You are on page 1of 11

Infante N, Martnez K, Flores F, Ordaz C, Ros S, Jurez A, Guillen R, Hernndez A, Chvez

J, 2016. (11) pp. Ingeniera en Biotecnologa

Aislamiento de hongos entomopatgenos como medida de control


biolgico para combatir plagas en cultivos agrcolas

Isolation of entomopathogenic fungus as a biological control


measure to combat pests in agricultural crops
Universidad Politcnica de Gmez Palacio Durango
Recibido 09 de Diciembre 2016

Resumen

Los hongos entomopatgenos son un amplio grupo de microorganismos que proveen


mltiples servicios a los sistemas agroecolgicos, como su capacidad de combatir las plagas.
La presente investigacin describe la infeccin de los hongos entomopatgenos para el
combate de plagas, el mecanismo de accin a travs de la cutcula externa de su hospedero
(insectos/artrpodos), sobre el comportamiento in vitro del hongo para el control de ciertos
insectos como el pinacate (Eleodes), gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) entre otros y
sobre la utilizacin de la quitina perteneciente de la cutcula de camarn (Caridea). De igual
manera, se describe las formulaciones que se utilizan para el desarrollo de esta biotecnologa
en campo. En el desarrollo de bioplaguicidas los hongos entomopatgenos son una opcin
viable para disminuir el detrimento del medio ambiente.

Palabras clave: entomopatgeno, Spodoptera frugiperda, cutcula, quitina.

Abstract

Entomopathogenic fungus is a wide group of microorganisms that provide multiple


services to agroecologicals, such as their ability to combat pests. The present research
describes the infection of entomopathogenic fungus for pest control of certain insects such
as black beetle (Eleodes), fall armyworm (Spodoptera frugiperda) among others and the use
of chitin belonging from shrimp (Caridea) cuticle. Likewise, it describes the formulations
that are used to develop this biotechnology in the field. In the development of biopesticides
the entomopathogenic fungus is a viable option to decrease the detriment of the environment.

Key words: entomopathogenic, Spodoptera frugiperda, cuticle, chitin.


