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XVIII Congresso Brasileiro de Automtica / 12 a 16-setembro-2010, Bonito-MS

TECNICAS ALTERNATIVAS PARA ANALISE DO SINAL DE BIOSENSORES


BASEADOS EM RESSONANCIA DE PLASMA DE SUPERFICIE

Carlos Alberto de Souza Filho, Antonio Marcus Nogueira Lima, Helmut Neff


Departamento de Engenharia Eletrica
Centro de Engenharia Eletrica e Informatica
Campina Grande, Paraba, Brasil

CETENE/LINCS
PE,Brasil

Emails: calberto@ee.ufcg.edu.br, amnlima@ee.ufcg.edu.br, heneff@web.de

Abstract This paper proposes the use of new features for analyzing the SPR signal (SPRsig). The mor-
phology analysis of the SPRsig by measuring and asymmetry G is proposed. The energy can also be used to
analyze the SPRsig. Thus, the feature is obtained directly from the raw signal, avoiding the calibration step
of reference signal as well as the need for dividing the measured data by the reference to get the SPR curve.
Besides these features, the noise of the minimum value of the SPR curve is included as an important feature for
measurements based on SPR biosensors.
Keywords biosensor, Surface Plasmon Resonance, Morphology Analysis, line broadening, asymmetry

Resumo Este artigo propoe o uso de novas caractersticas para analisar o sinal dos biosensores baseados
em ressonancia de superfcie de plasma (SPR). Uma analise morfologica, atraves da medicao da largura da
curva e da assimetria G, e proposta como alternativa a convencional analise do angulo ou da frequencia de
ressonancia. A energia do sinal bruto tambem pode ser utilizada, apresentando a vantagem de evitar a etapa de
calibracao do sinal de referencia e diminuir a complexidade computacional. O rudo sobre o angulo de ressonancia
e acrescentado como outra possibilidade para medicao em biosensores SPR.

Keywords biosensores, Ressonancia de Plasma de Superfcie, analise morfologica, largura, assimetria.

1 Introducao funcionalidades de biosensores baseados em


Ressonancia de Superfcie de Plasma, atraves
Biosensores que utilizam o princpio da ressonan- da inclusao de novas tecnicas para a analise
cia de plasma (SPR) usam a condicao de ressonan- do sinal SPR obtido. A largura da curva e
cia para obter a informacao sobre as substancias utilizada para medir a evolucao temporal das
absorvidas. Outra alternativa e a utilizacao de variacoes existentes na camada sensvel. Sao
modelos matematicos para estimar, atraves da apresentadas novas alternativas para medicao
curva SPR obtida experimentalmente, os parame- como a monitoracao do valor da assimetria e a
tros da espessura da camada d3 e o ndice de re- variacao do rudo no angulo de ressonancia. A
fracao da substancia analisada n3 . energia do sinal bruto de imagem e outra forma
Nos biosensores SPR, que utilizam a interro- analisada para evolucao temporal.
gacao angular, a curva SPR obtida e uma funcao Foi realizado um estudo comparativo anali-
da intensidade do sinal de luz refletida pelo an- sando a sensibilidade com relacao ao ndice de re-
gulo de incidencia do feixe de luz. A curva apre- fracao e a espessura da camada sensvel, alem da
senta um decaimento que atinge seu mnimo no variacao com relacao a temperatura das tecnicas
angulo de ressonancia res . Atraves do angulo de propostas.
ressonancia encontra-se o valor do ndice de re- Os novos parametros foram utilizados para
fracao efetivo, que geralmente e o unico parametro auxiliar na discriminacao de ligacoes reversveis e
fornecido pelos biosensores existentes. Alguns irreversveis de protenas na formacao da monoca-
biosensores sao capazes de fornecer o ndice de re- mada do biosensor.
fracao absoluto e a espessura da camada formada
pela substancia analisada. 2 Ressonancia de Plasma de Superfcie
A forma da curva SPR tambem e modifi-
cada de acordo com a substancia a ser medida, Biosensores SPR utilizam um campo evanescente
porem, ainda e pouco utilizada. Existem estu- de um modo especial de propagacao do campo
dos que demonstram que a largura da curva eletromagnetico em uma interface entre um metal
e afetada pela espessura da camada de ouro do e um dieletrico (Plasma de Superfcie) para medir
biochip (Neff et al., 2006). O valor de tambem mudancas no ndice de refracao do dieletrico nas
pode ser utilizado, em conjunto com a variacao proximidades da interface (Piliarik and Homola,
do angulo de ressonancia, para estimar o valor do 2009)
ndice de refracao e da espessura da camada sen- O biosensor utilizado foi o CAMBIO
svel (Koutsiuobras et al., 2007). (de Souza Filho, 2008) ilustrado pelo diagrama
Este trabalho propoe a expansao das da Figura 1. Este biosensor utiliza o princpio

