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manuscrito aceptado

sensor basado en liposomas para la deteccin de bacterias: Ttulo

Autor: Manuela Petaccia Cecilia Bombelli Francesco Paroni Sterbini


Massimiliano Papi Luisa Giansanti Francesca Bugli Maurizio Sanguinetti
Giovanna Mancini

PII: S0925-4005 (17) 30547-6


DOI: http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.snb.2017.03.124
Referencia: SNB 22036

Aparecer en: Sensors and Actuators B

Fecha de recepcin: 16-12-2016


Fecha revisada: 23-3-2017
Fecha de aceptacin: 27-3-2017

Por favor citar este artculo como: M. Petaccia, C. Bombelli, FP Sterbini, M. Papi,
L. Giansanti, F. Bugli, M. Sanguinetti, G. Mancini, sensor basado en liposomas para la deteccin de
bacterias, Sensores y Actuadores B: Qumica ( 2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.snb.2017.03.124

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aplican a la revista pertenecen.
sensor basado en liposomas para la deteccin de bacterias

Manuela Petaccia, , Cecilia Bombelli, * Francesco Paroni Sterbini, y Massimiliano Papi,

Luisa Giansanti, , Francesca Bugli, y Maurizio Sanguinetti, Y Giovanna Mancini

Dipartimento di Scienze e fisiche Chimiche, Universit degli Studi dell'Aquila, Via Vetoio,

do
67100 Coppito (Aq), Italia

ta
CNR-IMC Sezione di Meccanismi Reazione c / o degli Dipartimento di Chimica Universit

ep
Studi di Roma La Sapienza P.le A. Moro 5, 00185 Roma, Italia
ac
y Istituto di Microbiologia, Universidad Catlica del Sacro Cuore, Largo Francesco Vito, 00168,

Roma, Italia.
ito

Istituto di Fisica, Universidad Catlica del Sacro Cuore, Largo Francesco Vito, 00168, Roma,
cr

Italia.
us

CNR - Istituto di Metodologie Chimiche, Via Salaria km 29.300, 00016 Monterotondo Scalo
an

(RM), Italia
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1
ABSTRACTO

Identificacin y cuantificacin de las bacterias que afectan a la vida humana, enfermedades que causan directamente y

indirectamente contaminar los ecosistemas naturales, se llevan a cabo principalmente por caro y tiempo-

consumir mtodos. Existe la necesidad de formas rpidas y econmicas para la deteccin de bacterias en el

medio ambiente y en las clnicas. Proponemos el uso de liposomas diseados para la deteccin de bacterias en

agua potable. Nuestro enfoque explota liposomas catinicos funcionalizados con una superficie de potencial

fluorforo sensible, 4-heptadecylumbelliferone (C17-HC). La interaccin entre los liposomas

do
y las bacterias implica un cambio en el potencial de superficie experimentado por C17-HC y los conmutadores de

ta
una seal ptica.

ep
Se investig, mediante DLS, el potencial zeta y la fluorescencia experimentos, un gran nmero de

liposomas catinicos formuladas con un fosfolpido 1,2-dipalmitoil naturales sn glicero-3-


ac

fosfocolina (DPPC) o 1,2-dioleoil sn glicero-3-fosfocolina (DOPC), C17-HC, y


ito

uno de los tres componentes catinicos sintticos, que difieren unos de otros para el nmero de

insaturaciones en la cabeza polar de amonio, 1-3 (Tabla 1), dos de los cuales eran ad hoc sintetizado.
cr

Luego se evalu la capacidad de los liposomas para producir una seal fluorescente tras la interaccin con
us

tres cepas bacterianas, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Enterococcus faecalis;


an

Adems, se analiz la respuesta fluorescente de cada formulacin de liposomas en la presencia en

al mismo tiempo de las tres cepas bacterianas al mismo tiempo, con el fin de simular un escenario real.
m

Se wasWe encontr que la interaccin con las bacterias desencadena una seal ptica en seis de los evaluados

formulaciones, dando como resultado que result sensible a 10 2 CFU / ml de bacterias suspendidas en

el agua procedente de la tubera principal de agua de Roma (Italia).

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PALABRAS CLAVE: liposomas fluorescentes catinicos, grupos alilo, deteccin de bacterias, agua tubera, 4-

heptadecylumbelliferone.

do
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3
reflejos

Se propone un sistema fluorescente basada en liposomas para la deteccin de bacterias en el agua


Se investigaron diferentes formulaciones de liposomas mixtos
Tambin se estudiaron las variaciones de Z-potencial de la interaccin con las bacterias

do
La organizacin de la membrana del liposoma controla la respuesta fluorescente del sistema
Inespecfica de liposomas / bacterias interacciones pueden ser explotados para la deteccin diferencial

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4
1. INTRODUCCIN

En los ltimos aos, los sistemas de sensores para la deteccin de bacterias patgenas han recibidos mejorado

inters, sobre todo en el campo de la seguridad alimentaria, los diagnsticos clnicos y los grmenes de guerra

campos. Esto es debido al creciente nmero de patologas causadas por bacterias, que representan

hasta el 40% de los 50 millones de muertes anuales en todo el mundo. [1]

do
Durante dcadas, la identificacin y cuantificacin de gneros y especies cepas bacterianas, que

afecta a la vida humana que afecta tanto a las enfermedades que causan directa e indirectamente contaminen naturales

ta
ecosistemas, se basaron en el cultivo bacteriolgico tradicional y la identificacin bioqumica
ep
tcnicas. [2,3] Estos mtodos convencionales [4] para la deteccin de bacterias se basan en
ac
medios de cultivo enriquecido selectivo y no selectivo, seguida de bioqumica y serolgica

identificacin. El objetivo principal de los sistemas no convencionales ms recientes ha sido la de abarcar una
ito

rpida alternativa a los mtodos de cultivo que consumen mucho tiempo, que generalmente requieren de varios das a
cr

dar un resultado.
us

Muchos enfoques [5,6] para la deteccin de bacterias y para la construccin de sensores para su

no especfica o de identificacin especfico se han explorado; entre otros, polmeros, nanopartculas


an

y los liposomas se han utilizado para superar este reto y han producido la deteccin nanosensor
m

sistemas, tales como polmeros fluorescentes de hidratos de carbono funcionalizado, [7] nanopartculas magnticas

(MGNP) [8] y los sensores de polidiacetileno (PDA) de liposomas. [9] Estos sistemas se han mostrado

a ser muy atractivo tambin para el futuro diseo de los detectores ms eficaces para los patgenos, pero

criterios tales como lmite de deteccin, sensibilidad, tiempo requerido para obtener un resultado, y los gastos de laboratorio

(Incluyendo la habilidad, la mano de obra y el costo) quedan a menudo sin resolver.