Introduccin
Los insectos por su parte, tienen
El uso excesivo de plaguicidas mecanismos de defensa contra las
provoca efectos negativos en el suelo, el agresiones de los entomopatgenos, que
agua y el ambiente. Adems, ha involucran barreras fsicas, defensas
contribuido a aumentar los problemas de humorales, defensas celulares y de
plagas debido al desarrollo de resistencia y comportamiento social (Marmaras et al.,
a la destruccin de los enemigos naturales. 1996).
Muchos plaguicidas tambin afectan la Existen diversas revisiones sobre
salud de las personas (Monzn, 2001) esto los mecanismos de defensa de los insectos
debido a que los pesticidas originalmente (Levitin & Whiteway, 2008), los
estn creados en base a metales pesados mecanismos de accin de los hongos
como arsnico, mercurio, plomo y cobre entomopatgenos (Shah & Pell, 2003;
(Adams, 1988). Castrillo et al., 2005) y las interacciones
Por ello se han buscado nuevas entre ellos (Hajek & St. Leger, 1994;
alternativas como el control biolgico, que Vilcinskas & Gtz, 1999).
es una prctica agrcola en constante Por su parte en Mxico la
crecimiento y busca la destruccin total o produccin comercial de agentes de
parcial de patgenos e insectos plaga, control biolgico se realiza en 68
frecuentemente mediante el uso de sus empresas, en ellas se reproducen
enemigos naturales (Spardo & Gullino, masivamente 14 hongos
2004). Existen numerosos reportes sobre entomopatgenos, de los cuales Bauveria
la utilizacin de microorganismos bassiana y Metarhizium anisopliae son los
entomopatgenos, que por su capacidad de que ms se comercializan (Tamez, 2001).
producir enfermedad y muerte en insectos, El presente trabajo se dedic al
son utilizados como agentes de control aislamiento de cepas silvestre de hongos
biolgico (Asaff et al., 2002). De los entomopatgenos que permitan el
diferentes microorganismos empleados, desarrollo del control biolgico de
los hongos tienen mecanismos de invasin insectos, partiendo del aislamiento de
nicos que les permiten atravesar de forma hongos de ste tipo a partir de muestras de
directa la cutcula o la pared del tracto suelo y de insectos con micosis.
digestivo de los insectos, lo que los hace
excelentes agentes de control biolgico,
actuando como insecticidas de contacto Metodologa
(Charnley & Collins, 2007).
En general, las fases que Aislamiento de hongos a partir de
desarrollan los hongos sobre sus muestras suelo
hospedantes son: germinacin, formacin La recoleccin de la muestra de
de apresorios, formacin de estructuras de suelo se realiz mediante el muestreo de
penetracin, colonizacin y reproduccin. diferentes puntos en la Comarca Lagunera,
El inculo o unidad infectiva est en reas con humedad y condiciones
constituido por las estructuras de fsicas adecuadas, para un desarrollo
reproduccin sexual y asexual, es decir las ptimo de hongos. La toma de muestra se
esporas y conidias (Alves, 1986). realiz acorde al protocolo descrito por
Tuininga et al., (2009).
Las muestras fueron transportadas hongos no entomopatgenos que puedan
hasta el laboratorio en bolsas estriles desarrollarse en el medio (MacFaddin,
debidamente etiquetadas y se mantuvieron 1985). Se denomin a este medio como
en refrigeracin hasta su utilizacin. MMS- CC-A.
Se pesaron 0,2 g de cada muestra De igual manera se prepar medio
de suelo, las cuales se colocaron en un PDA enriquecido con 1% de Gentamicina
microtubo de 1.5 ml, adicionando 1.3 ml y Clorofenicol respectivamente (PDA-A),
de solucin Tween-80 al 0.02% con el objetivo de evaluar la dinmica de
previamente preparada, y fue llevada al crecimiento en un medio universal para el
vortex durante 15 minutos. La suspensin crecimiento de hongos (PDA) y uno
resultante fue diluida de manera seriada y especfico, para hongos entomopatgenos,
sembrada en medio PDA. Se dej en con quitina.
incubacin durante 6 das a 271C. Las cajas se incubaron durante 72
Aislamiento de hongos a partir de horas a una temperatura media de 27C.
muestras de insectos con micosis Pruebas de respuesta de crecimiento de
Se recolectaron ejemplares de hongos entomopatgenos en insectos
Nezara viridula y Epilachna varivestis que fijados en placas con medio de cultivo
presentaban muerte presuntamente a causa Se prepar un preinculo en medio
de hongos entomopatgenos. Se lquido de MMS-CC-A a partir de las
obtuvieron a partir de un cultivo de maz cepas aisladas en placa. Los matraces se
localizado en el municipio de Matamoros, dejaron bajo incubacin durante 72 horas
Coahuila. Se trasladaron al laboratorio en a temperatura de 271C.
forma individual en recipientes de plstico Se recolectaron ejemplares de 3
y frascos, en dnde se prepararon caldos especies de insectos, al duplicado, con un
YPD, los cules fungieron como caldo de da de anticipacin a las pruebas,
enriquecimiento para los hongos alojados recolectando Gryllus assimilis o grillo
en los insectos. Se dejaron incubando negro, Periplaneta americana o