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de reflexao interna total e modo de interrogacao q


angular. A luz gerada por um diodo Laser, com n2j (n1 sen(1 ))2
comprimento de onda de = 670nm, incide qj = (4)
perpendicularmente no filme metalico de ouro n2j
com espessura d2 = 50nm. O elemento de 2 q 2
acoplamento otico de difracao(DOCE), que forma dj nj (n1 sen(1 ))2
j = (5)

o substrato do meio 1, funciona como um guia de
onda que direciona a luz para regiao central onde Os valores utilizados nas equacoes 3 a 5 sao
esta localizado o elemento sensor. A luz refletida referentes a luz incidente e as camadas do trans-
tambem sai do DOCE perpendicular ao filme dutor ilustrada na Figura 1, de forma que:
metalico e e captada por uma camera CMOS
nj = njre + injim e o ndice de refracao com-
unidimensional de 1024 pixels.
plexo do meio j
No ponto de incidencia do feixe de luz parte
da radiacao penetra no meio 3, criando um campo j e o angulo de incidencia da onda de luz que
eletrico evanescente com amplitude que cai expo- se propaga pelo meio j
nencialmente com a distancia de penetracao. O
campo eletrico excita os eletrons livres do metal e e o comprimento de onda da luz incidente
criando uma onda de superfcie de plasma (SPW) no vacuo.
que se propaga ao longo do filme. A criacao da
SPW provoca uma transferencia de energia do
3 Definicao dos Parametros
feixe de luz para a onda, que pode ser verifi-
cada como um decaimento na intensidade de luz 3.1 Analise Morfologica da Curva SPR
refletida pelo filme. A SPW e criada quando a
componente horizontal do feixe de luz incidente e A analise morfologica da curva SPR, que e pro-
igual ao vetor de onda da SPW. Na interrogacao posta como alternativa a medicao do angulo de
angular este ponto e denominado de angulo de ressonancia, procura identificar alteracoes no for-
ressonancia res . Mudancas na interface causadas mato da curva em funcao de variacoes na camada
por alteracoes da espessura d3 ou do ndice de re- sensvel. A analise proposta e realizada atraves do
fracao n3 provocam um deslocamento do angulo monitoramento dos parametros da largura e da
de ressoancia, permitindo identificar variacoes na assimetria G ilustrados na Figura 2.
substancia analisada.
1

4 n4re d4
3 n3re+in3im d3 0.9
2 n2re+in2im d2
DOCE 1 =+
n1re d1 0.8
G= /
Intensidade

Ajuste Polinomial
0.65

0.7
0.6

qres 0.55
0.6
0.5

0.45
0.5

Res
0.4
67 67.5 68 68.5 69 69.5 70
Diodo Laser Cmera CMOS Curva SPR 0.4
60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80
()

Figura 1: Estrutura dos componentes e Modelo de


Camadas do Biosensor CAMBIO
Figura 2: Caractersticas da Morfologia da Curva
O CAMBIO pode ser representado atraves do SPR
modelo de 4 camadas ilustrado na Figura 1. O co-
eficiente de reflexao pode ser calculado atraves da A largura da curva e calculada no valor de in-
equacao de Fresnel na formulacao matricial (Neff tensidade media representado pela reta da Figura
et al., 2006) exposta na equacao 1. 2. Este valor e obtido atraves do valor medio entre
o ponto maximo e o ponto mnimo da curva SPR.
(m11 + m12 qm )q1 (m21 + m22 )qm O valor de e entao obtido atraves da distancia
r= (1) entre a borda esquerda e a borda direita da curva.
(m11 + m12 qm )q1 + (m21 + m22 )qm
Para encontrar a assimetria G e preciso ini-
sendo, cialmente determinar a abscissa do valor mnimo
da curva que corresponde ao angulo de ressonancia

