PRACTICA NO 3

SEPARACION DE COLORANTES POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA Y CUATIFICACION POR

ESPECTROFOTOMETRIA
Oscar Ivan Arroyo Vargas

OBJETIVOS

Separar los componentes de una mezcla de colorantes usando cromatografa en columna

Cuantificar por espectrofotometra el primer colorante que salga de la columna
Evaluar la pureza del compuesto mediante cromatografa en capa delgada
Identificar cuales son los colores que componen las diferentes tintas de los marcadores

CROMATOGRAFIA
La Cromatografa es una tcnica de separacin en la que los componentes de una muestra se separan en
dos fases: una fase estacionaria de gran rea superficial, y una fase mvil. El objetivo de la fase estacionaria
es retrasar el paso de los componentes de la muestra. Cuando los componentes pasan a travs del sistema a
diferentes velocidades, estos se separan en determinados tiempos. Cada componente tiene un tiempo de
paso caracterstico a travs del sistema, llamado tiempo de retencin. La separacin cromatografa se logra
cuando el tiempo de retencin del analito difiere del resto de componentes de la muestra.

La cromatografa puede ser preparativa y analtica.

La cromatografa preparativa se refiere a la separacin de los componentes de una mezcla para su

posterior procesamiento, y se puede considerar un mtodo de purificacin.
En la cromatografa analtica generalmente se hace con una pequea muestra permitiendo para
cuantificar la proporcin relativa de los componentes en la mezcla.

La cromatografa es una de los principales mtodos analticos y permite la separacin y cuantificacin de

sustancias muy similar en estructura y propiedades qumicas.

CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA

En la cromatografa en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorbente
(como por ejemplo gel de slice, almina o celulosa) depositada sobre un soporte plano como una placa de
vidrio, o una lmina de aluminio o de plstico. La CCF es una tcnica analtica y tiene como objetivo el
anlisis de una mezcla de componentes.
El proceso es similar a la cromatografa de papel con la ventaja de que se desarrolla ms rpidamente,
proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre diferentes adsorbentes. La CCF es una tcnica
estndar en el laboratorio de qumica orgnica. Debido a su simplicidad y velocidad, la CCF se utiliza a
menudo para monitorizar las reacciones qumicas y tambin para el anlisis cualitativo de los productos de
una reaccin, puesto que permite conocer de manera rpida y sencilla cuntos componentes hay en una
mezcla

Rf

El smbolo Rf significa relacin de frentes es una relacin de distancias , y se expresa como el cociente
entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por el disolvente hasta el frente del
eluyente

distancia que corre la muestra desde el punto de aplicacion

Rf =
distanciaque corre el disolvente hasta el frente del eluyente

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra: tipo de absorbente, eluyentes,
as como las condiciones de la placa, temperatura , vapor de saturacin, etc. Tiene una reproducibilidad de
mas o menos 20%, por lo que es mejor corres duplicados de la misma placa

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

La cromatografa en columna es quizs el mtodo ms general, utilizado para la separacin, a la vez que
para la purificacin, de diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en estado slido o lquido.

En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el interior
de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la
columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyentes o fase mvil. Seguidamente la mezcla orgnica
que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y as la fase mvil
podr ir atravesando el sistema.
ESPECTOFOTOMETRO

El espectrofotmetro es un instrumento usado en la fsica ptica que sirve para medir, en funcin de la
longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de

radiaciones. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y

microorganismos.

Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y
medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos
funciones:

Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra

Indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa esta presente en la muestra

ECUACION DE LA LEY DE LAMBERT-BEER

La absorbancia est relacionada con la concentracin de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer, que se
resume con la ecuacin: A = b c , donde c se expresa en mol/L, b es la longitud del camino ptico (anchura
de la clula que contiene la disolucin de la sustancia) y se expresa en cm, y es la absortividad molar,
propiedad caracterstica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiacin que absorbe a una
longitud de onda determinada por unidad de concentracin, siendo sus unidades L mol-1 cm-1 (tngase en
cuenta que la absorbancia no tiene unidades).

Para poder aplicar la ley de Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una Longitud de onda
puesto que tanto A como varan con ella. Para ello se obtiene previamente el espectro de absorcin de la
sustancia, que consiste en una representacin de los valores de absorbancia frente a la longitud de onda
expresada en nanometros (nm). Del espectro de absorcin puede seleccionarse el valor de longitud de onda
para el cual la absorbancia es mxima.
Si bien la ley de Lambert-Beer indica que a una representacin grfica de la absorbancia frente a la
concentracin le correspondera una lnea recta, esto slo tiene lugar para disoluciones diluidas, por ello, no
es conveniente utilizar la expresin matemtica directamente, sino construir en cada caso la recta de
calibrado que confirme que la ecuacin de Lambert-Beer se cumple en el intervalo de concentraciones en el
que se trabaja. Esta recta se construye midiendo la absorbancia de una serie de disoluciones de
concentracin perfectamente conocida.