dichos matraces de enriquecimiento cucaracha americana y Eleodes
durante un lapso de 72 horas a temperatura obscurus o pinacates. Se recolectaron de
de 271C. Posterior al lapso de manera individual en recipientes plsticos
incubacin del preinculo, se resembr en y frascos hasta su utilizacin en el
placas preparadas con medio PDA, laboratorio.
dejando en incubacin durante 5 das a Los insectos fueron lavados en una
271C. solucin de hipoclorito de sodio al 0.5%
Determinacin de presencia de hongos durante 5 minutos, posteriormente se
entomopatgenos a partir de cepas enjuagaron de 3 a 4 veces con agua
aisladas destilada estril. Se dejaron secar
Se realiz la resiembra de las cepas colocndolos sobre gasas dentro de la
obtenidas anteriormente, segn la campana PCR con radiacin UV.
metodologa descrita por Castro-Franco et Se prepar un Medio Mnimo de
al., (2000). Para la cual se prepar Medio Sales adicionado con Antibitico al 1%, el
Mnimo de Sales (MMS) enriquecido al cual se verti en cajas Petri y se dej
1% de Cutcula de Camarn (CC) y 1% de gelatinizar gradualmente. Antes de que
Antibitico (A), para el cual se emple solidificara totalmente se aadi un
Gentamicina y Clorofenicol, siendo insecto a cada una de las cajas y una vez
aplicado ste ltimo para producir un que quedaron completamente fijados al
efecto inhibidor en diversas especies de medio se inocularon las cajas a partir de la
aplicacin de 200 L de los diferentes Aislamiento de hongos
preinculos en cada una de las diferentes entomopatgenos a partir de muestras
especies de insectos utilizados. Se dejaron de insectos con micosis.
en incubacin a temperatura ambiente, Se sembraron al duplicado las dos
revisando crecimiento y desarrollo de los muestras de insectos recolectadas que
hongos durante cada 24 horas hasta mostraron presencia de hongos, todas ellas
identificar el crecimiento del hongo sobre resultaron positivas (100%) a crecimiento
el exoesqueleto de los insectos. en medio mnimo de sales enriquecido con
Pruebas de respuesta de crecimiento de cutcula de camarn al igual que en el
hongos entomopatgenos en insectos en mms-cc adicionado con antibitico, pauta
cmaras hmedas que permite suponer la presencia de
Se realiz la misma metodologa hongos entomopatgenos en las cepas
de lavado de insectos descrita en la prueba aisladas.
anterior. Posteriormente se coloc papel Pruebas de respuesta de crecimiento de
filtro estril en las cajas Petri y se adicion hongos entomopatgenos en insectos
agua destilada estril para que los papeles fijados en placas con medio de cultivo
filtro absorbieran dicha agua y se generara Se present desarrollo positivo de
un ambiente de humedad en las cajas. Se la cepa de hongos entomopatgenos en los
colocaron los insectos dentro las cajas exoesqueletos de las 3 especies de insectos
Petri, especficamente sobre el papel filtro empleadas, posterior a 72 horas de
humedecido y se procedi a la inoculacin incubacin bajo diferentes
de los cuerpos de los insectos en una concentraciones de inculo. Genera
concentracin de 100L de inculo por incertidumbre el hecho de emplear un
insecto. Se sellaron individualmente las medio slido para fijar los insectos, debido
placas con plstico parafilm y se dejaron a que el medio de cultivo puede estimular
en incubacin a temperatura ambiente, el crecimiento de las cepas por fuentes de
revisando crecimiento cada 24 horas. carbono alternas. Sin embargo, el
crecimiento presentado nicamente se
Resultados desarroll sobre el exoesqueleto de los
insectos, lo que ejemplifica la afinidad de
Aislamiento de hongos las cepas al consumo de quitina.
entomopatgenos a partir de muestras Pruebas de respuesta de crecimiento de
de suelo hongos entomopatgenos en insectos en
Se present respuesta positiva a cmaras hmedas
presencia de hongos en 4 (66.6%) de las 6 La experimentacin desarroll
muestras de suelo recolectadas. Sin resultados positivo en dos de las tres
embargo, de las 4 colonias aisladas, especies de insectos usadas para el
ninguna (0%) fue positiva a presencia de crecimiento de hongo en cmara hmeda,
hongos entomopatgenos luego de la mostrando dicho desarrollo total de
prueba de desarrollo de hongos recubrimiento del exoesqueleto a 72 horas
entomopatgenos al someterlos al medio de la inoculacin.
especfico MMS-CC-A, cuya fuente de Se debe contemplar el factor de
carbono, proveniente de la quitina, especificidad que presentan los hongos
present consumo durante la incubacin. entomopatgenos en relacin al tipo de
hospedero que infectan, es decir, es
posible que la respuesta positiva a
crecimiento de los hongos en el
exoesqueleto del insecto se deba a que
dicho insecto presenta mecanismos de
defensa contra hongos de ste tipo.
Esto permite sealar que las cepas
aisladas no se desarrollan sobre cualquier
fuente de carbono que se les presente;
muestran especificidad frente a ciertas
especies de insectos. Se muestra el
desarrollo de las cepas de hongos en
Gryllus assimilis en incubacin durante 96
horas en la Tabla 2.

