Métodos de Estudo

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em Microbiologia Oral
Marcia Pinto Alves Mayer
José Luiz De Lorenzo

INTRODUÇÃO As bactérias, pelo contrário, não nos ofere-
cem essa facilidade, salvo em raríssimos casos.
O estudo das bactérias visando à sua iden- O encontro, no exame microscópico, de cocos
tificação, principalmente em termos de gênero e Gram-positivos em uma coleção purulenta, não
espécie, tem múltiplas aplicações e finalidades permite que afirmemos, com segurança, que o
em Microbiologia, desde a taxonomia, em Micro- agente etiológico do abscesso é um estafiloco-
biologia Básica, até a aplicação que mais nos in- co, um estreptococo ou até mesmo um peptos-
teressa, que é o diagnóstico microbiológico das treptococo. Quando semeamos, em condições de
diferentes doenças infecciosas que acometem o anaerobiose, uma amostra de placa subgengival
homem, principalmente em sua boca. colhida de uma bolsa periodontal profunda, em
O primeiro aspecto que deve ser ressaltado um meio de cultivo que não seja seletivo como
é a grande dificuldade que o bacteriologista en- o ágar-sangue, o resultado previsto é o desen-
frenta quando tem que identificar uma espécie volvimento de diversas colônias com aspectos
bacteriana. A grande maioria dos seres vivos diferentes, mas geralmente insuficientes para
(animais, vegetais superiores e inferiores, proto- possibilitar sua identificação mesmo por um
zoários e até mesmo os fungos) pode ser distin- bacteriologista experiente. O exame microscópi-
guida pelo simples exame morfológico. Não há co de grande parte dessas colônias evidenciará
como confundir um homem com uma cobra e a presença de bacilos Gram-negativos e esta,
ambos com um inseto. Uma bananeira é comple- provavelmente, será a única informação que o
tamente diferente de uma avenca, bem como de bacteriologista receberá desse exame, incapaz de
todas as árvores e demais plantas. As morfolo- reconhecer se esse bacilo pertence ao gênero Por-
gias dos protozoários Giardia lamblia, Enta- phyromonas, Prevotella, Bacteroides, Eike-
moeba gingivalis e Trichomonas tenax, habitan- nella, Fusobacterium ou qualquer dos demais.
tes da cavidade bucal, são suficientemente dife- Os exames macroscópico e microscópico das
rentes para permitir um diagnóstico correto. Da colônias, no máximo em alguns casos, apenas
mesma forma, o aspecto de células de Candida fornece um diagnóstico presuntivo.
albicans nem de longe lembra o de um Peni- Conseqüentemente, o exame morfológico da
cillium. As partículas virais também costumam célula bacteriana constitui apenas a fase inicial
apresentar morfologias distintas que permitem — importante mas meramente inicial — do com-
sua identificação; por exemplo, o vírus da herpes plexo processo de identificação bacteriana. No
simples é morfologicamente muito diferente de entanto, ele se torna extremamente útil principal-
um poliovírus. mente quando da necessidade de detecção de

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de forma que as estruturas de digerir diferentes substratos nitrogena- celulares mais densas apareçam claras e as que dos. de bactérias da microbiota bucal. porém. os principais métodos de estudo e identificação cimento das bactérias era restrito ao exame mi. renciar espécies. cópios especiais como o de campo escuro e o • o comportamento assumido ante a colora- de contraste de fase. móveis ou imóveis. anaeróbias facultativas e incida diretamente (verticalmente) sobre a lâmi. lidade bacteriana. na maioria das vezes complexa. presentes no soro do doente. conforme mencionado no final do Capítulo 3 havido um grande progresso dos métodos utili. o exame direto do material clínico coletado. Nas últimas décadas do século XX. de. executadas em laboratório de Microbiologia. as análises têm que ser de energia. adotado por grande parte dos laboratórios de vel e que esses exames são incapazes de dife. a identificação de bactérias — e conse. como microscópio óptico comum. • uma infinidade de provas de comportamen- te iluminadas e o fundo intensamente negro to bioquímico. de grande parte dos treponemas que tir em uma série. com a utilização de métodos mo- cipalmente com os estudos de Louis Pasteur leculares ou genéticos de identificação bacteria- (1822-1895) e de Robert Koch (1843-1910). • testes sorológicos que utilizam diretamente gem dessas técnicas de exame “a fresco” (sem os antígenos bacterianos ou os anticorpos coloração) é possibilitar a visualização da moti. durante muitas décadas do século Os testes usados para a identificação de XX. Assim. O microscópio de campo ção de Gram. bactérias em laboratório podem ser divididos em qüentemente o diagnóstico de laboratório das dois grandes grupos: 44 © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. pois per- mite separar as bactérias em dois grandes gru.bactérias não cultiváveis como é o caso. Desde os primórdios da Bacteriologia. trole. anaeróbias estritas). microscópio dos de ágar) que possibilitam a obtenção de co. O objetivo deste capítulo é informar ao es- Hans Christian Gram ter introduzido o método de tudante e ao profissional de Odontologia sobre coloração que leva seu nome (1884). escuro possui o chamado condensador cardiói. como resultado. são associados à sífilis e a periodontites seve. Outra grande vanta. Para sua visualização. . as bactérias ficam intensamen. na contendo o esfregaço. como proteínas e aminoácidos (pro- têm densidade próxima à da água apareçam es. em meios sólidos para cultivo. de materiais adequados em seu consultório. que começaram a surgir perspectivas de facilitamen- ganhou realce há pouco mais de 100 anos prin. cabe lembrar que Este. ria de corantes etc. a respeito da ca. anaerobiose) diferentes carboidratos e a sidades diferentes. curas. com gião-dentista pode utilizar. como o citoplasma. por sinal. (Componentes Bacterianos da Microbiota Bu- zados na identificação de bactérias. bate- lônias isoladas e a de Pasteur. de testes destinados