Teoria Biorreactores PDF

BIORREACTRES
Mg. Anah V. Cuellas 2007
Universidad Nacional de Quilmes

Ingeniera en Alimentos
BIORREACTORES
TEORIA
INTRODUCCION
Definicin de bioprocesos es el uso de organismos vivos o partes de ellos (estructuras sub celulares,
molculas) para la produccin de bienes y servicios. En esta definicin se encuadran un conjunto de
actividades que el hombre ha venido desarrollando por miles de aos, como la produccin de alimentos
fermentados (pan, yogurt, vinos, cerveza, etc.).
Que se incorpora en la mayora de los sectores productivos tradicionales, como ser el agropecuario,
alimentos, qumico, farmacutico, minera, medio ambiente, energtico, etc. Por lo tanto se lo define no
como un sector diferente, sino como una tecnologa de amplio alcance que probablemente afectar
muchos sectores de la economa. Junto con las tecnologas informticas y de comunicaciones,
conforman la "ECONOMIA DEL CONOCIMIENTO O BASADA EN EL CONOCIMIENTO".
II-CAMBIOS EN EL ENTORNO AGROALIMENTARIO:
Durante las dos ltimas dcadas el sector agroalimentario a nivel mundial ha experimentado profundos
cambios en su entorno, los cuales estn generando diversos procesos de reestructuracin tanto a nivel de
la produccin como de organizacin en el sector.
En trminos generales los cambios en el entorno se refieren principalmente a:
- la apertura de las economas, la globalizacin de los mercados y el incremento del mercado
internacional;
- cambios en los patrones de consumo de alimentos y por lo tanto en la demanda de alimentos;
- creciente problema de pobreza rural y de marginalizacin del sector rural en la participacin del
desarrollo econmico;
- crecientes problemas relacionados con el manejo sostenible del medio ambiente y de los recursos
naturales;
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- cambios en el papel del Estado y de la sociedad civil y proceso de apropiacin privada del
conocimiento.
Estos cambios estn induciendo a su vez diversos procesos de readaptacin de los agro alimentos,
orientados a buscar una mayor funcionalidad entre esta y el nuevo contexto.
III-LA INVESTIGACIN AGRCOLA INTERNACIONAL EN UN MUNDO GLOBALIZADO
La tendencia hacia la apertura y desregulacin de las economas, ha significado el paso de modelos

proteccionistas hacia modelos de ms exposicin a la competencia internacional, con el objeto de lograr
una mayor eficiencia en la produccin domstica de bienes y servicios.
En muchos de los pases de la regin estos cambios se introdujeron en una coyuntura adversa de bajos
precios internacionales y de muy escasa preparacin de la produccin nacional para enfrentar la
competencia, el sector ha tenido que enfrentar una profunda crisis que se refleja en diversos pases
latinoamericanos en la cada del PIB sectorial, la disminucin del ingreso de los productores, la cada del
empleo en el campo, y un importante incremento de las importaciones.
La estructura de la demanda por alimentos est cambiando drsticamente debido a tres factores que se
refuerzan entre si. En primer lugar el creciente grado de urbanizacin, en segundo lugar un creciente nivel
de ingresos y en tercer lugar cambios en el estilo de vida que privilegia el consumo de alimentes
procesados. El efecto acumulado de estos tres factores est generando profundos cambios en la estructura
de la demanda de productos agrcolas, favoreciendo una mayor demanda por alimentos procesados y con
algn tipo de valor agregado.
Las cifras que reflejan la alta tasa de urbanizacin son elocuentes. A nivel mundial, la poblacin urbana
est pasando de representar un tercio de la poblacin global en 1975, a representar dos tercios de esa
misma poblacin en el ano 2020. Estos niveles ya se han alcanzado en varios pases de Amrica Latina y
el Caribe. Esto est llevando a la necesidad de pensar cada vez ms en trminos de cadenas
agroalimentarias que vinculen la produccin al nivel de finca con el consumidor final, crecientemente en
el sector urbano.
Si bien los niveles de pobreza se redujeron un poco a nivel global, pasando la proporcin de la poblacin
que vive con menos de US$1 por da de 28.3% en 1987 a 24% en 1998, esta reduccin fue menor de la
que se haba predicho (de 32.7% en 1985 a 18% en el 2000). Las diferencias entre una localidad y otra
son an mayores. La generacin de empleo se ha convertido en el principal desafo en muchos pases de
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la regin y del mundo, confrontndose en ciertas regiones niveles de desempleo que estn llegando a 18 y
20%. El desafo de la pobreza rural se est agudizando por el patrn de desarrollo agroindustrial que
impera en la actualidad, caracterizado por la concentracin del valor agregado y de los ingresos que se
generan en los eslabones ubicados en el sector urbano y el comercial en la cadena agroindustrial, en
desmedro de la regin rural de origen de la cual provienen dichos productos. Aqu se confronta un gran
desafo en trminos de como re-pensar este patrn de desarrollo agro-industrial, en trminos de un patrn
que genere empleo e ingresos en el campo y en el sector rural. De lo contrario se agudizar la diferencia
entre la calidad de vida del sector urbano y del rural, incentivando aun ms el proceso de urbanizacin y
de abandono del campo. Uno de los ms desafos ms importantes que afrontan los pases en la actualidad
es la forma de participar en el marco de un comercio mundial que cambia rpidamente. Se trata de un
medio en que la competencia tiene una evolucin constante debido a la aparicin, da a da, de nuevos
productos, procesos y servicios. Para asegurar el crecimiento econmico, los pases en desarrollo deben
poder ser competitivos en el mercado internacional, aumentando sus capacidades de utilizacin de nuevas
tecnologas y produciendo servicios y productos de nivel mundial.
Los bioprocesos o procesos biolgicos constituyen una tecnologa esencialmente multidisciplinaria y
basada en la ciencia y la tecnologa que permite disear y/o producir nuevas molculas, nuevos productos
y nuevos procesos. Podemos decir simplificadamente que es el resultado de la integracin de la
bioqumica, con la microbiologa con la ingeniera.
Resumiendo, es el resultado del dominio de la informacin cientfica y tecnolgica por el hombre. Esta
caracterstica, sobre todo por ser material biolgico reproducible, hace que entre los resultados de
laboratorio y el poder colocar un producto en el mercado, pasan aos (3 5 aos) y mucho dinero
invertido. Argentina cuenta con personal cientfico tcnico formado para encarar estos proyectos y
empresas con capacidad industrial y financiera para comenzar a llevar proyectos de mediano y largo
tiempo adelante.
IV-BIOPROCESOS EN INDUSTRIAS DE ALIMENTOS. GENERALIDADES TECNOLGICAS
En la industria de la alimentacin se refiere al uso de las tecnologas biolgicas para la produccin,

transformacin y / o preservacin de alimentos o bien para la produccin de materias primas, aditivos y
coadyuvantes empleados en la industria de alimentos. Paralelamente crece su importancia en los aspectos
analticos (bioanaltica), control de calidad y control de contaminaciones de alimentos.
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La produccin de alimentos e ingredientes alimentarios utilizando tcnicas fermentativas, tambin

denominados bioprocesos, estn presentes desde los primeros registros histricos del hombre. Los
microorganismos y las enzimas se usan ampliamente para la conversin de sustratos alimenticios
primarios (leche, cereales, etc) para obtener una cantidad muy grande de productos: quesos, leches
cultivadas, vino, cervezas, alcohol, cidos orgnicos.
Desde fines del siglo XIX y especialmente desde comienzos del siglo XX, los avances de la bioqumica y
de la gentica comienzan a hacerse sentir, sobre todo en la caracterizacin molecular de las enzimas, la
comprensin de los caminos metablicos bacterianos, la gentica bacteriana, etc., es decir, en la segunda
dcada del siglo XX comienza el uso de la ciencia en la produccin industrial de alimentos.
El salto cualitativo comienza a concretarse con el uso de las nuevas tecnologas de ADN recombinante
(ingeniera gentica) para el diseo de nuevos insumos - productos (enzimas, bacterias transgnicas, etc.)
destinados a la produccin de alimentos. Mas abajo tratamos el tema de las enzimas con mayor
profundidad, ac solo queremos informar que la mayor parte de las enzimas hoy en uso en la industria,
son enzimas recombinantes ( obtenidas por las tcnicas de ingeniera gentica) por la posibilidad de
producir protenas homogneas, con una composicin y estructura qumica definida, que pueden ser
elaboradas en mayor cantidad, con nuevas caractersticas (termoestables, resistentes a altas presiones o a
diferentes solventes, resistencia a la oxidacin, especificidad, etc.).
De igual forma se trabaja con clulas bacterianas o de levaduras a las que se puede introducir una
determinada informacin gentica (saborizantes, aromatizantes, resistencia a fagos, expresin de
determinadas enzimas para elaboracin de bebidas y jugos, etc.).
V-ALIMENTOS Y SALUD HUMANA
Los bioprocesos en alimentos estn cada vez mas relacionados con la salud humana, o de manera ms
amplia, se avanza en el uso y diseo de los alimentos como primer medicamento. Es obvio para todos
que una buena salud comienza por una buena alimentacin (nutricin), pero en la actualidad, dado que
podemos disear nuestros alimentos, se trata de definir que caractersticas especficas necesitamos
consumir (y evitar las que pueden presentar riesgos) para tener una buena o mejor salud.
As ha surgido en los ltimos aos una especialidad que estudia y produce los llamados alimentos
funcionales y nutracuticos (neologismo que significa nutricin y farmacuticos, o sea alimentos y
medicamentos) que son alimentos que cumplen con el objetivo de satisfacer las necesidades de la
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nutricin humana y adems prevenir o curar. Estos alimentos pueden contener protenas inmunognicas
(vacunas), enzimas para facilitar digestin o metabolismos, medicamentos, cidos grasos definidos,
leches humanizadas, etc. En esta lnea de productos trabajan empresas especializadas de biotecnologa
y grandes compaas farmacuticas y agroqumicas.
I-ASPECTOS GENERALES DE LOS PROCESOS DE FERMENTACION
Un proceso de fermentacin tpico es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un recipiente

llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el
medio de cultivo son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa. El microorganismo
va aumentando en su concentracin en el transcurso del proceso al mismo tiempo que el medio se va
modificando y se forman productos nuevos como consecuencia de las actividades catablicas y
anablicas. Los dos fenmenos crecimiento y formacin de producto, tienen lugar durante el desarrollo
del proceso simultneamente o no segn los casos.
Resumiendo, un proceso fermentativo consiste en unir un medio de cultivo que contiene nutrientes con un
microorganismo dado, en un ambiente ptimo (fermentador), donde se establecen condiciones
experimentales adecuadas (pH, temperatura, agitacin, etc.) para obtener finalmente el producto deseado -
biomasa, metabolitos, enzimas- con el mayor rendimiento.
II-EFECTORES INTERNOS Y EXTERNOS
El comportamiento de un microorganismo en crecimiento es el resultado de la interaccin que se produce

entre el microorganismo y el medio ambiente en el reactor, y que en rigor es el resultado de los llamados
efectores intra y extra celulares.
Los efectores internos estn representados por la dotacin gentica intrnseca del organismo considerado
y por sus mecanismos de regulacin metablica. Estos ltimos pueden ser modificados por alteraciones
del medio ambiente o ms precisamente por los efectores externos mientras que la existencia de un gen
depende de la especie del microorganismo considerado. Un gen est o no est, slo su expresin puede
modificarse. Con el fin de mejorarla productividad de un proceso de fermentacin las cepas empleadas
pueden someterse a tratamiento fsico o qumico de mutacin que al alterar algn sector del genoma
logran aumentar la produccin de un metabolito aunque tambin pueden disminuirla o incluso suprimirla.
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Tambin se puede dotar a un microorganismo de una capacidad gentica nueva cuando se efecta la
insercin de sectores del genoma de una especie en un microorganismo, hacindose ste capaz de
producir metabolitos que desde el punto de vista gentico de su especie no podra hacerlo. La obtencin
de mutantes por el uso de agentes mutagnicos o por algn otro mecanismo bioqumico y la construccin
de cepas nuevas por ingeniera gentica constituyen los recursos de la gentica microbiana, para mejorar
la productividad de un microorganismo dado o para dotarlo de una capacidad productiva nueva. Es decir
que los efectores internos pueden modificarse para lograr la optimizacin de un proceso fermentativo.
Las tcnicas de ingeniera gentica sin duda permitirn avances espectaculares en la eficiencia y
rendimiento en la produccin de los ms variados productos microbianos. Sin embargo, es necesario
recalcar que estos microorganismos, naturales o manipulados genticamente, deben colocarse en un
ambiente favorable tanto para su crecimiento como para la ptima expresin del producto buscado a fin
de poder producirlo a nivel industrial. En efecto, el crecimiento microbiano depende tanto del genotipo
como del medio ambiente en que ste se desarrolla. Este ambiente controlado y propicio al crecimiento
microbiano se logra, ya sea en el laboratorio o en la industria, gracias a un instrumento especial, llamado
fermentador (figura 1).
El comportamiento o expresin fenotpica, o sea lo que realmente se observa como respuesta del
microorganismo al medio ambiente en el reactor es, adems, el resultado de la influencia de las variables
de naturaleza fsica y qumica que constituyen los efectores externos.
Los efectores externos de naturaleza fsica estn vinculados con las condiciones de operacin que se
utilizan en los reactores y son por ejemplo la temperatura, la agitacin, aireacin, etc.; es decir, estn
constituidos por las variables de manipulacin fsica que se fijan o se programan en el curso del proceso
de produccin. La modificacin de algunos de los efectores fsicos como por ejemplo la temperatura,
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tiene un efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es adecuado puede disminuir o an
impedir la formacin de un metabolito determinado.
Adems la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de algunos microorganismos, lo
que significa que al modificarse el valor de un efector puede cambiar los requerimientos de otro.
Los efectores externos de naturaleza qumica estn representados por la presencia de los componentes de
los medios de fermentacin, adems del 0 2 que puede considerarse un nutriente ms. Los componentes
de los medios deben cumplir con todos los requerimientos nutricionales y adems con los requerimientos
especficos que son indispensables para la formacin de productos. Los aspectos fundamentales de los
medios, como su diseo y formulacin.
Los reactores estn tambin estrechamente vinculados al manejo o manipulacin de los efectores
externos, ya que adems de la regulacin de las variables fsicas permiten segn el modo de operarlos
fijar o regular la alimentacin de componentes de los medios que, como ya se dijo, constituyen los
efectores qumicos.
Tal es el caso cuando se operan los reactores en "batch" o en forma discontinua, (todos los componentes
son colocados desde un comienzo en el medio de produccin) o cuando se opera el reactor en "batch
alimentado" donde la alimentacin de los componentes se realiza en forma controlada durante el proceso.
Finalmente cuando se opera el reactor en continuo, se alimenta medio completo a una determinada
velocidad al mismo tiempo que se deja salir con la misma velocidad medio fermentado, lo que permite
tratar a la velocidad de crecimiento especfico como variable independiente
La influencia de los efectores internos y externos sobre el comportamiento de una clula microbiana se
puede representar esquemticamente como se muestra en la figura
Figura. Influencia de los efectores internos y externos sobre la expresin celular.
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En los ltimos aos se han logrado avances significativos en el diseo de los fermentadores as como en
el grado de control que se ejerce durante el proceso de fermentacin. El fermentador no es ms que un
instrumento que permite al operador controlar el estado del medio de cultivo, el cual determina el
crecimiento y produccin de un microorganismo.
Para comprender con claridad estos conceptos es conveniente citar algunos ejemplos demostrativos.
Supongamos una cepa de un microorganismo (B. subtilis) que genticamente est en condiciones de
efectuar la biosntesis de una enzima (a-amilasa) y que es colocada en un medio de cultivo adecuado y en
condiciones de operacin ptimas para la produccin de esa enzima. Por medio adecuado se entiende una
fuente de carbono como el almidn o dextrina, adems de fuente orgnica de nitrgeno, y otras sales
minerales. Por condiciones de operacin ptimas se consideran la temperatura de 30-37 C, agitacin, pH
inicial 6.5-7.0. Supongamos tambin que el proceso es de tipo "batch". Si en la composicin del medio
utilizamos glucosa, por ejemplo, difcilmente tendremos un rendimiento normal de a-amilasa mientras
exista glucosa en el medio, debido a la influencia negativa de sta, ya que la misma acta como represor
catablico de la biosntesis de la enzima. Este es un ejemplo negativo de un efector externo (glucosa) que
no permite la expresin del gen de la cepa. No solamente la glucosa tiene este efecto sino en general
cualquier otra fuente de carbono que sea de consumo rpido. Si en cambio se opera el reactor como
"batch" alimentado, con alimentacin programada de glucosa, la influencia negativa de ese efector
externo desaparece, porque su concentracin se mantiene en lmites muy bajos.
Otro efector externo de naturaleza qumica que inhibe la biosntesis de otros productos como muchos
antibiticos es el anin fosfato. Por eso la produccin industrial de esos compuestos debe hacerse de
manera tal que existan concentraciones limitantes de fosfato inorgnico. Si ste esta en concentraciones
de 0.3 a 300 mM generalmente se produce crecimientos celulares altos pero concentraciones superiores a
10 mM suprimen la sntesis de muchos antibiticos.
III-REQUERIMIENTOS FISIOLGICOS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:
Para su crecimiento, los microorganismos utilizados en los procesos tecnolgicos, requieren estrictas
condiciones del medio ambiente, tales como:
Medio acuoso. Todas las reacciones biolgicas se realizan en presencia de agua. Esta ltima es por lo
general el principal componente del medio de cultivo. Incluso aquellos microorganismos que crecen en
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un medio slido como granos de cereales, necesitan que estos sustratos estn humedecidos para poder
colonizarlos.
Temperatura de crecimiento. Las temperaturas entre las cuales se puede desarrollar una clula microbiana
varan entre 10 y 60 C. Segn el rango de temperatura en el cual el crecimiento es posible podemos
distinguir microorganismos sicrfilos (4-25 C), mesfilos (30-40 C) y termfilos (40-65 C y ms).
La temperatura del medio de cultivo dentro de un fermentador es medida en forma continua gracias a una
termocupla inmersa en l. Esta ltima est conectada a un sistema de calentamiento-enfriamiento del
fermentador, el cual permite mantener la temperatura constante durante toda la operacin.
Acidez. El pH de crecimiento de los microorganismos vara entre 3.0 y 8.0. En forma general, las
bacterias crecen a pH cercanos a la neutralidad (pH 7.0), con la importante excepcin de las bacterias
lcticas que resisten pH cidos. Por el contrario, la mayora de los hongos filamentosos y levaduras
prefieren pH cidos, de alrededor de 5.0. Este cido-tolerancia otorga una ventaja importante a las
fermentaciones con hongos, ya que el riesgo de contaminacin bacteriana es bajo.
Durante la fermentacin, hay produccin o consumo de cido en el medio segn el microorganismo, lo