Pruebas de crecimiento de hogos


entomopatgenos en gusanos cogolleros
(Spodoptera frugiperda).
La experimentacin con este
invertebrado fue por medio del uso de un
cebo (maz) inoculado con el hongo
entomopatgeno por 5 das. No se
obtuvieron resultados positivos al
desarrollo de hongos entomopatgenos
sobre su exoesqueleto, sin embargo, se
decidi hacer este estudio para comprobar
si el hongo entomopatgeno encontrado es
exclusivo en insectos artrpodos, es donde
nuevamente se retoma la importancia de la
relacin hogo-hospedero. Se observa los
resultados en la Tabla 3.
Se presentan los resultados de las pruebas en insectos a partir de las muestras de hongos entomopatgenos aislados en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados de pruebas de desarrollo de hongos entomopatgenos en medios de cultivo y exoesqueleto
de insectos.
Cepas Medios de cultivo Especies de insectos empleadas
aisladas (MMS-A)
PDA-A MMS-CC-A Gryllus assimilis Eleodes obscurus Periplaneta
americana
Cepa A

Cepa B

PDA-A, agar papa dextrosa adicionado con antibitico (gentamicina al 1%); MMS-CC-A, medio mnimo de sales adicionado con cutcula de
camarn (1%) y antibitico (gentamicina al 1%).
Gryllus assimilis, grillo negro; Eleodes obscurus, pinacates; Periplaneta america, cucaracha americana.
Tabla 2. Desarrollo de hongos entomopatgenos en Gryllus assimilis en cmara hmeda bajo accin de diferentes
cepas.
Cepas de hongos
entomopatgenos 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

Cepa A

Cepa B

Gryllus assimilis, grillo negro.


Tabla 3. Resultados de pruebas de crecimiento de hogos entomopatgenos en gusanos cogolleros
(Spodoptera frugiperda).
Husped 1 Husped 2 Husped 3

Spodoptera frugiperda, Gusanno cogollero.


Discusiones pruebas de incubacin de las cepas
La preparacin de un medio de aisladas en cebos alimento de dicho
cultivo dirigido al desarrollo de hongos gusano, a diferencia de los resultados
entomopatgenos, como el medio mnimo obtenidos por Garca et al., (2011),
de sales adicionado con cutcula de realizados en la ciudad de Durango y
camarn, result ser ptimo para el enfocados en el combate de ste gusano
desarrollo de hongos de sta ndole, al plaga en los cultivos de maz del Estado.
igual que en el trabajo realizado por Se conoce la especificidad que presentan
Castro-Franco et al., (2000), donde los hongos entomopatgenos a ciertos
identific, que puede llegar a ser un hospederos afines, por lo cual se cree que
excelente sustituto a la utilizacin de las cepas aisladas no resultan afines al
quitina pura para el desarrollo de un medio desarrollo de colonias sobre Spodoptera
adecuado para entomopatgenos, esto frugiperda. Por otro lado, se obtuvieron
frente a los costos que puede implicar excelentes resultados en el desarrollo de
adquirir el reactivo, adems de la gran colonias sobre otras especies de insectos,
facilidad con que la cutcula de camarn siendo importante sealar la afinidad a
puede ser adquirida. La utilizacin de un Gryllus assimilis, otro de los insectos
antibitico como inhibidor de crecimiento cotidianos de la regin que de igual forma
de posibles bacterias entomopatgenas llega a ser insecto plaga en diversos
tambin fue un gran factor para el cultivos como lo son del maz, trigo,
aislamiento de hongos entomopatgenos, alfalfa, entre otros vegetales.
Tae-Young et al., (2010) emple, bajo la
misma concentracin, estreptomicina y Conclusiones
estreptomicina como antibitico, adems
de dodina, un fungicida que inhibe el Se logr el aislamiento de cepas de
crecimiento de una gran variedad de hongos entomopatgenos a partir de
hongos, sin contar hongos muestras de insectos de cultivos agrcolas,
entomopatgenos, present resultados los cuales presentaban micosis, por lo que
positivos al aislamiento confiable de se esperaba una respuesta positiva al
hongos entomopatgenos. De igual forma aislamiento de ste tipo de hongos. Las
se obtuvieron buenos resultados con la cepas aisladas de muestras de suelo
utilizacin de un solo tipo de antibitico, arrojaron respuesta negativa a presencia de
pero al no emplear un fungicida que hongos entomopatgenos, indicativo de
permita volver el trabajo an ms que resulta mayormente compleja la
especfico a hongos exclusivamente presencia de ste tipo de hongos en suelos
entomopatgenos, es necesario verificar ajenos a cultivos agrcolas, donde no
de manera prctica la actividad de estos existe la misma presencia de insectos
hongos frente a insectos, por ello la como en problemticas de plaga. Adems,
experimentacin en el desarrollo del se corrobor el aislamiento de hongos
exoesqueleto de diversas especies de entomopatgenos a partir de pruebas de
insectos. desarrollo sobre el exoesqueleto de
Se esperaba combatir una plaga tan insectos comunes en la regin,
comn en la regin como lo es el gusano produciendo respuestas positivas a
del maz (Spodoptera frugiperda), sin micosis en las muestras en la mayora de
embargo, no se presentaron los resultados los casos. Se presentaron resultados
esperados en durante la realizacin de
negativos a especies especficas de este mecanismo contribuir a la bsqueda
insectos, lo cual indica especificidad o de cepas con caractersticas especiales y a
mayor afinidad de las cepas aisladas a establecer condiciones de proceso que
ciertas especies de insectos frente a otras. permitan la obtencin de esporas con
mayor virulencia hacia determinado
Trabajos a futuro insecto e incluso insectos plaga para
combatir estas problemticas de cultivos
agrcolas. Aunado a la necesidad de
El mecanismo de patogenicidad de
conocer los tiempos de desarrollo en base
los hongos entomopatgenos es muy
cinticas de crecimiento de stos hongos,
complejo y an quedan muchas
la velocidad de consumo de su sustrato
interrogantes por responder. Es indudable
principal, la quitina, adems del desarrollo
que tal mecanismo es altamente
de un producto liofilizado o procesado que
especializado y que la relacin insecto-
pueda ser aplicado directamente en
hongo es fundamental, siendo ambos
cultivos agrcola
organismos activos. Conocer ms sobre

