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UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC

PRACTICA N 07

ANLISIS BROMATOLGICO BSICO, ANLISIS DE PROTENAS,


DETERMINACIN DE NITRGENO EN PROTENAS POR EL MTODO DE
KJELDAHL

NDICE

Resumen2

Introduccin..2

Objetivos..2

Revisin Bibliogrfica..3

Materiales Y Mtodo.8

Resultados..

Discusiones

Conclusiones.

Bibliografa.

Cuestionario..

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I.-RESUMEN

El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos


mtodos. El mtodo Kjeldahl se basa en la determinacin del nitrgeno.

La determinacin del contenido de nitrgeno en muestras de naturaleza orgnica es


importante en muchos campos de anlisis, como los relacionados con las industrias
agroalimentaria o farmacolgica o con el medio ambiente, entre otros.

El fundamento del mtodo Kjeldahl, recogiendo el nitrgeno sobre cido brico y


valorndolo con una disolucin de cido clorhdrico o sulfrico. Tambin se explican los
clculos necesarios para obtener el porcentaje de protenas de un alimento a partir del valor
del contenido en nitrgeno obtenido.

II.-INTRODUCCIN

El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos


mtodos. La forma ms habitual es su cuantificacin de forma indirecta y aproximada, bien
a partir del contenido en nitrgeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a partir del
contenido de uno o dos aminocidos particulares que conforman la protena, fciles de
identificar y de cuantificar por su reactividad qumica especfica. Este segundo
procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace ms de 100 aos se est
utilizando el mtodo Kjeldahl para la determinacin del nitrgeno en una amplia gama de
muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el clculo del
contenido en protena. Tambin se utiliza el mtodo Kjeldahl para la determinacin de
nitrgeno en aguas residuales y suelos. Es un mtodo oficial descrito en mltiples
normativas: AOAC, US- EPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias.

El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla compleja
de protenas. Estas existen en una combinacin con carbohidratos o lpidos, que puede ser
fsica o qumica. Actualmente todos los mtodos para determinar el contenido proteico total
de los alimentos son de naturaleza emprica. Un mtodo absoluto es el aislamiento y pesado
directo de la protena pero dicho mtodo se utiliza slo a veces en investigaciones
bioqumicas debido a que es dificultoso y poco prctico

III.-OBJETIVO

Comprender los fundamentos del mtodo Kjeldahl para la determinacin


del contenido en protena de un alimento.

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IV.-MARCO TEORICO

4.1.-Protenas

Las protenas son compuestos qumicos muy complejos que se encuentran en todas las
clulas vivas, en la sangre, en la leche, en los huevos y en toda clase de semillas. Hay
ciertos elementos qumicos que todas ellas poseen, pero los diversos tipos de protenas los
contienen en diferentes cantidades. En todas se encuentran un alto porcentaje de nitrgeno,
as como de oxgeno, hidrgeno y carbono. En la mayor parte de ellas existe azufre y en
algn fsforo y hierro Las protenas son sustancias complejas, formadas por la unin de
ciertas sustancias ms simples llamadas aminocidos, que los vegetales sintetizan a partir
de los nitratos y las sales amoniacales del suelo. Los animales herbvoros reciben sus
protenas de las plantas; el hombre puede obtenerlas de las plantas o de los animales, pero
las protenas de origen animal son de mayor valor nutritivo que las vegetales. Esto se debe
a que en las protenas animales se encuentran los aminocidos esenciales, imprescindibles
para la vida del ser humano.(( Barba y col. (1992)

Las protenas son compuestos orgnicos que contienen nitrgeno; son importantes para el
mantenimiento del cuerpo animal, crecimiento, desarrollo, produccin y reproduccin. Un
ser vivo, necesita reparar tejidos desgastados y reemplazar protena perdida durante el
proceso metablico.

Para la determinacin del contenido protenico de la carne, se utiliza el factor estndar 6.25,
pero para determinacin de los productos lcteos y el huevo se emplean factores de 6.38 y
6.68, respectivamente (Stricher et al., 1999).

Funciones.
Las protenas determinan la forma y la estructura de las clulas y dirigen casi todos los
procesos vitales. Las funciones de las protenas son especficas de cada una de ellas y
permiten a las clulas mantener su integridad, defenderse de agentes externos, reparar
daos, controlar y regular funciones, etc. Todas las protenas realizan su funcin de la
misma manera: por unin selectiva a molculas. Las protenas estructurales se agregan a
otras molculas de la misma protena para originar una estructura mayor. Sin embargo,
otras protenas se unen a molculas distintas: los anticuerpos a los antgenos especficos, la
hemoglobina al oxgeno, las enzimas a sus sustratos, los reguladores de la expresin gnica
al ADN, las hormonas a sus receptores especficos, etc. (Edwards, 2007).

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4.1.1.-Clasificacin de protenas

Las protenas son macromolculas complejas que pueden constituir el 50% o ms del peso
seco de las clulas vivas y tienen un papel fundamental en la estructura y funcin de las
mismas. La masa molar de las protenas vara de unos 5,000 a varios millones de Daltons y
estn constituidas de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y algunas veces por azufre.
Son base de los procesos fisiolgicos celulares ya que a partir de ellas se regulan la mayora
de los procesos metablicos (Boyer, 2000).

