LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

dosen pengampuh :

Ffitria Susilowati S. Sp. M. Sc

disusun oleh :

Ava Zaujah

PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTOR

DEVISI 2017
KEGIATAN 3

Isolasi Pigmen Tanaman dengan Kromatogarafi Kolom

I. TUJUAN
1. Melakukan isolasi pigmen tanaman dengan kromatografi kolom
2. Memonotoring fraksi dengan KLT

II. DASAR TEORI
Istilah kromatografi berasal dari kata latin croma berarti warna dan graphien berarti
menulis. Kromatografi pertama kali di perkenalkan oleh Michel Tsweet 1903 seorang ahli
botani dari rusia. Dalam perubahannya ia berhasil memisahkan klorofil dan pigmen-pigmen
warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat yang
diisikan kedalam kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses pemisahan ini diawali
dengan menempatka larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium karbonat, kemudian
dialirkan pelarut petroleum eter. (Alimin. 2007)
Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan
kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan
menghasilkan apa yang disebut kromatogram. (Khopkar. 2008)
Kromatorgafi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini
memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan
bebepara gram. Prinsip metode komatografi kolom adalah suatu teknik pmisahan yang
didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat dilarutkan pada
ujung atas kolom. Eluen atau pelarut dialirkan secara kontinyu kedalam kolom. Dengan adanya
tekanan atau gravitasi, maka eluen akan melewati kolom dan proses pemisahan akan terjadi.
(Sastrowijojo. 1991)
Pemisahan kromatografi kolom menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan
komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu
kran dibagian bawahnya untuk menendalikan aliran zat cair. (Yazid. 2005)
Pemisahan kromatografi kolom didasarkan oleh adsorpsi komponen-komponen
campuran dengan afinitas berbeda-bedaterhadap permukaan fase diam.kromatografi kolom
adsorpsi termasuk pad a pemisahan cairpadat. Subtrat padat (adsorben) betindak sebagai fase
diam yang bersifat tidak larut dalam fase cair. Fase geraknya adalah cairan (pelarut) yang
mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan tergatung pada
kesetimbangan yan terbentuk pada bidang antarmuka diantara butiran-butiran adsorben dan fase
gerak serta kelarutan relatif komponon pada fase geraknya. Pada saat teradsorpi komponen
dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase gerak yang ditambahkan secara kontinyu, akibatnya
hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben yang akan secara
relatif tertahan komponen dengan afiitas lebih kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran
pelarut. (Yazid. 2005)
Teknik pemisahan kromatogafi kolom sangat mirip dengan kromatografi kolom
adsorpsi. Perbedaan utamanya terletak pada sifat dan penyerapan yang sigunakan. Pada
kromatografi kolom partisi penyerapan berupa materi padat berpori seperti kieselguhr, selulosa
atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair. (Yazid. 2005)
Silika gel dapat membentuk ikatan hidrogen dipermukaannya karena pada
perkukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karena itu silika gel sifatnya sangat polar . jika fase
gerak yang digunakan sifatnya non polar, maka pada saat campuran di masukan senyawa-
senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fase stationer, dan senyawa-
senyawa non polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. (Yazid. 2005)

III.ALAT DAN BAHAN
1. Alat
a. Gelas ukur 5ml
b. Gelas ukur 10ml
c. Gelas ukur 25ml
d. Gelas beaker 250ml
e. Kolom
f. Tube
g. Spatula
h. Lumpang aluh
2. Bahan
a. Metanol
b. N-hexsan
c. Aseton
d. Na2SO4
e. Daun kangkung
IV. PROSEDUR KERJA
A. Penyiapan kolom

Menimbang silika gel hingga mendapatkan bobot 3 gr

Menambahkan n-hexsan kedalam silika gel secukupnya hingga
bubur silika dapat masuk dalam kolom
Memasukan kapas kedalam kolom

Memasukan campuran silika gel dan n-hexsan kedalam kolom

B. Menyiapkan ekstrak daun kangkung

Memotongkankung menjadi bagian-bagian kecil dan
menghaluskannya
Menambahkan aseton 10ml

