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norma UNE-EN ISO 6222

espaola
Diciembre 1999

TTULO Calidad del agua

Enumeracin de microorganismos cultivables

Recuento de colonias por siembra en medio de cultivo de agar


nutritivo

(ISO 6222:1999)

Water quality. Enumeration of culturable micro-organisms. Colony count by inoculation in a nutrient agar
culture medium. (ISO 6222:1999).

Qualit de l'eau. Dnombrement des micro-organismes revivifiables. Comptage des colonies par
ensemencement dans un milieu de culture nutritif glos. (ISO 6222:1999).

CORRESPONDENCIA Esta norma es la versin oficial, en espaol, de la Norma Europea EN ISO 6222 de
mayo 1999, que a su vez adopta ntegramente la Norma Internacional ISO 6222:1999.

OBSERVACIONES

ANTECEDENTES Esta norma ha sido elaborada por el comit tcnico AEN/CTN 77 Medio Ambiente
cuya Secretara desempea AENOR.

Editada e impresa por AENOR LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depsito legal: M 47264:1999
9 Pginas

AENOR 1999 C Gnova, 6 Telfono 91 432 60 00 Grupo 9


Reproduccin prohibida 28004 MADRID-Espaa Fax 91 310 40 32
S
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD EN ISO 6222
NORME EUROPENNE
EUROPISCHE NORM Mayo 1999

ICS 13.060.30

Versin en espaol

Calidad del agua


Enumeracin de microorganismos cultivables
Recuento de colonias por siembra en medio de cultivo de agar nutritivo
(ISO 6222:1999)

Water quality. Enumeration of culturable Qualit de l'eau. Dnombrement des Wasserbeschaffenheit. Quantitative
micro-organisms. Colony count by micro-organismes revivifiables. Bestimmung der kultivierbaren
inoculation in a nutrient agar culture Comptage des colonies par Mikroorganismen. Bestimmung der
medium. (ISO 6222:1999). ensemencement dans un milieu de culture Koloniezahl durch Einimpfen in ein
nutritif glos. (ISO 6222:1999). Nhragarmedium. (ISO 6222:1999).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 1999-03-16. Los miembros de CEN estn sometidos al Reglamento
Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificacin, la norma
europea como norma nacional.

Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliogrficas relativas a estas normas nacionales, pueden
obtenerse en la Secretara Central de CEN, o a travs de sus miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemn, francs e ingls). Una versin en otra lengua realizada
bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretara Central, tiene el
mismo rango que aqullas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalizacin de los pases siguientes: Alemania, Austria,
Blgica, Dinamarca, Espaa, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Pases Bajos,
Portugal, Reino Unido, Repblica Checa, Suecia y Suiza.

CEN
COMIT EUROPEO DE NORMALIZACIN
European Committee for Standardization
Comit Europen de Normalisation
Europisches Komitee fr Normung
SECRETARA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles

1999 Derechos de reproduccin reservados a los Miembros de CEN.


EN ISO 6222:1999 -4-

ANTECEDENTES

El texto de la norma internacional del Comit Tcnico ISO/TC 147 "Calidad del Agua", de la Organizacin
Internacional de Normalizacin (ISO), ha sido adoptado como norma europea por el Comit Tcnico
CEN/TC 230 "Anlisis del agua", cuya Secretara desempea DIN.

Esta norma europea deber recibir el rango de norma nacional mediante la publicacin de un texto idntico a
la misma o mediante ratificacin antes de finales de noviembre de 1999, y todas las normas nacionales
tcnicamente divergentes debern anularse antes de finales de noviembre de 1999.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, los siguientes pases estn obligados a adoptar
esta norma europea: Alemania, Austria, Blgica, Dinamarca, Espaa, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda,
Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Pases Bajos, Portugal, Reino Unido, Repblica Checa, Suecia y
Suiza.
-5- EN ISO 6222:1999

INTRODUCCIN
Las aguas, cualquiera que sea su naturaleza, contienen multitud de microorganismos de origen diverso, procedentes por
ejemplo del suelo y de la vegetacin, cuya estimacin global proporciona informacin til para la evaluacin y control
de la calidad del agua. Generalmente se efectan recuentos independientes de los microorganismos capaces de crecer y
formar colonias sobre medio de cultivo de agar nutritivo a 36 C y a 22 C.

