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SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES

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LII. SEPARACIÓN de la albúmina sérica
En dos fracciones
II. OBSERVACIONES SOBRE LA NATURALEZA DE
LA FRACCIÓN DE GLICOPROTEÍNA

Por LESLIE FRANK HEWITT
De los Laboratorios Belmont (London County Council),
Sutton, Surrey
(Recibido el 1 de enero de 1937)
EXPERIMENTOS informaron recientemente llevado a la conclusión de que la albúmina sérica,
cuando
incluso se obtiene en el estado cristalino, contiene cantidades considerables de
otra proteína que es extraíble sólo con dificultad [Hewitt, 1936]. Eso
aparecería por lo tanto que el material considerado como razonablemente puro y se usa
como el pointof de partida muchas investigaciones era una mezcla de diferentes proteínas.
Una clara separación de la fracción de albúmina de suero de caballo en dos
distintas fracciones de muy diferentes propiedades químicas y físicas fue
descrito en la antigua de papel. Una de las fracciones era suero cristalino
albúmina en un estado más puro que alcanza normalmente y era prácticamente libre de
polisacárido. Puesto que la fracción de albúmina total de suero contiene considerable
cantidades de polisacárido no es de extrañar que la segunda fracción aislada
contenida una glicoproteína, cuya identidad no fue establecida.
En vista de la posible importancia de estas observaciones, los experimentos
ahora descrito se llevaron a cabo con el fin de obtener furtherevidence en apoyo
de las conclusiones alcanzadas y para recoger más información acerca de la glico-
proteína presente en la segunda fracción de albúmina de suero.

NOMENCLATURA
La falta de una nomenclatura claramente definido conduce a dificultades en la discusión de estas
albúmina derivado originalmente de clara de huevo, hasbeen aplicarse a cualquier material de proteína pero su
plazo, los
proteínas.
uso general, ahora se limita a proteínas solublein 50%, pero insolublein 100% saturado
solución de sulfato de amonio. Hay, sin embargo, ningún nombre disponible, excepto la albúmina de aplicar
la
a proteína libre de carbohidratos cristalizable presente en la fracción de albúmina de suero. El de-
cripción cristalino albúmina de suero, además de ser engorroso no es necesariamente preciso, ya que la
proteína se puede precipitar en un no cristalino conditionand que es, en efecto generalmente encontró
en solución. Parecería, pues, que existe la necesidad de una nueva palabra para describir esta proteína.
El nombre debe sugerir la capacidad de cristalización de la proteına y su ocurrencia en la albúmina
fracción. Se sugiere que crystalbumin podría ser apropiada, y por comodidad este término
se utilizará a lo largo de este documento.
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El uso de correcciones "en blanco" mediante el calentamiento de la proteína y ácido sulfúrico por sí sola no puede ser justificado. capas en un Stufen-fotómetro utilizando el azul (470 de la mezcla) y el verde (530 m. Las fracciones crystalbumin se diferencian claramente de la glicoproteína fracciones que contienen más de 4% de polisacárido. ahora se mantuvo para obtener la glicoproteína tan pura como la naturaleza del material que lo haría permiten. pero se puede afirmar thatthe resultados anteriores han sido confirmado. para purificar el con. y se inició una serie de fraccionamientos con este objeto a la vista. y las soluciones deben ser protegidos de la luz a fin de evitar cambios fotoquímicos. Una curva debe beconstructed relacionar los coeficientes de extinción a la carbo- contenido de hidrato.5%) de las fracciones se mencionó anteriormente. en un baño de agua a 800ºC durante Al 20 final min. Por crystalbuminis recristalización repetidas obtenido que contiene sólo trazas de hidratos de carbono (menos de 0. correspondiente a 0-02- 0-2 mg. con modificaciones que eran encontrado para ser mejoras. albúmina es dis- EXPERIMENTAL Los métodos generales utilizados fueron similares a los previamente descrito [Hewitt. se calentó con 2-5 ml. Plasma HQrse era la fuente de las proteínas empleadas. y una solución de partes iguales de galactosa y Manosa se utilizó para la comparación. S0rensen y Haugaard [1933] y Bierry [1934] se