a analisar: ras. podemos usar micros. to dessa tarefa. ainda é o esquema seqüencial a grande maioria das espécies bacterianas é imó. de contraste de fase ou de campo escuro. Bacteriologia. Também representaram excelentes avanços as principalmente devido à necessidade de dispor descobertas de Koch sobre o cultivo das bacté. tais rias em meios sólidos (meios líqüidos adiciona. bacilos ou espirilos. No entanto. um processo anaeróbico de obtenção muito limitada. para triagem ou con- outras múltiplas propriedades diferentes entre si. mas seja refletida e • a morfologia das colônias desenvolvidas depois refratada. Antes de cal). por doenças por elas causadas — passou a consis- exemplo. de forma a tangenciar a lâmina. A coloração de MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA Gram representou um grande avanço. • a morfologia celular. teólise ou putrefação). tem na. esse exame tem validade boidratos. apenas classificá-las como cocos. que permite para as patogênicas. que faz com que uma luz puntiforme não microaerófilas. com ênfase croscópico a fresco ou in natura. • o comportamento respiratório (aeróbias. São muito raras as ocasiões em que o cirur- pos: as Gram-positivas e as Gram-negativas. O microscópio de contraste de oxidar (em aerobiose) ou fermentar (em fase ainda permite diferenciar materiais de den. Assim. o reconhe. Além disso. posto na Introdução. pelo motivo ex- pacidade de muitas bactérias fermentarem car. tais como a capacidade de (“céu estrelado”).

PRAS (Solução de Ringer Pre-Reduced Anaero- me direto a fresco (microscópio de campo escu. O diag. vas. exigindo muitos dias para desenvolver co. • Dispersão e diluição da amostra: chegan- mente examinado (em nosso caso placa dental. antes de coletarmos d) além disso. preferentemente. conteúdo de bolsa periodontal ou de bolsa de maioria dos exames para efeito de estu. bically Sterilized). O meio de transporte tem como função viabilidade. no laboratório. adequado para estreptococos. mais modernamente. Para obtenção de um ambiente reduzido. para a diferenciação de sorotipos ou mos a escolha do meio de transporte e o proces- genótipos. de forma a a) são técnicas geralmente muito trabalhosas. Deve. Mycobacterium tuberculosis e algumas Gram. não contidos nesse material. mos depende da composição dos diferentes retamente no material clínico. algumas desvantagens manter a viabilidade dos microrganismos. o RTF (Reduced Transport Fluid). o nóstico da presença dessas bactérias requer exa. devemos ter um bom co- ção até nível de espécie. bactérias anaeróbias estritas. desde que as bac. a bactéria em estudo é fasti. ou seja. perimplantar ou de canal radicular. francamente predominantes na cavidade Exemplos clássicos de bactérias fastidiosas são bucal. por ções de assepsia. como T. ciente e pelos modernos testes de identi. manter um ambiente anaeróbio indispensável diosa. e o meio é preparado sob fluxo de ga- sua execução e alguns deles são muito lábeis em ses livres de oxigênio. Assim. para manter ao máximo a viabili- dade microbiana. dium). Uma de suas maiores vanta. lação existem soluções de sais que garantem um c) ainda não se tornou possível cultivar algu. meio isotônico necessário para a estabilidade das mas bactérias. maioria dos materiais clínicos provenientes da térias isoladas sejam mantidas em condição de boca. por nhecimento sobre esse material. secreções na- do e diagnóstico. não se prestando. células microbianas. Os meios de transporte ro Treponema. rial clínico. pallidum e várias outras mais utilizados na atualidade são o VMGA III espécies que fazem parte da microbiota bucal. para evitar falsos resultados provas sorológicas indiretas realizadas representados pele detecção de microrganismos com amostra do soro sangüíneo do pa. 45 . na grande maioria dos casos —. • dependentes de cultivo: constituem a gran. na grande timicrobianas (antibiograma). do ao laboratório de Microbiologia. Este procedimento é indispensável gens é o fato de ser o único teste que se presta particularmente no caso de material contendo para a verificação da sensibilidade a drogas an. meios de transporte adequados para cada mate- dos presentemente. meios de transporte. de óxido-redução como resarzurina e azul de b) necessita de microrganismos viáveis para metileno. ser imediatamente processado ficação genética de bactérias. o THM (Thioglycolate ro ou de contraste de fase) ou exame indireto Medium) e o Stuart. na sua formu- função de pequenas alterações ambientais. sem no apreciáveis são inerentes ao cultivo: entanto permitir sua multiplicação. turais como a saliva ou patológicas como pus ou • independentes de cultivo: grupo consti. a solução consiste Os testes bacteriológicos que utilizam meios na semeadura imediata do material-problema em de cultivo ainda constituem a maioria dos efetua. samento posterior desse material. conservar a proporção inicialmente existente na a maioria dos resultados demanda alguns dias e. também. realizados di. só estabelecem a identifica. exsudato gengival) deve ser coletado em condi- tuído pelo exame direto (microscopia). (Viability Maintaining Microsbiotatic Me- especialmente no âmbito subgengival. a amos- © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. caso de muitas espécies do gêne. A viabilidade de um grupo de microrganis- néticos independentes de cultivo. Coleta do Material e Uso de Meios de Transporte Processamento Laboratorial Todo material clínico a ser microbiologica. o material para análise. (sorologia) ou. Testes Dependentes de Cultivo Quando isto não for possível — aliás. amostra. No entanto. indicadores do potencial que necessitam de 15 dias para se desenvolver. exames ge. Além disso. para direcionar- exemplo. são adicionadas substâncias redutoras como negativas anaeróbias periodontopatogênicas tioglicolato e cisteína. para as bactérias anaeróbias estritas e facultati- lônias necessárias para posteriores análises. Geralmente é preparado de maneira a em vários casos.