Los recuentos de las colonias son tiles para la evaluacin del estado de los recursos de aguas subterrneas y de la
eficacia de procesos de tratamiento del agua como la coagulacin, la filtracin y la desinfeccin y proporcionan
indicacin sobre la limpieza y el estado de los sistemas de distribucin. Igualmente, pueden utilizarse para estimar la
aptitud de un determinado suministro de agua para la preparacin de alimentos y bebidas, en cuyo caso dicho agua no
debera contener ms que un pequeo nmero de microorganismos, para evitar la contaminacin del producto por
grmenes contaminantes.

El principal inters del recuento de las colonias reside en la posibilidad de detectar los cambios en relacin a los
nmeros esperados, basndose en un control frecuente y a largo plazo. Todo aumento repentino del nmero obtenido
puede advertir anticipadamente de la existencia de un foco serio de polucin y requiere su inmediata investigacin.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN


Esta norma europea especifica un mtodo para la enumeracin de los microorganismos cultivables presentes en el agua,
mediante recuento de las colonias que se forman en un medio de cultivo de agar nutritivo tras incubacin, en
condiciones aerobias, a 36 C y 22 C.

El mtodo est destinado a medir la eficiencia operativa de los procesos de tratamiento de los suministros pblicos de
agua potable y es de aplicacin general para todos los tipos de agua. Principalmente es aplicable al anlisis de las aguas
destinadas al consumo humano, incluyendo las aguas suministradas en recipientes cerrados y las aguas minerales
naturales.

2 NORMAS PARA CONSULTA


Esta norma europea incorpora disposiciones de otras publicaciones por su referencia, con o sin fecha. Estas referencias
normativas se citan en los lugares apropiados del texto de la norma y se relacionan a continuacin. Las revisiones o
modificaciones posteriores de cualquiera de las publicaciones referenciadas con fecha, slo se aplican a esta norma europea
cuando se incorporan mediante revisin o modificacin. Para las referencias sin fecha se aplica la ltima edicin de esa
publicacin.

EN ISO 3696 Agua para uso en anlisis de laboratorio. Especificacin y mtodos de ensayo (ISO 3696:1987).

EN ISO 5667-3 Calidad del agua. Muestreo. Parte 3: Gua para la conservacin y la manipulacin de las muestras
(ISO 5667-3:1994).

EN 25667-2 Calidad del agua. Muestreo. Parte 2: Gua para las tcnicas de muestreo (ISO 5667-2:1991).

ISO 6887 Microbiologa. Gua para la preparacin de diluciones para examen microbiolgico.

ISO 8199 Calidad del agua. Gua general para la enumeracin de microorganismos en medios de cultivo.

3 DEFINICIONES
Para los propsitos de esta Norma europea, se aplica la siguiente definicin:

microorganismos cultivables: Todas las bacterias aerobias, levaduras o mohos capaces de formar colonias en el medio
especfico y en las condiciones de ensayo descritas posteriormente.
EN ISO 6222:1999 -6-

4 FUNDAMENTO
Se siembra, por mezclado con un medio de cultivo especfico en placas Petri, volmenes medidos de una muestra o de
sus diluciones. Se incuban una serie de placas a 36 C, durante 44 h y otra serie a 22 C durante 68 h.

Clculo del nmero de unidades formadoras de colonias (u.f.c.) por mililitro (ml) de la muestra, a partir del nmero de
colonias formadas en el medio.

5 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO


Material de uso habitual en laboratorios de microbiologa y, en particular:

5.1 Equipo para la esterilizacin con calor hmedo (autoclave)

5.2 Estufa de incubacin capaz de mantener una temperatura de (36 2) C.

5.3 Estufa de incubacin capaz de mantener una temperatura de (22 2) C.

5.4 Placas Petri de vidrio o de plstico con un dimetro de 90 mm o de 100 mm.

5.5 Bao de agua o equipo similar capaz de mantener una temperatura de (45 1) C.

5.6 Aparato contador de colonias equipado con un sistema de iluminacin sobre fondo negro.

6 MUESTREO
Las muestras de agua se toman de acuerdo a las instrucciones de muestreo, manipulacin y conservacin indicadas en
las Normas EN 25667-2 y EN ISO 5667-3.

Las aguas suministradas en recipientes cerrados, incluyendo las aguas minerales naturales, se analizan en las 12 h
siguientes al embotellado, manteniendo una temperatura de (5 3) C durante este perodo.

7 MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

7.1 Materiales bsicos


Para la preparacin del medio, se utilizan ingredientes de calidad uniforme y productos qumicos de calidad analtica;
como alternativa puede utilizarse un medio completo deshidratado equivalente y seguir las instrucciones del fabricante.

Para preparar el medio se utiliza agua desionizada o destilada en un equipo de vidrio conforme al nivel de calidad 3 de
la Norma EN ISO 3696, que est libre de sustancias que pudieran inhibir el crecimiento en las condiciones del ensayo.

