla-hlice
e a formamida, para romper as pontes de hidrognio. Nesse momento,
estabelecido o nvel de estringncia do experimento, ou seja, o nvel de exigncia para
que sondas parcialmente hibridizadas permaneam ligadas ao DNA cromossmico.

NVEL DE ESTRINGNCIA
Tecnicamente, o nvel de estringncia indica a percentagem mnima de nucleo-
tdeos corretamente pareados, entre a sonda e o DNA-alvo, necessria para manter
a estabilidade da molcula hbrida. Em uma HIS com nvel de estringncia de 80%,
por exemplo, apenas as cpias da sonda com pelo menos 80% de sua seqncia de
nucleotdeos corretamente pareada com o DNA cromossmico permanecero
hibridizadas aps as lavagens ps-hibridizao.
Hibridizaes realizadas com nvel de estringncia alto produzem resultados
mais confiveis, mas se o DNA-alvo no for abundante e de fcil acesso, poder
no ocorrer hibridizao em muitas clulas. Por outro lado, reduzindo-se o nvel
de estringncia, facilita-se o pareamento da sonda com o DNA-alvo, mas aumenta-
se tambm a chance de pareamento com seqncias no-alvo. Portanto, o nvel
de estringncia deve ser ajustado para o tipo de DNA-alvo visado.
20 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

Os protocolos mais utilizados tm nvel de estringncia entre 70% e 90%. A


determinao do nvel de estringncia de uma hibridizao depende do tamanho
da sonda, da proporo de AT:GC da sonda e das condies de hibridizao e
lavagens ps-hibridizao (concentrao de formamida e SSC e temperatura,
geralmente de 37 a 42 C). Como na prtica o tamanho e a seqncia da sonda
nem sempre so bem conhecidos, trabalha-se em geral com valores mdios para
esses parmetros, resultando em variao do nvel de estringncia em torno de 5%
(Leitch et al., 1994). Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) apresentam uma
tabela simplificada na qual possvel estabelecer o nvel de estringncia desejado
variando-se a temperatura e a composio dos banhos ps-hibridizao.

DETECO DOS STIOS DE HIBRIDIZAO


Na marcao indireta, aps a hibridizao, a sonda precisa ser detectada, o que
feito por meio de molculas conjugadas, constitudas por uma unidade capaz de
reconhecer e se ligar fortemente molcula marcadora da sonda e outra que
permite sua visualizao ao microscpio (sinalizao).
A unidade que reconhece a marcao da sonda geralmente um anticorpo
ou outra molcula com alta capacidade de associao com a molcula marcadora.
Se a sonda for marcada com biotina, poder ser localizada com um anticorpo
antibiotina ou com avidina ou estreptavidina. Se for marcada com digoxigenina usa-
se antidigoxigenina.
A avidina uma glicoprotena extrada do ovo de galinha (como a biotina),
com uma constante de associao pela biotina 1.000.000 vezes mais alta que a
afinidade tpica de antgenos-anticorpos. A avidina pode ser substituda pela
estreptavidina, uma glicoprotena secretada pelo fungo Streptomyces avidini
composta por quatro subunidades, cada uma com um stio de ligao com uma
biotina. A estreptavidina tem a vantagem de ser mais especfica que a avidina,
embora apresente menor estabilidade e constante de associao mais baixa.
O anticorpo, ou a avidina/estreptavidina, precisa estar previamente ligado a uma
molcula sinalizadora, que a unidade do conjugado que permite sua visualizao ao
microscpio. A molcula sinalizadora pode ser uma enzima ou um fluorocromo. A
Tabela 1.2 apresenta um resumo das molculas mais freqentemente acrescentadas
sonda no processo de HIS no-isotpica. A hibridizao in situ utilizando
fluorocromos comumente denominada FISH (Fluorescent In Situ Hybridization).
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 21

Tabela 1.2 Principais molculas adicionadas s sondas no processo de HIS.

