MUTACIONES EN P53 Y LAS MUTACIONES EN CNCERES

HUMANOS
TP53 es el gen mutado ms frecuentemente en cncer humano, con un predominio de
mutaciones missense dispersas sobre 200 codones. En muchos cnceres, se pueden
identificar patrones de mutacin especficos, los cuales son moldeados por
mutagnesis especfica del sitio y por seleccin biolgica. En los cnceres relacionados
con el tabaco (pulmn, cabeza y cuello) se observan patrones especficos de rganos,
con muchas mutaciones compatibles con las inducidas experimentalmente por
carcingenos del tabaco. En varios otros tipos de cncer, como el carcinoma de clulas
escamosas del esfago o el carcinoma hepatocelular (HCC), los patrones de mutacin
muestran variaciones geogrficas entre regiones de alta y baja incidencia, lo que
sugiere un papel para los factores de riesgo especficos de la regin. HCC de las
regiones de alta incidencia mostrando tambin una alta prevalencia de una especfica
Ser-249 TP53 mutacin es uno de los ejemplos ms llamativos de una mutagnica
huella digital. Todas estas evaluaciones son tiles para generar pistas sobre los
mecanismos mutagnicos implicados en el cncer humano. Por otra parte, se ha
demostrado que el ADN recuperado del plasma puede ser utilizado con xito para la
deteccin de mutaciones TP53, lo que da esperanza para la deteccin temprana ms
precisa de los cnceres humanos.

INTRODUCCIN

El gen TP53 se ve frecuentemente afectado por la prdida de alelos y por mutaciones

puntuales en casi todos los cnceres. TP53 se encuentra en el cromosoma 17p13 y
codifica una protena de unin al ADN
Con propiedades supresoras de tumores. Las mutaciones son excepcionalmente
diversas en su posicin y naturaleza, afectando a ms de 200 codones dispersos
principalmente a lo largo de la porcin central del gen (Hainaut et al., 2000). Una base
de datos de todas las mutaciones publicadas se mantiene en la Agencia Internacional
para la Investigacin del Cncer (http://www-p53.iarc.fr/p53data-base.htm, Olivier et
al., 2002). El anlisis de los patrones de mutacin TP53 ha demostrado su utilidad en al
menos dos reas principales. En primer lugar, la posicin de las mutaciones ha ayudado
a comprender mejor las funciones de diversos dominios de la protena p53 y su
participacin en la meditacin de las funciones supresoras que estn inactivas en el
cncer. En segundo lugar, se ha demostrado que los patrones de mutaciones pueden
variar de acuerdo con la naturaleza de los agentes sospechosos de actuar como
mutgenos, permitiendo el uso de mutaciones TP53 como biomarcador para el papel
de los carcingenos en el cncer humano (Hainaut & Hollstein, 2000, Greenblatt et al.,
1994). En este breve resumen, resumiremos estas lecciones y analizaremos sus
implicaciones para la explotacin de los datos de la mutacin TP53, en particular en los
estudios epidemiolgicos moleculares. Tambin discutiremos la idoneidad de los
fragmentos de ADN libres extrados del plasma como una fuente de material para la
deteccin de mutaciones en pacientes con cncer y pre-cncer.
FUNCIONES DE LA PROTENA p53
La razn principal por la que el gen TP53 est tan frecuentemente mutado en los
cnceres (en general en ms del 50% de los cnceres invasivos) es que la protena p53
desempea papeles mltiples y coordinados contra la proliferacin en respuesta a
muchos tipos diferentes de estrs (Pluquet y Hainaut, 2001; Appella y Anderson, 2000).
Las condiciones que activan p53 incluyen agentes que inducen dao al ADN (radiacin
UV, gamma o X, carcingenos voluminosos, agentes alquilantes, micotoxinas,
inhibidores de topoisomerasas, etc.), as como condiciones no dainas para el ADN
tales como Hipoxia, agotamiento de ribonucletidos o alteracin de la adhesin celular.
Otra categora de seales fisiolgicas que estimulan p53 es el resultado de la activacin
de cascadas de sealizacin que promueven el crecimiento. Estas diversas seales
activan p53 a travs de varias vas, lo que conduce a una velocidad variable o nivel de
activacin de p53, dependiendo de la naturaleza del estrs, su intensidad y la
sensibilidad del tipo de clula considerado (revisado en Pluquet y Hainaut, 2001) . Por
lo tanto, no hay una "respuesta de p53" uniforme y las consecuencias de la induccin
de p53 pueden variar mucho en funcin de varios factores (Appella & Hainaut, 2000).