CURVA DE CALIBRACION

Un procedimiento analtico muy utilizado en anlisis cuantitativo es el llamado de calibracin que implica la
construccin de una curva de calibracin. Una curva de calibracin es la representacin grfica de una
seal que se mide en funcin de la concentracin de un analito. La calibracin incluye la seleccin de un
modelo para estimar los parmetros que permitan determinar la linealidad de esa curva. y, en
consecuencia, la capacidad de un mtodo analtico para obtener resultados que sean directamente
proporcionales a la concentracin de un compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de
trabajo. En el procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estndares de concentracin
conocida del mismo analito (o de algn otro con propiedades muy similares a ste). Para realizar la
comparacin se requiere utilizar mtodos y equipos apropiados para la resolucin del problema de acuerdo
al analito que se desee determinar.

TOXICIDAD DE REACTIVOS

Etanol acidulado:
Altamente inflamable : evitar llamas, No producir chispas y no fumar
Las mezclas vapor-aire son explosivas: Sistema cerrado , ventilacin, No utilizar aire comprimido para
llevar , vaciar o manipular
Agua en grandes cantidades , dixido de carbono
Mantener frio los bidones y dems instalaciones rociando agua
ter de petrleo:
Liquido y vapores extremadamente inflamables , daino o letal si es ingerido
Causa irritacin en los ojos , piel y extracto respiratorio
No inducir el vomito en caso de ser ingerido , tomar grandes cantidades de agua o leche
En caso de contacto con la piel o ojos lavar con abundante agua durante 15 minutos o mas en cual
quiera de los caso recibir atencin medica
SEPARACION POR CC

PREPARAR
PREPARAR UNA
UNA SUSPENSION
SUSPENSION
ENTRE LA FASE ESTACIONARIA Y
LA
LA FASE
FASE MOVIL
MOVIL

SUJETAR A UN SOPORTE
LA
DELA

LA
DE LA
UNIVERSAL LA AN
AN ADIR
ADIR FASE
FASE MOVIL
MOVIL A LA
A LA
PREPARACIONDE

COLUMNA COLUMNA
COLUMNA Y Y LUEGO
LUEGO AGRAGAR
AGRAGAR LALA

RELLENO DE
COLUMNA
COLUMNA
COLUMNA
COLUMNA

SUSPENSION ANTERIOR
SUSPENSION ANTERIOR
LENTAMENTE
LENTAMENTE
PREPARACION

RELLENO
GOLPEE
GOLPEE LA
LA COLUMNA
COLOCAR UNA SUAVEMENTE
COLUMNA
SUAVEMENTE CON UNA
CON UNA
PEQUEN A CAPA DE MANGUERA
COMPACTE
PARA QUE
MANGUERA PARA
COMPACTE LA
SE
QUE SE
LA FASE
FASE
ALGODON EN LA LLAVE ESTACIONARIA
ESTACIONARIA

LA
LA FASE ESTAIONARIA DEBE
FASE ESTAIONARIA DEBE
TENER UNA
TENER ALTURA DE
UNA ALTURA DE 8
8 cm
cm

ABRA LA LLAVE Y Y CIERRELA

HASTA CUANDO EL SOLVENTE
ESTE EN EL BORDE DE LA FASE.
ELUCION DE LAS

CIERRE LA LLAVE
CIERRE LA LLAVE DE LA
DE LA
CIERRE LA LLAVE COLUMNA Y GRAGUE LA FASE
LA

MOVIL ETANOL 7:3

ELA

FRACIONES

AGREGUE EXACTAMENTE 1 ml
A
RA
DE

DE LA MEZCLA A LA COLUMNA CUANDO VEA QUE LA PRIMERA

STR
OD

SUSTANCIA VA
SUSTANCIA VA A
A SALIR
SALIR RECOJALA
RECOJALA
EST

DEJANDOLA CAER POR LAS EN UN VASO

VASO DE
DE PRECIPITADO
DO

EN UN PRECIPITADO
LIMPIO, CUANDO TERMINE
TERMINE DE
DE
PAREDES LIMPIO, CUANDO
AD
UE

SALIR CIERRE LA LLAVE

RA
MU
M
BR

ESTA PRIMERA FRACCION

ESTA PRIMERA FRACCION NO
NO
MB

DEBE TENER MAS DE 12mL .

ABRA LA LLAVE DE LA
SEM

MIDA EXACTAMENTE EL
COLUMNA PARA PERMITIR LA VOLUMEN RECOLECTADO DE LA
SE

FRACCION
FRACCION
ENTRADA DE LA MEZCLA
Ficha de seguridad de m- nitroanilina

FICHA DE SEGUIRDAD DEL ROJO CONGO