Marcadoras Reconhecedoras Sinalizadoras


Antibiotina, avidina,
Biotina ou estreptavidina ou Enzimas (ex.: fosfatase alcalina) ou fluorocromos
digoxigenina (ex.: rodamina, FITC)
antidigoxigenina

ENZIMAS UTILIZADAS NA DETECO DOS STIOS DE HIS


As enzimas mais comumentes utilizadas nesse processo so a fosfatase alcalina e uma
peroxidase obtida da planta Armoracia rusticana (em ingls, horseradish). Essas
enzimas so geralmente biotiniladas, permitindo que se liguem sonda por uma
ponte biotina-avidina-biotina. Na presena de um substrato adequado, a enzima
quebra esse substrato produzindo uma substncia que pode ser corada, resultando
em um sinal de cor escura junto sonda. No caso da fosfatase alcalina, o substrato
o BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) e o produto da reao corado pelo
NBT (nitroblue tetrazolium), enquanto com a peroxidase o substrato o perxido
de hidrognio e a colorao do produto enzimtico feita pelo DAB (diamino-
benzidine tetrahydrochloride). A Figura 1.7 esquematiza o processo de reconhe-
cimento da sonda pela fosfatase alcalina e sua reao de colorao. A reao
apresentada nessa figura pode ser simplificada utilizando-se antibiotina ou avidina
j acoplada fosfatase alcalina. Em ambos os casos, aps a colorao da sonda, o
restante dos cromossomos corado fracamente com algum outro corante, como
o Giemsa ou a orcena actica.

Figura 1.7 Visualizao da sonda marcada com fosfatase alcalina biotinilada. A avidina
reage com a biotina da sonda e, posteriormente, com a biotina da fosfatase. A enzima quebra
o substrato, a molcula de BCIP, que reage com o NBT produzindo uma substncia escura
onde se encontra a sonda.
22 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

FLUOROCROMOS UTILIZADOS NA DETECO


Os corantes fluorescentes, quando excitados com radiao ultravioleta de
comprimentos de onda especficos, emitem forte brilho de cor caracterstica. A
anlise dessa colorao feita ao microscpio de fluorescncia, equipado com
lmpada ultravioleta e um conjunto de filtros que permitem selecionar o compri-
mento de onda de mxima excitao do corante e de mxima emisso de luz. O
fluorocromo excitado pela energia da luz ultravioleta desloca alguns eltrons para
orbitais mais externos. Esses eltrons ficam instveis e logo retornam a seus orbitais
originais, liberando energia na forma de luz na faixa do visvel, portanto, com um
comprimento de onda distinto da utilizada em sua excitao (Tabela 1.3). A Figura
1.8 apresenta um esquema do curso seguido pela luz que sai da fonte de ultravioleta
at o cromossomo e da luz emitida pelo cromossomo at o observador.

Tabela 1.3 Principais fluorocromos utilizados na HIS, com seus comprimentos de onda de
mxima excitao e mxima emisso e a cor da fluorescncia emitida (baseada em
Schwarzacher e Heslop-Harrison, 2000).

Mxima Mxima Cor da


Fluorocromos
excitao (nm) emisso (nm) fluorescncia
Ligados sonda FITC 495 523 verde
Cy3 550 570 vermelho
Rodamina 560 580 vermelho
Vermelho-Texas 595 610 vermelho
Ligados ao DNA
DAPI 358 461 azul
cromossmico
Iodeto de propdeo 535 617 vermelho

Os fluorocromos mais utilizados na colorao da sonda so o Cy3, o FITC


(fluorescein isothiocyanate), o vermelho-Texas e a rodamina. O Cy3 o mais utilizado
de um grupo de fluorocromos denominado de cianinas, que inclui tambm o Cy2,
Cy3.5, Cy5, Cy7 e alguns outros. Para corar o DNA cromossmico total, usa-se
mais comumente o DAPI ou o iodeto de propdeo. Uma combinao de fluro-
cromos muito usada o FITC para sonda e o iodeto de propdeo para o restante
do cromossomo, ou o DAPI para o cromossomo e o FITC e a rodamina para duas
sondas diferentes. As caractersticas principais desses fluorocromos esto resumidas
na Tabela 1.3. O DAPI e o iodeto de propdeo apresentam a vantagem de serem
mais estveis, enquanto os fluorocromos usados nas sondas tm maior instabilidade,
isto , quando expostos luz por um tempo mais longo perdem o brilho, podendo
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 23

desaparecer completamente em pouco tempo. Esse problema pode ser minimizado


montando-se a lmina em meios que reduzem o esmaecimento dos fluorocromos,
como o Vectashield.

Figura 1.8 Trajetria da luz na microscopia de fluorescncia. A luz ultravioleta projetada


para fora da caixa protetora por um espelho. O filtro de excitao seleciona um
comprimento de onda que excita apenas determinado fluorocromo. A luz selecionada
(verde) atinge o cromossomo e o fluorocromo excitado emite outra fluorescncia (vermelho-
escuro). Um filtro de emisso deixa passar luz na faixa do visvel (vermelho-claro) para o
observador.