Menyiakpan corong yang telah dilapisi dengan kertas saring
yang telah dibasahi Na2SO4

C. Elusi dengan kromatografi kolom

Memasukan ekstrak daun kangkung kedalamkolom silika

Mengelusi dengan menggunakan n-heksan 5ml

n-hexsan + aseton 5 ml

Aseton 5ml

Aseton + metanol 5ml

Metanol 5ml

Menampung setiap pigmen yang di hasilkan dengan tube

V. DATA PENGAMATAN

Perlakuan pengamatan Jenis senyawa
Ekstrak daun kangkung Berwarba hijau muda polar
Kromatografi kolom a. N-hexsan = bening Non polar
b. N-hexana + aseton = hijau Non polar + polar
tua dan hijau muda
Semi polar
c. Aseton = hijau stabilo dan
kuning Semi polar + polar
d. Aseton + metanol = hijau
Polar
muda dan hijau stabilo
e. Metanol = kuning

VI. PEMBAHASAN
Pada uji isolasi tanaman, pemisahan dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi
kolom, karena metode ini merupakanmetode pemisahan yang didasarkan pada pemisahan daya
adsorpsi suatu adsorben terhadap suatu swnyawa baik pengatomnya maupun hasil isolasinya.
Prinsip dasar kromatografi kolom adalah didasarkan pada afinitas kepolaran analit dengan
fase diam. Sedangkan fase geraknya selalu memiliki kepolaran yang berbe dengan fase diam.
Pada praktikum kali ini melakukan uji isolasi pigmen tanaman daun kangkung, hal pertama
yang dilakukan pada praktikum ini adalah menyiapkan adsorben dan kolom. Adsorben yang
berupa fase diam yaitu kolom. Adsorben yang berupa fase diam yaitu silika gel.
Silika gel ditimbang menggunakan timbangan analitik sehingga mencpai bobot 3 gram.
Tujuan menggunakan timbangan analitik untuk mendapatkan bobot yang sesuai dan akurat. Silika
gel ditambahkan dengan n-hexsan hingga silika gel dapat masuk dalam kolom . tujuan
ditambahkannya n-hexsan pada silika gel dikarenakan alumina mengandung titik aktif A, -OH,
sehingga n-hexsan yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat dengan silika gel yang
merupakan fase diam menjadi homogen dan untuk mempermudah memasukan bubur ke dalam
kolom.
Bubur silika dimasukan kedalam kolom yang sebelumnya kolom tetes telah dimasukan
kapas pada bagian tengah bawahya. Hal ini bertuan untuk menyaring pigmen dalam ekstrak
sehingga aka didapatkan ekstrak daun kangkung tanpa penggotor. Dan sebagai penahan fase diam
(adsorben) silika gel agar tidak turun dari kolom.
Memasukan bubur silika kedalam kolom dengan perkahan-lahan dan ketika
memasukannya dipastikan corong menempel pada dinding kolom sehingga ketika bubur silika
dimasukan akan mengalir ke dinding kolom terlebih dahulu. Bertjuan untuk menghindari
terjadinya gelembung dalam kolom silika yang mengakibatkan bibir slika pecah. Bil perlu ketika
memasukan bubur silika sambil mengetuk-ngetuk kolom agar tidak membentukgelembung-
gelembung udara, karena akan menyebabkan penyebaran noda.
Tapah selanjutnya adalah pemyiapan ekstrak sampel daun kangkung. Daun kangkung
digerus menggunakan lumpang aluh dan ditambahlan dengan aseton 10 ml. Penambahan aseton
10 ml bertujuan untuk melarutkan pigmen yang terkandung dalam daun kangkung, karena aseton
adalah pelarut polar sehingga pigmen dengan sangat mudah terlarut.
Pemisahan ekstrak daun kangkung menggunakan corong gelas yang telah dilapisi kertas
saring yang telah dibasahi dengan Na2OH4 berfungsi untuk mengikat kandungan air yang terdapat
dalam estrak pigmen, karena sifat dari Na 2OH4 yang hidroskopis sehingga diharpkan ekstrak-
ekstrak pigmen tidak mengandung air.