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5
polmeros funcionalizados, mostrando un andamio verstil para la unin de una variedad de

diferentes hidratos de carbono, tienen la ventaja de proporcionar la deteccin simultnea de ms de

un patgeno, por desgracia, el lmite de deteccin de estos mtodos es bastante alta (~ 10 4 CFU / ml). [7]

nanopartculas MGNPs magntico podra ser muy ventajoso para la deteccin de bacterias

porque se caracterizan por una alta relacin superficie / volumen que ofrece una mayor superficie de contacto

para la fijacin de molculas de direccionamiento para capturar patgenos. [10] molculas de direccionamiento pueden ser

hidratos de carbono, pptidos o anticuerpos. En el caso de anticuerpos, MGNPs pueden mostrar una deteccin

do
limitar considerablemente menor que la del mtodo de ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA). [8]

Glico-MGNPs son funcionalizados con restos de azcar y con xito explotan la conocida

ta
capacidad de las bacterias en el reconocimiento de hidratos de carbono, por lo general expuesto en la superficie de clulas de mamferos, a
ep
infectar las clulas. [11, 12] Sin embargo, la modificacin de superficie de MGNPs con ligandos de diana podra
ac
inducir la agregacin y aglomeracin de nanopartculas, influyendo as en su toxicidad y

comportamiento en el entorno biolgico. [13, 14]


ito

Por el contrario, los liposomas no muestran este problema al tener muchas ventajas, como
cr

sensibilidad, rapidez, amplio rango dinmico, relativamente simple y de bajo coste de fabricacin
us

equipo. Los sistemas basados en liposomas PDA son las ms estudiadas en liposomas basan

sensores; PDA, diversamente incrustado en la membrana del liposoma, puede someterse a un simplemente detectable
an

transformacin colorimtrica tras la interaccin con bacterias enteras o con bacterianas secretadas
m

molculas [15,16]. Con el fin de mejorar el rendimiento de liposomas PDA en trminos de especificidad y

sensibilidad, una gran cantidad de esfuerzos se han hecho ya sea mediante la decoracin de liposomas con diferentes PDA

especficas etiquetas bacteria, [17, 18] o mediante la modificacin de la formulacin de lpidos [19]. La mayora de

Estos sistemas permiten la deteccin y la identificacin de diferentes cepas de bacterias Gram-negativas, mientras

Slo unos pocos artculos informan sobre el xito de la deteccin de las bacterias Gram-positivas por liposomas PDA,

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6
adems con tiempos de respuesta largos [20]. Adems, es bien conocido que los liposomas catinicos pueden

interactuar con ambas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, aunque de manera no especfica,

por adsorcin sobre la pared celular cargada negativamente [21] y, de hecho, la atraccin electrosttica es

en gran parte explotada en el desarrollo de sistemas de administracin de frmacos para la orientacin no especfica de

bacterias [22,23] y biofilms [24].

Aqu proponemos Por el contrario, los liposomas no se muestran estos graves problemas ambientales

problemas y tienen muchas ventajas tales como la sensibilidad, rapidez, amplio rango dinmico, relativamente

do
un equipo sencillo y de bajo costo. En particular, los sensores de polidiacetileno basados en liposomas permiten

detectar una concentracin muy baja de lipopolisacridos y la identificacin de diferentes cepas de bacterias.

ta
Desafortunadamente, en la mayora de los casos, estos sensores son capaces de detectar slo Gram-negativas negativeGram
ep
bacterias [15] y requieren sntesis compleja y de larga incubacin time.Here que proposean
ac
un enfoque basado en liposomas eficaz para la deteccin de bacterias en el agua potable, explotando

liposomas catinicos funcionalizados con el fluorforo 4-heptadecylumbelliferone (C17-HC), una


ito

la sonda sensible al potencial de la superficie. [25] El enfoque se basa en la induccin de un fluorescente


cr

seal tras la interaccin de liposomas con bacterias, debido al cambio de potencial de superficie
us

experimentado por C17-HC.

Hemos preparado una serie de liposomas catinicos Exploramos un nmero de formulaciones catinicas
an

en su capacidad para producir una seal fluorescente tras la interaccin con tres cepas bacterianas,
m

Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli) Y Enterococcus

faecalis (E. faecalis). Se investig la interaccin de cada formulacin de liposomas tanto con

una cepa nica y con una mezcla de las tres cepas bacterianas, con el fin de simular un verdadero

escenario de contaminacin. Con este fin, se realizaron todos los experimentos se suspenden ambos liposomas

y bacterias en el agua procedente de la tubera principal de agua de Roma (Italia). Este procedimiento fue

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7
adoptado en el marco de la AQUALITY proyecto sistema de anlisis de la calidad del agua industrial Online

para la deteccin rpida y precisa de los patgenos(financiado por la UE 7PM 2007-2013). De hecho, en el

a partir del proyecto, en cada uno de los pases involucrados, se distribuy un cuestionario a

algunas industrias objetivo de conseguir ms adentro en el escenario de aplicacin del proyecto AQUALITY.

Una de las industrias que contribuyeron al cuestionario fue Laboratori SpA, un grupo de Acea

Company, la mayor utilidad grupo italiano en el sector del agua, que operan en los acueductos romanos.

Los liposomas se formulan con un fosfolpido 1,2-dipalmitoil naturales sn glicero-3-

do
fosfocolina (DPPC) o 1,2-dioleoil sn glicero-3-fosfocolina (DOPC), el fluorescente

sonda C17-HC y uno de los tres anffilos catinicos sintticos, a saber, allyldimethylhexadecyl

ta
yoduro de amonio 1, yoduro diallylhexadecylmethylammonium 2, amonio triallylhexadecyl

bromuro 3, reportado en la Tabla 1.


ep
ac
ito
cr
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an
m

Grfico 1. fosfolpidos naturales DPPC y DOPC, tensioactivos catinicos catinicos 1, 2, 3, y el

sonda fluorescente C17-HC.

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8
La carga total catinica de liposomas tiene la funcin de promover la interaccin electrosttica

con bacterias que muestran una carga global negativa en su pared celular. Los tres sinttica

componentes catinicos se diferencian entre s por el nmero de insaturaciones en la polar

de cabeza de amonio. Elegimos estas estructuras particulares, ya que permiten la investigacin de la

influencia de la polaridad del grupo de cabeza en los elegimos con el objetivo de investigar investigado

cmo las influencias del grupo de cabeza de polaridad de la polaridad del grupo de cabeza en tanto

liposoma / interaccin patgeno, Nd en el sobre de la topologa de sonda fluorescente incluido en el

do
bicapa lipdica, y por lo tanto, sobre su respuesta ptica. Por otra parte, suponemos ese resto allico, siendo

ms rgida con respecto a un residuo de propilo flexibles, podra tener un efecto mayor en bicapa

ta
reorganizacin de la interaccin con las bacterias, y, por tanto, sobre la respuesta de la sonda fluorescente.
ep
2. Seccin experimental
ac

2.1. Instrumentacin
ito

Los espectros de RMN se registraron en un espectrmetro Bruker Avance 300 II que funciona a 300,13 y

75,47 MHz para 1 H y 13 C, respectivamente, equipado con un aparato de regulacin de la temperatura tubo de muestra.
cr

Las seales fueron referenciadas con respecto a TMS ( = 0.000 ppm), usado como patrn interno en
us

discos compactos 3 SOBREDOSIS.


an

Los espectros de fluorescencia en estado estacionario se registraron a temperatura ambiente (T = 25 C) en un Horiba

Jobin-Yvon Fluoromax 4 espectrofluormetro. El sSpectra fueron corregidos por medio de una


m

incorporado en el programa con el fin de contrarrestar el deterioro de la sensibilidad en la regin del infrarrojo cercano.

Todos los experimentos de fluorescencia se llevaron a cabo en soluciones con densidad ptica inferior a 0,05

para minimizar el efecto de filtro interno.

Dispersin dinmica de luz (DLS) y Zeta-potenciales mediciones se realizaron con

Zetasizer Nano ZS (Malvern, Herrenberg, Alemania) equipado con un 633-nm lser de He-Ne.

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9
micro cubetas resistentes a los disolventes (ZEN0040, Malvern, Herrenberg, Alemania) se han utilizado durante

experimentos DLS con un volumen de muestra de 1 ml. Los m Las mediciones se realizaron en un fijo

posicin con un atenuador automtico y a una temperatura controlada. Los obtenido tasas de recuento

obtenido entonces se corrigieron para el atenuador utilizado.

Las concentraciones de cultivos de clulas durante la noche se estimaron con el DensiCHEK Plus

instrumento (bioMrieux).

Los liposomas se extruyeron usando una 2,5 ml extrusor (LipexBiomembranes, Vancouver, Canad)

do
a travs de una membrana de policarbonato con 200 nm de dimetro de poro (Whatman Nucleopore).