m11 m12 res . Em seguida e determinada a distancia entre
Mtot = M2 M3 . . . Mm1 = (2) o mnimo e a borda esquerda da curva SPR ,
m21 m22
assim como a distancia entre o mnimo e a borda
" # direita . Estes valores sao obtidos no valor de
i.sen(j )
cos(j ) intensidade media da curva. O valor da assimetria
Mj = qj (3)
i.qj sen(j ) cos(j ) e definido atraves da razao entre as duas metades

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da curva em relacao ao ponto mnimo, podendo relacao a temperatura. O sensor utilizado foi o
ser calculado atraves das equacoes 6 e 7 CAMBIO simulado com o modelo de 4 camadas
atraves da equacao 1.

GR = (6)

4.1 Variacao com o Indice de Refracao
GL = (7)

Para avaliar a sensibilidade dos parametros em re-
Existe uma relacao direta entre os valores de lacao a variacao do ndice de refracao, o valor da
e G. A largura da curva pode ser determi- espessura da camada sensvel d3 foi mantido cons-
nada em funcao dos valores de e de de acordo tante em 10nm. Para cada ndice de refracao n3 ,
com a equacao 8. Utilizando-se as equacoes 6 e 8 variando dentro da faixa de 1, 33 a 1, 7 com um
encontra-se a relacao entre a assimetria e a largura incremento de 1 103 , obteve-se uma curva SPR
da curva atraves da equacao 9. atraves das equacoes de Fresnel. Utilizando-se a
curva obtida foram calculados os valores de res ,
=+ (8) , G e Esig .
Como os parametros apresentam valores em
ordem de grandezas diferentes, foi realizada uma
GR = 1 (9) normalizacao para permitir uma comparacao en-

tre eles. Cada parametro foi normalizado em
3.2 Energia e Rudo funcao do seu primeiro valor, que e referente ao
ndice de refracao de 1, 33, para comparar a sen-
Variacoes na camada sensvel provocam um deslo- sibilidade relativa dos parametros. O comporta-
camento no angulo de ressonancia assim como mento obtido para os valores normalizados estao
tambem uma variacao no decaimento da curva. ilustrados na Figura 3.
Desta forma a area total da curva tambem e al-
terada. O aumento da espessura d3 assim como
mudancas no valor do ndice de refracao da ca- 1.4

G E
mada n3 , fazem com que a energia absorvida para 1.35 res R sig
resN , N, Assimetria GN, Energia EsigN

criar a onda de superfcie de plasma tambem seja 1.3

modificada. Isto permite medir variacoes da ca- 1.25

mada sensvel atraves da energia do sinal de luz 1.2

refletido. 1.15

A energia total do sinal bruto obtido, denom- 1.1

inada aqui por Esig e definida como sendo o so- 1.05

matorio de todos os pontos do sinal de imagem 1

para a substancia analisada. A determinacao do 0.95

valor de Esig nao necessita do sinal de referencia, 0.9


0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
Variao do ndice de Refrao da camada sensvel n3
0.35 0.4