necessários para o desen. o meio escolhido aproximadamente 10% de CO2. mear os meios de cultura em duplicata e ta cultivável total presente no material-problema. em seguida estas devem ser • Incubação: a atmosfera de incubação dos seqüencialmente diluídas (10–3. se- Quando o objetivo for o estudo da microbio. em grande parte dos casos. para Streptococcus bucais o Ágar auxílio de pérolas de vidro já existentes no Mitis-Salivarius (MS). quando o objetivo do exame for — técnica do roll tube): técnica que con- a detecção de apenas um grupamento bacteria. se que exclusivamente por microrganismos ses procedimentos. respec- ções bacterianas. em especial a supragengival. Para o isolamento de trabalhoso. para Streptococcus do frasco contendo o meio de transporte. como hormônios. zindo um ambiente anaeróbio composto – extrato de carne (fonte de nitrogênio e de por H2. amostras bucais. em função da alta células do espécime. me o oxigênio do ambiente interno. visando um exame microscópico preliminar das Para facilitar o isolamento. siste em obter um ambiente anaeróbico no no ou de apenas alguma espécie em particular. Como a microbiota bucal é constituída qua- • Semeadura em meios de cultivo: após es. na MSB são seletivos e diferenciais. 10–4. pela manipula- devemos usar um meio seletivo. do O2) e em se fazer uma “lavagem” das taminas). deve apresentar uma formulação que o torne su. tivamente). alta concentração de sacarose (5 e 15%. Os meios MS e teriana. Alguns gica presuntiva das colônias de estreptococos autores recomendam que placa subgengi. val seja submetida a esse processo. 46 © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. o Ágar Triptone-Soro-Baci- do o material a ser estudado é a placa bac. redutores. embo. volvimento de organismos fastidiosos. 80% de N2 + 10% de H2 + 10% de CO2. normalmente executado concentração de microrganismos presente nas com o auxílio de coloração de Gram. Lactobacillus spp podemos usar o meio de sada em aparelho agitador de tubos com o Rogosa. 10–5 etc. poderá ser usada para a confecção de esfregaço rias Gram-negativas. de manter a viabilidade das células bacterianas. Geralmente são utilizados meios enriquecidos – Câmara de anaerobiose. em cuja formu. ou grupo mutans o Ágar Mitis-Salivarius-Bacitra- por sonicação “delicada”. Mesmo a saliva apresen. Nessa condição. Os componentes – Jarra de anaerobiose. cina (MSB) e. é reco- em meios de cultivo adequados. processa uma reação química que conso- se (fontes de nitrogênio). Outro recurso consiste minerais como cloro. ção do material sempre sob fluxo de gases lação existem componentes que permitem quase livres de oxigênio e pelo uso de agentes que exclusivamente o desenvolvimento do gru. incubá-los tanto em ambiente anaeróbio o meio utilizado no isolamento primário não deve como em ambiente microaerófilo contendo ser seletivo. róbico interno é conseguido pela presença menadiona e formiato. da mistura de gases livres de oxigênio. mendável. bucais neles desenvolvidas. no interior da qual se mais freqüentes dos meios de cultivo são: usa um envelope em cujo conteúdo se – peptonas como a bactopeptona e a tripto. a fim tificação quanto a escolha do(s) meio(s). jarras com uma mistura de gases contendo – carboidratos (fontes de carbono). N2 e CO2. tra-problema geralmente deve ser disper. produ- – aminoácidos (fontes de nitrogênio). que permite a diferenciação morfoló- ta células bacterianas agregadas. que contêm vitaminas e cabine impermeável na qual o ambiente anae- outros compostos. pois contêm qual existe grande número de aglomera. interior de tubos de vidro. para Actinobacillus actinomy- mento é obrigatório principalmente quan. Uma pequena amostra do material-problema ra se saiba que a sonicação lisa as bacté. é pouco usado por ser muito po-alvo ou da espécie-alvo. . cara e sofisticada com sangue ou soro. – Meio de cultura pré-reduzido (tubos PRAS No entanto. tracina-Vancomicina (TSBV). hemina. em promover vácuo (retirada de ar conten- – extrato de levedura (fonte de diversas vi. Este procedi.) em cultivos é um aspecto tão crítico da iden- solução isotônica como o soro fisiológico. O ambiente anaeróbio poderá ser consegui- ficiente para promover o desenvolvimento da do por um dos seguintes métodos: grande maioria das bactérias. sódio e potássio). a amostra é semeada anaeróbios facultativos e estritos. cetemcomitans.