Las mediciones de conductividad se llevaron a cabo en un conductmetro Hanna, HI-9932, equipada

ta
con un aparato de regulacin de la temperatura. Todas las mediciones se realizaron en una clula con camisa de A que se utiliz
ep
a maintaine mantener d a la temperatura apropiada (dentro de 0,1 C) para todas las mediciones.
ac
Conductividad se midi despus de la mezcla completa y equilibrado de la temperatura en cada

adicin.
ito

2.2. Materiales y mtodos


cr

2.2.1 Materiales. 1,2-dipalmitoil sn glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1,2-dioleoil sn


us

glicero-3-fosfocolina (DOPC) (pureza> 99%) se adquirieron en Avanti Polar Lipids

(Alabaster, AL) y se us sin purificacin adicional. Tamponada con fosfato tabletas de solucin salina (PBS, 10
an

tampn de fosfato mM, KCl 2,7 mM y 137 mM de NaCl, pH 7,4), norte- bromohexadecano,
m

dialilamina, trialilamina y 4-heptadecylumbelliferone (C17-HC) (pureza> 98%) eran

adquirido por Sigma Aldrich y se us sin purificacin adicional.

El yoduro de tensioactivo aAllyldimethylhexadecyl amonio ( tensioactivo 1) se prepar como se

previamente reportado. [26] Preparacin de yoduro diallylhexadecylmethylammonium, tensioactivo 2,

y bromuro de amonio triallylhexadecyl, tensioactivo 3, caracterizacin y coloidales propiedades

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10
( cac, punto de Krafft y Krafft temperatura, la dimensin y potencial Zeta de espontnea

agregados) de tensioactivo 1-3 se presentan en el SI.

2.2.3 Preparacin 2 liposoma. Las pelculas lipdicas se prepararon en la pared interior de una redonda

matraz de fondo por evaporacin del CHCl 3 soluciones que contienen la cantidad apropiada de lpidos

componentes (DPPC -OR DOPC- y uno de los tres anffilos catinicos 1, 2 o 3) y la sonda

C17-HC para obtener las relaciones molares de lpidos deseados y concentraciones (Tabla 1). Las pelculas obtenidas

se almacenaron durante la noche bajo presin reducida (0,4 mbar) y luego hidratada con el correcto

do
volumen de una solucin PBS, para obtener dispersiones de liposomas multilamelares 5 mM en lpidos totales

(DPPC -OR DOPC- y uno de los tres anffilos catinicos 1, 2 o 3). agitacin vigorosa de los lpidos,

ta
utilizando un mezclador de vrtice encima de la temperatura de transicin principal de la bicapa (T metro), dio el
ep
formacin de una poblacin heterognea de vesculas multilaminares (MLVs). la obtenidos
ac
MLVs se congelacin-descongel seis veces de nitrgeno lquido a una temperatura diez grados por encima de T metro

de la formulacin de liposomas y, a continuacin, se extruye (10 veces) a travs de un policarbonato de 200 nm


ito

membrana. Todas las formulaciones preparadas se presentan en la Tabla 1.


cr

Tabla 1. Resumen de las formulaciones investigadas. las concentraciones de lpidos son en relacin con DPPC (o
us

DOPC) y uno de los tres tensioactivos catinicos 1, 2 o 3.


an

basado DPPC formulacin Relacin la


Formulacin basada DOPC molar concentracin de lpidos
(MM)
m

DPPC / C17-HC DOPC / C17-HC 10 / 0.7 5


DPPC / 1 / C17-HC DOPC / 1 / C17-HC 7/3 / 0,49 3,5 / 1,5
DPPC / 2 / C17-HC DOPC / 2 / C17-HC 7/3 / 0,49 3,5 / 1,5 2.2.8 3 lneas celulares y
DPPC / 3 / C17-HC DOPC / 3 / C17-HC 7/3 / 0,49 3,5 / 1,5
celda culturas. Tres

Se investigaron diferentes cepas bacterianas: E coli ATCC 25922 (Gram-negativo) (CE), MI.

faecalis ATCC 28212 (Gram-positiva) (EF) y S. aureus ATCC 29213 (Gram-positiva) (SA).

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bacterias Gram-positivas se cultivaron durante la noche en caldo de infusin cerebro corazn (caldo BHI) a 37 C,

bacterias Gram-negativas en caldo Luria-Bertani (LB caldo). Diluciones seriadas de la noche a la maana

Se prepararon cultivos de bacterias tanto Gram-positivas y Gram-negativas y diluciones de

10- 5 a 10- 9 fueron cultivadas en TSS (tripcasa soja agar + 5% de agar de sangre de oveja) y MCK (Mac

agar Conkey) placas de agar, respectivamente. El da despus de las UFC se contaron y la concentracin era

determinado. Adems, dos diluciones de cada cultivo, 1/10 y 1/100, se midieron y se

valores McFarland se convirtieron a nmero de clulas (0,5 McF 1,5x10 7 CFU).

do
2.2.4 Determinacin Global de la dimensin dimensin y Zeta potencial determinacin

por mediciones DLS. La distribucin de tamao y el tamao de las formulaciones de liposomas y agregados

ta
formado en soluciones acuosas por las anffilos 1, 2 y 3 fueron obtenidos por mediciones DLS.
ep
DLS y experimentos potencial zeta se llevaron a cabo los das 10 y 2 soluciones acuosas M de los puros
ac
anffilos a 50 C en el caso de 1, 2 y 25 C en el caso de 3 ( encima de la temperatura Krafft).

mediciones de tamao de los liposomas se realizaron en DOPC puro y liposomas de DPPC y en


ito

liposomas mixtos que contienen un fosfolpido (DPPC o DOPC) y un compuesto anfiflico catinico ( 1, 2 o
cr

3) en proporcin de 7: 3 molar, en 1 mM de concentracin total de lpidos. mediciones de potencial zeta se llevaron


us

hacia fuera en suspensiones de liposomas diluidos ms (0,5 mM de lpido total) y en un tampn ms diluida (PBS

15 mM).
an

DLS mide la funcin de autocorrelacin de intensidad:


m

(1)

gramo
2
()
donde es el tiempo de demora y los soportes representan la media de conjunto. puede estar relacionado con la

gramo
1
( )
funcin de campo de autocorrelacin por la relacin Siegert:

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12
(2)

gramo
1
( )
donde es una constante instrumental y, para una muestra polidispersa, es:

(3)

donde PI (r) dr es la funcin de distribucin de radio de intensidad ponderada, que describe la distribucin

de la fraccin en el intervalo dr, de la intensidad dispersada por una partcula de hidrodinmico radio r

do
y las tasas de descomposicin

ta
ep
con la viscosidad del agua y k la constante de Boltzmann. El valor de (r) PI se puede obtener
(4)
ac
utilizando la inversin de Laplace regularizado de la funcin de intensidad de autocorrelacin. [27]

Zeta-potenciales se midieron tomando el promedio de 3 mediciones a nivel estacionario. Nosotros


ito

utilizado una clula capilar desechable (DTS1070). El potencial zeta se calcula a partir de la
cr

movilidad electrofortica mi por medio de la correccin de Henry con la ecuacin de Smoluchowski:


us
an

(5)

donde 0 es la permitividad del vaco, r es la permitividad relativa del disolvente, a es la


m

radio de la partcula, f (ka) es la funcin de Henry, y es el tampn de solucin salina viscosidad del disolvente.

2.2.5 Evaluacin de la estabilidad C17-HC en liposomas. La estabilidad de las fluorescente C17-HC

sonda C17-HC en liposomas se evalu mediante el control de la emisin de la sonda en el

formulaciones de liposomas (lambda ex = 365 nm y em = 450 nm) con el tiempo. 5 dispersiones de liposomas mM

se incubaron primero a 25 C, y en diferentes intervalos de tiempo (0, 24, 48, 72 h) A entonces alcuotas de

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13
cada dispersin de liposomas (10? l) se mezclaron en diferentes tiempo (0, 24, 48, 72 h) con 3 ml de

PBS; y la intensidad de emisin de fluorescencia registrada en 400-500 gama nm. Se midi la

estabilidad en tres experimentos independientes mediante el clculo de la variacin de emisin de C17-HC, de acuerdo

con la siguiente ecuacin:

% C17-HC = (It-I 0) / ( yo 0) x 100

donde 0 es la fluorescencia a t = 0 y es la fluorescencia en un momento dado.