supone que el poli- sacárido presente en las proteínas es la galactosa-manosa-glucosamina (GMG) Y los cálculos se basan en esta suposición. en general. se han fraccionado.1% en los doce veces recristalizaron Especímenes). la contenido de polisacáridos se toma como el índice principal para el curso de la Fraccionamiento. Sobre la base de la obra de Frankel y Jellinek [1927]. de 1-6% de solución de orcinol y 15 ml. que corresponde a un contenido de proteína-N de 14-3%. de 60% de H2 $ 04 en un punto de ebullición de tubo 7 x 1 in. Los reactivos utilizados fueron de 60% (en volumen) H2S04 y 1-6% de orcinol en 30% de H2SO4. u) Ifiters Es necesario tomar ciertas precauciones para obtener resultados reproducibles. cada uno obtiene de 25 litros de plasma de caballo. Dado que el trabajo ya se ha informado de cinco lotes de albúmina. Proteína deter- minations se llevaron a cabo por el método de micro-Kjeldahl y en vista de la (360) Página 2 * SEROGLYCOID 361 N variables contenidos de diferentes fracciones de un factor de conversión de 7 0. Rimington [1929. y se puede afirmar a la vez que se encontró difícil https://translate. Es más difícil. De carbohidrato. Colorimétrico comparación se llevó a cabo mediante la medición de los coeficientes de extinción de 20 mm. ya que procede de formación humin de manera diferente en la presencia y ausencia de orcinol. 1 ml. Levene y Mori [1929]. se usó en todo. métodos Fratiotio Fracción S tenía el más alto contenido de polisacárido (9. Los detalles se Para ahorrar espacio. 1931].com/translate_f 2/8 . Determinaciones de hidratos de carbono se basan en los métodos de Tillmans & Filipo [1929] y Sorensen y Haugaard [1933].8/8/2017 LII. 1936]. De solución.googleusercontent. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES cussed En una pero sección en lasposterior seccionesdeanteriores la identidadsedehace thesecond referencia proteína presente en términos generales en la como fracción unade glicoproteína.más soluble constituyente de una mezcla que la menos soluble y la tenacidad con la que el fracciones aparecieron a adherirse hecho su separación más difícil de lo que es habitual incluso con las proteínas. de este tiempo el tubo se sumergió en agua fría.

ningún fraccionamiento pero de ácido túngstico fue igualmente Calor-coagulación.8/8/2017 LII. Solución de alcohol.googleusercontent. y Esta se volvió a precipitar con 2 2SO4 saturado (NH4). °.7% de GMG No hay fraccionamientos con (NH4) 2SO4 tuvieron éxito en elevar el contenido de polisacáridos por encima de 10% e El fraccionamiento con disolventes orgánicos. por el contrario.5%. de NaOH7-1%. las precipitar tener muy similar contenido de polisacárido.deEllauso adición de ácido tricloroacético al 2-2% no dio diluidas. En otro experimento. Las condiciones para obtener la coagulación satisfactoria estaban ahora estudiados. aunque infructuosos. De esta manera el contenido de polisacárido de la fracción (H) era enfriado levantado de 8-5 9 * 6%.aComo ebullición añadió sólocaliente la solución se observó muy leve y se produjo una coagulación álcali coagulación. Los intentos de obtener una separación más considerable de fracciones fueron infructuosos.com/translate_f 3/8 . El precipitado Cuando la zona de precipitación se abordó desde el lado alcalino. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES Elevar fracciónelsecontenido de polisacáridos había mantenido dedespués en solución cualquier fracción de la muy de eliminación porlaencima fraccióndecristalina esta cifra. En este caso el contenido de polisacáridos de la proteína no coagulada alcanzó Casi el 11. Precipitación Alum. El precipitado se centrifugó.fenómenos Los Los intentos éxito.experimental diciones eran los mismos. 