Como é importante a identificação de estrep- tecção de atividades enzimáticas das bacté. pH ácido: cor amarela. vela acesa. – dióxido de carbono (CO2). mutans e A. pH ácido: cor amarela. indol e o sulfeto de chumbo é usado para a de- tir de colônias isoladas em meios sólidos tecção de gás sulfídrico. semeadas são colocadas no interior das coagulase. – amônia.0: cor amarela. senvolvidas. tococos bucais. gumas espécies periodontopatogênicas são Alguns indicadores de pH muito usados nesse muito fastidiosas. mas. acetoína. aminas tóxicas como putrescinas e seletivo MSB. como as hemolisinas. salivarius. exigindo incubação durante processo são: cerca de 15 dias. nos quais se insufla isolada em vários caldos nutritivos contendo. indispensá. por exemplo. Algumas espécies. a par. mais encontradas na placa cariogênica humana. DNAse e fosfatase al- jarras ou dessecadores. Além dessa habilidade bioquí- anaeróbico) de carboidratos (fontes de mica. sobrinus. que é tes provas bioquímicas usadas na identificação realizada por provas bioquímicas. melha. Ambientes microaerófilos. a) Provas bioquímicas: baseiam-se na de. Durante a incubação (geral- controlada de 5 a 10% de CO2. – Vermelho de metila (VM): pH > 6. As capacidades de oxidação e de fermenta- – Colocação das placas semeadas no inte. urease. expressadas pela produção de catabolitos tes de avaliação de risco de cárie dental. podem ser consegui. actinomycetemcomitans e muitas ácidos). que impede o desenvolvimento © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. – Vermelho de fenol: pH alcalino: cor verme- tes bactérias pelo aspecto das colônias de. junto com uma calina. a acidificação do meio co. se a bactéria decompõe Também é crítico o tempo de incubação. mas al. ção podem ser avaliadas semeando-se a amostra rior de sacos plásticos. em alguns casos é possível – Verde de bromocresol: pH alcalino: cor ver- um diagnóstico presuntivo usando lupas de-azulada. tes nitrogenadas como proteínas e amino- bacilos. nessa tabela. ra seja muito difícil caracterizar as diferen. é o primeiro passo. mesmo assim. e diferenciação de algumas espécies de estrep- gicas e moleculares. a produ- desenvolvem colônias típicas em meios ção de ácidos graxos e outros produtos finais adequados. outras espécies bucais. lha. soroló. de reativos especiais. mesmo nesses casos. mutans e S. cada qual. como S. A.1 mostra os resultados de diferen- vel. dos por: – peróxido de hidrogênio (H2O2). convém tais como: reparar. dará de cor. have- pois a maioria das espécies bucais desenvolve. o ar expirado e se veda hermeticamente. para a identificação bacteriana. um determinado carboidrato-teste e – Incubação em estufa contendo atmosfera um indicador de pH. requer testes proteólise no meio de cultivo é feita com o uso complementares para confirmação. 47 . Por outro lado. mente de 24 a 72 horas). pH < 6. – Método da “chama de vela”: as placas – enzimas como catalase. gás sulfídrico. A Tabela 4. de aumento ou microscópio estereoscópi. lacto. os reativos • Testes para identificação definitiva de bac. de cultivo pode ser determinada em aparelho S. De forma quantitativa. as espécies S. indol. que ao apagar deixa tensão – exotoxinas. o carboidrato presente no meio de cultivo. as carbono).0: cor ver- • Exame da morfologia das colônias: embo. que esse grupamento dis- – ácidos: resultam da oxidação (processo tingue-se dos demais pela capacidade de fer- aeróbico) ou fermentação (processo mentar o manitol. rá formação de ácido(s) e o indicador de pH mu- se rapidamente. actinomycetemcomitans. tococos do grupo mutans principalmente em tes- rias. gelatinase. no máximo em 72 horas. oxidase. pode ser detectada por cromatografia gasosa. esse exame requer muita experiência do A detecção da presença de catabolitos da examinador e. de cultivo. de Ehrlich e Kovacs denunciam a produção de térias: a obtenção de culturas puras. adequada de CO2. apropriado (pH-metro). são resistentes à bacitracina presente no meio escatol. adequados para o cadaverinas: resultantes da proteólise ou desenvolvimento de anaeróbios facultativos putrefação (degradação enzimática de fon- como estreptococos do grupo mutans. denunciando a acidificação do meio.