2.2.6 Evaluacin de la interaccin de liposomas-bacteria

do
2.2.6.1 mediciones potencial zeta. La interaccin de neutro (compone de DPPC puro o

ta
DOPC) y los liposomas catinicos con las tres cepas bacterianas, las mediciones se evalu por

ep
mediciones de las mediciones de potencial zeta llevaron a cabo a diferentes concentraciones de liposomas

concentraciones (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 mM) y la concentracin bacteriana fijo (10 8 CFU / ml). Todos
ac
los experimentos se realizaron a 25 C.
ito

2.2.6.2 Las mediciones de fluorescencia. La capacidad de las formulaciones de liposomas para actuar como bacteriana

sensores de deteccin para la deteccin de bacterias se evalu mediante la monitorizacin del cambio de
cr

la emisin de fluorescencia ( max = 450 nm) de C17-HC en presencia de diferentes concentraciones de


us

bacterias diferente concentracin de bacterias (10 5 CFU / ml-10 2 CFU / ml) en Roma tubera de agua.
an

Las mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo mediante la adicin de 10! l de 5 mM de dispersiones de liposomas

a 3 ml de Roma tubera de agua en presencia o en ausencia (muestra de control) de conocida


m

concentraciones de bacterias. emisin de C17-HC a 450 nm se registr 1 min despus de la adicin

( exc = 365 nm). experimentos de fluorescencia se llevaron a cabo a 25 C en el caso de DOPC basado

liposomas y a los 25 y 45 C en el caso de formulaciones basadas DPPC.

El incremento de C17-HC de fluorescencia tras la interaccin se determin como sigue:

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% F = (F x- F 0) / ( F 0) x 100

donde F 0 es la fluorescencia de liposoma en agua (control) y F x es la fluorescencia de

liposomas en presencia de bacterias. Los resultados se presentan a continuacin son en relacin con los ms bajos

relacin de liposoma / bacteria evaluado (0,02 mM / 10 2 CFUmL- 1).

Anlisis estadstico 2.2.6.3. La prueba se realiz usando Prism GraphPad 6

(Http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/) de software. La significacin estadstica (*** P <

0,001, ** P <0,01, * P <0,05,) se calcul usando anlisis de dos vas de la varianza (ANOVA)

do
con la correccin de Tukey.

ta
2.2.6.4 Microscopa Electrnica de Barrido (SEM) anlisis. La morfologa celular fue investigado por

microscopa electrnica de barrido por medio de un SEM Supra 25 (Zeiss, Alemania). antes de imgenes
ep
adquisicin, las clulas fueron fijadas en glutaraldehdo al 2,5% en 0,1 M de cacodilato tampn y pulverizacin catdica
ac
recubierto con oro como se describi anteriormente. [28]

2.2.7 Evaluacin del efecto de efecto de la temperatura sobre las caractersticas de fluorescencia de los liposomas.
ito

espectros de excitacin de los liposomas fluorescentes en el agua potable a diferentes temperaturas eran
cr

grabada mediante la adicin de 10 l de liposomas (5 mM) a 3 ml de Roma agua tubera. En particular,


us

espectros de excitacin ( exc = 300-400 nm, em = 450 nm) de DOPC, DOPC / 2 y DOPC / 3 a 25 C y

DPPC, DPPC / 2 y DPPC / 3 a 25 C y 45 C se registraron. Los resultados se presentan en el SI.


an
m

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15
3. RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1. caracterizacin de liposomas por DLS. Todas las formulaciones de liposomas que contienen o bien el

mera fosfolpido, DPPC o DOPC, o se aade con 30% de uno de los tres anffilos catinicos 1-

3, se caracterizaron por DLS, como se describe en la seccin experimental. anffilos 1-3 formar

micelas en solucin acuosa y pueden actuar como detergentes en la bicapa lipdica, por lo tanto, en el objetivo

de obtencin de liposomas catinicos con un alto potencial de la superficie asegurando una buena interaccin con

bacterias, se utilizan en la formulacin de la mayor 1-3 cantidad (30%) compatible con la obtencin de

do
agregados estables y homogneas. Los resultados se presentan en la Tabla 2. Sorprendentemente, todos

dispersiones de liposomas presentan un dimetro hidrodinmico, D marido, menor de lo esperado en base a la

ta
tamao de poro de la membrana de policarbonato utilizado para la extrusin (200 nm). tamao de los liposomas
ep
distribuciones se caracterizan por una polidispersidad muy baja polidispersidad independientemente de la
ac
estructura del componente catinico cerrado. Un radio hidrodinmico menor de lo esperado se

informaron tambin para otra formulacin de liposomas obtenida por extrusin junto con congelacin-descongelacin
ito

ciclos. [29] La facilidad y rapidez de procedimiento de extrusin nos sugiri que dispersiones de liposomas
cr

se componen principalmente de ~ 100 nm vesculas an antes de la extrusin.


us

Tabla 2. El tamao y el potencial zeta de formulaciones.

Dh (nm) Potencial Zeta (mV)


an

DOPC 140 6 - 2.4 4


DPPC 125 4 - 2.4 4
m

DPPC / 3 153 12 43 13
DPPC / 2 142 8 40 9
DPPC / 1 130 8 44 9
DOPC / 3 100 5 48 14
DOPC / 2 122 4 49 14
DOPC / 1 118 4 44 9

Todas las formulaciones de liposomas se caracterizan, como se esperaba, por un potencial Zeta positivo. En

en particular, el valor potencial Zeta no se ve afectada ni por la naturaleza del fosfolpido

Pgina 16 de 40

diecisis
(DPPC o DOPC), ni por la diferente naturaleza de los grupos de cabeza polares de los anffilos 1-3 ( Mesa

2).

3.2. Evaluacin de la estabilidad C17-HC en liposomas. A fin de evaluar la estabilidad de la

formulaciones de liposomas exploraron como sensores fluorescentes, la estabilidad de la seal fluorescente de

sonda C17-HC incrustado en la bicapa lipdica se evalu en 5 soluciones de liposomas de archivo mM por

el seguimiento de la disminucin de la intensidad de emisin ( max = 450 nm) de la sonda durante tres das.

Los resultados se presentan en la Figura 1 como el porcentaje de disminucin de la fluorescencia C17-HC como una funcin de

do
hora. En general, la variacin de la fluorescencia C17-HC durante tres das es muy bajo para todas las

formulaciones, la ms alta disminucin (20%) se observaron en el caso de DOPC / 2 liposomas. En

ta
en particular, en todos los liposomas basados DPPC (Figura 1a) y en DOPC / 1 y DOPC / 3 formulaciones,
ep
la presencia del componente catinico parece estabilizar las caractersticas de emisin de C17-HC con respecto
ac
a los liposomas neutros. Una variacin de la emisin de la sonda podra ser debido a una reorganizacin de

la bicapa lipdica en el tiempo y, en consecuencia, a una variacin de la cantidad de la desprotonado


ito

forma de la sonda que es responsable de la emisin en las condiciones experimentales elegidas. UN


cr

fuga de la sonda de la bicapa lipdica durante el tiempo del experimento se puede excluir el
us

la base de la estructura qumica C17-HC, ya la larga cadena alquilo hidrfoba sobre cumarina

proporciona un buen anclaje de la sonda fluorescente a la bicapa lipdica. El efecto estabilizador de


an

el componente catinico en C17-HC puede atribuirse a las interacciones electrostticas entre el


m

grupos de cabeza polares del componente catinico y la forma aninica de la sonda. Est claro que si se trata de

el caso, el efecto de estabilizacin debe ser estrictamente relacionado con la posicin recproca de la catinico

componente y C17-HC en la bicapa lipdica. Es posible que la organizacin de los lpidos en DOPC / 2

liposomas implica una posicin completamente diferente de la sonda fluorescente con respecto a la

otras formulaciones.