cual produce una variacin del pH. Este ltimo es detectado gracias a un electrodo inmerso en el medio.
Este electrodo acciona dos bombas (una con cido y otra con lcali) que equilibran constantemente este
parmetro.
Presin parcial de oxgeno. Se distinguen dos tipos de microorganismos en funcin de su requerimiento

en oxgeno: los microorganismos aerobios, para los cuales la disponibilidad del oxgeno es indispensable;
y los microorganismos anaerobios, para los cuales el oxgeno es txico. Existen, por ltimo, algunos
microorganismos capaces de adaptar su metabolismo a las condiciones de oxigenacin imperantes en el
medio y que son por lo tanto aerobios facultativos (ste es el caso de Escherichia coli y Saccharomyces
cerevisae, entre otros).
La fermentacin aerobia es hasta hoy la ms utilizada ya que el crecimiento es mucho ms rpido en

aerobiosis que en anaerobiosis. Sin embargo, los microorganismos anaerobios son capaces de sintetizar
una serie de compuestos nicos (metano, etanol, solventes, etc), lo que ha provocado un nuevo inters en
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su cultivo y estudio, en particular para la industria qumica. Por otra parte es necesario mencionar dos
limitantes que presentan las fermentaciones aerobias:
a) Muy baja solubilidad del oxgeno en el agua, lo que hace necesario airear y agitar fuertemente el medio
de cultivo.
b) Produccin elevada de calor que debe ser constantemente removida a fin de mantener estable la
temperatura.
Las concentraciones de oxgeno y CO2 disueltos en el medio son controladas por sondas de O2 y CO2,
respectivamente.
IV-NUTRIENTES REQUERIDOS PARA EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS.
En primer lugar, el microorganismo requerir de una fuente de carbono de la cual extraer la energa
necesaria para su metabolismo. Las fuentes de carbono ms comunes son los hidratos de carbono, tales
como almidn y azcares.
Durante los aos sesenta, algunos hidrocarburos derivados del petrleo fueron intensamente estudiados
como fuentes de carbono de bajo costo. Esta situacin cambi radicalmente en la dcada del 70, debido al
alza del precio del petrleo y hoy en da, por el contrario, se investiga la conversin biolgica de hidratos
de carbono en combustibles. En la bsqueda de nuevas fuentes de carbono, se est estudiando, desde hace
poco, la utilizacin de recursos lignocelulsicos (pajas de cereales, rboles y sus residuos, etc.), principal
fuente de biomasa renovable.
Muchas de estas fuentes de carbono requieren un tratamiento previo a su utilizacin; es el caso, por
ejemplo, del almidn que debe ser cocido e hidrolizado hasta glucosa antes de ser trasformado en etanol
por los microorganismos que realizan esta transformacin. Es tambin el caso de la celulosa y de los
substratos lignocelulsicos en general, los cuales necesitan drsticos tratamientos fsicos y/o qumicos
antes de ser utilizables con este fin.
Otros nutrientes que son necesarios en cantidades importantes para el crecimiento microbiano son el
nitrgeno, el fsforo y el azufre. Estos elementos son incorporados en las molculas estructurales y
funcionales de la clula. El nitrgeno, en particular, debe ser provisto en proporciones variables bajo la
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forma de nitrgeno proteico obtenido a partir de subproductos de la industria del maz, extracto de
levadura u otros, y no proteico (sales de amonio, urea, etc.). Los otros dos elementos son entregados
como sales de fosfato y sulfato, respectivamente.
Por ltimo, una serie de micro nutrientes (vitaminas, hierro, cobalto, cobre, zinc, etc.), deben ser
suministrados al medio.
La determinacin de varios de estos nutrientes en forma continua durante la fermentacin permitir en un

futuro prximo espectaculares avances en el control de los procesos. Esto ha sido posible gracias al
reciente desarrollo de sensores o electrodos biolgicos (enzimticos y microbianos). Esta tecnologa,
novedosa y especfica, promete un gran desarrollo en un futuro prximo, ya que tiene grandes ventajas en
materia de anlisis, tales como respuesta rpida, aplicacin en muestras coloreadas, uso repetido de los
biocatalizadores, etc. El principal problema para su puesta en operacin es la dificultad de esterilizar el
biosensor sin inactivarlo.
V-TIPOS DE FERMENTADORES:
Un fermentador es un recipiente de vidrio o acero inoxidable si el uso es farmacutico, o de material

menos noble, como acero al carbono, en el caso de aplicaciones menos exigentes en pureza. Por lo
general, el reservorio tiene una altura 2.5 a 4 veces superior a su dimetro, y en funcin de la aplicacin,
su volumen vara entre 1000-10 000 lt en el caso de un producto farmacutico, a 1500000 lt, y ms en el
caso de la produccin de microorganismos como fuente de protena animal.
El diseo de un fermentador, aparte de asegurar que la operacin s desempee en forma asptica, debe
responder a tres requisitos principales: Mezcla adecuada, buena transferencia del oxgeno del aire al
microorganismo y remocin del calor. Este ltimo imperativo explica que, a pesar de las bajas
temperaturas a que operan los procesos biolgicos con respecto a la catlisis qumica; sea necesario
considerar superficies importantes de intercambio trmico dentro del fermentador para mantener la
temperatura de crecimiento. Esto explica tambin en parte el inters que presentan los microorganismos
termfilos, capaces de trabajar a temperaturas ms elevadas que otros microorganismos, lo cual reduce
por una parte los problemas de remocin de calor durante la fermentacin y, por otra parte, los riesgos de
contaminacin por los microorganismos mesfilos.
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En forma general existen tres tipos principales de fermentadores para cultivos aerbicos
1) Estanques aireados agitados. Estos son los ms tradicionales y tuvieron un gran desarrollo durante los
aos 50 y se usan para la produccin de antibiticos como la penicilina a escala industrial.
El fermentador agitado consiste en un cilindro vertical que posee varios deflectores para prevenir la
formacin de un torbellino durante la agitacin. El aire estril penetra por la base del reservorio, a travs
de un distribuidor circular. El eje vertical lleva una o varias hlices en funcin de la relacin
altura/dimetro.
A pesar de que este modelo de fermentador no es el ms econmico de instalar ni de operar, sigue siendo
el ms corrientemente utilizado desde los ltimos treinta aos. La razn de su xito reside en su gran
versatilidad para ser usado a cualquier escala de produccin y para un gran nmero de procesos sin
modificaciones del diseo. Por lo tanto, los costos relativamente elevados de inversin y operacin se
encuentran compensados por su flexibilidad.
2) Reactores tubulares (Air-1ift). Se trata de un reactor en forma de torre o columna, en el cual el aire es
introducido en la base del tubo, y la ascensin de las burbujas de aire constituye el nico tipo de agitacin
existente.
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A pesar de que el modelo agitado permite concentraciones superiores de biomasa, el fermentador tubular,
por su simplicidad y costos inferiores de energa, mantenimiento e instalacin, es preferido en algunos
procesos al anterior. Estos fermentadores son utilizados en la produccin de cerveza, vinagre y cido
ctrico.
3) Estanques a recirculacin. Todos los fermentadores de este tipo tienen en comn el flujo del medio de
cultivo en una direccin definida. Esto se ha logrado gracias a la incorporacin de tubos de aspiracin en
el diseo, lo cual permite una recirculacin interna del fluido, o por el uso de un conducto de
recirculacin, el que permite una recirculacin externa.
La fuerza motora se desarrolla por el efecto de ascensin de las burbujas de aire (air lift) o por un sistema
de flujo hidrodinmico. Existe gran polmica sobre las virtudes de este tipo de sistema, el cual para
muchos, es tan eficiente a ms que el tanque agitado con respecto a la transferencia de masa, y con una
economa sustancial de energa.
Este tipo de fermentadores ha producido un inters creciente por la reduccin en los costos de
produccin. Sin embargo, no se conocen bien an los problemas en la sntesis de un producto que pueden
derivar de las fluctuaciones ambientales a las que es sometido un microorganismo en este tipo de
fermentadores por la falta de agitacin. Por lo tanto, el desarrollo de la investigacin en este sentido es
indispensable.
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VI-ETAPAS PARA LA OBTENCIN DE UN PRODUCTO MICROBIANO.
La secuencia de etapas envueltas en la obtencin de un producto o de clulas enteras, por fermentacin,