La protena p53 se expresa constitutivamente en todos los tipos de clulas, pero no se

acumula debido a su rpida degradacin por el proteasoma. En respuesta a la
estimulacin, p53 se fosforila en mltiples sitios y escapa a la degradacin, como
resultado de la disociacin de su regulador clave, Mdm2, que acta como ubiquitina
ligasa para iniciar el proceso de degradacin. Dos factores principales pueden inducir la
disociacin de p53 de Mdm2. La primera es la fosforilacin de p53 y / o mdm2 en
varios residuos clave por quinasas activadas por el dao de estrs o ADN (Appella &
Anderson, 2000). El segundo es el secuestro de Mdm2 por la protena p14 (arf). Esta
protena, codificada por el mismo locus gentico que la que codifica el gen supresor de
tumor CDKN2A, se trans- forma en respuesta a factores de crecimiento (Sherr, 2000).
Por lo tanto, la estabilizacin de p53 puede ocurrir en al menos dos contextos: la
respuesta al estrs daino del ADN, y el control normal del crecimiento celular despus
de la estimulacin del factor de crecimiento.

El escape de la degradacin se acompaa de cambios en la conformacin de la

protena p53 que lo convierten en un factor de transcripcin activo. La protena se une
entonces a secuencias de ADN especficas en las regiones reguladoras de genes diana,
regulando as (positivamente o negativamente) su expresin. Los genes diana incluyen
los reguladores del ciclo celular, la apoptosis, la reparacin del ADN y la diferenciacin
(Hainaut y Hollstein, 2000). El efecto de la activacin de p53 depende de la secuencia
temporal de la regulacin de muchos de estos objetivos. Colectivamente, estos genes
objetivo forzarn a la clula a abandonar la replicacin del ADN, bien induciendo la
apoptosis, o favoreciendo la detencin transitoria o permanente en el ciclo celular
(Oren y Rotter, 1999).
La protena p53 puede compararse con un "freno de emergencia" que activa la clula
para detener la proliferacin si las condiciones no son adecuadas para la correcta
replicacin del ADN. En circunstancias normales, p53 se activa transitoriamente en el
borde G1 / S y participa en el control de la velocidad y el momento de entrada en la
fase S. Sin embargo, en clulas expuestas a riesgos genotxicos, p53 se acumula a
niveles muy altos y se requiere para prevenir la proliferacin de clulas que podran
haber adquirido nuevas lesiones de ADN.

La prdida de la funcin TP53 predispone a las clulas a una rpida acumulacin de

mltiples cambios genticos. Un principio de esta funcin para la progresin del cncer
viene dado por el hecho de que los ratones sin el gen TP53 funcional se reproducen y
desarrollan (casi) normalmente pero mueren a una edad temprana de mltiples
cnceres (Donehower et al., 1992). Muchas de las condiciones que conducen a la
activacin de p53 se cumplen durante los pasos iniciales de formacin del tumor
(exposicin a mutgenos, hipoxia, deplecin en ribonucletidos o alteracin de la
adhesin celular). Por lo tanto, la prdida de la funcin de TP53 puede ser crtica para
que las clulas eviten un "punto de restriccin" en la progresin del cncer, lo que
explicara por qu las mutaciones TP53 son tan comunes en formas avanzadas de
cncer (Guimaraes y Hainaut, 2002).