Pgina 17 de 40

17
En realidad, una ubicacin diferente de la sonda como una funcin de la estructura molecular de la

Se observ componente fosfolpido tambin en otros liposomas catinicos formulados con

anffilos catinicos sintticos. [30]

do
ta
ep
ac
ito
cr
us

Figura 1. Cambios en el tiempo de la intensidad de emisin de fluorescencia a 450 nm (lambda exc = 365 nm) de
an

C17-HC cargado (4,9%) en 0,05 mM 7/3 DPPC / 1-3 ( A) y 7/3 DOPC / 1-3 ( B) los liposomas, en el

ausencia de bacterias a pH = 7.
m

3.3. Liposoma-bacteria interaccin. La interaccin entre los liposomas fluorescentes y bacterias

( E coli, CE; E. faecalis, EF; S. aureus, SA) se evalu mediante mediciones de potencial zeta y

espectroscopia de fluorescencia.

3.3.1. mediciones de potencial zeta. La primera proyeccin de la interaccin de liposomas-bacteria

se llev a cabo mediante mediciones de potencial zeta, a fin de seleccionar las formulaciones capaces a

Pgina 18 de 40

18
interactuar eficientemente con bacterias. mediciones de potencial zeta mostraron ser un simple y

poderosa herramienta, [23], de hecho, diferentes bacterias y liposomas se caracterizan por una cierta Zeta

valor potencial, determinado por tanto la carga superficial y los iones asociados a la superficie. En

en particular, las bacterias siempre que se vea un Zeta-potencial negativo, mientras que los liposomas catinicos un positivos

uno. La interaccin entre los liposomas y las bacterias produce racimos mezcladas de partculas que muestran

un valor de potencial Zeta diferente de la de las partculas originales.

Los experimentos se realizaron en los liposomas formulados con DPPC o DOPC y uno de

do
los anffilos catinicos 1-3 en ausencia de la sonda fluorescente C17-HC. Las mediciones en

vesculas compuestas de DOPC puro o DPPC Tambin se llevaron a cabo para verificar la ausencia de

ta
la interaccin entre las tres cepas de bacterias y liposomas neutros.
ep
En estos experimentos, la relacin entre los liposomas y las bacterias es un parmetro crtico. De hecho, si
ac
una de las dos poblaciones de partculas es mucho ms grande que el otro, existe el riesgo de medir

slo el potencial Zeta de las especies abundantes y, por lo tanto, perder la informacin sobre el mixta
ito

racimos. El rea de superficie total de las bacterias y los liposomas debe ser similar. En el comunicado
cr

experimentos, la concentracin de la concentracin bacteriana se fij a 10 8 CFU / ml y el


us

concentracin de liposomas se vari en el rango de 0,01 0,5 mM. proporciones de superficie exploran en

estos experimentos se presentan en la Tabla 3. Obsrvese que diferentes bacterias pueden presentar diferentes
an

dimensiones de modo que a la misma concentracin de lpidos de la relacin de superficies de bacteria / liposoma podra ser
m

diferente. En particular, E coli es mayor que E. faecalis y S. aureus.

Tabla 3. relacin de superficie del liposoma / bacteria calculado como S liposomas xN liposoma / S bacteria xN bacteria,

teniendo en cuenta las especies esfricas caracterizadas por d = 0,200 micras en el caso de liposomas, d = 0,5 m de

el caso de EF y SA y d = 1 m en el caso de CE.

Los liposomas CE 10 8 CFU SA 10 8 CFU EF 10 8 CFU


(MM) / mL / mL / mL

Pgina 19 de 40

19
0.01 2 7 7
0.05 9 34 34
0.1 18 70 70
0.5 87 350 350

Los resultados de las mediciones de potencial zeta se reportan en la Tabla 4 y la Tabla 5, donde Zeta

Tambin se informa de valor potencial de cada especie que interactan antes de mezclar. Como era de esperar, todos

bacterias se caracterizan por Zeta-posibles valores negativos muy similares entre s. los

Adems de DPPC o DOPC liposomas a las suspensiones de las tres bacterias no afecta a la

Zeta-potencial, lo que indica que los liposomas neutros no interactan con las bacterias. Por otra parte,

do
la adicin de cantidades crecientes de liposomas catinicos implica, para cada bacteria / catinico

ta
par liposoma, un aumento gradual del valor potencial Zeta que cambia de negativo a

ep
positivo. El cCambie de los valores de potencial zeta muestra que la interaccin entre bacterias y

liposomas catinicos que realmente ocurre, no influenciados de manera significativa por la naturaleza de la catinico
ac
componente, pero influenciada por la naturaleza de fosfolpidos. De hecho, la adicin de DPPC basa
ito

liposomas a las bacterias cambia el valor del potencial Zeta de negativo a positivo en menor

relacin de superficie del liposoma / bacteria (liposoma / E. coli = 9) con respecto a DOPC basado
cr

formulaciones (liposoma / E. coli = 87). Tenga en cuenta que todos los liposomas DPPC y DOPC basados cuentan con la
us

mismo valor potencial Zeta, por lo tanto, la diferente interaccin de DOPC y DPPC que contiene
an

liposomas con bacterias no es debido a diferentes interacciones electrostticas, pero tiene que ser atribuido a

la diferente fluidez y / o a la diferente organizacin de las bicapas lipdicas.


m

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20
Tabla 4. Zeta-potencial de las mezclas de 10 8 diferentes bacterias en la presencia de diferentes concentraciones de liposomas CFU / mL

formulado con DOPC y los anffilos catinicos 1, 2 y 3.

do
DOPC 0,5 mM DOPC / 1 0,5 mM DOPC / 2 0,5 mM DOPC / 3 0,5 mM
= -2.4 4 = 44 9 = 49 14 = 48 14

ta
CFU / ml 10 8
0,01 0,05 0.1 0,5 0,01 0,05 0.1 0,5 0,01 0,05 0.1 0,5 0,01 0,05 0.1 0,5
mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM

ep
CE
- 34 6 -33 5 -35 6 -34 6 -35 8 -24 5 -21 9 24 6 - 33 7 -20 5 0 6 30 5 -30 8 -14 5 0 6 24 6
= -30 6
EF

ac
= 27 12 - 29 6 -31 8 -32 5 -32 9 -26 8 -15 7 -28 30 7 - 22 8 -10 7 - 4 8 37 7 -22 8 -13 7 - 2 7 37 7

SA
- 21 5 -22 4 -23 5 -21 5 -28 6 -11 6 -18 31 6 - 22 7 -21 6 -12 5 33 6 -20 6 -21 6 -15 6 33 6
= -24 6

ito
Tabla 5. Zeta-potencial de las mezclas de 10 8 diferentes bacterias en la presencia de diferentes concentraciones de liposomas CFU / mL
cr
formulado con DPPC y los anffilos catinicos 1, 2 y 3.
us

DPPC 0,5 mM DPPC / 1 0,5 mM DPPC / 2 0,5 mM DPPC / 3 0,5 mM


an

= -2. 4 4 = 44 9 = 43 13 = 40 9
CFU / ml 10 8
0,01 0,05 0.1 0,5 0,01 0,05 0.1 0,5 0,01 0,05 0.1 0,5 0,01 0,05 0.1 0,5
mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM
m

CE
- 30 5 -29 5 -30 6 -29 6 -29 7 29 8 30 6 43 5 - 31 7 31 7 33 8 45 4 -31 6 30 7 27 7 41 4
= -30 6
EF
- 24 6 87 47 7 46 4 -23 6 13 7 30 7 44 4
= -27 12 -27 6 -28 6 -29 8 -29 7 -22 7 12 7 31 7 45 4
SA
- 23 8 -22 5 -21 7 -22 5 -14 7 31 6 33 5 48 6 - 17 5 30 5 34 6 44 5 -diecisis 6 34 6 38 6 42 5
= -24 6