Berdasarkan hasil percobaan ekstrak daun kangkung diketahui ekstrak pigmen yang
dihasilkan sebesar 3 ml.
Setelah bubur silika berada dalam kolom, kemudian memasukan eluen-eluen yang
berurutan kepolarannya. Penambahan eluen yang pertama adalah n-hexsan 5 ml, penambahan ini
bertujuan sebagai pengaktif ion-ion dalam resin, sebagai penanda dalam batas volum tertentu
pada titik akhir titrasi yang menunjukan terjadinya perubahan warna.
Penambahn fase gerak dalam kolom silika gel dilakukan secara kontinyu, hal ini bertujuan
agar eluen yang dihasilkan sempurna. Eluen selanjutnya adalah campuran n-hexsan dan aseton
dengan perbandingan 7:3 sebanyak 5 ml,penggunaan fase gerak ini dikarenakan sifat
kepolarannya yang dimiliki, dimana campuran antara kexsan dan aseton membuatnya dapat
mengelusi senyawa polar dan non polar. Maka tidak heran jika capuran ini mengjasilkan 2
komponen warna yaitu hijau tua dan hijau muda.
Eluen selanjutnya adlah aseton 5 ml. Aseton digunakan karena dapt mengelusi senyawa
polar yang terkandung dalam daun kangkung. Mengigat aseton adalah senyawa semi polar
dimana tinggkat kepolarannya dibawah metanol.
Campuran eluen ini dimasukan ke dalam kolom setelah eluen aseton yaitu campuran eluen
aseton dan metanol. Aseton dan metanol akan mengasilkan eluat yang terpisah dan bersifat lebih
polar. Dengan perbandinagan aseton metanol 8:2 sebanyak 5 ml.
Eluen terakhir adalah metanol sebanyak 5 ml.pemilihan metanol yang dimasukan pada
akhir titrasi ini bertujuan kareba sifat yang dimiliki metanol yaitu polar.
Jika kita amati eluen yang digunakan bersifat mulai dari non polar menjadi polar atau semi
polar dan semakin polar. Tujuan dari tingkatan kepolaran eluen agar bubur silika dalam kolom
tidak terlarut. Karena sifat silika gel yang polar apabila eluen yang dimasukan pertama kali
bersifat polar akan membuat bubur silika terlatur dengan eluen dan habis.
Literatur yang dihasilkan dalam pemisahan ekstrak kangkung menghasilkan warna hijau
tua, menunjukan bahwa pigmen menghasilkan klorofil a. Bila berwarna hijau muda menunjukan
pigmen menghasilkan klorofil b, bila hijau stabilo menunjukan mengandung klorofil b, dan bila
berwarna kuning pigmen mengandung xantrofil.
Kelebihan dari metode pemisahan dengan kromatografi kolom dalah metode ini dapat
digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif. Dignakan untk menentukan jumlah komponen
campuran, untuk memisahkan dan parifikasi subtansi.
VII. KESIMPULAN
Isolasi tanaman menggunakan metode kromatografi kolom sebagai pemisahan
campuran. Adsorben yang dignakan adalah silika gel yang bersifat polar.
Eluen yang digunakan dalam pemisahan ini adalah n-heksan, n-heksan+ aseton (7:3)
aeston, aseton + metanol (8:2), dan metanol dengan ukuran masing_masing eluen sebesar 5 ml.
Pecobaan ini menghsilkan warna pada tiap-tiap eluen yaitu n-hexsan menghasilkan
eluet bening. N-heksan dan aseton menghasilkan warna hijau tua dan hijau muda, aseton
menghasilkan hijau muda dan hijau stabilo, aseton dan metanol menhasilkan warna hijau stabilo
dan kuning dan metanol menghasilkan warna kuning.

VIII. DAFTAR PUSTAKA
1. Khophar . S . M . 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI. Press . Jakarta
2. Sastrohamidjojo. Harjono 1991, Kromatografi Edisi 2, Library . Yogyakarta
3. Yazid . E . 2005 . Kima Fisika Farmasi .Yogyakrta
4. Anwar . Chairil . Bangbang Purwono . 1996 . Pengantar Praktikum Organik
Yogyakarta . Duplikasi .