como acontece no calculo do angulo de ressonan-


cia, evitando a etapa de calibracao e tornando
mais rapido o processamento. Uma soma ponde- Figura 3: Variacao dos parametros em funcao do
rada de pontos ja foi utilizada para gerar um sinal ndice de refracao da camada sensvel
de tensao correlacionado ao ndice de refracao e
concentracao do analito (Hansen et al., 2005). Os parametros apresentaram um taxa de vari-
Alem dos parametros da morfologia da curva acao relativa de res = 1, 466 104 , =
e da energia e proposto o monitoramento do 1, 1 103 , GR = 1.0319 104 e Esig =
rudo sobre o pixel correspondente ao angulo de 1.7365 104 . A largura foi o parametro mais
ressonancia. Cada amostra do sinal da curva SPR sensvel a variacao do ndice de refracao, apresen-
e obtida atraves da media de quadros do sinal de tando maior taxa de variacao relativa. A ener-
imagem. A partir desta media e calculado o valor gia do sinal Esig foi o segundo parametro mais
do angulo de ressonancia res . O rudo e entao sensvel seguido por res e por ultimo GR . A as-
calculado pelo desvio padrao do valor do pixel, simetria e a energia apresentaram taxa de variacao
correspondente ao angulo de ressonancia, para os negativa indicando que com o aumento do ndice
quadros utilizados na obtencao da curva SPR. de refracao existe um decrescimo nos valores de
GR e Esig .
4 Analise da Sensibilidade Os coeficientes de correlacao entre os para-
metros res e em relacao ao ndice de refracao
Para avaliar a utilizacao de , G e Esig na medicao foram unitarios. Para a assimetria GR o valor foi
de uma substancia com biosensores SPR, foi rea- de 0, 9333 e para Esig de 0, 999. Estes valo-
lizada uma analise da sensibilidade destes para- res indicam que todos os parametros podem ser
metros em funcao do ndice de refracao n3 , da utilizados para detectar variacoes no ndice de re-
espessura da camada sensvel d3 e da variacao em fracao da camada sensvel.

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4.2 Variacao com a Largura fixacao de substancias sobre a camada sensvel. O


efeito da dilatacao do biochip tambem pode provo-
A sensibilidade dos parametros em relacao a vari- car um deslocamento na curva SPR e consequente-
acao da espessura foi analisada para um ndice mente no angulo de ressonancia calculado.
de refracao de 1, 45, que corresponde ao valor do Existem estudos que demonstram a influen-
ndice de refracao da protena BSA (Bovine Serum cia da temperatura sobre a resposta do biosen-
Albumin). O BSA foi escolhido por ser o elemento sor SPR. A sensibilidade de um biosensor SPR
que forma a primeira camada do biocatalizador. com interrogacao angular em relacao a tempera-
Os valores da espessura foram analisados no in- tura pode chegar a 1, 4 104 RIU/ C. Pode-se
tervalo de 3 109 m a 17 109 m com incre- encontrar na literatura tecnicas para minimizar
mentos de 1 109 m. Para cada valor de d3 , foi ou compensar o efeito da temperatura . A mais
obtida a curva SPR e calculados os parametros , comum e a utilizacao da medicao do sinal de um
G, Esig e res . Os parametros foram normaliza- canal de referencia em paralelo com o canal sen-
dos em funcao do primeiro valor apresentando um sor. Como a temperatura afeta os dois canais,
comportamento ilustrado na Figura 4. realiza-se a diferenca entre a resposta do canal sen-
sor e o do canal de referencia para retirar o efeito
1.25 da temperatura(Naimushin et al., 2003). Outra
res
GR Esig
possibilidade e a utilizacao da medicao do sinal
resN , N, Assimetria GN, Energia EsigN

1.2
em valores inferiores ao angulo crtico (Chinowsky
1.15
et al., 1999).
Para avaliar o efeito da temperatura sobre a
1.1 forma da curva SPR foi considerado a influencia
sobre o valor ndice de refracao do metal n2 , do
substrato n1 e da agua n3 . Os efeitos sobre a fonte
1.05