sg.gd. micas estão liofilizados em poços existentes em Na técnica direta. positivas para S. célula bacteriana e.mit.mut. = S. cos ao microrganismo).ang. 1992) Prova Grupo oralis Grupo mutans S. = S. = S. ao qual se adiciona um anti-soro ou imunesso- ses poços. S. Se houver especificida- de alterações de cor. = S. S. mutans. S. o anticorpo marcado liga-se à empregam sistemas semelhantes de provas bio. a bactéria será visuali- 48 © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. Alíquotas padronizadas de rado um esfregaço do material a ser examinado.sv. sobrinus. positiva para S. permitem a diferenciação entre micos e. para imunofluorescência. = S. vidas. Lai e Tanner. em certos casos. que têm como nado material (amostra clínica ou cultivo) vantagens rapidez e facilidade. sobre uma lâmina é prepa- cartelas plásticas. salivarius. S. Os resultados podem ser de. ro (anticorpos específicos preparados em coe- ções atmosféricas. quanto a indireta é mais usada para infec- rias para a identificação. S.sg. de microrganismos presentes em determi- nóstico disponíveis no comércio. S. . das outras espécies de estreptococos que se matizados para leitura e determinação de micror- desenvolvem bem no meio MS.or.sob. As provas de fermentação da inulina e b) Provas sorológicas (imunodiagnóstico): melibiose. S.sv. isto é. da ções virais e para exames do soro de pa- maioria dos patógenos bucais.or. A análise bioquímica da amostra isolada – Imunofluorescência (IF): na identificação também pode ser feita usando-se kits para diag. sobrinus e negativa para confirmar os resultados dos testes bioquí- para S. S. S.ang. S. ganismos. = S. tempos e temperaturas variá. Nesses kits.mit.1 Diferenciação Bioquímica de Diferentes Espécies de Estreptococos Bucais (Adaptada de Maiden. anginosus. = S. e a produção de peróxido de sensibilidade e especificidade podem ser usadas hidrogênio. Os grandes laboratórios cífico conhecido. além de conterem geralmente é usada a técnica direta.mut. S.gd. Tabela 4. S. suspensões da bactéria-teste são colocadas nes. até nível de espécie. seguindo-se a incubação sob condi. em microscópio apropriado químicas. se a amostra-problema contiver o an- analisados em tabelas ou com a utilização de pro. gordonii. mutans. Fermentação Manitol – – – – – + + – Sorbitol +/– – – +/– – + +/– – Amidalina – + – – + +/– +/– – Rafinose +/– +/– +/– +/– +/– + +/– + Inulina +/– +/– – – – + – +/– Lactose + + + + + + + + Melibiose + – Hidrólise Arginina + + – +/– + – – – Esculina +/– + – – + + +/– + Produção Acetoína – – – – + + + + H2O2 + + + + +/– – + – Legendas: S. sobrinus. sanguinis. tígeno bacteriano correspondente ao soro espe- gramas de computador. mutans e negativas reações imunológicas dotadas de adequadas para S. elucidar eventuais dú- essas espécies cariogênicas para o homem. = S. oralis. porém utilizando equipamentos auto. mitis. +/– = a maioria das cepas produz. S. S.sobr. A leitura é realizada por análise visual rodamina (cor vermelha). lho) conjugado a um corante fluorescente como veis conforme o grupamento bacteriano a ser o isotiocianato de fluoresceína (cor verde) ou a analisado. os cientes (pesquisa de anticorpos específi- substratos e os indicadores das provas bioquí. mas algumas não. en- grande número de provas bioquímicas necessá.

Em escavações (poços) de placas plás. é colo. que indicará a dessa bactéria. na cor corres. O seqüenciamento de alguns genes ou do mas (ELISA): na identificação de bactérias genoma de espécies bacterianas permite fazer bucais. para exame. Estas. – Ensaio de imunoabsorção acoplada a enzi. o resultado será a visualização quantidade de produto corado originado de grande número de bacilos intensamente fluo.1).3). alteram devido a variações das condições de Antígeno Bactéria Esfregaço em lâmina Anticorpo específico para a bactéria-alvo (soro produzido em coelho). inclusive na ausência de bactérias terial-problema em lâmina são aplicados viáveis. se usarmos como reagente um soro a fosfatase alcalina é o p-nitrofenilfosfato. Após novas lavagens com solução características fenotípicas. Os métodos moleculares ba- cada uma pequena porção da amostra-pro. seiam-se no uso de sondas de DNA e da reação blema e uma pequena porção de imunes. em cadeia de polimerase (PCR). rescentes. adiciona-se uma solução do subs. nessa reação (Fig. sua identificação com base nas seqüências de ta. previamente con. cultivos. 49 . 4. c) Provas moleculares: para confirmar a – Imunoaglutinação do látex: embora apre. precedente. de grande vantagem dessa técnica é a rapidez forma mais rápida e prática. essas partículas Genéticos ou Moleculares: Sondas de se aglutinarão de forma visível a olho nu DNA e PCR) (Fig. 4. cias de ácidos nucléicos e não na expressão de calina. 4.1 — Esquematização da reação de imunofluorescência direta. Como marcação dos anticorpos. tornando dispensável a realização de anticorpos específicos para a bactéria. alvo. ocorrerá hidrólise enzi- material examinado (placa colhida de bolsa pe. que muitas vezes se tampão. identificação de uma colônia. mento ou espécie. a das provas moleculares ou genéticas. adiciona-se uma solução vantagem é permitir que o diagnóstico seja fei- contendo anticorpos específicos para a to de maneira muito mais segura do que as pro- imuneglobulina presente no primeiro soro vas clássicas de identificação descritas no item (soro anti-IgG humana). também podem ser dos resultados. conjugado ao corante fluorescente Imunofluorescência (reação positiva) Fig. mática do substrato e o resultado será afe- riodontal) contiver proporções apreciáveis rido em espectrofotômetro. previamente ligados a partículas iner- tes como o látex. Outra aos anticorpos. estes testes são bastante antígenos bacterianos que não se ligaram específicos para cada microrganismo. Testes Independentes de Cultivos (Testes cia antígeno-anticorpo. de coelho anti-Porphyromonas gingivalis e o Em caso positivo. soro (IgG específica para a bactéria-alvo). o substrato para exemplo. Sobre o esfregaço do ma. Havendo correspondên. podem ser utiliza- sente sensibilidade apenas moderada. © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. geralmente é usada a técnica dire.zada com intensa fluorescência. 4. ácidos nucléicos específicas para cada grupa- ticas próprias para microtitulações. Isto porque baseiam-se em seqüên- jugados a uma enzima como a fosfatase al. Além de não necessitarem da presença de Após cuidadosas lavagens para remover organismos viáveis.2). trato específico para a enzima utilizada na pondente ao corante usado (Fig. conseguidos em apenas executadas diretamente no material coletado alguns minutos.