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21
3.3.2. Las mediciones de fluorescencia. La evaluacin de la capacidad de los liposomas investigados hasta la

actan como sensores fluorescentes para la deteccin de bacterias de la bacteria se realiz con liposomas

formulado con DPPC o DOPC, uno de los tres anffilos catinicos 1-3 ( 7: 3) y la

sonda fluorescente C17-HC (4,9% con respecto a los lpidos totales). experimentos de emisin de fluorescencia

se llevaron a cabo para investigar si, y en qu medida, las diferentes formulaciones fueron capaces de

generar una seal de fluorescencia a 450 nm tras la interaccin con las tres cepas bacterianas y para

evaluar la diferente sensibilidad hacia las tres cepas. Por otra parte, con el fin de simular una verdadera

do
situacin, hemos explorado la interaccin de cada formulacin de liposoma con una mezcla de los tres

cepas bacterianas fue explorado.

ta
Debido a que este estudio tiene como objetivo el desarrollo de un sensor para la deteccin de bacterias en
ep
agua potable, la evaluacin de la emisin de fluorescencia de C17-HC embebido en liposomas
ac
se realiz suspendiendo ambos liposomas y bacterias en el agua de tuberas, en particular tuberas

agua procedente de la tubera principal de Roma (Italia).


ito

experimentos de fluorescencia preliminares se llevaron a cabo a diferentes relaciones de liposoma / bacteria


cr

para evaluar el umbral de deteccin de bacteria. En la Figura 2, a modo de ejemplo, la


us

Los espectros de emisin de fluorescencia de DPPC / 2 liposomas en presencia y en ausencia de

se reportan bacterias.
an
m

Pgina 22 de 40

22
do
Figura 2. Los espectros de emisin de fluorescencia de C17-HC (4,9%) cargada en DPPC / 2 ( 7: 3) liposomas,

en ausencia (control) y en presencia de bacterias (10 2 CFU / ml).

ta
Interaccin de los liposomas y las bacterias induce un aumento de la intensidad de la C17-HC
ep
emisin. En un nivel de calidad, el aumento de la intensidad de emisin de la interaccin con las bacterias es
ac
observado para todas las formulaciones; Adems, todos los seis liposomas son capaces de detectar bacterias

hasta 10 2 CFU / mL.


ito

En la figura 3 el aumento de la intensidad de los incrementos de la intensidad de fluorescencia C17-HC


cr

sobre uno a uno interaccin de los diferentes liposomas con las tres cepas de bacterias a 25 C
us

se presentan en la Figura 3. se reportan. Los resultados relativos a los resultados en relacin con DPPC y

formulacin basada DOPC son reportados en el panel A y B, respectivamente. Es evidente, tambin en una primera
an

vista, que las interacciones con todas las bacterias provocan un incremento mayor de la fluorescencia cuando el
m

sonda est incrustado en DPPC en lugar de en liposomas basado DOPC. Adems, en el caso de DPPC

liposomas basados la intensidad de todas las diferencias entre incrementos de intensidad de fluorescencia se

la misma tras la interaccin con las bacterias no son estadsticamente significativos y son independientes de

la naturaleza del componente catinico. Por otro lado, cuando se inserta la sonda fluorescente

en liposomas de DOPC, su respuesta depende de la naturaleza del componente catinico; en particular,

la mejor respuesta, para cada patgeno, se obtiene con liposomas formulado con catinica

Pgina 23 de 40

23
componente 1. Por lo tanto, los resultados de los experimentos de fluorescencia confirman los resultados de los Zeta

potencial investigacin que indica una mayor eficacia de DPPC liposomas para interactuar con basado

bacterias, aunque en ausencia de especificidad. Sin embargo, becau Debido C17-HC es una sonda locales,

su respuesta est influenciada por su ubicacin en la bicapa lipdica y por la organizacin de lpidos antes y

despus de la interaccin con las bacterias. Esta caracterstica C17-HC, por lo tanto, en principio, puede podra permitir

especfico de deteccin aliado de deteccin de diferentes diversas bacterias cuando incrustado en diferente

formulaciones. La diferente respuesta de DPPC y liposomas basado DOPC puede atribuirse a

do
su diferente estado de fase, (a 25 C DPPC y DOPC liposomas ser DPPC y DOPC en

gel y en fase de cristal lquido a 25 C, respectivamente, y / o a sus diferentes colas hidrofbicas

ta
que influyen en la interaccin con el componente catinico y, por lo tanto, la organizacin de los lpidos.
ep
ac
UN)
ito
cr
us
an

SEGUNDO)
m

Pgina 24 de 40

24
Figura 3. Variacin de la emisin de fluorescencia a 450 nm ( exc = 365 nm) de C17-HC cargado (4.9%)

en 0,02 mM liposomas tras la adicin de un 10 2 CFU / ml de las diferentes bacterias en tubera Roma

de agua a 25 C. A) 7: 3 liposomas basado DPPC (DPPC negro / 3; blanco DPPC / 2; gris DPPC / 1); SEGUNDO)

7: liposomas basados 3 DOPC (DOPC negro / 3; blanco DOPC / 2; gris DOPC / 1). CE / DOPC / 3 vs CE /

DOPC / 2, CE / DOPC / 1 vs CE / DOPC / 2 p <0,01; SA / DOPC / 1 vs SA / DOPC / 2, SA / DOPC / 3

p <0,01; EF / DOPC / 1 vs EF / DOPC / 2, EF / DOPC / 3 p <0,01; TwoWay-ANOVA con Tukey

correccin.

do
Los resultados de la interaccin entre los liposomas y las bacterias basado DPPC llevadas a cabo por

ta
experimentos de emisin de fluorescencia mismos experimentos en los liposomas de DPPC a 45 C, ( es decir en el

ep
estado de fase de cristal lquido) por encima de la bicapa de lpidos DPPC T metro,( La Figura 4) indican que si el

interaccin de las bacterias con liposomas de DPPC base se produce por encima de la T metro de la bicapa lipdica, la
ac
resultados son ms Mostrar resultados similares a los obtenidos en el caso de DOPC liposomas basados en

25 C (Figura 4). De hecho, la medida de intensidad de la respuesta es ms baja y es una funcin tanto de
ito

el componente catinico y la cepa bacteria. Sin embargo, la formulacin ms eficaz en


cr

estas condiciones es DPPC / 2, mientras que para los liposomas basados DOPC la mejor formulacin era
us

DOPC / 1 ( Figura 3, panel B)


an
m

Pgina 25 de 40

25
Figura 4. Variacin de la emisin de fluorescencia a 450 nm ( exc = 365 nm) de C17-HC cargado (4.9%)

en 0,02 liposomas basados DPPC mM (DPPC negro / 3; blanco DPPC / 2; gris DPPC / 1) sobre la

adicin de un 10 2 CFU / ml de bacterias diferentes en Roma tubera de agua a 45 C. CE / DPPC / 3 vs

CE / DPPC / 2 p <0,01; SA / DPPC / 3 vs SA / DPPC / 2 p <0,001; SA / DPPC / 3 vs SA / DPPC / 1 p <0,05;

EF / DPPC / 3 vs EF / DPPC / 2, p <0,001; TwoWay-ANOVA con correccin de Tukey.