1
de luz, o foto detector e sobre os componentes oti-
cos nao foram includos nesta analise.
0.95
2 4 6 8 10 12 14 16 18 Os valores dos ndices de refracao foram cal-
Espessura d3 (nm)
culados atraves de polinomios interpolados da res-
posta de cada material em funcao da tempera-
Figura 4: Variacao dos parametros em funcao da tura (Moreira et al., 2008). O metal apresenta
espessura da camada sensvel uma funcao dieletrica complexa, de forma que foi
utilizado um polinomio para a parte real mr e
A largura da curva e o angulo de ressonancia outro para a parte imaginaria mi de acordo com
apresentam uma caracterstica de comportamento as equacoes 10 e 11.
linear em relacao a espessura, com uma taxa de
variacao positiva. A assimetria GR e a energia do
sinal Esig , da mesma forma como na variacao do mr = a4 T 4 + a3 T 3 + a2 T 2 + a1 T 1 + a0 (10)
ndice de refracao, assumem um comportamento
com taxa de variacao negativa em relacao a espes-
sura. mi = b4 T 4 + b3 T 3 + b2 T 2 + b1 T 1 + b0 (11)
As taxas de variacao relativa para cada 1nm
da espessura sao res = 0, 0018, = 0, 012, sendo,
GR = 0, 0011 e Esig = 0.0021. Isto indica a4 = 1, 9895 1014 , a3 = 6, 4089 1011 ,
que o parametro e o mais sensvel em relacao a a2 = 4, 2999 107 , a1 = 7, 4367 104 ,
variacao da espessura, seguido de Esig ,res e por a0 = 15, 3332
ultimo GR .
Os coeficientes de correlacao de e res em re- b4 = 1.3989 1012 , b3 = 2, 3246 109 ,
lacao a espessura apresentaram valores unitarios, b2 = 1, 3486106 , b1 = 0, 0022, a4 = 0, 2287
enquanto que para a assimetria GR o valor foi de
0, 9725 e para Esig foi de 0.9997. Isto demons- O ndice de refracao do substrato foi calcu-
tra que todos os parametros podem ser utilizados lado atraves do polinomio da equacao 12. Os va-
com precisao para medicao de d3 . lores dos coeficientes sao: c4 = 2, 1091 1022 ,
c3 = 5, 8455 1012 , c2 = 1, 1017 108 ,
c1 = 3, 4756 106 , c0 = 1, 5142
4.3 Sensibilidade com Relacao a Temperatura
A temperatura e um fator que afeta fortemente n1 = c4 T 4 + c3 T 3 + c2 T 2 + c1 T 1 + c0 (12)
o desempenho de um biosensor, podendo ser o
limitante para a precisao do equipamento. O seu O analito utilizado foi a agua com ndice de
valor influencia no nvel de potencia otica do diodo refracao calculado atraves do polinomio descrito
laser, no rudo termico e na sensibilidade do foto pelo equacao 13. Os valores dos coeficientes sao:
detector, nos componentes oticos existentes, no d4 = 4, 1330 1011 , d3 = 5, 8331 108 , d2 =
ndice de refracao dos materiais e ate mesmo na 3, 1701 105 , d1 = 0, 0076, d0 = 0, 6560

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4
x 10
14
res / T
12
/T
4 3 2 1
n3 = d4 T + d3 T + d2 T + d1 T + d0 (13) 10 GR / T

8 E /T
sig

A faixa de variacao da temperatura utilizada


6

para analise foi de 273, 16K a 376, 16K, com um 4

incremento de 1K. Para cada valor de tempe- 2

ratura foram calculados os respectivos ndices de 0

refracao atraves das equacoes 10 a 13. Estes valo- 2

res foram utilizados nas equacoes de Fresnel para 4

obter a curva SPR correspondente ao valor de 6


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura (C)
temperatura. Com a curva foram calculados os
valores de res , , G e Esig .
Figura 6: Taxa de variacao dos parametros res ,
Para comparar a sensibilidade em relacao a
, GR , Esig em funcao da temperatura
temperatura realizou-se a normalizacao dos para-
metros em funcao de seus valores na temperatura
de 25 C. O comportamento dos parametros em
5 Resultados Experimentais
relacao a temperatura esta ilustrado na Figura 5.
O biosensor utilizado para realizacao dos ex-
1.07
perimentos foi desenvolvido anteriormente
1.06
1.005

res
(de Souza Filho, 2008) e utiliza o princpio
1.05
1 da interrogacao angular. Inicialmente foram
GR

1.04
0.995 Esig
realizados sucessivos ciclos de limpeza atraves da
passagem de hipoclorito seguido de agua, para
1.03 0.99
20 25
Temperatura (C)
30
remover impurezas presentes no biochip. Em
seguida obteve-se o sinal de referencia sem a
1.02

