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FUNDAMENTOS DE
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA
Historia
1850 Runge
Anilinas (Colorantes) 1906 Mikhail 1941 Martn y Singe
Cromatografia-Papel Tswett Posibilidad terica
Fm: Solventes Pigmentos vegetales Fm: Gas
Fe: Papel Cromatografia-Colummna
1952 Martn y
1955 Primer CG 1954 Ray 1 Publicacin James
Realidad Experimental 1941
Chroma : Color
Graphein: Escribir
1955-1967 usos de otras 1960 SFC
Fases mviles JJ kirkalnd 1960
1987 se comercializa
auge-comercializacin
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Definicin IUPAC
Mtodo
Separacin fsica componentes
Muestra distribuye 2 fases
Fase Fase
Mvil Estacionari
a
Lquida
Gas Slida Lquida
Slido
Lq/gas
Gel
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Modalidades de Cromatografia
Naturaleza
Fase
Estacionaria Fenmeno en
Naturaleza
Columna
Fase mvil
L iq-Sol (LSC)
Gas : C. Gaseosa GC Liq-Liq (LLC)
Gas-Liq (GLC)
Lquido: C Lquida LC Gas-Sol (GSC) 1. Afinidad
Normal/Reversa
Capa Delgada TLC Ligada
Columna Abierta Intercambio Inico
HPLC *
2. Tamano molecular
Lquido/Gas :SFC
Permeacin por gel
Filtracin por gel
Cantidad Muestra
Aplicada
Analtica: Pg Ug
Semipreparativa: ug gramos
Preparativa: gramos-
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CG
HPLC
vS e p a r a : S u s t a n c i a s O r g n i c a s
Voltiles , NO Termolbiles, peso
molecular promedio (no alto )
vSepara: Orgnicos e inorgnicos
vLa fase el parmetro de separacin Voltiles o no, Termolbiles o no,
Inter.
Inico
IEC
Liq-
Sol
LSC
Formas
CL
Excl.
Liq-
Tamao
Liq
SEC
LLC
Fase
ligada
BPC
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Solventes
Es el verdadero motor y una gran diferencia con CG donde
el gas es solo Carrier del analito.
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Liberacin de burbujas
bomba y celda del
detector
Eliminacin de oxigeno
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Mtodos de desgasificacin:
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Bomba
Caractersticas
Permitir caudal 0.1 a 10 mL/m
Generar presin hasta 6000 psi ( libras/pulgada )
Exactitud de caudal alto
Ruido Bajo ( Generacin de pulsos mnimos variacin de caudal)
Deriva Baja ( Ruido que se genera por el uso en un largo tiempo)
Sistema Corte: Poder parar cuando aumente o disminuya presin del
sistema
Material
Cuerpo en acero Inoxidable
Partes en contacto fase mvil : Zafiro, Rub, tefln , Acero
Se usa TITANIO cuando el acero es incompatible con muestras
biolgicas
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Clases Bombas
vPistn ( Reciprocantes )
Mayora equipos la poseen, las hay 1, 2, 3 pistones. Bomba Tanden.
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Inyectores
Caractersticas
Fcil de operar
Inerte
Soportar altas presiones 7000 psi
Preciso en la cantidad de muestra introducida
Soportar altas temperaturas ( para mantener en
solucin polietilenos )
Biocompatible con la muestra TITANIO
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Clases Inyectores
Desprenden material
Perdida de presin
Necesario vencer la presin para inyectar
Necesita flujos altos
Poca reproducibilidad en la inyeccin
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Clases Inyectores
Vlvula
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DUCTOS TUBERIA
Para: uniones entre la fase mvil bomba Inyector.
Caractersticas
1. Inerte
2. Resistencia a la presin (Indeformable) Acero Inoxidable (316-314),
Polmeros (Polipropileno-tefln)
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UNIONES
Permiten conectar las tuberas y los componentes
cromatogrficos
Caractersticas
Macho Hembra
Frula + Tornillo Conector
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Columnas
Caractersticas
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Clases
1 Analticas 10 a 30cm
2 Precolumnas
Detectores
Funcin : Ver y ubicar en el tiempo y espacio la posicin de
cada uno de los componentes a la salida de la columna.