NOTA Pueden utilizarse productos qumicos de otras calidades siempre que se demuestre que presentan las mismas caractersticas de
funcionamiento en el ensayo.
-7- EN ISO 6222:1999

7.2 Diluyente
Para las diluciones, se utiliza el diluyente a base de peptona indicado en la Norma ISO 8199.

7.3 Agar de extracto de levadura


Triptona (Peptona de casena, pancr.) 6,0 g

Extracto deshidratado de levadura 3,0 g

Agar, en polvo o granulado de 10 g a 20 g (segn el poder gelificante)

Agua 1 000 ml

Se aaden los ingredientes, o el medio completo deshidratado, al agua y se disuelve calentando. Se ajusta el pH si fuera
necesario de modo que, tras la esterilizacin, tenga un valor de 7,2 0,2 a 25 C.

Se distribuyen en tubos, botellas u otros recipientes, volmenes de medio de 15 ml a 20 ml. Para la conservacin de
volmenes mayores se utilizan recipientes de hasta 500 ml de capacidad. Se esteriliza en autoclave (5.1) a (121 3) C
durante (15 1) min.

Para su empleo, se funde el medio, se deja enfriar y se mantiene a (45 1) C en el bao de agua (5.5). Es
recomendable no mantener el medio durante ms de 4 h a 45 C. Transcurrido este tiempo el medio debe desecharse.

8 PROCEDIMIENTO

8.1 Preparacin y siembra


La preparacin de la muestra, las diluciones y la siembra de los medios de cultivo se lleva a cabo conforme a las
Normas ISO 8199, EN ISO 5667-3 e ISO 6887.

Se utiliza el mtodo de siembra en profundidad en placa (ISO 8199). Se pone un volumen de la muestra de ensayo (o de
su dilucin) que no supere los 2 ml en la placa Petri, se aaden de 15 ml a 20 ml de medio fundido (7.3) y se mezcla
cuidadosamente mediante una suave rotacin. Se deja solidificar el medio. El tiempo transcurrido entre la adicin de la
muestra de ensayo (o de su dilucin) y la adicin del medio fundido no debe superar los 15 min. Debe sembrarse como
mnimo una placa para cada temperatura de incubacin.

8.2 Incubacin y examen


Se invierten las placas y se incuba una serie a (36 2) C durante (44 4) h; la otra serie de placas se incuba a (22 2) C
durante (68 4) h. Se examinan las placas tan pronto como se sacan de las estufas de incubacin. Si no es posible realizar
el examen de inmediato, se conservan a (5 3) C y se examinan en las 48 h siguientes. Debe rechazarse toda placa que
presente un crecimiento confluente.

8.3 Recuento de colonias


Para cada temperatura de incubacin, y siguiendo el procedimiento descrito en la norma ISO 8199, se cuentan las
colonias que se observan en cada placa y se calcula el nmero estimado de unidades formadoras de colonias presentes
en 1 ml de muestra.
EN ISO 6222:1999 -8-

9 EXPRESIN DE RESULTADOS
Los resultados se expresan como el nmero de unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml) de muestra para
cada temperatura de incubacin.

Si no hay colonias en las placas sembradas con los volmenes de ensayo de la muestra sin diluir, los resultados se
expresan como: no detectado en un mililitro. Si hay ms de 300 colonias en las placas sembradas con las mayores
diluciones utilizadas, los resultados se expresan como: > 300 o solamente como valores aproximados.

10 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe hacer referencia a esta norma europea y debe proporcionar toda la informacin relevante,
incluyendo:

a) todos los detalles necesarios para la identificacin completa de la muestra;

b) la tcnica (siembra en profundidad en placa) y el medio utilizado;

c) el tiempo y la temperatura de incubacin;

d) los resultados del recuento expresados de acuerdo al captulo 9;

e) toda incidencia observada en el transcurso del anlisis y cualquier otro hecho relevante que concierna al
procedimiento seguido.
-9- UNE-EN ISO 6222

ANEXO NACIONAL

Las normas que se relacionan a continuacin, citadas en esta norma europea, han sido incorporadas al cuerpo normativo
UNE con los siguientes cdigos:

Norma Internacional Norma UNE

EN ISO 3696:1995 UNE-EN ISO 3696:1996


EN ISO 5667-3:1995 UNE-EN ISO 5667-3:1996
EN 25667-2:1993 UNE-EN 25667-2:1995
Direccin C Gnova, 6 Telfono 91 432 60 00 Fax 91 310 40 32
28004 MADRID-Espaa