AMPLIFICAO DO SINAL
Quando o sinal emitido pela sonda for muito fraco, no permitindo observao ou
documentao fotogrfica segura, torna-se necessrio amplificar o sinal, aumen-
tando o nmero de molculas marcadoras e sinalizadoras. A amplificao , nesse
caso, feita adicionando um anticorpo contra a molcula marcadora, contendo esse
anticorpo outras molculas marcadoras. Por exemplo, se a sonda for marcada com
biotina e reconhecida com avidina usa-se um anticorpo antiavidina biotinilado. Esse
anticorpo possui quatro radicais de biotina, podendo ligar-se avidina por um
desses radicais e deixar os outros trs livres para reagirem com novas molculas de
avidina (Figura 1.9). Expondo-se novamente a clula avidina-FITC, duas ou trs
dessas molculas conjugadas se ligaro s biotinas do anticorpo, amplificando
portanto o sinal.
24 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

Figura 1.9 Amplificao do sinal da sonda marcada com biotina. A biotina inicialmente
reconhecida pelo conjugado avidina-fluorocromo. Acrescentando um anticorpo anti-
avidina biotinilado, cada stio com uma biotina fica agora com trs biotinas livres. A reao
com o conjugado avidina-fluorocromo repetida, resultando na amplificao do sinal.

Teoricamente, o sinal pode ser amplificado repetidas vezes. Na prtica, no


entanto, usa-se apenas uma ou, raramente, duas amplificaes em razo da
tendncia ao aumento da marcao de fundo durante as sucessivas recoloraes.

SENSIBILIDADE E RESOLUO DA FISH


A ampliao do sinal pode ajudar a localizar uma marca muito pequena, mas,
mesmo assim, a sensibilidade da tcnica limitada pelo tamanho do DNA-alvo. A
sensibilidade pode ser aumentada se o acesso ao DNA-alvo for melhorado.
Cromossomos livres de resduos citoplasmticos facilitam muito a deteco de sinais
pequenos. Em vertebrados e humanos, a tcnica de preparao de lminas permite
eliminar mais o citoplasma que a utilizada geralmente em vegetais, resultando em
melhor deteco de sinais.
Uma alternativa para localizar seqncias nicas e curtas utilizar como
sonda no apenas a seqncia do DNA-alvo mas tambm as seqncias vizinhas
a ele. Por exemplo, se vrios genes ou marcadores moleculares aparecem no mapa
gentico localizados muito prximos uns dos outros, uma sonda formada pelo
conjunto dessas seqncias poder ser suficiente para emitir um sinal de fcil
deteco no cromossomo metafsico. Pedrosa et al. (2003) utilizaram um conjunto
de RFLPs, situados muito proximamente no mapa gentico de cromossomos de
feijo, para visualizar em qual cromossomo aqueles marcadores se localizavam.
Outra alternativa procurar primeiramente localizar a seqncia de DNA
desejada em uma biblioteca genmica de BACs ou YACs (cromossomos artificiais
bacterianos ou de leveduras, utilizados para clonagem de seqncias de DNA com
centenas de kb em extenso) e utilizar o fragmento inteiro para hibridizao. Essa
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 25

tcnica muito empregada para localizar genes e outras seqncias curtas de DNA
no cromossomo (veja, por exemplo, Pedrosa et al., 2002).
A deteco do sinal pode tambm ser melhorada trabalhando-se com
cromossomos mais descondensados, como os paquitnicos da meiose, os politnicos
ou os cromossomos interfsicos. Um stio bem pequeno, com 10 kb, aparecer no
cromossomo metafsico como um pequeno ponto, enquanto em cromossomos
paquitnicos aparecer como uma regio mais longa e mais facilmente visvel.
Em cromossomos mais distendidos, no apenas a sensibilidade mas tambm
a resoluo da HIS aumenta, ou seja, melhora a capacidade de visualizar duas
sondas muito prximas como sinais distintos, sem superposio. Em humanos, duas
sondas precisam estar separadas por pelo menos um milho de pares de bases (1
Mb) para serem visualizadas como stios distintos em cromossomos metafsicos,
enquanto em cromossomos paquitnicos essa distncia pode ser reduzida para perto
de 60 kb. Em fibras de DNA completamente distendidas a resoluo da HIS ainda
maior, passando para cerca de 0,7 kb (De Jong et al., 1999).

