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Escuela de Ingeniera Bioqumica

ICB-495 Laboratorio de Anlisis de Material Biolgico

Gua 4
Determinacin de Protena Total

Las protenas son heteropolimeros formados por aminocidos unidos por enlaces
peptdicos. Los aminocidos que conforman las protenas son del tipo (a excepcin de la prolina
que es un iminocido) y poseen una configuracin del tipo L. Son 20 en total y, de acuerdo a su
estructura qumica, pueden dividirse en polares, no-polares, cargados o no cargados. Las
propiedades funcionales de una protena dependen esencialmente del nmero y distribucin de
estos residuos aminocidicos a los largo de la molcula. Las protenas constituyen, en general,
ms de la mitad del peso seco de la clula y determinan su forma y estructura. Adems, actan
como los principales instrumentos de reconocimiento molecular y como catalizadores.

El hombre es incapaz de sintetizar ciertos aminocidos (aminocidos esenciales), por ello


los debe obtener de su dieta. En la mayora de los alimentos los aminocidos forman parte de las
protenas constituyentes y sus proporciones dependern del origen del alimento. Por esto la
determinacin del contenido proteico es altamente relevante en la caracterizacin nutricional de
un alimento.

Por otra parte, dada la enorme versatilidad de las propiedades observadas en las distintas
protenas surgi, ya a comienzos del siglo pasado, un gran inters por su produccin y uso a nivel
industrial. En la actualidad existen un gran nmero de empresas dedicadas a la produccin de
protenas de muy variada aplicacin y muchas ms que utilizan estas protenas en procesos
productivos de diversa ndole.

De esta forma, en las distintas etapas de diversos Bioprocesos, frecuentemente es


necesario determinar la concentracin de protena total. Por ejemplo: en la produccin de
alimentos formulados; en la produccin de protena unicelular; en la produccin mediante cultivos
celulares, de una protena especfica y en las posteriores etapas de recuperacin y purificacin
requeridas; en plantas de tratamiento de aguas residuales de matadero, etc.

Existen diferentes mtodos para la determinacin de la concentracin de protenas. Para la


eleccin del mtodo habr que tener en cuenta, entre otros: la cantidad total de protena
disponible, la necesidad de conservar la muestra intacta luego del ensayo, la presencia en la
muestra de compuestos que interfieran en el ensayo, la especificidad del ensayo, la rapidez con
que se necesita el resultado. Las tcnicas ms utilizadas estn basadas en la espectroscopia, y
pueden dividirse en dos categoras de acuerdo al cromforo que detecta el ensayo:

- Cromforos presentes en las protenas: espectroscopia en el ultravioleta


- Cromforos que resultan de reacciones qumicas de las protenas: reaccin del biuret,
ensayo de Lowry, ensayo del cido bicinconnico y ensayo de Bradford.

En este laboratorio se utilizaran cuatro mtodos para la determinacin del contenido total
de protenas en una muestra patrn (albmina bovina) y dos muestras problemas. Los mtodos
utilizados sern: espectroscopia en el ultravioleta a 280 nm, ensayo de Bradford, ensayo de Lowry
y Microkjeldahl.

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MTODO DE BRADFORD1

El mtodo de Bradford ac descrito permite analizar muestras cuya concentracin de


protenas totales est entre 100 y 1000 g/ml.

A. Preparacin de soluciones

Reactivo de Bradford
1. Pesar 10 mg de Azul Brillante de Coomasie G-250 y disolver (por al menos 1 h) en 5 mL de
etanol al 95%.

2. Adicionar 10 mL de cido fosfrico 85% y agitar hasta homogeneidad.

3. Agregar lentamente agua destilada y aforar a 100 mL.

4. Filtrar dos o tres veces con papel filtro corriente.

5. Mantener el reactivo en oscuridad y a 4C.

B. Procedimiento

Adicionar 100 L muestra (convenientemente diluida) y 1 mL de reactivo a un tubo de ensayo


(por duplicado). Dejar reposar durante al menos 2 min (y 1 h como mximo).

Medir la absorbancia de las muestras a 590 nm. Usando la solucin de NaCl como blanco.

La concentracin de protena total de la muestra se determina interpolando el valor de su


absorbancia en la curva de calibrado realizada simultneamente.
Construccin Curva de Calibrado: Se preparan cinco diluciones de estndar a partir de una
solucin stock de 5 mg/mL de albmina de suero bovino (200, 400, 600, 800 y 1000 g/mL) con
NaCl 0.15 M.

2
MTODO DE LOWRY2

El mtodo ac descrito permite analizar muestras cuya concentracin de protenas totales


est entre 10 y 100 g/ml.

A. Preparacin de soluciones

Reactivo de cobre alcalino (RCA)


Pesar por separado 5 g Na2CO3; 0.5 g de Tartrato de Na y K; 0.25 g de CuSO4 y 10 g de
NaOH. Disolver, siempre por separado, en pequeos volmenes de agua destilada. Luego
mezclar la solucin de carbonato con la de tartrato. Agregar lentamente, pero con agitacin
vigorosa, la solucin de cobre. Finalmente incorporar el hidrxido y aforar a 500 mL.

Reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC)

Se prepara una solucin de reactivo al 20% v/v. Para ello se mezcla 20 mL de solucin de
reactivo comercial con 100 mL de agua destilada.

B. Procedimiento
1) Adicionar 1 mL de muestra (convenientemente diluida) y 1 mL de RCA mezcla bien y dejar
reposar por 10 min a temperatura ambiente. (por duplicado)

2) Adicionar 500 L de RFC, inmediatamente mezclar en Vortex, y dejar reposar durante 30


min a temperatura ambiente.

3) Medir la absorbancia de las muestras a 650 nm. Usando agua destilada como blanco

4) La concentracin de protena total de la muestra se determina interpolando el valor de su


absorbancia en la curva de calibrado realizada simultneamente.

Construccin Curva de Calibrado: Se preparan cinco diluciones de estndar a partir de una


solucin stock de 1 mg/mL de albmina de suero bovino (20, 40, 60, 80 y 100 g/mL) con agua
destilada.

Nitrgeno por Microkjeldahl4

Revisar gua de laboratorio 1 Anlisis Proximal

Bibliografa

1. A rapid and sensitive methods for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Bradford, M. Anal Biochem 72:248-253, 1976.
2. Current Protocol in Molecular Biology. 2001. John Wiley & Sons, Inc. Editores. New York.
3. Skoog, D. Y West, D.M. 1990. Qumica Analtica. Cuarta Ed. Mc Graw-Hill. New York.