TP53 pertenece a una familia de protenas con funciones superpuestas en el control del
crecimiento, el desarrollo y la diferenciacin. Dos homlogos de TP53, P63 y TP73,
codifican varias variantes de empalme implicadas en la diferenciacin y el desarrollo.
Ninguno de ellos, sin embargo, es un objetivo frecuente para las mutaciones missense
en los cnceres humanos. Existe una buena evidencia de que p63 desempea un papel
central en la regulacin de la diferenciacin de epitelios escamosos, y los ratones que
carecen de esta protena muestran un fen- meno dramtico caracterizado por la
ausencia de una piel desarrollada y por varias malformaciones craneales y de los
miembros. Los resultados recientes indican que P63 es a menudo sobreexpresado ya
veces amplificado en carcinomas escamosos de la cabeza y el cuello, esfago y pulmn.
Por lo tanto, este gen puede desempear funciones especficas en can-
Cer, pero muy diferente de los de TP53 (Levrero et al., 1999).

TP53 MUTACIN PUNTOS CALIENTES - MUTAGENESIS VERSUS SELECCIN

La mayora de las mutaciones en el gen TP53 ocurren en la parte que codifica el

dominio de unin al ADN. En este dominio (residuos 102 a 296), se ha descubierto que
cada residuo tiene como objetivo sustituciones en cnceres humanos (con una
excepcin, el residuo 123) (Olivier et al., 2002). Sin embargo, algunos codones son ms
frecuentemente mutados que otros. Las mutaciones en cinco "hotspots" principales
representan aproximadamente el 30% de todas las mutaciones conocidas. Estos
codones son R175, G245, R248, R249, R273 y R282. La aparente "hipermutabilidad" de
estos sitios se debe a dos factores. En primer lugar, estos codones abarcan sitios CpG
donde las citosinas se metilan a menudo, y su desaminacin espontnea induce una
mutacin de transicin de C a T (Rideout et al., 1990). Este tipo de mutacin es
frecuente en todos los cnceres. En segundo lugar, estos residuos desempean papeles
importantes en la superficie de contacto entre la protena y el ADN diana. Por lo tanto,
la sustitucin de estos residuos da como resultado una protena con una afinidad
disminuida por el ADN, que ha perdido la capacidad de suprimir la proliferacin (Cho et
al., 1994). Las mutaciones de "Hotspot" pueden explicarse as por una interaccin entre
la mutagnesis, que ocurre en sitios especficos, y la seleccin, que da a las clulas con
funcin TP53 deficiente una ventaja selectiva y proliferativa durante la progresin del
tumor.
Hay muchos mutgenos que pueden daar el ADN de maneras especficas, dejando
huellas dactilares en el genoma de las clulas cancerosas. Sin embargo, muchas de las
mutaciones que se encuentran en los cnceres probablemente surgen
espontneamente, a travs de mecanismos endgenos. El ms comn de estos
mecanismos son los errores de polimerasa durante la repugnacin o reparacin del
ADN y la desaminacin de la citosina metilada en motivos CpG para formar timina. Este
ltimo es potenciado por el xido ntrico y este tipo de mutaciones es comn en
tumores que ocurren dentro de un contexto inflamatorio crnico, como cncer
colorrectal o estomacal (Ambs et al., 1998).
En la prctica, es difcil estimar qu mutaciones surgen espontneamente y cules son
debidas a carcingenos exgenos. Adems, existe un gran grado de superposicin
entre los patrones de mutaciones de un tipo de cncer a otro. En la Fig. 1 describimos
los factores que influyen en la formacin de patrones de mutacin como una sucesin
de "filtros" que permiten la adquisicin y persistencia de mutaciones particulares
(Hainaut & Holstein, 2000). En primer lugar, la capacidad metablica de las clulas y
tejidos expuestos determina la magnitud del dao al ADN inducido por un mutagnico
determinado. En segundo lugar, el sistema de reparacin del ADN corrige la mayora de
las alteraciones y slo las que no son reemplazadas se fijan en el genoma. En tercer
lugar, la seleccin biolgica favorece a las clulas que han adquirido una ventaja
proliferativa como consecuencia de una mutacin.