son las siguientes:
a) Produccin del biocatalizador (clula o enzima) o starter. EL costo de los catalizadores, puede ser
elevado, en particular cuando se trata de enzimas purificadas. En efecto, en este ltimo caso, el
costo de muchas de ellas es tal, que el proceso solo es econmico si stas pueden ser utilizadas
varias veces. Una forma de realizar este objetivo es reciclar las clulas microbianas a las enzimas.
Esto resulta muy difcil de operar con las enzimas y provoca a menudo lesiones en las clulas y
contaminacin con organismos forneos del reactor. Otra manera de reducir las prdidas del
catalizador, es mantenindolo dentro del fermentador, es a travs de tcnicas de inmovilizacin.
Esto se logra gracias a la transformacin de la enzima soluble o de la clula microbiana, en una
nueva forma de catalizador, una forma fija sobre un soporte slido.
Estos biocatalizadores inmovilizados, pueden tener varias formas (cilindros, hojas, partculas, etc.) y
han sido utilizados en todo tipo de reactores.
Las potencialidades de la inmovilizacin de enzimas y en particular de clulas enteras son

considerables, ya que se ha demostrado que no slo se puede reutilizar el biocatalizador, sino que,
muchas veces, los rendimientos y la vida media de ste aumentan en forma significativa. Sin
embargo, muchos problemas debern ser resueltos, como la eleccin del mejor soporte, asegurar un
control adecuada del pH, suplementar adecuadamente con oxgeno en los casos que sea necesario,
etc., para asegurar el ptimo funcionamiento de estos biocatalizadores.
b) Preparacin del medio de cultivo (pretratamiento de la materia prima, adicin de nutrientes, ajuste
de pH).
c) Esterilizacin del medio de cultivo. Pare evitar la contaminacin del medio por microorganismos
indeseables, es necesario esterilizarlo y mantener condiciones aspticas durante la fermentacin
(aireacin estril, adicin de nutrientes estriles, etc.). Esto se debe a que la mayora de los productas
biolgicos obtenidos hasta hoy son producidos en cultivo puro, es decir, por un solo microorganismo.
La contaminacin de este cultivo por otros microorganismos puede resultar en la destruccin del
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catalizador, en su inhibicin o en la destruccin del producto. Por ltimo, pueden introducirse

sustancias txicas difciles de separar del producto que nos interesa (como en el caso de un
antibitico, por ejemplo).
d) Sntesis del producto. En funcin del producto y del catalizador empleado se determina la
modalidad de funcionamiento del fermentador: continuo a discontinuo.
En los procesos discontinuos o tipo batch, el aporte de nutrientes es nico, el tiempo de fermentacin
es limitado y el producto es recuperado ntegramente al final de la fermentacin por vaciado de la
cuba del fermentador. Este mtodo es actualmente el ms utilizado para los productos que necesitan
condiciones de esterilidad muy estrictas.
En los procesos continuos, en cambio, el aporte de nutrientes es renovado regularmente y el producto

es removido al mismo tiempo. Este tipo de procesos presenta varias ventajas con respecto a los
procesos discontinuos. As, por ejemplo, los volmenes de produccin por unidad instalada son muy
superiores en un sistema continuo. Por otra parte, el catalizador no es eliminado en este tipo de
proceso, lo cual permite economas sustanciales, ya que se considere que el precio del biocatalizador
es, por lo menos, igual al de los nutrientes empleados en su crecimiento. Por ltimo y sobre todo, este
tipo de cultivo abierto permite una versatilidad inherente de operacin, en el cual todos los parmetros
(concentracin microbiana velocidad de crecimiento, concentracin de sustratos y productos) pueden
ser controlados indefinidamente.
Existen dos tipos principales de fermentadores continuos: el quimostato, en el cual el crecimiento est
controlado por uno o ms sustratos que son limitantes, y el turbidostato, que opera a tasas mximas de
crecimiento, gracias al ajuste del flujo de nutrientes a una velocidad tal que el crecimiento no se
encuentre en ningn momento limitado por ningn sustrato.
La mxima velocidad de crecimiento de un microorganismo es el resultado de las caractersticas

inherentes de ste, ms que la consecuencia de la disponibilidad de nutrientes. En las mejores
condiciones, el crecimiento es exponencial. Una disminucin en la velocidad de crecimiento puede
operarse limitando la disponibilidad de cualquier nutriente esencial. En esta nueva situacin el
crecimiento se encuentra desequilibrado y los nutrientes divergen hacia otras rutas metablicas que no
son aparentemente indispensables para el crecimiento. Aquellos metabolitos que son producidos
cuando el microorganismo se encuentra en fase exponencial de crecimiento, se llaman primarios
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(cido ctrico, aminocidos, alcoholes, etc.), por oposicin a los metabolitos secundarios (vitaminas,
antibiticos, etc.), los cuales son sintetizados en condiciones de crecimiento sub-ptimas. El tipo de
metabolito secundario que ser sintetizado depender del microorganismo involucrado y del nutriente
limitante en el medio de cultivo (carbono, nitrgeno, fsforo, azufre, etc.).
Segn el tipo de metabolito requerido, la estrategia de fermentacin a seguir deber en primer lugar
tomar en cuenta en qu momento del crecimiento ste se expresa. As, por ejemplo, en el caso de un
metabolito secundario, muchas veces convendr utilizar un sistema doble de fermentacin. En el
primer recipiente, Se har crecer el microorganismo en condiciones ptimas a fin de obtener el
mximo de biomasa microbiana. Luego, esta biomasa se trasladar al segundo recipiente donde la
limitacin de un nutriente particular permitir la sntesis del metabolito. Este sistema permite tambin
el ptimo aprovechamiento de la materia prima utilizada, la cual sera de otra manera en gran parte
desperdiciada.
b) Separacin del medio y del catalizador. El producto puede encontrarse dentro de la clula
(producto intracelular), como en el caso de la vitamina B12 o la enzima glucosa isomerasa, por
ejemplo; tambin es la situacin de los productos obtenidos por transformacin gentica en
Escherichia coli.. O bien puede ser liberado al medio de cultivo (extracelular), como es el caso de
la penicilina, amilasa, aminocidos y otros.
c) Purificacin del producto. Si el producto es extracelular, es decir, es excretado al medio por la

bacteria, se encontrar relativamente puro, pero diluido en un gran volumen de agua. Si es intracelular
(no excretado al medio) estar mezclado con todos los constituyentes celulares y habr que separarlo
de ellos.
En el caso de E. coli, por ejemplo, los productos son intracelulares. En primer trmino hay que
concentrar las bacterias, lo que se logra por filtracin o centrifugacin.
Para obtener el producto, hay que romper las bacterias, quedando ste mezclado con todos los
constituyentes celulares. Para separarlo se utilizan diversos mtodos, tales como precipitacin con
sales o alcohol y/o tcnicas cromatogrficas, (que separan las molculas de acuerdo a tamao, carga
elctrica o por su afinidad por algn reactivo qumico).
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BIORREACTRES
En cada caso, hay que adaptar las diversas alterativas de purificacin y extraccin. Dentro de estos
procesos, especialmente para los productos de alto valor comercial, los anticuerpos monoclonales
estn comenzando a ser de gran utilidad.
Ella se debe a su tremenda especificidad y sensibilidad. Sin embargo, paradjicamente, esta ltima
propiedad trae problemas en el caso de productos lbiles, ya que la separacin final del complejo
antgeno-anticuerpo es difcil de romper y requiere de tratamientos drsticos y muchas veces
denaturalizantes.
VII-ESQUEMA DE UN PROCESO INDUSTRIAL
En la Fig. se presenta un esquema general de un proceso de fermentacin.
Como puede verse existen 4 etapas bien diferenciadas, a saber:
1) Propagacin de cultivos, lo que se realiza en el laboratorio y que comienza generalmente en un

tubo de ensayo que contiene un repique reciente del microorganismo o un tubo liofilizado o
congelado donde se conserva la cepa de inters o de una colonia del microorganismo previamente
seleccionada. Este material microbiolgico seleccionado constituye el punto de partida con el cual se
debe aumentar la cantidad del mismo mediante sucesivos pasajes en frascos de volmenes crecientes
que son generalmente operados en agitadores de vaivn o rotatorios en cmaras de cultivo.
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BIORREACTRES
2) Fermentacin: con el material obtenido anteriormente, se siembra el tanque de inoculo que puede
tener un volumen de 50, 500 1000 1 segn la escala industrial posterior. Del tanque de inoculo se
pasa posteriormente al fermentador industrial cuyo volumen, que vara de acuerdo al producto a
obtener y a su concentracin, est comprendido comnmente entre 10,000 y 100,000 l. En algunos
casos especiales, como en la produccin de protena unicelular, los tanques de fermentacin pueden
llegar hasta 1,000,000 l. Un proceso esencial ligado a la produccin es la preparacin y esterilizacin
de los medios que se lleva a cabo tambin en esta etapa (previamente a la inoculacin) ya sea en el
tanque de inculo o en el reactor industrial.
3) Operaciones y proceso de separacin y purificacin de los productos; estas etapas comprenden en