utilizados os métodos baseados em cultivo. rápida e com maior sensibilidade (maior número ciados. sim. da bactéria. coli enteropatogênica (EPEC) e E. a detecção de microrganismos de maneira mais cação de patógenos que não podem ser diferen. No entanto. ambos específicos para cada espécie. mas podem detecção dos genes que codificam a produção ser detectadas pelo uso de sondas de DNA ou desses fatores de virulência pode ser feita pelas de iniciadores específicos (primers) na reação sondas de DNA ou pela reação de PCR. habitantes normais do intestino humano.2 — Esquematização da reação de imunoaglutinação de partículas de látex. . a Outras não são cultiváveis in vitro. cas como E. Esfregaço bacteriano em lâmina Anticorpos específicos ligados a partículas inertes (látex Imunoaglutinação sensibilizado pelo anticorpo) (reação positiva) Fig. como Prevotella nigrescens e Prevotella néticos mostrou que os métodos baseados em intermedia. das pelo perfil bioquímico. Para a identificação molecular de determina- coli enteroemorrágica (EHEC) e cepas comen.3 — Esquematização de reação direta de ELISA. O uso de múltiplas sondas de O uso dos testes genéticos resulta em menor DNA ou de múltiplos iniciadores específicos tempo necessário para a identificação permite (curtos pedaços sintéticos de DNA ou RNA) que maior número de espécies sejam identifica. também não podem ser diferencia- cultivos geralmente subestimam a verdadeira ex. a análise de microrganismos por testes ge. mas têm fatores de em meios de cultura e para fornecer respostas em virulência adicionais que requerem experimentos provas bioquímicas usadas em sua identificação. sais. de organismos de resultados positivos) e especificidade (menor similares não patogênicos. a espé. para cada grupo ou espécie microbiana permite das no laboratório e ainda possibilita a identifi. As cepas patogênicas apresentam o mesmo per- requerendo um longo tempo para se desenvolver fil bioquímico das comensais. por provas bioquímicas. número de falso-positivos) do que quando são cie Escherichia coli apresenta cepas patogêni. mas somente por téc- tensão da diversidade microbiana. As. 4. mas espécies bacterianas da cavidade bucal. Por exemplo. cultivo. são utilizadas sondas ou iniciadores específicos E E E E Adsorção do antígeno Adição do anticorpo IgG Adição de soro anti-IgG Substrato específico (bactéria-alvo) (soro) específico para a humana conjugado a + para a enzima no poço da lâmina bactéria-alvo enzima ↓ Leitura em espectrofotômetro Fig. sofisticados para sua detecção. 50 © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. de acordo com o método adotado. Muitas bactérias bucais são fastidiosas. 4. Algu- PCR. nicas moleculares.

de bases específicas para a espécie anali. a presença de microrganismos. quando então o DNA é imo- 16S e 23S do rRNA são as mais conservadas. O seqüenciamento des. indicando positividade do teste) é dade mesmo entre cepas da mesma espécie. As frações gens da membrana. uma fita enzimas como a fosfatase alcalina ou a peroxida- de DNA produzida a partir de uma espécie co. positivando a reação. Por exemplo. A seqüência-alvo usada dos nucléicos homólogos existentes no como base para o desenvolvimento de iniciado. DNA isolada da bactéria que pretendemos iden. A hibridização pode ser realizada em líqüidos tivados em laboratório. mas diferente da encontrada em indivíduos tido a exame. O uso de iniciado. mesmo daque. na ordem de 102 a 104 células de espécies ou tipos diferentes. virtualmente. disponíveis em kits comerciais e. homólogos a porções do DNA próprias de to. ligados a indicadores que emi- qüência homóloga à da fita conhecida. tos de DNA ou RNA contendo seqüências qualquer sonda pode ser marcada por elas. e com alto grau de especificidade. a sonda é inicialmente todos os organismos procariotas. O DNA bacteriano deve ser inicialmente res homólogos às seqüências comuns a todos desnaturado (tornado fita única) e. uma sonda baseada © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. genes humanos e de mutações gênicas. Os genes que codificam o vida por enzimas que quebram o seu DNA de fita rRNA (RNA ribossômico) estão entre os mais única em meio líqüido. na-se ao número de pares de bases não-coinci- zada em laboratório e comercializada. mente. ou pela incorporação de substâncias como a nhecida é colocada em contato com uma fita de biotina ou a digoxigenina. onde o DNA a ser tes- dados de seqüências já conhecidas têm permiti. 51 . partículas. a sonda não-ligada é remo- tão desconhecidas. realizada sua hibridização com a sonda já marca- clusive de genes de microrganismos nunca cul. em filtros (mem- tes produtos e a comparação com um banco de branas) de nitrocelulose. material-problema. as sondas geralmente são marcadas com Em resumo. Estringência relacio- a sonda pode ser bioquimicamente sinteti. ou seja. Detectam rapida- te PCR são ácidos nucléicos de fita simples. tado deve ser imobilizado em um suporte fixo. Existem seqüências que são conservadas em Para ser visualizada. mente. se.homólogos a seqüências encontradas somente de até 50pb) ou fragmentos maiores. mas que di. principalmente 32P. (hibridização. podem ser oligonucleotídios (sondas ções de baixa estringência. formar uma dupla hélice. ou. a reação fitas entram em combinação (hibridização ou é revelada por substâncias cromogênicas ou anelamento). porque podem se ligar a seqüências de áci- les muito relacionados. da. Após a hibridização. A presença da sonda ligada enquanto a região entre elas apresenta diversi. no método mais utilizado. As dentes que podem ser tolerados quando duas sondas de DNA podem ter desde 20pb moléculas de ácidos nucléicos juntam-se para (pares de bases) até milhares de pb. a maio- seqüências do gene16S rRNA são espécie-espe. no caso de vírus. do a identificação de inúmeras espécies até en. a seguir. capazes de detectar proporções muito bai- igual