1-5 ml.3precipitada y la proteína ml. La precipitación con alcohol de metilo y acetona fallado en proporcionar un método satisfactorio de fraccionamiento. No es necesario muchos fraccionamientos que fallaron para producir una fracción de apreciablemente mayor contenido de polisacáridos de S. https://translate. diluido y ácido eran En ninguno caso eran el contenido de polisacáridos de la precipitado y sin precipitar de agua proteínas apreciablemente diferente. Una concentración bastante alta de ácido acético es necesario para precipitar la glicoproteína a partir de soluciones en 1tricloro- Soluciones% de proteína consistente. enfriada proteína se volvió a disolverse añadió a un volumen en agua igual y se volvió de a precipitar con alcohol. pero se empleó una solución de proteína de menos de 01%. el fraccionamiento fue UN- de proteínas precipitadas y sin adición éxito. La glicoproteína se precipitó bastante fácilmente por alcohol etílico y esto sugirió un posible método para efectuar 23-2 Página 3 362 362 LF HEWITT Fraccionamiento. N.3% de polisacárido y la precipitación con 2 2SO4 saturado (NH4) separados en uno fracción (63 mg. la proteína de separar las fracciones de paracoagulable calor-coagulación en la calefacción fracciones de glicoproteína ahora se han estudiado en una variedad de experimental Condiciones. Soluciones de las fracciones de glicoproteína B y H que contiene aproxi- madamente 1%de la proteína se ajustaron a pH 4-8 y se calentó en un punto de bañera. de 5% de se hicieron alumbre se añadieron a 9 ml. crystalbumin coagula rápidamente al calentarla en el punto isoeléctrico a aproximadamente 600. La albúmina es precipitable por alumbre de potasio y los intentos para utilizar este hecho en un proceso de fraccionamiento.fracciones de glucoproteína. de solución de 0-4% de proteína (fracción H) y el potasio precipitación máximo proteína contenía 8-6%mediante se obtuvo la adición de polisacárido 0-1 de 3. se coagulan sólo con las y a temperaturas adificultad una temperatura llevando abajo con él superiores la 80tuvieron intermediaa no glicoproteína.considerable. Se informó en la comunicación anterior que.) que contiene 10% de polisacárido y una segunda fracción (107 mg. el con. Tricloroacético y ácidos túngstico. mediante la el álcali a la proteína antes de la solución de alumbre.) Que contiene sólo el 5. pero se puede hacer mención del contenido más alto Alcanzado en cualquier proceso de refracción de salting-out. La proteína original (B) tenía 7.

con solución salina porciones 10 mediante la se transfirieron adición de ácido a ocho diluido o cada uno fisiológica tubos un y hasta álcali. calefaccióncalefacción Mg / ml. ambos bastante definitivamente fijada. aaproximadamente un diferente ml. mientras que el segundo calentamiento (a pH 4. Los tubos se sumergieron en una de Baño durante 10 min. Las proteínas que permanecían no coaguladas en las muestras 3.9 T 0-39 11-4 6 5-6 yo 009 10.8) se coagula la proteína disociado durante el primer calentamiento. 003 9-3 2 7-1 .googleusercontent. como casi puro especímenes de la glicoproteína como cualquier obtenidos hasta la fecha y la repetición con otro muestras de glicoproteína dieron resultados similares. Los diversos grados de opalescencia. % 1 8-1 . y el contenido de polisacáridos más bajos en las muestras calentadas a valores de pH más lejano Eliminado de este rango. El polisacárido con- Página 4 SEROGLYCOID 363 Se determinaron las tiendas de las proteínas que permanecían no coaguladas y los resultados del experimento se resumen en la Tabla I. los tampón valores de pH variaron de 4-0 frente a 8-1. Efecto de soluciones de glicoproteína de calentamiento que contiene 1-38 mg. de De proteína por 1 ml. siendo mayor en aquellos tubos adyacente a otros pH 4-8tubos mostraron y menos en las personas más eliminadas de este pH.0 + 0 * 05 9-8 8 4. previamente calentada a pH 4-0.com/translate_f 4/8 . 4 y 5 están.7 4 6-1 . No se produjo la precipitación y los tubos se sumergieron en un baño de agua hirviendo durante una segunda vez durante 5 Coagulación ahora se produjo en grado variable en cada tubo. La muestra en la que se había producido la coagulación se había ajustado a ebullición pH 4-6 antes del calentamiento de agua y fue a pH 5-0 después del calentamiento. 0 45 11. 0 * 12 10-2 3 6-6 . pero hay varios puntos adicionales de interés en el experimento. excepto el uno min. primero a diferentes niveles de pH y luego a pH 4-8 Proteína Polisacárido Coagulado contenido de PH de Opalescencia Después del segundo No coagulado Muestra primero Después de la primera calefacción proteína no. Tabla I. 0-48 10-8 5 5. En soluciones más concentradas disociación del complejo no se produce y la glicoproteína se realiza en el https://translate.0) es necesario para efectuar la disociación del complejo. No que contenía se utilizaronsesales debido ajustó a los efectos de 0-15% confusión de diferentes soluciones tampón [Hewitt. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES Fracción de pH S se diluyó proteína. La proteína coagulable y la glicoproteína no coagulable parecen estar combinadas en cierta medida y el primer calentamiento (a pH 6.1 . 1929]. los cantidad de precipitación fue mayor en el tubo calentado inicialmente a pH 6-1 y menos en los tubos retira más lejos de este pH. 0 9-3 Se verá que el contenido de polisacárido más altas (aproximadamente 11%) son Alcanzado en las muestras calentadas originalmente a valores de pH entre 5-8 y 6-6. Con el fin de obtener la máxima coagulación en estas soluciones de glicoproteínas se fue necesario calor a dos niveles de pH diferentes. Las muestras se se enfrió y cada uno se ajustó a pH 4-7 o 4-8. pero sólo uno de los tubos mostraron ninguna coagulación y este fue muy leve.8/8/2017 LII.1 7 5. a juzgar por su alto contenido en polisacáridos. que meramente desarrolló una ligera opalescencia.

en un matraz graduado. la discrepancia con los diferentes Color es mucho menos.10 0-84 1-45 En el caso de la glicoproteína. 5 ml. como se describe anteriormente. El hidrolizado es luego se evaporó hasta sequedad a vacío. El método utilizado para determinar cystinewas basa en [1931] modificación útil de Tompsett del método de Folin y Marenzi de [1929] y se puede aplicar a las cantidades de proteína tan pequeña como 50 mg. El frasco. En el caso de la cristalina. A cada matraz 0-8 ml. respectivamente. La solución de proteína (1-5 ml. El color se desarrolla rápidamente y después de Página 5 364 L. de HCI concentrado puro se colocan en un 100 ml. de 20% se añadió Na2SO3 y después de 2 min. De 10 a 20 ml. el residuo se disuelve en agua y la volumen se completa hasta 25 ml. Cistina Glicoproteína Cristalina S 43 Azul 0-16 0-22 0-23 S47 Azul 0. Pero utilizando luz azul (filtro S 43) una cifra de 0 55 mg.. De cistina se incluyen para Parisina Tabla II. de filtrado se utilizaron para cada determinación. de 8% de NaHCO3 y luego 2 ml. y 0-2-0-5 mg. la comparación de los coeficientes para el rojo filtro S 72 da una cistina equivalente de 0-31 mg. Matraz de Kjeldahl y se calienta a punto de ebullición. En los presentes experimentos 1-6 ml. se obtiene debido a que el color amarillo del hidrolizado sí mismo. Las cifras dadas por 0-4 mg. Cuando el filtro rojo S 72 (aproximada de longitud de onda 720 m / u) se utiliza la extinción coeficientes tienen una relación casi lineal con la cantidad de cistina utilizado para el análisis. Que contiene 40-120 mg.com/translate_f 5/8 . F.) De 20 mm.googleusercontent. el volumen final de la soluciones colorimétricos ser 25 ml.08 0-83 1-40 S 75 rojo 1. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES coágulo. Los coeficientes de extinción (2 k. los coeficientes de extinción de las soluciones se miden en un Stufen- Fotómetro. De proteína) se pipetean directamente en el ácido hirviendo. del reactivo de ácido úrico (libre de fenol reactivo) de Folin y Marenzi [1929]. thecontents se mantiene simplemente hirviendo durante 18 horas. Esta último hecho ilustra la gran diferencia en el comportamiento de la glicoproteína y https://translate.8/8/2017 LII.19 0-22 0-29 S 50 Verde 0-25 0-24 0-36 S 53 Verde 0-36 0. Determinaciones de cistina El contenido de cistina de las fracciones han demostrado ser de gran valor en con- Sidering su identidad. los Color marrón de los hidrolizados de glicoproteínas tiende a hacer colori- La comparación métrica del color azul se desarrolló muy difícil. Humin se separó por filtración y una parte alícuota del filtrado se toma para el análisis. las cifras son 0-52 y 0 57 mg.35 0-53 S 57 Amarillo 0 * 51 0 * 44 0-72 S 61 rojo 0-66 055 093 S 72 rojo 1. capas de soluciones utilizadas Para determinaciones de cistina Filtrar color 0-4 mg. como se verá de la Tabla II que da los coeficientes de extinción de las soluciones colorimétricos Utilizado durante el análisis de los hidrolizados de una glicoproteína (S) y de un Cristalina. se calienta en una eléctrica baño de arena. Capas de solución que se utilizan. HEWITT 10 minutos. 20 mm. de cistina se utilizó para comparación.