1.01
presenca de substancia lquida no sensor, ou seja,
1
o ar sendo considerado a substancia de referencia.
0.99
A curva SPR, ilustrada na Figura 2 e calculada
0.98
dividindo-se o sinal de imagem pelo sinal de
0.97
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 referencia armazenado. Cada amostra do sinal
Temperatura (C)
foi obtida atraves da media de 12 quadros do
sinal de imagem adquirido. A media e realizada
Figura 5: Variacao relativa dos parametros res , tanto na aquisicao do sinal de referencia quanto
, GR , Esig em funcao da temperatura na analise da substancia.
O angulo de ressonancia Res e calculado
No intervalo entre 20 C e 30 C todos os para- atraves da tecnica do Ajuste Polinomial. Esta
metros apresentam um comportamento linear em tecnica, ilustrada na Figura 2, consiste na apro-
relacao a temperatura. Neste intervalo a variacao ximacao da regiao de pontos proximos ao mnimo
relativa da assimetria e da largura sao pratica- a um polinomio de grau n. O valor de Res e
mente iguais. determinado encontrando-se o ponto referente ao
mnimo do polinomio. O polinomio utilizado foi
O comportamento de res , e Esig e nao li- de segundo grau.
near, apresentando taxa de variacao dependente
Os valores de Res e de sua intensidade sao
da temperatura. A assimetria apresenta um com-
utilizados na determinacao de e G como descrito
portamento linear com taxa de variacao fixa em
anteriormente.
relacao a temperatura. A Figura 6 ilustra a taxa
Para analisar a qualidade da medicao dos pa-
de variacao dos parametros de acordo com a tem-
rametros propostos, foi realizado um sensorgrama
peratura.
com a absorcao de BSA na formacao da mono-
Em temperaturas baixas a Largura e o camada do biosensor. O sensorgrama realizado e
parametro mais sensvel apresentando taxa de composto de 5 etapas:
variacao maxima de /T = 1, 272 103 / C.
Quando a temperatura atinge valores superiores 1. Inicialmente coloca-se agua pura para ser
a 29, 27 C a largura passa a ser menos sensvel analisada pelo equipamento.
do que a assimetria. A assimetria possui taxa de
variacao relativa constante de GR /T = 6, 54 2. Em seguida e colocada uma solucao de BSA a
104 / C. Os valores de res e de Esig apresentam 1% e espera-se atingir um regime permanente
taxas de variacao negativa com relacao a tempe- no valor do ndice de refracao
ratura. A largura atinge uma taxa de variacao
relativa menor do que a energia a uma tempera- 3. Na terceira etapa coloca-se agua novamente
tura de 51 C e menor do que res a 52 C. para remover as ligacoes fracas de BSA sobre

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o chip de ouro. Estas ligacoes sao denomi- cruzamento B, quando o valor do ndice de re-
nadas de ligacoes reversveis por serem facil- fracao volta a ser menor do que ao final da terceira
mente removveis. etapa.
4. Na quarta etapa e colocada uma solucao
de limpeza com Hipoclorito para remover 5.1 Analise da Largura da Curva
a monocamada de BSA. O Hipoclorito e A largura da curva obteve um comportamento
necessario para remover as ligacoes fortes, de- semelhante ao do ndice de refracao. Quando a
nominadas irreversveis, de BSA com o ouro. espessura da camada absorvida cresce pode-se ve-
5. Na ultima etapa coloca-se novamente agua rificar que existe um aumento no valor de . Isto
pura para retirar o hipoclorito e voltar a indica que o aumento da camada fixada sobre o
condicao inicial do experimento. ouro provoca a absorcao de mais energia da fonte
de luz incidente.
O sensorgrama descrito foi realizado diversas Pode-se observar, no grafico da Figura 7, que
vezes para avaliar a reprodutibilidade do ciclo. A o valor de atinge o regime permanente mais ra-
Figura 7 ilustra o comportamento para dois ciclos pidamente. Este resultado esta de acordo com
do sensorgrama. Pode-se verificar que os para- os valores simulados na secao 4.2, onde a largura
metros monitorados apresentam comportamentos apresentou a maior taxa de variacao relativa. Ate
similares em ambos os ciclos. o instante da formacao da monocamada, marcado
Para avaliar as ligacoes reversveis e irrever- pelo ponto A na curva, o valor da largura cresce
sveis, foi tracada uma reta no ponto que o ndice rapidamente. A partir deste momento verifica-
de refracao efetivo nef f atinge um valor esta- se apenas pequenas variacoes sobre o valor de ,
cionario ao final da terceira etapa de cada ciclo. que correspondem a formacao das ligacoes rever-
Este ponto indica que as ligacoes reversveis foram sveis. Quando as ligacoes irreversveis sao removi-
removidas, pois circulou apenas agua durante a das o valor de decresce rapidamente indicando
terceira etapa. A agua e capaz de remover ape- a diminuicao da espessura da camada.
nas as moleculas de BSA fracamente fixadas. A
evolucao da variacao do ndice de refracao efetivo 5.2 Analise da Assimetria
nef f , em relacao ao ndice de refracao da agua de
1, 33, esta ilustrada no primeiro grafico da Figura A evolucao da assimetria esta ilustrada no terceiro
7. grafico da Figura 7, apresentando um comporta-
mento de variacao negativa em relacao as modifi-
6
x 10
3
cacoes na camada.
1 2 3 4 5
Quando a espessura da camada cresce o valor
neff