Por lo tanto, la fluidez de la bicapa lipdica juega un papel fundamental en el liposoma-bacterias

interaccin, sin embargo, no puede ser el nico parmetro que afecte a dicha interaccin. De hecho, en igual

do
condiciones de fluidez todava hay diferencias entre DPPC y liposomas basado DOPC que

ta
han de atribuirse a una organizacin diferente de DPPC y bicapas de lpidos DOPC y,

ep
en consecuencia, a una ubicacin diferente y la exposicin de C17-HC. Es importante tener en cuenta que la

sonda fluorescente C17-HC puede estar presente en las formas y el neutro y desprotonados
ac
equilibrio entre las dos formas depende del pH del medio ambiente local y por lo tanto en

organizacin de los lpidos. En experimentos de emisin de fluorescencia, excitacin se fij a 365 nm por lo tanto
ito

que implica la deteccin de solamente la forma aninica de C17-HC. Esta eleccin fue dictada por el
cr

mayor coeficiente de extincin molar de la forma aninica con respecto al neutro uno y por lo tanto
us

por la posibilidad de explotar un sistema ms sensible. [31] Un anlisis ms profundo de entender


an

el origen de la diferente respuesta de los liposomas fluorescentes investigados se llev a cabo por

mediciones de excitacin de fluorescencia y se informa y se discuten en la SI.


m

Intensidad de fluorescencia incremento de C17-HC de la interaccin de formulaciones de liposomas

con una mezcla de las tres bacterias tambin se investig. Resultados con respecto a la interaccin de

mezcla bacteriana con DPPC y formulaciones a base de DOPC a 25 C se indican en la Figura 5,

panel A y B, respectivamente. Est claro que tanto para los liposomas DPPC y DOPC las basa

respuesta fluorescente resultante de la interaccin con la mezcla de bacterias no es simplemente la

Pgina 26 de 40

26
suma de las respuestas fluorescente tras la interaccin de una formulacin con una sola cepa. En

De hecho, la concentracin total de bacterias en igualdad de condiciones, la respuesta fluorescente es siempre ms

intensa que en el caso de uno a uno interaccin, lo que sugiere una sensibilidad mayor de la

sistemas en presencia de ms de una cepa bacteriana. En el caso de liposomas basado DOPC

la respuesta de fluorescencia muestra la misma tendencia formulacin dependiente observado en la de

una interaccin y DOPC / 1 resulta la mejor formulacin, lo que provoc el mayor incremento de

de fluorescencia con respecto a DOPC / 2 y DOPC / 3. Por otro lado, DPPC formulaciones basadas

do
dar una respuesta fluorescente que depende de la formulacin no slo a 45 C (Figura 6), como se

observado en la interaccin uno a uno, sino tambin a 25 C.

ta
En resumen, pasando de una sola cepa a una suspensin bacteriana de material compuesto, la fluorescencia
ep
respuesta de los liposomas no es tan simplemente predecible. Hemos encontrado que la respuesta de fluorescencia
ac
tras la interaccin con una mezcla de bacterias no es la suma de las respuestas individuales y tambin que la

sensibilidad de una formulacin definida con respecto a la otra puede cambiar. Estos resultados pueden ser
ito

adscrito a la complejidad de la interaccin de liposomas / bacteria en un bacteriana compuesto


cr

suspensin. En principio, las interacciones simultneas de un liposoma con ms de un tipo de clula,


us

posibilidad de interacciones competitivas, la produccin por bacterias, en respuesta a la presencia de

otras especies en la matriz, de molculas especficas que pueden afectar a la intensidad de la seal de fluorescencia,
an

son todos factores que pueden explicar las diferencias entre los resultados obtenidos en uno a uno
m

liposoma / bacteria o en la interaccin de la mezcla de liposoma / bacteriana.

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27
UN)

do
SEGUNDO)

ta
ep
ac
ito

Figura 5. Variacin de la emisin de fluorescencia a 450 nm ( exc = 365 nm) de C17-HC loaded
cr

(4,9%) en los liposomas de 0,02 mm tras la adicin de un 10 2 mezcla CFU / ml de CE, SA, EF en
us

agua tubera Roma a 25 C. A) 7: 3 liposomas basado DPPC (DPPC negro / 3; gris perla DPPC / 2;
an

gris plomo DPPC / 1); B) 7: liposomas basados 3 DOPC (DOPC negro / 3; DOPC pearl gray / 2; dirigir

gris DOPC / 1).


m

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28
do
La Figura 6. Variacin de la emisin de fluorescencia a 450 nm ( exc = 365 nm) de C17-HC loaded

(4,9%) en 0,02 liposomas basados DPPC mM (negro DPPC / 3; gris perla DPPC / 2; gris plomo

ta
DPPC / 1) tras la adicin de un 10 2 mezcla CFU / ml de CE, SA, EF en Roma tubera de agua en

45 C.
ep
ac
3.3.3. Microscopa Electrnica de Barrido (SEM) anlisis. El anlisis SEM se llev a cabo a

investigar la interaccin bacteria-liposoma. Figura 7 informa dos micrografas tpicas de SEM de MI.
ito

coli ( 0,05 10 8 CFU / ml) despus de la interaccin con DOPC 0,5 mM / 1 ( Figura 7a) y DPPC / 1
cr

liposomas (Figura 7B), respectivamente. En la Figura 7a se observan slo unos pocos liposomas
us

attachedadherent a la pared celular de las bacterias, su forma esfrica est parcialmente perdido debido

su aplanamiento en la pared celular; de otro modo en la figura 7b se observa que varios liposomas (ver
an

flechas azules) permanecen unidos adherente a la pared celular bacteriana manteniendo su integridad,
m

forma esfrica y el dimetro esperado (~ 150 nm). Estas evidencias confirman por un lado,

los resultados potenciales zeta, que demuestran que a 25 C liposomas basados la DPPC muestran una mayor

afinidad por las bacterias; desde el otro lado, ponen de relieve el papel fundamental de la membrana de la

estado fsico de la membrana en la interaccin con las bacterias. De hecho, en el experimento

temperatura del experimento (25 C), la formulacin basada DOPC DPPC se encuentra en el estado de gel, mientras

Pgina 29 de 40

29
DPPC DOPC uno basado est en la fase de cristal lquido. Por lo tanto, el estado fsico de la

membrana del liposoma influye en gran medida la fuerza de la interaccin y la morfologa de

liposomas despus de la interaccin.

do
ta
ep
ac
ito
cr
us
an
m

La Figura 7. Micrografas representativas de E coli antes (a) y despus de la interaccin con DOPC / 1 ( segundo)

y DPPC / 1 liposomas (c). liposomas esfricos de alrededor de 150 nm son adherentes claramente visible para

la pared celular (ver flechas azules).

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30
Las micrografas SEM con relacin a la interaccin de liposomas interactan con los otros dos

bacterias se omitieron porque no significativa desde dimensiones relativas de los liposomas y de

bacterias de forma esfrica despus de la deposicin son demasiado similares como para permitir un morfolgica fiable

anlisis.

4. CONCLUSIONES

En este estudio trabajo hemos explorado el uso de liposomas catinicos, formulado con la superficie

fluorforo sensible al potencial C17-HC, se explor el fin de desarrollar un liposoma basado

do
sensor para la deteccin de bacterias en el agua potable. En este objetivo, hemos preparado dos series de

ta
liposomas fluorescentes, formulados con DPPC o DOPC y uno de los tres estructuralmente correlacionados

ep
anffilos catinicos 1-3 (2 y 3 ad hoc sintetizada). Los liposomas se caracterizaron en trminos de

dimensiones, potencial de superficie y la estabilidad de la atrapado C17-HC (emisin de fluorescencia). A


ac
este objetivo dos ad hoc tensioactivo catinico ( 2 y 3) fueron sintetizados y dos series de fluorescente

liposomas, formulado con DPPC o DOPC y uno de los tres catinico estructuralmente correlacionados
ito

anffilos 1-3 fueron preparado y caracterizado en trminos de dimensiones, la superficie potencial y


cr

estabilidad de la atrapado C17-HC (emisin de fluorescencia). En tPara para poner de relieve la mayor parte
us

liposomas efectivas, e identificar los parmetros cruciales para una respuesta eficaz, entienden
an

que son los parmetros cruciales de los liposomas propuestos para ser controlados para obtener una

respuesta eficaz, hemos explorado la interaccin de cada todas las formulaciones de liposomas con cada
m

sola cepa sola bacteriana; se encontr que el estado fsico de la membrana y la

estado de protonacin de la sonda fluorescente son los responsables principales parmetros que controlan la

respuesta fluorescente. Todas las formulaciones evaluadas son capaces de detectar en tiempo real (dentro de una

minutos de incubacin) a 10 2 CFU / ml de las tres cepas bacterianas seleccionadas.