em todos os membros da mesma espécie ou xas de microrganismos no material subme- tipo. Se esta contiver em seu DNA uma se. sas substâncias. em um processo deno- res específicos ou de sondas de DNA deve ser minado hibridização ou anelamento. Quando essa seqüência é conhecida. Até a década de 1980. ou. nos testes moleculares. quimioluminescentes. pos. bilizado no filtro. são adicionados anticorpos que reconhecem es- tificar. em condi- sim. tida era detectada por auto-radiografias. Após a hibridização. é os procariotas pode resultar em amplificação in. A hibridização pode ser regulada alterando- sada. iniciadores homólogos a estas são capazes de moléculas quimioluminescentes ou radioisóto- detectar todas as Eubactérias. substratos antigênicos. Tanto as sondas de DNA mesmo o DNA genômico total de uma como os iniciadores específicos usados no tes. Essas substâncias estão – Sondas de ácidos nucléicos: são segmen. e até na espécie analisada. de vários dos os organismos daquela espécie. Atual- rianas baseiam-se nestas seqüências. as duas tem luz ou que têm atividade enzimática. bactéria pode ser usado. e a radiação emi- utilizados para identificação de espécies bacte. ferem de outros microrganismos. As detectada a seguir. ou por sucessivas lava- conservados entre os organismos. São espécie-específica ou tipo-específica. se a estringência da reação. ria das sondas era marcada com compostos cíficas e muitas sondas ou pares de iniciadores radiativos. e sondas ou marcada com enzimas. as.

pois bilhões de microrganismos gene. drão conhecido do número de pares de bases. Os clones de P. A rea. que permite que ocorra 100% de homologia com a sonda. o número de cópias do gene em es- das ao mesmo tempo. actino- como primers ou iniciadores específicos. permi- hibridizar com DNA de outras bactérias do mes. é feita a análise de seu perfil bioquímico. existe uma grande diversidade entre nucléicos in vitro substituem os processos bio. Para que ocorra a síntese de que as demais cepas. em são submetidas à hibridização com várias son. cas de ácidos nucléicos. possibilitan- número enorme de cópias de um ou mais do sua identificação mesmo em materiais onde o genes a partir de uma mínima quantidade DNA analisado ocorre em proporções mínimas. tindo a hibridização entre ambos. No As técnicas de amplificação de ácidos entanto. são curtos pedaços sintéticos de DNA. • Desnaturação: o DNA é submetido a alta patógeno associado à etiologia da periodontite temperatura. espécies bacterianas da microbiota bucal. crônica. de maneira que as duas fi. também tem sido muito utiliza- ria detectada por outras técnicas. a hibridização • Extensão: geralmente é feita a uma tempe- só ocorre com o DNA da mesma espécie. da resultados falso-positivos. . geométrica). Em alta estringência. mo gênero. Também existem diversidades entre os orga- Cada ciclo de PCR tem três estágios: nismos da espécie Porphyromonas gingivalis. ocorre a amplificação de seu sistema quando seu tamanho é comparado com um pa- biológico. dicina Legal. gingivalis apresentam tas se separem e estejam disponíveis cinco tipos de fímbrias diferentes. A principal vantagem Assim. foram discutidos os aspectos possível detectar os produtos metabólicos de metodológicos relativos à detecção de diferentes uma única célula. A grande vantagem do PCR é que. O produto da amplificação geralmente é de- Quando um microrganismo é cultivado em tectado após a eletroforese em gel de agarose. o somatório dos ciclos for- plificação (PCR): esta técnica produz um nece milhões de cópias desse gene.em seqüências de DNA que codificam o 16S • Anelamento: a mistura do material-proble- rRNA de determinada espécie bacteriana pode ma com os iniciadores é resfriada. por cinco tipos de gene “fimA”. já que não é Neste capítulo. damente associado com a etiologia da periodon- até que o número de cópias seja suficiente para tite agressiva. gingivalis que apresentam o gene “fimA tipo II” 52 © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. laboratório. ça de um único microrganismo. que produz mais leucotoxina do ser detectado. sidade pode inclusive refletir-se na virulência. Assim. fita complementar a partir do ponto de ane- Um dos métodos mais empregados para a lamento com o iniciador específico. cada ciclo. conhecidos que apresentam outros clones de A. de de desenvolver a doença do que indivíduos deias de DNA da seqüência-alvo. pela enzima DNA-polimerase. do que outros. conside. microrganismos da mesma espécie e esta diver- lógicos na amplificação de seqüências específi. de DNA no material-problema. ticamente semelhantes são obtidos a partir de uma única célula presente na amostra inicial. codificadas para a hibridização com os iniciadores es. detecção de organismos bucais é a hibridização Essas três etapas definem um ciclo e uma rea- com sondas de DNA. tudo aumenta de forma exponencial (progressão – Reação em cadeia de polimerase ou de am. evitando-se a síntese. Por esse motivo. pecíficos. Indivíduos que albergam DNA. So. que mycetemcomitans. do em diagnósticos médicos e em testes de Me- ra-se que seja capaz de detectar a presen. organismo reconheci- seqüência-alvo presente na amostra-problema. existe a necessidade da presença de este clone mais virulento têm maior possibilida- oligonucleotídios complementares a ambas ca. utilizando o sistema deno. ção em cadeia de polimerase (PCR) utiliza ciclos Existe um clone da espécie Actinobacillus repetidos de síntese de DNA para replicar uma actinomycetemcomitans. ção de PCR geralmente apresenta entre 30 e 50 minado checkboard no qual múltiplas amostras ciclos. com ratura intermediária. DIVERSIDADE BACTERIANA mente a partir destes bilhões de células. As células de P. que não se. alguns clones de uma determinada es- do uso da técnica de amplificação de ácidos pécie podem estar mais associados a doenças nucléicos in vitro é sua alta sensibilidade.