forma general y sucesivamente:
a) Separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin, o decantacin;
b) separaciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin;
c) purificacin por extraccin lquido-lquido, o extraccin a dos fases acuosas, o cromatografa de

afinidad, y finalmente d) aislamiento del producto.
4) Tratamiento de efluentes: si bien no tiene una relacin directa con el producto, que es la razn de
ser de la industria de fermentacin, representa una etapa imprescindible porque es fundamental
controlar la calidad del efluente que sale de la fbrica y que es enviado generalmente a un curso de
agua, sea un canal, arroyo, un ro o al mar.
Es importante tener en cuenta que todas las etapas de un proceso de fermentacin deben estar
ntimamente ligadas e integradas ya que es indispensable que el proceso sea optimizado globalmente.
Cada etapa debe considerar la importancia e influencia de los procesos y operaciones anteriores y
tambin de los siguientes para poder cumplir con ese concepto de integracin.
Adems, el reactor y las condiciones de operacin deben ser tales que aseguren la productividad
mxima del proceso y la calidad del producto, que en algunos casos depende de las condiciones de
operacin empleadas como sucede con algunos preparados enzimticos cuya composicin es regulada
segn como se opere en la etapa de la fermentacin y en la correspondiente a la separacin y
purificacin.
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BIORREACTRES
IIX-SELECCION, MANTENIMIENTO Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE

INTERES INDUSTRIAL:
Seleccin:
Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo

utilizado, en la eleccin del mismo se deberan tener en cuenta ciertos criterios generales que se
indican a continuacin:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. Su velocidad de crecimiento debera ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.
4. Sus requerimientos nutricionales deberan ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo
reducido.
5. Debe ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo, sin prdida de sus caractersticas
particulares.
6. Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debera ser de alto rendimiento y de fcil extraccin
del medio de cultivo.
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de
fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. Existen en el mundo un gran nmero de colecciones
depositarias de cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan: "American Type Culture
Collection", USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas, actinomycetes, mohos, protozoos,
virus y lneas celulares; "Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes" del Institut Pasteur,
Francia; "Northern Regional Research Laboratory" (NRRL), de Peoria, USA, y "National Collection
of Type Cultures", Londres, Inglaterra.
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BIORREACTRES
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el
mismo; en este caso las alternativas son:
a) aislamiento directo, o
b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.
Una vez efectuado el muestreo y seleccin (screening) para el aislamiento de una cepa de inters, la
misma deber ser caracterizada. En este procedimiento se debe tener en cuenta que la composicin
qumica del material a partir del cual se va a realizar el aislamiento comienza a variar a partir del
momento en que es tomada la muestra, por lo tanto sta se debe procesar rpidamente, tratando de
evitar alteraciones que afecten a la poblacin de inters.
a) Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento
permita la mxima expresin del material gentico del organismo.
Si se busca por ejemplo un organismo con accin antimicrobiana, se puede crecer al potencial
productor, en una caja de petri en presencia del o los organismos contra los cuales se requiere la
accin antimicrobiana, observndose la produccin del inhibidor por las zonas de inhibicin de
crecimiento.
Para la deteccin de productores de factores de crecimiento tales como aminocidos y necletidos se

utiliza la estimulacin del desarrollo de bacterias auxtrofas por un lisado del organismo. Esto se
puede llevar a cabo en medios slidos. En este caso se debe tener una "rplica" de la caja a ensayar.
Una vez obtenido el crecimiento en la primera caja, se replica a una segunda, antes de "matar" las
colonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensin
del organismo auxtrofo al producto buscado. Despus de un perodo de incubacin se observa
crecimiento en forma de halo alrededor de las colonias productoras, lo que permite el aislamiento de
este organismo de la placa rplica.
b) Enriquecimiento del cultivo: esta tcnica consiste en incrementar en una poblacin mixta el nmero
de organismos de inters en relacin al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un
tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones
inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos especficos
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BIORREACTRES
o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el
crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos peridicos en medio fresco. Esto lleva a
que el organismo de inters sea el dominante de la poblacin, lo cual facilita su posterior aislamiento
en medio slido. Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad especfica de
crecimiento ().
La seleccin de un organismo por este procedimiento depende de su valor de u comparado con los de
los otros organismos. Evidentemente el dominante de la poblacin ser el que posea el mayor valor de
u para las condiciones de cultivo empleadas. Sin embargo no necesariamente ser mas til un
organismo de u ms alto; puede ser deseable uno con mayor afinidad por el sustrato. El problema de
seleccin puede ser superado empleando el sistema de cultivo continuo, donde la fuerza de seleccin
se mantiene a un nivel constante y el organismo dominante ser seleccionado por su afinidad por el
sustrato, ms que por su u mxima
IX-MANTENIMIENTO O CONSERVACIN DE LOS CULTIVOS
Los objetivos de la conservacin de los cultivos se podran resumir en los siguientes aspectos:
a) preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida de ninguna de sus propiedades bioqumicas;
b) preservar los niveles de su productividad inicial;
c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.
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BIORREACTRES
Esto ltimo puede ser un factor esencial en la seleccin de un mtodo de preservacin.
En todo trabajo de Microbiologa se deben conocer las caractersticas de la poblacin con la cual se va
a trabajar (propiedades morfolgicas y bioqumicas). En este sentido, tanto en la conservacin como
en el desarrollo del cultivo, ya sea el que suministra o el que recibe la cepa, deberan usar las mismas
tcnicas metodolgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin de inculos se
deben usar mtodos reproducibles que no produzcan variaciones o prdidas de las caractersticas de la
cepa empleada.
El conocimiento de las caractersticas del cultivo es esencial en la eleccin de un mtodo de

preservacin. La identidad del cultivo puede conocerse en base a sus caractersticas de crecimiento en
uno o ms medios especficos, tomando en consideracin propiedades macro y microscpicas
exhibidas, o en base a una evaluacin ms exhaustiva empleando muchos ensayos bioqumicos,
biolgicos, inmunolgicos y genticos.
En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibilidad de determinar en
cada etapa si ha habido o no alteracin gentica. En la mayora de las situaciones solamente se pueden
notar cambios mensurables u observables tales como pigmentacin, morfologa, reacciones
fermentativas, propiedades microscpicas, etc. El anlisis de estos parmetros junto con la
determinacin cuantitativa del recuento de colonias antes y despus del proceso de mantenimiento
brindan la informacin necesaria para la correcta evaluacin de la tcnica de conservacin a elegir.
Los mtodos de preservacin o mantenimiento ms importantes son los siguientes:
Subcultivos
Es un mtodo comn de conservacin, que consiste en el repique peridico del cultivo en un medio
nutritivo fresco. El intervalo de transferencia vara con el microorganismo, debiendo considerarse el
medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 C durante
lapsos que oscilan entre 15 das y 2 meses. Los inconvenientes que presenta son varios:
a) incremento de la posibilidad de mutacin con cada transferencia, con prdida de las caractersticas
del organismo;
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BIORREACTRES
b) riesgo de contaminacin;
c) alteraciones en el medio de cultivo, durante la estada en fro, en la cual se produce una desecacin
gradual del mismo.
Mantenimiento bajo capa de aceite
Es una tcnica simple y efectiva para prolongar la conservacin de muchos organismos y consiste en
cubrir completamente el cultivo despus de su desarrollo en medio slido, con una capa de aceite
mineral o vaselina estril. Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o
an mejor en heladera por perodos de varios aos. Algunos autores sostienen que en estas
condiciones los microorganismos pueden continuar reproducindose, con posibilidades de aparicin
de mutantes; sin embargo se acepta que estas alteraciones no se observan hasta los tres aos de
mantenimiento.
Congelacin
Debido a que la actividad metablica de una clula se reduce considerablemente por mantenimiento a
muy baja temperatura, la congelacin es una tcnica de eleccin, ya sea para cortos o largos perodos
de tiempo. A esto ha contribuido tambin la mayor disponibilidad de nitrgeno lquido (-196 C) y el
mejoramiento de los equipos de refrigeracin. La tcnica involucra el crecimiento del cultivo hasta la
fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las clulas son ms resistentes a los daos por
congelacin y descongelacin, que las de fase exponencial. Tambin es aconsejable utilizar una
densidad celular elevada en la congelacin, debido a que, cuando parte de las clulas se lisan se
liberaran sustancias crioprotectoras que aumentaran el porcentaje de clulas sobrevivientes.
Las clulas a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede
agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El ms empleado es glicerol al 10%, aunque otros
agentes como dimetilsulfxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato de
malta, han sido tambin empleados. La suspensin celular es colocada en ampollas (vidrio o plstico)
y sellada antes de colocarla bajo nitrgeno lquido. Uno de los problemas de esta tcnica se refiere a
la velocidad de congelacin.
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BIORREACTRES
Muchos estudios son coincidentes en sealar que una velocidad de congelacin lenta y una rpida
descongelacin rinden los mayores nmeros de clulas viables. Se encontr que dependiendo de la
naturaleza de las clulas, existe una velocidad de congelacin ptima en cada caso para obtener una
mxima sobre vida.
Como criterio general se puede decir que, lo ms ampliamente usado es el enfriamiento a 1 C min-1
(ya que una rpida congelacin causa ruptura de membranas) hasta -20 C y luego un rpido
descenso.
En cuanto a la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70 C, ya que a