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31
Con el fin de simular un escenario real, es decir, un agua contaminada, se analiz la respuesta fluorescente

de cada formulacin de liposomas en presencia de todas las tres cepas bacterianas al mismo tiempo.

Se encontr que la respuesta general de liposomas fluorescentes no es aditivo y que la sensibilidad de

mayora de las formulaciones es mayor que en uno a uno interaccin debido a la complejidad de la

liposoma / interaccin mezcla bacteriana.

Con respecto a otros sistemas basados en liposomas descritos en la literatura, estos catinico

liposomas son capaces de detectar tanto las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas y no requieren

do
tiempo de incubacin largo para el anlisis es rpido. La sensibilidad es bastante bueno para un liposoma basado

sensor; sistemas basados en otra de nanopartculas (por ejemplo MGNPs) de visualizacin mejor sensibilidad pero tambin algunas

ta
inconvenientes tales como el tiempo ms largo de anlisis, pobre estabilidad y toxicidad ambiental. Adems, el
ep
preparacin de estos liposomas es simple y relativamente de chip, no slo con respecto a otro
ac
nanopartculas (polimricos y magnticos), sino tambin con respecto a otros liposomas, tales como

liposomas polidiacetileno, que a menudo pueden requerir la sntesis de complejo.


ito

Ninguna de las formulaciones exploradas muestran especificidad para un patgeno definido; sin embargo,
cr

formulacin preferencial / interacciones bacteria se encuentran observ mediante la variacin de la formulacin


us

composicin. De hecho, entre los liposomas basados DOPC, DOPC / 1 resulta ser la mejor

formulacin con todas las bacterias, mientras que, entre los liposomas a base de DPPC (a 45 C), DPPC / 2 espectculos
an

para desencadenar un incremento fluorescente superior. Estos resultados sealan que, teniendo disponible un adecuado
m

biblioteca de componentes lpidos, tambin incluso en ausencia de ligandos especficos, selectiva parcial

interacciones podran ser explotadas para el desarrollo de un sistema de sensor basado en el concepto de

deteccin diferencial .

contenido asociado

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32
Informacin de soporte. Sntesis y caracterizacin de tensioactivos 2-3; propiedades coloidales

de los tensioactivos 1-3; 1 H RMN y 13 Los espectros de RMN de C de los tensioactivos 2 y 3; parcelas de conductividad para

la determinacin de punto Krafft, la temperatura Krafft y cac de los tensioactivos 1-3; excitacin

espectros de algunas formulaciones de liposomas mixtos. Este material est disponible de forma gratuita a travs de la

Internet en http://pubs.acs.org .

INFORMACIN DEL AUTOR

Autor correspondiente

do
* correo electrnico: cecilia.bombelli@uniroma1.it Tel: +390649913683 Fax: 390649913629.

ta
Contribuciones de autor
ep
El manuscrito fue escrito a travs de las contribuciones de todos los autores. Todos los autores han dado su aprobacin
ac
a la versin final del manuscrito.
ito

Fuentes de financiamiento
cr

La investigacin que lleva a estos resultados ha recibido financiacin de la Unin Europea Sptimo

Programa Marco (FP7 / 2007-2013), gestionado por la REA - Agencia Ejecutiva de Investigacin
us

bajo el Acuerdo de Subvencin n 286.601.


an

RECONOCIMIENTO
m

Dos de los autores (CB, GM) gracias al AQUALITY proyecto FP7-SME-2011-1 (proyecto

nmero 286601), el Centro Sapienza IIT @ por la Vida Nanociencia de apoyo financiero y el Sr.

Marco Pastore y la seora Aurelia Stella para soporte tcnico. Todo el dr autores gracias. Flavio

Di Maio para el apoyo en el anlisis estadstico de datos.

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ABREVIATURAS

C17-HC, 4-heptadecylumbelliferone; nanopartculas magnticas, MGNPs; ligado a enzimas

mtodo de ensayo de inmunoabsorcin, ELISA; 1,2-dipalmitoil sn glicero-3-fosfocolina, DPPC;

1,2-dioleoil sn glicero-3-fosfocolina, DOPC; Resonancia Magntica Nuclear, RMN;

tetrametilsilano, TMS; Dispersin de luz dinmica, DLS; Salina tamponada con fosfato, PBS;

temperatura de transicin, T metro; vesculas multilamelares, MLV; caldo de infusin de cerebro y corazn, caldo BHI;

caldo de Luria-Bertani, caldo LB; Tripcasa soja agar + 5% de agar de sangre de oveja, TSS; Mac Conkey

do
agar, MCK; Microscopa Electrnica de Barrido, SEM; dimetro hidrodinmico, D marido; Escherichia coli,

CE; Enterococcus faecalis, EF; Staphylococcus aureus, SA.

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38
Manuela Petaccia, PhD, cientfico visitante en el CNR-IMC, Roma.

Cecilia Bombelli, cientfico de investigacin tercer nivel en el Instituto de Qumica Metodologas IMCCNR. Sus intereses cientficos se refieren
al estudio de los liposomas como sistemas de administracin de frmacos de frmacos y compuestos naturales y elementos sensores.

Francesco Paroni Sterbini, recibi la maestra en Biotecnologa Mdica (2007) y la especializacin en Microbiologa
y Virologa (2011) en la Universidad Catlica del Sagrado Corazn de Roma. Desde 2011 es investigador en el
Instituto de Microbiologa de la Universidad Catlica del Sagrado Corazn de Roma.

Massimiliano Papi es Profesor Asociado de la Universidad Catlica del Sagrado Corazn de Roma. l es el investigador
principal o participante de diversos fondos nacionales e internacionales y autor de ms de 90 publicaciones en revistas
revisadas por pares internacionales en el campo de la biofsica, biomateriales y de la administracin de frmacos.

do
Luisa Giansanti, cientfico investigador en el Departamento de Fsica y Ciencias Qumicas en la Universidad de L'Aquila. Sus intereses
cientficos se refieren al estudio de liposomas como elementos sensores y como sistemas de administracin de frmacos en la terapia

ta
antibacteriana.

ep
Francesca Bugli recibi la maestra en Ciencias Biolgicas de la Universidad "Sapienza" de Roma y el doctorado en
Microbiologa General de la Universidad Catlica del Sagrado Corazn de Roma. En 2005 se especializ en
Microbiologa y Virologa. Desde 2005 es profesor adjunto en el Instituto de Microbiologa de la Universidad Catlica
ac
del Sagrado Corazn de Roma.

Maurizio Sanguinetti es el Director del Departamento de Microbiologa y Virologa, Policlinico Universitario A.


Gemelli, donde se realizan aproximadamente 650.000 pruebas diagnsticas al ao que cubre varias reas de
ito

Microbiologa Clnica. Se ha realizado una amplia investigacin en los campos de microbiologa molecular y clnica y
es autor de ms de 200 publicaciones en revistas revisadas por pares internacionales.
cr

Giovanna Mancini, cientfico de investigacin de primer nivel y director del Instituto de Qumica Metodologas IMC-CNR. Sus
us

intereses cientficos se refieren al estudio de los agregados polimoleculares, tales como micelas y liposomas, como sistemas
de administracin de frmacos y como modelos de membrana, para investigar el posible papel de las membranas biolgicas
en la homogeneidad quiral de biomolculas.
an
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39
Insertar Tabla de contenido grfico Aqu y Sinopsis

do
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