1992. biota bucal ainda requer muitos estudos. organismos ainda não são cultiváveis in vitro e 8. 373-385. transmitido entre indivíduos adultos (cônjuges). Kroes I. Por exemplo. 69:998-1007. Characteristics dos interessantes foram obtidos com esses es. Por outro lado.foram associados com quadros mais severos res de virulência dos microrganismos com po- dessa doença. Kataoka K. Diagnostic molecular microbiology. pp. Diagnóstico micro- biológico e imunológico. mutans Taubman MA. Alguns da. FC. Muitos avanços foram conseguidos nos úl- 7. Bacterial diver- Essas técnicas são empregadas em estudos sity within the human subgingival crevice. Newman MG. Bueno L. Smith TF. No entanto. Herança e variabilidade. Oral Microbiol Immunol. 1st ed. White TJ. Detection of colonies of Bacteroides têm sido detectados por técnicas moleculares. rios. Muitos American Society for Microbiology. Ou. 5. via transmissão horizontal. 6. 332-339. DiRienzo JM. As técnicas de amplifica. principalmente de pais para os filhos (transmis. BIBLIOGRAFIA cos para os genes de virulência que apresentem diversidade. 1998. transmitidos entre membros da mesma família. e não somente a identificação ro aos agentes microbianos são áreas nas quais em termos de espécie. J Clin Microbiol. periodontitis-susceptible children from health to tras técnicas. Lepp PW. Microbiol Immunol. 1430. Maiden MFJ. 37: 1426- divíduos diferentes. Tenover metodologias adequadas ao estudo de microrga. J Periodontol. Mosby. Microbiolo- são vertical). 53 . In: Persing DH. Tanner A. e sua análise funcional. 1986. periodontitis patients. Rapid identification of important perio- restringe à detecção de espécies microbianas ou dontal microorganisms by cultivation. foi observado que S. Os métodos mais utiliza. St. 1987. A análise de fato. Guanabara Koogan. 2a ed. pp. Principles and applications. 1972. ção que usam iniciadores homólogos a diver. São Paulo. Oral de clones dentro da espécie. também permitem a identifica. of oral Gram positive bacteria. geralmente são usadas técnicas ba. os métodos de detecção de clones específicos de um determi. nismos bucais. rastreamento de determinado clone. elucidada. 1999. Persing DH. O estudo da microbiota bucal não se 9. 4. Makron. 1993. plasmidial. ção de clones distintos. controle da microbiota e a resposta do hospedei- nado patógeno. como a Southern Blot que usa disease and Actinobacillus actinomycetemcomitans sondas baseadas nos genes que codificam o leukotoxin promoter structure. Mayer MPA. Nisengard RJ. 2a ed. In: ______. 96:547-552.. os mecanismos de coloniza- Estes exemplos refletem a importância da ção dos microrganismos bucais. prevenção e ao controle das doenças infeccio- rulência. Microbiologia. 1:48-55. Rela- sas regiões do cromossoma bacteriano permi. gingivalis é gia Oral e Imunologia. doenças da cavidade bucal ainda deve ser 3:139-141. tionship between conversion of localized juvenile tem traçar um perfil único para cada clone. sas da boca. 1996. 1999. Krieg NR. In: ______. Com o seqüenciamento do genoma de mui- volvem a análise do DNA cromossômico e/ou tos patógenos bucais. Louis. pp. Washington DC. 3. Slots J. tudos. 342-372. Pelczar Jr MJ. Chan ECS. visando à Para a identificação dos clones de maior vi. Proc epidemiológicos nos quais se pretende fazer o Nat Acad Sci USA. Hamada SI. a pesquisa em Biologia Oral faz progressos diá- dos para análise da diversidade microbiana en. 2. Contemporary Oral Microbiology ou Actinobacillus actinomycetemcomitans são and Immunology. Morisaki I. Concei- CONCLUSÃO tos e aplicações. Amano A. 1. A gingivalis by a rapid fluorescence assay for importância destes “novos” microrganismos nas trypsin-like activity. Slots J. Lai C-H. será possível um avanço ainda maior. seadas em sondas de DNA ou reações de am- plificação (PCR) usando iniciadores específi. Rio de Janeiro. P. Nakagawa I. Distribution of Porphyromonas A análise da diversidade também é útil na gingivalis strains with fimA genotypes in determinação da identidade das cepas entre in. rRNA bacteriano. © Direitos reservados à EDITORA ATHENEU LTDA. In: Slots J. Relman DA. In vitro nucleic acid amplification timos anos em relação ao estabelecimento de techniques. a análise da micro. tencial patogênico.

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