4 A B A B
2
0
1500 2000 2500 3000 3500 4000 de GR diminui, enquanto que a diminuicao da es-
pessura provoca um aumento no valor de GR . Este
5

4.5

4
comportamento esta de acordo com os resultados
1.8
1500 2000 2500 3000 3500 4000
simulados.
Durante o instante de formacao da monoca-
G

1.75
1.7
1.65
1500 2000 2500 3000 3500 4000 mada pode-se verificar um pico no valor de GR .
1250
O mesmo fenomeno foi encontrado para o valor da
Esig

1200

1500 2000 2500 3000 3500 4000


largura. Esta variacao abrupta nos valores de GR
74
e e atribuda a consolidacao da formacao da ca-
Rudo

72
70
68
66
64
mada. O valor do pico em GR pode ser utilizado
1500 2000 2500 3000 3500 4000
para detectar previamente o instante da formacao
da monocamada com as ligacoes irreversveis de
BSA.
Figura 7: Sensorgrama da absorcao de BSA
5.3 Analise da Energia
O aumento do ndice de refracao efetivo nef f ,
durante a segunda etapa do ciclo, indica que as A energia do sinal obtida apresentou um compor-
moleculas de BSA estao sendo fixadas na camada tamento ilustrado no quarto grafico da Figura 7.
de ouro. O ponto A de cruzamento com a reta O comportamento obtido e similar ao do ndice
tracada indica o momento em que e formada a de refracao. A medida que o BSA comeca a ser
monocamada com as ligacoes irreversveis. A par- absorvido o valor de Esig aumenta ate o instante
tir deste momento o ndice de refracao continua que atinge o valor de regime permanente. Quando
aumentando, indicando um acrescimo na espes- a camada e retirada o valor da energia diminui.
sura da camada formada. Porem, as ligacoes for- O valor de Esig apresentou uma dinamica in-
madas sao fracas e facilmente removveis. As liga- vertida com relacao aos valores simulados. Apesar
coes irreversveis so sao removidas apos a realiza- deste resultado ser contraditorio pode-se verificar
cao da etapa de limpeza. O instante de remocao que a energia do sinal varia conforme a modifi-
da monocamada pode ser verificado no ponto de cacao da camada.

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XVIII Congresso Brasileiro de Automtica / 12 a 16-setembro-2010, Bonito-MS