DIGITALES DE MUTAGENS AMBIENTALES

Hasta el momento, la identificacin de huellas digitales precisas dejadas por

mutagnicos en TP53 ha sido posible en una serie de cnceres en los que existe una
buena demostracin experimental y molecular de que carcingenos especficos
desempean un papel importante.
En los cnceres de pulmn de fumadores, el patrn de mutacin de TP53 es
consistente con mutagnesis por al menos algunas clases de carcingenos de tabaco
(Pfeifer et al., 2002). En general, el cncer de pulmn difiere de los cnceres no
relacionados con el tabaquismo por una alta prevalencia de G a T transversiones (30%
en el cncer de pulmn, en comparacin con un promedio de 9% en cnceres no
relacionados con el tabaco como el cerebro, mama o cncer colorrectal) . Estas trans-
versiones estn preferentemente situadas en la cadena no transcrita del ADN TP53, y
ocurren a menudo en los codones 157, 158, 245, 248 y 273. Aunque los datos sobre no
fumadores son todava limitados, se sabe que este tipo De transversin no es frecuente
en cnceres de pulmn de no fumadores (12%) (Pfeifer et al., 2002). El humo txico
contiene muchos agentes que potencialmente pueden inducir transversiones G a T,
particularmente agentes de estrs oxidativo, nitrosaminas, aminas aromticas e
hidrocarburos aromticos policclicos. Sin embargo, las bases en las que se producen
las transversiones G a T en los cnceres de pulmn de fumadores son las mismas que
aquellas en las que el benzo (a) pireno forma preferentemente aductos de ADN in vitro
(Smith et al., 2000). Parece que la presencia de una citocina metilada adyacente a una
guanina es un factor importante para la formacin preferente de aductos. Estos
resultados indican claramente un efecto mutagnico directo de algunos de los
principales componentes del tabaco en los cnceres de pulmn de los fumadores.

EL PLASMA COMO FUENTE ALTERNATIVA DEL ADN

La principal dificultad en la deteccin de la mutacin TP53 es asegurarse de que el ADN
analizado sea representativo de la lesin de cncer o de pre-cncer. Estas condiciones
suelen encontrarse con especmenes quirrgicos, en los que el patlogo puede
seleccionar reas tumorales representativas, pero no siempre ocurre con biopsias, en
particular las de lesiones tempranas. Por lo tanto, sera muy til tener acceso a fuentes
alternativas de material, como por ejemplo clulas tumorales exalimentadas, que se
pueden obtener con tcnicas menos invasivas que la biopsia o la ciruga. Estudios
recientes indican que el ADN plasmtico puede ofrecer tal oportunidad.
El ADN circulante libre (ADN CF) est presente en el plasma de todos los individuos. El
plasma de sujetos sanos contiene cantidades diminutas de dicho ADN (hasta unos
pocos nanogramos por ml), pero estos niveles se incrementan entre 10 y 100 veces en
varias enfermedades, incluido el cncer. Existe la evidencia de que el ADN de plasma
libre a menudo contiene ADN mutante de la lesin tumoral (Anker et al., 1999).
Estudios realizados en los aos setenta han demostrado que en pacientes con cncer,
este ADN muestra una serie de caractersticas fsicas que sugieren que de hecho se
origina a partir de clulas tumorales. La forma en que este ADN celular llega al torrente
sanguneo todava est en discusin. Su liberacin puede ser una consecuencia de
procesos neuromticos y / o apoptticos que ocurren en el tumor. Tambin hay
algunas pruebas que apoyan la hiptesis de la secrecin activa de fragmentos de ADN
por parte de clulas normales o de cncer, o la liberacin de clulas intactas en el
torrente sanguneo, donde su muerte liberara su contenido de ADN (Anker et al.,
1999 ).
En los ltimos aos, los estudios que utilizan un enfoque sensible basado en la PCR han
demostrado la utilidad del ADN plasmtico para detectar alteraciones tumorales
especficas en genes como K-RAS y TP53, as como la metilacin de CDKN2A,
inestabilidades de microsatlites y prdida de alelos en Loci especfico (revisado en
Anker et al., 1999).