Caractersticas
1. Sensible
2. Amplio rango dinmico de respuesta
3. No destruir la muestra
4. Estable a la temperatura
5. Respuesta lineal
6. Alta relacin seal /ruido
7. No contribuir al ensanchamiento de la seal (Banda
extracolumna)
8. Responder a todos los solutos
9. Constante de tiempo baja (Velocidad de respuesta rpida)
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Clasificacin
Generales Selectivos
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Caractersticas:
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Caractersticas
Ms empleado.
Buena sensibilidad
Detector Ultravioleta - Visible
Buen rango lineal
No destructivo
Puede emplearse con gradientes eluotrpicos
Estable a cambios de caudal y temperatura
190-350 nm UV
Hasta 700nm Visible
Concentracin analito cumple la ley de Beer
A=a.b.c
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214nm Lmpara de Zn
229nm Lmpara de Cd
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Arreglo de diodos
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Electroqumico
Compuestos redox
1000 veces ms sensible que UV.
Necesita fases mviles conductivas
( Buffers dePO4 0.02M)
Electrodos de Au, C, Pt, Hg
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Bases de la Separacin
Serie de Interacciones de la MUESTRA Fase mvil y Fase
estacionaria
Hidrofbica
Hidroflica
Puentes de H2
Momentos dipolares
Cargas electrostticas
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Cromatograma
Volumen de Elucin, de retencin total
Volumen muerto
Lnea base
Tiempo de retencin
Tiempo de retencin neto o relativo
Velocidad lineal ( u)
Factor de capacidad ( K ), Cte , coeficiente, razn de
distribucin (IUPAC)
Factor de separacin, de selectividad, de resolucin
Ancho de pico
Platos tericos, Altura plato terico
Asimetra
Resolucin
Eficiencia
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Por las diluciones que sufre el analito a medida que atraviesa el sistema
cromatogrfico y por efectos extracolumnares.
Analitos menos retenidos producen picos ms angostos
El ensanchamiento depende de la eficiencia (N) Platos tericos y calidad de ellos
Ensanchamiento intramolecular
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DIFUSION LONGITUDINAL
(B/U)
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RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE
MASA (C*U)
En la fase mvil
En la fase estacionaria
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Ensanchamiento Extracolumnar
Como los analitos ms retenidos generan picos ms anchos que los menos
retenidos este fenmeno afecta mas a los picos menos retenidos que son ms
agudos (Se nota mas)
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Bases de la Separacin
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Estructura Qumica
Naturales
Productos de modificacin inducida
Productos de modificacin permanente
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Estructura Qumica
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Bases de la Separacin
VENTAJAS:
Compuestos ionicos , no ionicos e ionizables pueden separarse
en la misma columna, con la misma fase mvil
La fuerza de atraccin superficial es dbil
La adsorcin irreversible raramente ocurre
La fase mvil predominante es agua
El modificador orgnico es etanol o metanol
El orden de elucin es predecible en funcin hidrofobicidad
Los equilibrios del sistema se alcanzan rpido.
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Es un solvente polar
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Fase Mvil(Reversa)
AGUA Es el carrier.
DESVENTAJA Avido por el Oxigeno y genera mayor presin que los otros solventes
ACETONITRILO
TETRAHIDROFURANO
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Teora Solvofbica: fuerzas intrasolvente ms fuertes que las generadas con el soluto obligando
al soluto a interactuar con la fase estacionaria
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3. De apareamiento ionico
4. Complejacin con iones metlicos Argentacin de la silicagel ( Cu, Cd, Ni, Zn. Ag )
Excelente para resolucin de isomeros geomtricos ( cis- Trans)
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VENTAJAS :
MATERIALES DE RELLENO
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Es un solvente apolar
Mezcla solventes
Se pueden agregar aditivos que actuan sobre sitios de fuerte
retencines causantes de irregularidades en la fase estacionaria
(Agua o solvente altamente polar)
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CLASES :
Aninica
Cationica
UTILIDAD
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Mecanismo de Retencin
Intercambio Inico
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Polmeros orgnicos
Intercambiadores fase ligada
Oxidos inorgnicos
Intercambiadores peliculares
Fase Mvil
Es un solucin acuosa de pH y fuerza ionica controlada por un
buffer.
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Cromatografa Exclusin
CLASES :
UTILIDAD
Solutos de peso mayor a 2000 que presentan
problemas en otros metodos
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Caractersticas Generales
Exclusin esterica
Mayor peso mayor tiempo
Menor tamao mayor tiempo
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