En la literatura el contenido de polisacárido de la albúmina usada no tiene en Muchos casos han sido reportados pero donde se les da es frecuentemente considerable. Y el presente autor [1934] encontró contenidos entre 0-29 y 078% para albúminas cristalinas y hasta 4-4% para otras fracciones. Rimington [1929.8/8/2017 LII. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES crystalbumin de cuando un color marrón y sesedeposita calientauncon HCl concentrado.5 1-8 En cada caso las crystalbumins con bajos contenidos de polisacáridos tienen un alto contenido de cistina. precipitado La glicoproteína negro de humin mientras quedesarrollado la La cristalina permaneció casi incolora. las figuras de Lustig & Haas [1931] son entre 0-47 y 0-65%.6 2-4 K 6-6 2*3 MARIDO 8-5 2-1 segundo 7-3 1. Página 6 SEROGLYCOID 365 Discusión Los experimentos reiterados confirman la conclusión anteriormente Se puede obtener una recristalización simple de albúmina sérica prácticamente exenta de polisacárido. 1931] da un contenido de carbohidratos de aproximadamente 2%.9 S 9. mientras que las glicoproteínas tienen bajos contenidos de cistina. Se discute este último punto En la siguiente sección. No sólo es esta de interés en demostrar una vez más las propiedades de contraste de la dos proteínas pero le permite a ciertas conclusiones que se pueden extraer en relación con la Naturaleza y composición de la fracción glicoproteica. Como ha sido se muestra en los dos documentos de esta serie que el contenido de polisacárido de purificado crystalbumin puede reducirse a valores por debajo de 041%. Los resultados de las determinaciones de cistina de diversas fracciones se dan en Tabla III.3 4-1 norte 5. en la que están incluidos también los contenidos de polisacáridos para la comparación. Tabla III Polisacárido Cistina Fracción contenido % contenido% mi 0. y S0rensen Haugaard [1933] dan 0-47% para una muestra y una cifra muy baja para otro.05 5-8 METRO 0-09 5-4 R 4. Naturaleza de la glicoproteína https://translate.googleusercontent. Dische y Popper [1926] describen como albúmina de suero que contiene 1-08% de carbo- Hidrato.com/translate_f 6/8 . es evidente que apre- Cantidades de glucoproteína deben estar presentes en muestras de albúmina no Sometidos a cuidadosos procesos de repurificación. La importancia de esto radica en el hecho de que casi cada espécimen Que los investigadores consideran materialmente puros deben tener Cantidad apreciable de otra proteína y muchas de las propiedades descrito son las de una mezcla de proteínas.