MARCAO E DETECO SIMULTNEA DE DUAS OU MAIS SONDAS


Nos trabalhos de mapeamento fsico de genes ou seqncias de DNA, geralmente
necessrio trabalhar simultaneamente com duas ou mais sondas. No caso de duas
sondas simples, porque uma das sondas pode ser corada em verde (FITC), a outra,
em vermelho (rodamina ou outro) e o restante do cromossomo, em azul (DAPI).
Quando necessrio hibridizar muitas sondas diferentes simultaneamente,
como no caso da pintura simultnea dos 23 pares cromossmicos humanos, a
soluo utilizar para cada sonda duas ou mais molculas marcadoras distintas. Isso
pode ser feito marcando algumas sonda com fluorocromos diferentes e outras com
uma combinao de dois ou mais fluorocromos em propores iguais. No microscpio
de fluorescncia, utilizando diferentes filtros, cada cromossomo ser identificado
por uma cor ou uma combinao de cores distintas. Eils et al. (1998), por exemplo,
marcaram os 23 tipos de sondas com diferentes combinaes de biotina, digoxige-
nina e outros nucleotdeos ligados diretamente a fluorocromos. As imagens obtidas
com diferentes filtros foram superpostas para identificar todos os cromossomos. As
cores resultantes da superposio no so muito distintas, mas o programa de
anlise de imagens reconhece bem cada combinao e substitui essas cores por
cores mais contrastadas, denominadas pseudocores (para uma explicao detalhada
dessa abordagem veja Eils et al., 1998). Essa tcnica foi denominada de FISH
Multicor ou M-FISH.
26 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

Uma estratgia alternativa para pintar todos os cromossomos humanos


simultaneamente foi desenvolvida por Schrck et al. (1996). Esses autores
marcaram cada sonda com diferentes propores de molculas marcadoras. A Figura
1.10 ilustra essa alternativa mostrando quatro sondas marcadas com diferentes
propores de biotina e digoxigenina. As molculas marcadoras foram reconhecidas
pela avidina conjugada rodamina e pela antidigoxigenina com FITC, resultando
em sinais com diferentes propores de vermelho e verde, o que poder ser
transformado em pseudocores diferentes. O nmero de marcaes diferentes pode
ser aumentado utilizando mais molculas marcadoras diferentes e tambm
nucleotdeos marcados diretamente com outros fluorocromos. Embora vrios
flurocromos sejam vermelhos, o sistema de anlise de imagem capaz de distingui-
los pela diferena no comprimento de onda.

Figura 1.10 Marcao e deteco simultnea de quatro sondas. (a) Sondas distintas,
marcadas com diferentes propores de biotina e digoxigenina foram hibridizadas em um
mesmo cromossomo. (b) A biotina reconhecida por um conjugado (avidina + FITC) e
a digoxigenina, por outro (antidigoxigenina + rodamina), nas mesmas propores da
marcao, resultando em sinal diferente para cada sonda.

Uma alternativa mais simples para localizar vrias sondas em uma mesma
clula fotografar as clulas com duas sondas e, em seguida, descorar a lmina e
utilizar as mesmas clulas para outra HIS com outras sondas. Cheng et al. (2001),
por exemplo, mapearam dez seqncias diferentes de DNA em um brao cro-
mossmico de arroz, utilizando cinco re-hibridizaes seguidas, cada uma com duas
sondas, sempre detectadas com FITC e rodamina. Mller et al. (2002) realizaram
quatro re-hibridizaes em clulas humanas, utilizando em cada re-hibridizao um
conjunto complexo de sondas cromossmicas, como as sondas para pinturas
cromossmicas mltiplas ou para Zoo-FISH.
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 27