temperaturas ms altas ocurren algunas recristalizaciones, las cuales si son intracelulares son letales
para las clulas.
En caso de nitrgeno lquido, la conservacin podra prolongarse por aos, asegurando una buena
provisin del mismo y disponiendo de equipos con sistemas de alarma en caso de fluctuaciones de
temperatura.
Cultivos en tierra
La tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios das para inducir esporulacin de
bacilos aerobios y anaerobios. Una vez que la misma se manifiesta, la tierra es secada (desecador) y el
cultivo mantenido de esta forma en una atmsfera seca o en refrigerador. El mtodo ha sido utilizado
ampliamente con hongos y actinomycetes, los cuales han sido mantenidos en estas condiciones varios
aos. Tambin se puede utilizar tierra para la conservacin directa de suspensiones de esporos.
Preservacin en celulosa
El empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de clulas en condiciones de ausencia de

agua es un procedimiento adecuado y sencillo, para conservar cepas. La tcnica consiste en embeber
tiras de papel de filtro con una suspensin densa de organismos en suero, glutamato de sodio u otro
agente, las mismas son posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo vaco. De esta
forma se han logrado conservar cepas de Streptomyres y Salmonella por perodos de hasta 2 aos a
temperatura ambiente.
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BIORREACTRES
Liofilizacin
La liofilizacin est considerada como el mtodo ms adecuado para la preservacin de

microorganismos. La tcnica involucra el congelamiento de un cultivo seguido por un secado bajo
vaco, lo cual resulta en la sublimacin de agua de la suspensin celular. La ventaja es que la mayora
de los organismos sobreviven al secado y el cultivo es fcilmente mantenido an a temperatura
ambiente sin prdida significativa de viabilidad.
La liofilizacin es apropiada para la conservacin de la mayora de las bacterias, encontrndose que

las Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-negativas cuando se las liofiliza y mantiene en
condiciones similares. Tambin se emplea en la conservacin de esporos, actinomycetes y muchos
hongos incluidas levaduras.
Sin embargo, no es adecuada para clulas animales, algas y hongos en fase de micelio.
La tcnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las clulas son usualmente ms
resistentes) resuspendiendo las clulas con un medio crioprotector, en el cual se obtenga una alta
densidad celular. Unas pocas gotas de suspensin celular son transferidas a una ampolla, la cual es
congelada a aproximadamente -40 C y deshidratada mediante una sublimacin en vaco. Este debe
ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado contina hasta llegar a valores de humedad
del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada bajo vaco. Se debe evitar la formacin de radicales
libres que se producen por exposicin de las clulas al oxgeno, ya que estn asociados con prdida de
viabilidad; de all la importancia de mantener el vaco. El medio empleado en la liofilizacin es un
factor importante en el proceso.
Entre los agentes recomendados estn la leche descremada en concentraciones del 10 al 20%; suero
equino, mezclas de suero, glucosa y extracto de levadura; suero fetal bovino, etc. En algunos casos el
efecto protector de la leche descremada es mejorado por el agregado de solutos tales como cido
ascrbico o tiourea. La sacarosa se ha empleado para reemplazar la leche descremada.
Normalmente la liofilizacin produce daos en las clulas, siendo los mismos en algunas casos
reversibles, por lo cual stas necesitan un tiempo de recuperacin que es variable en funcin del tipo
de dao producido.
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BIORREACTRES
En la reconstitucin de un tubo liofilizado se logra incrementar la sobreviva de los microorganismos

si en lugar de agua destilada se agrega caldo nutritivo o el mismo medio que se us para el
crecimiento inicial de las clulas; de esta forma al mantenerse elevada la presin osmtica durante la
rehidratacin se logra que la misma proceda en forma lenta.
Se encuentra con frecuencia que el crecimiento despus de la rehidratacin tiene una fase de retardo
extendida. Se puede reducir esta fase si se emplea para el crecimiento un medio de igual composicin
que el que da ptimo desarrollo pero disminuyendo su concentracin original entre un 25 y un 50%.
En general no es posible determinar para cada grupo de organismos el mtodo de conservacin ideal,
por lo que se trata de emplear el ms adecuado. De todos, la liofilizacin es el ms utilizado, aunque
algunos organismos muestran altas tasas de mortandad. En este caso la alternativa es la congelacin, a
pesar de que las cepas mantenidas de esta forma son difciles de transportar.
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BIORREACTRES
X-MEDIOS DE FERMENTACION
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental

para asegurar la productividad de los mismos. Como ya se explic, los componentes de los medios
constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los
27
BIORREACTRES
procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y
adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden
necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por las
fuentes de C, N, S, P, K y Mg;
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se
agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y
c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes orgnicos

suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino
incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica especfica, como vitaminas, algunos
aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en
1) medios sintticos o medios qumicamente definidos, y
2) medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal como
peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias
fundamentales ya mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable.
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseo para tratar
a continuacin la formulacin y optimizacin de los mismos.
Diseo
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes

necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a
desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales
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BIORREACTRES
del microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y
consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a
todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento
de los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos, como es el caso de la
importancia del anin P04.
XI-REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea
autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las algas y
algunas bacterias, y los heterotrficos que necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono.
Otro factor esencial est determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02
es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolismo energtico. En la ausencia del 0 2 , el N03 o
S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanognicas
son auxtrofos anaerobios que utilizan
Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol de ser fuente de energa.
Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden ser de
naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos
nucleicos y polmeros de la pared celular.
Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de P04 H y

S04 (o aminocidos azufrados). El fsforo se incorpora en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El
S es asimilado para la sntesis de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina,
coenzima A, tiamina y otros componentes.
Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del primero est unida al
RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento
del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El in K acta como coenzima y
probablemente acta como catin en la estructura aninica de varios componentes celulares. El in
Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas reacciones
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BIORREACTRES
del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y
sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras:
a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y
b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e I.
En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidos cualitativamente. A veces es

difcil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente est presente en
suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de stos
compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por
ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor ptimo.
Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y vitaminas del grupo
B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y
levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor
parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las
purinas, poliaminas, putrescinas, cte..
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes
requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos especficos del proceso
considerado.
El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y evolucin de los
parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por un descenso continuo de pH,
debido al uso de una sal de amonio como fuente de nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn
agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del
mismo.
Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de fosfatos o de
carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, con agregados peridicos de soluciones
alcalinas que pueden efectuarse en forma ms conveniente mediante un control automtico de pH. El
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BIORREACTRES
diseo de un medio especfico para la produccin de cido ctrico debe considerar la influencia
negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composicin; por lo tanto dicho medio
debe disearse de manera tal que su preparacin (a partir de diversas materias primas) considere una
eliminacin total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas.
XII-DISPONIBILIDAD DE LOS COMPONENTES
Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados
por la clula. Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metlicos cuya
concentracin es modificada por quelacin, ya que muchos constituyentes del medio y productos del
metabolismo actan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminocidos,
hidroxicidos, hidrxidos, y los aniones P04 y C03-2 .
Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de los iones
metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente quelante agregado, como el
EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico).
En medios complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya que existe una gran
variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metlicos
reduciendo la concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar: aminocidos,
protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales.
En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una
determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo su concentracin efectiva,
como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que tienen los grupos reactivos R-COO - ,
RHN- , RS- , RO , que son los ms importantes. La dinmica de formacin del complejo est
determinada por la constante de equilibrio de formacin del complejo metal-ligando, y por la
velocidad a la cual el equilibrio es obtenido.
XII-MATERIAS PRIMAS FUNDAMENTALES
Los componentes empleados en la industria de fermentacin son generalmente complejos, siendo

importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la
estabilidad en su composicin qumica. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa
31
BIORREACTRES
entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentacin, se hace
prioritario disminuir el costo de los medios.
Las materias primas ms importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrgeno.
Las fuentes de carbono pueden ser:
1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidn, dextrina;
2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y
3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros. Son muy importantes tambin por su
disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos,
melazas, celulosas, suero de queso, etc. Tambin se pueden emplear otros subproductos o efluentes de
industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como
las vinazas de destilera, alpechn y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente tiles para
procesos de produccin de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos
de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, tambin contienen
muchas impurezas que impiden su utilizacin en otros procesos por las dificultades y costo elevado
que presentan las operaciones de separacin y purificacin de los productos.
Las fuentes de nitrgeno de naturaleza inorgnica ms comunes son el amonaco o las sales de
amonio.
Las orgnicas estn representadas por varios productos, como ser:
1) Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas por hidrlisis cida o enzimtica de
distintas fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y animales, pescado, casena, gelatina,
harina de soja, algodn, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relacin enzima-sustrato y variando
tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de la cadena de polipptidos. Aparte de su funcin
como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgnicas como fosfatos y
suministran tambin algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.
32
BIORREACTRES
2) Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin posterior variando su tipo
de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura de la misma. 3) Extracto de
levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autlisis o
plasmlisis de la levadura, es bsicamente una mezcla de aminocidos, pptidos, vitaminas solubles
en H2 O y carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la
cebada y 5) "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz tiene mucha importancia por
su utilizacin como componente esencial de los medios para la produccin de varios antibiticos y
enzimas.
Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente cuando se presentan varias
alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de
impurezas que puede acompaar a las distintas materias primas utilizadas.
XIV-ESTERILIZACIN
Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a
cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por
calor, productos qumicos u otra va.
Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a los
microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo.
La palabra desinfeccin se aplica a la remocin o destruccin por cualquier va de organismos vivos

que pueden causar dao particular o infeccin. No significa por lo tanto la destruccin de todos los
microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado.
Un antisptico es un desinfectante, o sea un agente qumico usado para destruir microorganismos

dainos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos.
Asepsia es la exclusin continuada de microorganismos contaminantes. As por ejemplo el cultivo de

microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo aspticamente como en muchas fermentaciones
industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado
con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones aspticas.
33
BIORREACTRES
Pasteurizacin es el trmino aplicado al proceso que se utiliza para la destruccin de algunos de los
microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza.
Consiste en calentar la leche, por ejemplo a 62 C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y
despus enfriarla lo ms rpidamente posible. Esta tcnica no es de ninguna manera un procedimiento
de esterilizacin. Es solamente un mtodo para destruir organismos patgenos y al mismo tiempo
disminuir el nivel de aquellos organismos que ms pueden deteriorar la leche.
La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa Industrial es para evitar la

competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir as que el cultivo de microorganismos
especficos que se utilizan en un proceso de fermentacin de los rendimientos esperados en biomasa
y/o metabolitos especficos.
Mtodos de esterilizacin
Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos:
a) por destruccin total de microorganismos;
b) Por muerte o inactivacin; y
c) Por eliminacin con mediofsicos.
a)-Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento
apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de una llama, que es lo que hacemos en el
laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers.
Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto
sta metodologa, aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo.
b)-La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que exista

necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento, seco o hmedo,
por radiaciones o por agentes qumicos. El calor hmedo, generalmente en forma de vapor bajo
presin, es muy til y de gran valor en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave,
o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentacin.
34
BIORREACTRES
c)-La eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es fundamentalmente

llevada a cabo por filtracin mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales cermicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan
pequeos que la penetracin de los microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres
de celulosa, siendo las fibras de un dimetro variable de 0.5 a 15 micrones.
35
BIORREACTRES
MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:
La cintica de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones ms utilizadas por la ingeniera
alimentaria y la biotecnologa, por lo tanto, es sumamente importante conocer la forma de cuantificacin
de los mismos, sus formas de aplicacin, las ventajas y desventajas de los diferentes mtodos, y sobre
todo el monto econmico de cada uno de ellos.
El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el
recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno
celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la
poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos.
MTODOS DIRECTOS: MTODOS INDIRECTOS:

Recuento del nmero de clulas en una Recuento de colonias en placa
cmara Recuento sobre filtro de membrana
Peso seco celular Consumo de oxgeno
Determinacin de nitrgeno o de Liberacin de dixido de carbono
protenas totales Concentracin de un enzima
Determinacin de DNA constitutivo
Decoloracin de un colorante
Incorporacin de precursores
radiactivos
Medida de la turbidez
1-Mtodos directos:
PESO SECO CELULAR:
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se
obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para
grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso
de un gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula
36
BIORREACTRES
pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede
recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
ABSORCIN:
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada,
parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por
una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz
transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden
existir tres tipos de dispersin.
Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los
cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos.
Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una

suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.
Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias,
independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de
peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al
peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de
Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el
nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin
bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta
forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o
con UFC.
37
BIORREACTRES
Fig. 1 Absorbancia en funcin del Peso Seco
Absorbancia = K x Peso Seco
K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).
Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml).
La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de
bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores
producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas
puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.
PESO HMEDO:
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por
filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal
desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la
38
BIORREACTRES
masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas
muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo
a la forma y deformacin celular.
Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio
intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el
Dextrano) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes
bacterianas.
VOLUMEN DE CLULAS EMPACADAS Y NMERO DE CLULAS:
El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de
acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, esto es
iniciar y completar una divisin celular.
De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es

entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para
determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:
Recuento microscpico de partculas

Recuento electrnico de partculas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido
a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
Recuento de colonias
Mtodo del nmero ms probable
Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el
incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la
sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es
39
BIORREACTRES
un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es
la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.
RECUENTO MICROSCPICO:
Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un
laboratorio de microbiologa. Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando
microscopa de contraste de fase. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen determinado
usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos
permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rpido y sencillo; pero no
permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas muertas.
Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao
y la morfologa de los objetos contados.
Fig. Cmara de recuento de Petroff-Hausser
Tcnicas de recuento en placa:
Se coloca en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas
aisladas dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que el nmero de
estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada (sembrada).
El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas . Puede realizarse sembrando en superficie
(extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido) o en profundidad (mezclando
un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima opcin permite
40
BIORREACTRES
realizar el recuento de microorganismos microaerfilos que no crecen bien en la superficie de las placas
de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30
y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.
Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisin de luz por la luciferasa de
lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la
concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin
de ATP decae rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamente
las clulas vivas.
SISTEMAS DE CULTIVO
I. Cultivo en Batch
La evolucin del cultivo en el tiempo, sigue una curva tpica la cual recibe el nombre de curva de crecimiento en
batch. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente
diferenciables. En primer lugar existe una fase donde prcticamente no hay divisin celular pero s aumento de la
masa individual de los microorganismos (fase lag o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento
ocurre a velocidad especfica () mxima y constante = m (fase exponencial). Al final de esta fase se alcanza la
mxima concentracin microbiana. Posteriormente hay un rpido perodo de desaceleracin y se entra en la fase
estacionaria la cual es causada por agotamiento de algn nutriente (el sustrato limitante) o bien por acumulacin de
inhibidores.
Durante esta fase la concentracin microbiana (o de biomasa) permanece constante.
Finalmente se llega a una ltima etapa donde la concentracin de biomasa disminuye por autolisis o como
consecuencia del metabolismo endgeno (fase de decaimiento).
La duracin de cada una de estas fases es funcin del microorganismo en estudio y de la composicin del medio de
cultivo. En particular la fase lag depende adems de la fase de crecimiento en que se encuentran las clulas en el
momento de ser sembradas y de la composicin del medio de cultivo en que fueron crecidas. Si ste es igual a la
composicin del medio en que se van a sembrar y las clulas estn en fase exponencial, la duracin de la fase lag,
en general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que constituye tiempo perdido.
De la definicin de velocidad de formacin de obtenemos

rx = . x
41
BIORREACTRES
Donde x = concentracin de biomasa. Hemos visto que vara durante el cultivo, siendo un valor constante y
mximo en la fase exponencial (m) y nulo en la estacionaria. Monod ha propuesto una relacin muy simple entre
el valor de y la concentracin de sustrato limitante, S, entendindose por ste al componente del medio de cultivo
que est en menor proporcin respecto de las necesidades del microorganismo. Por tanto S puede ser la fuente de
N, de C, algn aminocido, etc. La ecuacin es:
A KS se la conoce como Constante de Saturacin, y da una idea de la afinidad que tiene el microorganismo por el
sustrato en cuestin. A menor KS mayor afinidad. Normalmente KS tiene valores muy pequeos (10-2 - 10-3 g/l)
por lo que concentraciones relativamente pequeas de S son suficientes para hacer que:
Reemplazando:
Al principio del cultivo todos los nutrientes estarn en exceso, y en particular el sustrato limitante tambin, por lo
que la ecuacin se reduce a (fase exponencial)
Integrando:
42
BIORREACTRES
Por tanto en esta fase la concentracin de biomasa aumenta exponencialmente, y tambin lo hace rx ya que
reemplazando:
Se puede calcular el tiempo de generacin del microorganismo (perodo de tiempo en que la biomasa se duplica)
haciendo x = 2 xo y nos queda
A medida que transcurre el tiempo de cultivo, S va disminuyendo (y por tanto rx) hasta que finalmente S = 0 (fase
estacionaria), y
43
BIORREACTRES
De la fase exponencial se calcula m mediante la ecuacin. La duracin de la fase lag, tL, se puede calcular del
grfico, o bien haciendo una correccin en la ec.
Consumo de Sustrato
Reemplazando:
A medida que S tiende a cero, rs tambin. En fase exponencial:
44
BIORREACTRES
Da la variacin de S en funcin de t durante la fase exponencial.