5.4 Analise do Rudo do Angulo de Ressonancia nef f . Isto permite a discriminacao de ligacoes
reverssveis e irreverssveis de protenas, com a
Alem dos parametros da morfologia da curva foi possibilidade de identificar o ponto de formacao
analisado o rudo sobre o pixel correspondente ao e remocao da monocamada.
angulo de ressonancia. Cada amostra do sinal
da curva SPR foi obtida atraves da media de 12
quadros do sinal de imagem. A partir desta me- Agradecimentos
dia foi calculado o valor do angulo de ressonan-
Os autores agradecem a CAPES e ao CNPQ pelo
cia res . O rudo e entao calculado pelo desvio
apoio financeiro disponibilizado.
padrao do valor do pixel, correspondente ao an-
gulo de ressonancia, para os doze quadros utiliza-
dos na obtencao da curva SPR. O comportamento Referencias
do rudo e ilustrado no quarto grafico da Figura
7. Chinowsky, T. M., Strong, A. A., Bartholomew,
O rudo apresenta um comportamento inverso D. U., Jorgensen-Soelberg, S., Notides, T.,
ao ndice de refracao efetivo nef . Quando o BSA Furlong, C. E. and Yee, S. S. (1999). Improv-
comeca a ser fixado existe um aumento de nef ing surface plasmon resonance sensor per-
enquanto que verifica-se uma diminuicao no valor formance using critical-angle compensation,
do rudo. No momento que a espessura da camada Vol. 3857, SPIE, pp. 104113.
diminui observa-se um aumento no valor do desvio de Souza Filho, C. A. (2008). Sistema de aquisicao
padrao do rudo. e processamento portatil para biosensores, 55
O comportamento do rudo pode ser atribudo Congresso Brasileiro de Automatica .
ao fato de que o aumento da espessura da camada
sensvel provoca o aumento da energia absorvida. Hansen, L., Johnston, M. and Wilson, D. (2005).
Isto faz com que as diferencas causadas por per- System-on-chip surface plasmon resonance
tubacoes contribuam menos no efeito SPR, conse- sensors using pulse-based interface circuits,
quentemente o rudo obtido e menor. Para espes- p. 4 pp.
suras menores a energia necessaria para alcancar
a condicao de ressonancia e menor, logo qualquer Koutsiuobras, A. G., Spiliopoulos, N., Anastas-
variacao no sinal pode provocar uma alteracao sig- sopoulos, D. L., Vradis, A. A. and Priftis,
nificativa na curva SPR. G. D. (2007). Surface plasmon resonance as
Outra maneira de se analisar o rudo e atraves tool for the estimation of adsorbed polymeric
da forma da curva SPR. O valor da largura da layer characteristics: Theoretical consider-
curva cresce de acordo com o aumento da espes- ations and experiment, Journal of polymer
sura da camada fixada. Logo, para pequenas es- science. Part B. Polymer physics 45: 2060
pessuras a largura da curva e pequena o que leva 2070.
a um decaimento rapido na intensidade da curva. Moreira, C., Lima, A., Neff, H. and Thirstrup,
Uma deslocamento horizontal no sinal causaria C. (2008). Temperature-dependent sensiti-
uma diferenca maior na intensidade do pixel de vity of surface plasmon resonance sensors at
ressonancia do que para larguras maiores. Isto the gold-water interface, Sensors and Actua-
porque comparando-se o sinal do mesmo pixel, tors B: Chemical 134(2): 854 862.
para curvas mais suaves a diferenca de intensidade
e menor. Naimushin, A. N., Soelberg, S. D., Bartholomew,
D. U., Elkind, J. L. and Furlong, C. E.
(2003). A portable surface plasmon resonance
6 Conclusoes
(spr) sensor system with temperature regu-
lation, Sensors and Actuators B: Chemical
Os resultados experimentais obtidos demon-
96(1-2): 253 260.
straram a viabilidade da utilizacao dos parame-
tros propostos na analise do sinal SPR. O estudo Neff, H., ZONG, W., Lima, A. M. N., BORRE,
comparativo demonstrou que a Largura da curva M. and HOLZHUETER, G. (2006). Optical
foi o parametro com maior taxa de variacao rela- properties and instrumental performance of
tiva, indicando que e capaz de detectar mais ra- thin gold films near the surface plasmon re-
pidamente modificacoes na camada sensvel. Em sonance, Thin solid Films 496: 688697.
contrapartida a largura tambem e mais sensvel a
variacoes de temperatura. Piliarik, M. and Homola, J. (2009). Surface plas-
A utilizacao do rudo e da energia do sinal mon resonance (spr) sensors: approaching
evita a necessidade da normalizacao pelo sinal de their limits?, Opt. Express 17(19): 16505
referencia, diminuindo a complexidade computa- 16517.
cional.
Com os novos parametros e possvel iden-
tificar mudancas no comportamento do sinal
nao observadas no monitoramento de res e de

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