VARIAES TCNICAS DA FISH


Entre as variaes tcnicas da FISH, a mais importante foi denominada de PRINS
(PRimed IN Situ labeling Koch et al., 1989). A principal diferena que na PRINS
a sonda hibridizada in situ antes de ser marcada (veja descrio detalhada do
procedimento em Gosden e Lawson, 1994). A sonda hibridizada funciona como
um iniciador de sntese que tem seu terminal 3' expandido pela ao de uma DNA-
polimerase Taq em presena de nucleotdeos marcados. O resultado que a sonda
adquire expanso marcada que denuncia sua localizao no cromossomo. Uma das
vantagens dessa tcnica que a intensidade do sinal no depende do tamanho da
sonda e, sim, do tamanho da expanso produzida pela polimerase. Isso torna a
tcnica especialmente til para hibridizaes com oligonucleotdeos ou outras
sondas pequenas de DNA de cpia nica. Alm disso, a PRINS apresenta a
vantagem de ser um procedimento mais simples e rpido.
A tcnica de PRINS deu origem a outra variante denominada C-PRINS
(cycling-PRINS), que consiste na amplificao, por PCR, do DNA-alvo in situ. Nesse
caso, utilizam-se dois iniciadores flanqueando o DNA-alvo, como numa reao de
PCR (e no apenas um, como na PRINS). Todos os reagentes necessrios para a
reao de PCR, incluindo os iniciadores, os nucleotdeos marcados e os no-marcados
e a Taq-polimerase, so aplicados na lmina e cobertos com uma lamnula. A
preparao lutada e introduzida num termociclador que aceita lminas em vez de
tubos de Eppendorf. Os iniciadores amplificam o DNA-alvo e os nucleotdeos
marcados permitem a visualizao do stio. Essa tcnica tem a vantagem de ser mais
rpida e, aparentemente, apresentar maior sensibilidade e poder de resoluo, embora
ainda seja relativamente pouco utilizada (Kubalkov et al., 2001).
Outras variantes tcnicas tm sido desenvolvidas para visualizar a intercalao
de seqncias repetitivas muito prximas, ou a distncia entre duas sondas no fio
de DNA. Nesses casos, a viso do cromossomo como uma macroestrutura d lugar
anlise de segmentos de DNA, com um nvel de resoluo vrias vezes maior que
o que poderia ser obtido na anlise cromossmica. Uma dessas tcnicas mais
utilizadas a de fibras estendidas, em que ncleos interfsicos inteiros e sem
citoplasma, no-fixados, so espalhados em um dos lados de uma lmina e, em
seguida, so lisados, deixando a cromatina parcialmente livre. Mantendo-se a
lmina inclinada, com os ncleos na parte mais alta, adicionam-se algumas gotas
de tampo na parte de cima da lmina, criando-se uma suave corrente que
impulsiona as fibras da cromatina para fora, deixando-as estendidas (Figura 1.11).
A lmina ento fixada e utilizada para FISH (Fransz et al. 1998). Glser et al.
(1997), por exemplo, utilizaram fibras estendidas de cromatina de ncleos
interfsicos humanos para visualizar a distribuio intercalada de trs seqncias
28 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica

repetitivas e dois genes na regio diferencial do cromossomo Y. O limite mximo


de resoluo nessas fibras prximo a 1 kb (De Jong et al., 1999).

Figura 1.11 FISH em fibras estendidas. Ncleos interfsicos sem citoplasma (a) so lisados
(b) e as fibras de DNA so impulsionadas para fora do ncleo por uma corrente lquida (c).
Em seguida, feita a fixao e o DNA-alvo localizado por FISH nas fibras estendidas (d).

Michalet et al. (1997) desenvolveram outra tcnica para obter fios de DNA
estendidos em uma lmina, denominada DNA combing, referindo-se ao fato de que
as fibras de DNA aparecem alinhadas ou penteadas (do ingls, to comb = pentear).
Nesse caso, uma lamnula siliconizada mergulhada em uma soluo contendo
molculas de DNA. Essas molculas tendem a aderir por uma das extremidades
(eventualmente pelas duas) na superfcie siliconizada. A lamnula ento retirada
lentamente da soluo. Ao atravessar o menisco, as molculas so tensionadas no
sentido contrrio ao da retirada da lamnula, o que as torna ao mesmo tempo
estiradas e aderidas superfcie da lamnula (Figura 1.12). A lamnula pode ser
utilizada para FISH, com uma resoluo semelhante das fibras estendidas, que
provavelmente o limite inferior que pode ser obtido com FISH.
Diversas outras variaes da tcnica de HIS procuram, por um lado, aprimorar
os mtodos de marcao e deteco da sonda e, por outro, ampliar o nvel de
resoluo de sondas contguas. Nesse ponto, as tcnicas citomoleculares
confundem-se com as estritamente moleculares, formando um elo importante entre
a anlise citogentica e a anlise genmica. O seqenciamento dos genomas
eucariotas revelou o padro de organizao de vrias seqncias do DNA
cromossmico. A citogentica atual tem procurado entender o significado dessas
seqncias em vrios organismos, verificando sua distribuio espacial em
diferentes tipos de ncleos (interfsicos, politnicos, meiticos) e em situaes
especiais, como nos ncleos de hbridos artificiais e de patologias celulares.
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 29

Figura 1.12 Fibras de DNA alinhadas por DNA combing. Uma lmina siliconizada
mergulhada em uma soluo contendo molculas de DNA (a). Algumas molculas de DNA
aderem lmina e quando esta retirada da soluo as molculas de DNA so estendidas
pela tenso superficial do menisco, aparecendo alinhadas (b).

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