Si se conoce de antemano el rendimiento yx (o Yx) y las concentraciones iniciales de sustrato y biomasa, es fcil
estimar el valor de xf ya que:
Si S es el sustrato limitante, se tendr que para x = xf ser Sf = 0, por tanto:
Donde:
II. Cultivo Continuo
De los tres mtodos usuales para el cultivo de microorganismos, el cultivo continuo, ofrece mayores posibilidades
de control. Por sus caractersticas especiales permite controlar el proceso a un valor de velocidad especfica de
crecimiento () prefijado de manera muy simple. Este punto es de suma importancia ya que el comportamiento de
la mayora de los microorganismos se ve afectado por el valor de al que estn creciendo. Por ejemplo, es comn
que a altos valores (cercanos a m) formen diversos productos, siendo la naturaleza de estos dependiente del
microorganismo, mientras que a bajos valores de no los formen.
Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto sobre el proceso de variables como pH,
temperatura, concentracin de nutrientes, etc., manteniendo constante el valor de , o bien, fijadas las anteriores,
45
BIORREACTRES
analizar el efecto de sobre el proceso. De este modo es posible separar los distintos efectos y obtener informacin
valiosa para la mejora del proceso.
Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en un momento dado,
normalmente cuando se agota el substrato limitante, se comienza a alimentar el biorreactor con medio de cultivo
fresco a un caudal F (Fig. 1).
F, SR
F,S,X,P
X S
P
Fig. 1
Mediante un rebalse se logra que el volumen del cultivo permanezca constante. El caudal de salida
contendr clulas, mientras que la concentracin de nutrientes ser menor que en el caudal de entrada debido a que
en parte fueron consumidos por los microorganismos. Eventualmente se encontrar tambin algn producto(s)
proveniente de la actividad metablica de los microorganismos.
46
BIORREACTRES
Una de las variables de operacin fundamental en este tipo de cultivos es la velocidad de dilucin, D, la
que se define como la relacin entre el caudal de alimentacin, F, y el volumen de cultivo, V.
F
D= (1)
V
Teniendo en cuenta las unidades usuales de F (L. h-1) y de V (L), las de D sern de h-1. El valor de D corresponde a
las veces que se renueva el volumen del biorreactor por unidad de tiempo, as un valor de D= 0.25 h-1 indica que en
una hora se renov un 25 % del volumen de cultivo, o bien que al cabo de 16 hs. se habr renovado cuatro veces el
volumen de cultivo. Podra pensarse que a estas alturas prcticamente ya no quedan microorganismos dentro del
biorreactor, pero no es as; debe tenerse en cuenta que estos se estn multiplicando activamente lo cual compensa
las perdidas debidas a los microorganismos que son arrastrados fuera del biorreactor por el caudal de salida. Bajo
ciertas condiciones, que analizaremos mas adelante, ambos procesos se compensan de modo tal que la
concentracin de microorganismos se mantiene constante en el tiempo, es decir que se habr alcanzado un estado
estacionario. En estas condiciones tambin se mantendrn constantes en el tiempo las concentraciones de
nutrientes, en particular la del substrato limitante del crecimiento, y la de producto(s).
Balances de materia:
De acuerdo al esquema de la Fig. 1 podemos plantear los siguientes balances de materia para la
concentracin de microorganismos ( X ), de substrato ( S ) y de producto ( P ).
dX
V. = V .r F . X (2)
dt x
dS ~ V. r
V. = F .S F .S (3)
dt R s
dP
V. = V .r F .P (4)
dt P
Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no varan con el tiempo, lo que equivale a igualar a
cero las Ecs. (2), (3) y (4), de donde resulta:
47
BIORREACTRES
r ~
= D. X (5)
X
~)
r = D . (S S (6)
S R
r = D . P~ (7)
P
Donde X ~, P
~, S ~ representan las respectivas concentraciones en estado estacionario. La Ec. (6) es vlida para
cualquier nutriente del medio de cultivo, sea el substrato limitante o no, ya que la misma surge de un balance de
materia en el que no se ha hecho ninguna consideracin con relacin a la naturaleza del substrato considerado.
Lo primero que debe destacarse en este tipo de cultivo es que permite determinar experimentalmente y de
modo muy simple las velocidades de crecimiento, consumo de substrato y de formacin de producto, tal como se
desprende de las Ecs. (5), (6) y (7). Del mismo modo permite calcular los rendimientos. Por ej. Si suponemos que S
representa a la fuente de carbono y energa, el rendimiento celular se calcula fcilmente:
X~
Y = ~) (8)
x / s (S S
R
De modo similar puede calcularse YP/S , o bien las velocidades especficas. Por ej. Para qs ser:
rS D.(S R S~)
qS = = (9)
x x~
Mientras que para la velocidad especfica de crecimiento ser:
rX ~
D. X
= = ~ =D ( 10 )
X X
La Ec. (10) es de suma importancia pues significa que en estado estacionario es = D, y como D puede ser variado
a voluntad por el operador (variable de operacin) resulta que el cultivo continuo permite imponerle
externamente a los microorganismos el valor de al que deben crecer.
48
BIORREACTRES
El estado estacionario:
Hemos visto que en estado estacionario es = D, la pregunta que surge inmediatamente es: cuanto tiempo
demora el sistema en alcanzar este estado?. En rigor, la respuesta surge de la misma definicin de estado
estacionario, es decir cuando todas las variables del cultivo (X, S, P, concentracin de O2 disuelto y composicin
de la biomasa) no varan en el tiempo. El criterio prctico que se suele seguir es que, una vez fijado el valor de D,
debe esperarse al menos 4.tR, donde tR se conoce como tiempo de retencin medio y puede demostrarse que :
tR = 1 / D
Por tanto si se fija un valor de D= 0.15 h-1, habr que esperar 26,7 hs. para suponer que se ha alcanzado el estado
estacionario, lo que deber ser corroborado experimentalmente midiendo las concentraciones de X, S, P hasta
observar que no varan con el tiempo. Usualmente con 4.tR es suficiente.
49

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BIORREACTRES

Mg. Anah V. Cuellas 2007

Universidad Nacional de Quilmes

II-CAMBIOS EN EL ENTORNO AGROALIMENTARIO:

III-LA INVESTIGACIN AGRCOLA INTERNACIONAL EN UN MUNDO GLOBALIZADO

La tendencia hacia la apertura y desregulacin de las economas, ha significado el paso de modelos

IV-BIOPROCESOS EN INDUSTRIAS DE ALIMENTOS. GENERALIDADES TECNOLGICAS

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II-EFECTORES INTERNOS Y EXTERNOS

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III-REQUERIMIENTOS FISIOLGICOS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

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IV-NUTRIENTES REQUERIDOS PARA EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS.

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VI-ETAPAS PARA LA OBTENCIN DE UN PRODUCTO MICROBIANO.

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La mxima velocidad de crecimiento de un microorganismo es el resultado de las caractersticas

c) Purificacin del producto. Si el producto es extracelular, es decir, es excretado al medio por la

VII-ESQUEMA DE UN PROCESO INDUSTRIAL

En la Fig. se presenta un esquema general de un proceso de fermentacin.

Como puede verse existen 4 etapas bien diferenciadas, a saber:

1) Propagacin de cultivos, lo que se realiza en el laboratorio y que comienza generalmente en un

3) Operaciones y proceso de separacin y purificacin de los productos; estas etapas comprenden en

a) Separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin, o decantacin;

b) separaciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin;

c) purificacin por extraccin lquido-lquido, o extraccin a dos fases acuosas, o cromatografa de

IIX-SELECCION, MANTENIMIENTO Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE

Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo

1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.

2. Su velocidad de crecimiento debera ser alta.

3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.

6. Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.

b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.

Para la deteccin de productores de factores de crecimiento tales como aminocidos y necletidos se

IX-MANTENIMIENTO O CONSERVACIN DE LOS CULTIVOS

b) preservar los niveles de su productividad inicial;

c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.

Esto ltimo puede ser un factor esencial en la seleccin de un mtodo de preservacin.

El conocimiento de las caractersticas del cultivo es esencial en la eleccin de un mtodo de

Los mtodos de preservacin o mantenimiento ms importantes son los siguientes:

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En cuanto a la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70 C, ya que a

El empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de clulas en condiciones de ausencia de

La liofilizacin est considerada como el mtodo ms adecuado para la preservacin de

La liofilizacin es apropiada para la conservacin de la mayora de las bacterias, encontrndose que

En la reconstitucin de un tubo liofilizado se logra incrementar la sobreviva de los microorganismos

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental

c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes orgnicos

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en

1) medios sintticos o medios qumicamente definidos, y

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes

Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol de ser fuente de energa.

Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de P04 H y