Referencias bibliogrficas
Asaff Torres; Y., Reyes Vidal; V., Lpez
Adams, E.B. (1988). Fungi in classical & M. de la Torre. (2002). Guerra
bicontrol of weeds, in Fungi in entre insectos y microorganismos:
Biological Control Systems, Ed. una estrategia natural para el
Burge, M.N. Manchester control de plagas. Avance y
University Press, pp. 111-124. Perspectiva 21:291295.
Alves, SB. (1986). Control microbiano de bacteria. vol. I. Williams & Wilkins,
insectos. Sao Pablo, Brasil. Baltimore.
Editorial Manole. P. 407.
Castrillo, L.A.; D.W., Roberts & J.D., Review of Entomology
Vandenberg. (2005). The fungal 39:293:322.
past, present and future: Levitin, A. & M. Whiteway. (2008).
germination, ramification and Drosophila innate immunity and
reproduction. Journal of response to fungal infections.
Invertebrate Pathology 89:45-56. Cellular Microbiology 10:1021
Charnley, A.K.; S.A. Collins. (2007). 1026.
Entomopathogenic fungi and their MacFaddin, J.F. 1985. Media for
role in pest control. In: Kubicek, isolation-cultivation-
C.P., I.S. Druzhinina (eds.). identification-maintenance of
Environmental and Microbial medical
Relationship. The Mycota IV. Marmaras, V.J.; N.D. Charalambidis &
SpringerVerlag Belin Heidelberg. C.G. Zervas. (1996). Immune
pp. 159187. response in insects: the role of
Hajek, A.E. & R.J. St. Leger. (1994). phenoloxidase in defense reactions
Interactions between fungal in relation to melanization and
pathogens and insect hosts. Annual sclerotization. Archives of Insect
Biochemistry and Physiology Tamez Guerra, P.; Galn Wong, L. J.;
31:119133. Medrano Roldn, H.; Garca
Monzn, A. (2001). Produccin, uso y Gutirrez, C.; Rodrguez Padilla,
control de calidad de hongos C.; Gmez Flores, R. A., & Tamez
entomopatgenos en Nicaragua. Guerra, R. S. (2001).
Manejo Integrado de Plagas Bioinsecticidas: su empleo,
(CATIE). produccin y comercializacin en
Pucheta Daz, M.; A. Flores Macas; S. Mxico. Ciencia UANL, 4(2),
Rodrguez Navarro & M. de la 143-152.
Torre. (2006). Mecanismo de Torres, E. (2007). Biocontrol de plagas
accin de los hongos agrcolas y enfermedades de las
entomopatgenos. Interciencia plantas, en Bolivar F. (ed. y
31:856860. comp.), Fundamentos y casos
Shah, P.A. & J.K. Pell. (2003). exitosos de la biotecnologa
Entomopathogenic fungi as moderna, 2a edicin Mxico, D.D.
biological control agents. Applied El Colegio Nacional, Academia
Microbiology and Biotechnology Mexicana de Ciencias-unam,
61:413423. Instituto de Biotecnologa;
Spardo, D. & M. L. Gullino. (2004). State Conacyt, Cibiogem, Mxico, pp
of the art future prospects of 519-524.
biological control of postharvest Vilcinskas, A. & P. Gtz. (1999). Parasitic
fruit diseases. International Journal fungi and their interactions with
of Food Microbiology 91: 185 the insect immune system.
194. Advances in Parasitology 43:267
St Leger, J. (1995). The role of cuticle- 313.
degrading proteases in fungal Vincent, F. & Wegst, G. (2004). Design
pathogenesis of insects, Ed. Can. and mechanical properties of insect
J. Bot. 73: S1119S1125. cuticle, en Arthropod Struct. Dev.
33: 187-199.