El contenido de cistina de la glucoproteína debe ser la suma del contenido de cistina de sus constituyentes. F. sin embargo. única Laalto que tiene un conocidade carbohidratos contenido contenido y no se coagula por calentamiento [Zanetti. Página 7 366 L. preparado por thismeans. sin embargo. precipitable por 50% saturado (NH4) 2SO4. La identidad de esta glicoproteína se discute y se aduce que la evidencia se trata de una nueva proteína de suero para el cual el nombre seroglycoid es provisionalmente Gested suge- https://translate. un menor contenido de N. 1909. ya que tiene un alto contenido de polisacárido (por lo menos 10% Calculado como gmg). una menor Van Slyke amino-N figura. 0 3% seroglycoid.googleusercontent. las siguientes cifras aproximadas pueden tomarse como indicación de la composición de suero de caballo: 3-6% globulina. difícil de calor- mayor contenido de triptófano y un menor contenido de cistina.com/translate_f 7/8 . Bywaters. los presentnecessitates crystalbumin un contenido de cistina de al menos 62 x 5-8 = 36% en la fracción de S.más cerca Spection Aunque. con el apoyo de todas las pruebas disponibles. 1931]. Consideración del contenido de cistina de la glicoproteína demuestra que no puede ser mucoide suero. incluso suponiendo que el mucoide suero no contribuye en absoluto cistina. entonces no está presente 38% de suero mucoide y 62% de crystalbumin. permanece en solución cuando suero se calienta y que es. diferentes curvas de valoración. de modo que SIIT imposible para el glicoproteína a ser mucoide suero. Rimington. seroglycoid tribución se asemeja a la globulina en lugar de albúmina pero no lo es.8/8/2017 LII. Mucoide El suero contiene 25% de polisacárido [Rimington. El parecido es. 2. a pesar del uso de una amplia variedad de métodos de fraccionamiento que tiene no beenpossible para obtener el presente glicoproteína con un contenido de más de 10 o 11% de polisacárido. Si el carbohidrato presente eran debido a suero mucoide (que contiene 25% de carbohidratos). y uno se ve obligado a la conclusión. que thisis una nueva proteína de suero. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES La identidad proteína de suerodealesta queglicoproteína se parece esahora debe suero mucoide ser considerado. cuando casi puro de la glicoproteína ahora puede ser investigada se calienta en solución diluida sin ser coagulada cuando se calienta en el presencia de cantidades apreciables de proteínas coagulables se lleva hacia abajo con El coágulo. 1931]. de hecho. En cuanto a la cantidad de Proteínas en suero. 2-8% crystalbumin. pero. Mucoide suero. Como ejemplo podemos considerar fracción S que tenía un contenido de carbohidratos de 9-5%.. RESUMEN 1. un menor consumo de energía rotatoria. de Por supuesto. La observación se confirmó que la albúmina de suero cristalino (cristalización Bumin) cuando pura está libre de polisacárido sino como prepara usualmente contiene Cantidades variables de una glicoproteína. En realidad. 1897. De hecho ninguna proteína descrita hasta ahora tiene la propiedades de esta glicoproteína. Por lo tanto. al que tal vez el nombre seroglycoid se puede aplicar provisionalmente. esta fracción contiene menos de 1-8% de cistina. por el contrario. El contenido de cistina de crystalbumin se encontró que era un 5-8%. En su aminoácido dis- coagulabilidad. HEWITT Las propiedades de la seroglicóide son diferentes en casi todos los de crystalbumin. sólo superficial y el hecho que la glicoproteína es diferente de la mucosa se hace evidente en la in. 0 05% mucoide suero.

260. 25. 115. 116. https://translate. Biochem.8/8/2017 LII. J. J. Biochem. Tillmans y Filipo (1929). J. Z. J.googleusercontent. (1936). . 1147. 15. Chim. 322. 2229. Granja.(1931). 392. Z. Biochem. Z. 702. J. Biochem. Biol. 185.com/translate_f 8/8 . (1934). 49. 12. Biochem. 1. Z. Biochem. 83. Rimington (1929). Frinkel y Jellinek (1927). 84. 25. Biochem. Levene & Mori (1929). Dische y Popper (1926). Tompsett (1931). Folin y Marenzi (1929). 23. S0rensen y Haugaard (1933). Chem. Biochem. París. SEPARACIÓN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES REFERENCIAS Bierry (1934). 103. Ana. J. 36. Biochem. 23. 231. biol. 389. Lustig & Haas (1931). Bywaters (1909). 215. biol. 30. 2080. 2014. Z. Biochem. J. 247. Zanetti (1897). CR Soc. J. Biochem. 430. 1062. 28. Biochem. Hewitt (1929).. Z. 472. Chem.