Las protenas se caracterizan por su funcin y mecanismo de accin, independientemente


de sus propiedades generales, tales como tamao, forma, comportamiento anfoltico,
solubilidad, etc. Dichas funciones dependen por completo de la secuencia de los
aminocidos que la componen y es definida para cada protena.
S se cambiase un solo aminocido de la secuencia, es considerablemente probable que la
protena pierda actividad biolgica, dicha secuencia aminoacdica en las protenas est
definida por una secuencia de bases en el ADN que forma los genes (Bohinski, 1991).

4.2.-Mtodo de Kjeldahl

Fundamento: El mtodo de Kjeldahl se basa en la hidrlisis cida de la materia orgnica


de la muestra por calentamiento con cido sulfrico concentrado y sulfato de potasio en
presencia de un catalizador sulfato de cobre. El nitrgeno se reduce en la sal sulfato de
amonio, de la cual se libera con hidrxido de amonio en la forma de amoniaco y se destila.
El destilado se valora con una solucin patrn de cido clorhdrico o sulfrico.

4.2.1.-Principio del mtodo kjeldahl

En el mtodo Kjeldahl los compuestos nitrogenados de la muestra se descomponen con


cido sulfrico concentrado en caliente, transformndose el nitrgeno de la mayora de los
grupos funcionales orgnicos en amonio. Cuando la descomposicin se ha completado la
disolucin se enfra, se diluye y se alcaliniza con hidrxido de sodio concentrado. El
amoniaco liberado se destila y se adsorbe en una disolucin de concentracin conocida de
cido brico.

4.2.3.-Mtodo micro kjeldahl

La materia orgnica es digerida por la accin del H2SO4 concentrado, convirtindose en


CO2y H2O; adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el cido
como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reduccin del material nitrogenado
hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es simultneamente reducido a SO2, que se
comporta como un fuerte reductor. La digestin de la muestra es la parte ms difcil de la
determinacin, esta se acelera mediante la adicin de catalizadores como el mercurio

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metlico, el xido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cprico (CuSO4), el selenio, el


permanganato de potasio (KmO4) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se
adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullicin y disminuir
entonces el tiempo de digestin. Cuando la totalidad de la materia orgnica ha sido
digerida, se libera el amonaco por descomposicin del sulfato de amonio con un lcali
fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y recoleccin en un volumen de cido
brico, como borato de amonio. El amonio se determina por titulacin con solucin
valorada de HCl 0,1 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de
rojo de metilo, el cual en medio cido se presenta de color morado y en medio alcalino de
color verde.

V.-MARCO CONCEPTUAL

5.1.-Anlisis qumico proximal:


En alimentos consiste en determinar el contenido nutricional de los mismos, lo que incluye:
humedad, protenas, lpidos, cenizas, extracto no nitrogenado, fibra cruda y caloras, con la
alternativa de fibra dietara, segn AOAC.

5.2.-Destilacin:
La destilacin es una tcnica de laboratorio utilizada en la separacin de sustancias
miscibles. Consiste en hacer hervir una
Mezcla, normalmente una disolucin, y condensar despus, por enfriamiento, los vapores
que han producido. (ERNESTO RENE 2007)
F.A.O: Siglas correspondientes a la Organizacin de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentacin

5.3.-Mtodo kjeldahl:
Es un mtodo de anlisis qumico utilizado para la determinacin de protenas y el
nitrgeno en una amplia gama de muestras. (Urdaneta y Zambrano (2009))

5.4.-Protena de referencia:
Es una protena terica definida por la FAO con la composicin adecuada para satisfacer
correctamente las necesidades proteicas. Se han fijado distintas protenas de referencia
dependiendo de la edad, ya que las necesidades de aminocidos esenciales son distintas.
(Edwards, 2007).

5.5.-Determinacin de protenas por el mtodo kjeldahl.

La determinacin del contenido total de nitrgeno en sustancias orgnicas no se consigui


con resultados satisfactorios hasta que Jean Baptiste Andr Dumas (1800-1884) mejor, en

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1831, el complicado y tedioso mtodo propuesto por Liebig (Lpez, 2005).

Como alternativa a la determinacin del nitrgeno orgnico por combustin de lamuestra,


y tras algunos intentos fallidos, el dans Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl
(1849-1900) public en 1893 un mtodo basado en la conversin del nitrgeno en
amoniaco por va hmeda (Kirk, 2002).

Aunque el mtodo de Kjeldahl no es aplicable a muchos compuestos orgnicos


nitrogenados debido a la conversin incompleta del nitrgeno en amoniaco, tal es el caso de
los nitritos y nitratos, conduce, a resultados exactos cuando se aplica a muestras que
contienen nitrgeno protenico (Mller, 2005).

La determinacin de nitrgeno total por el mtodo Kjeldahl an hoy en da es uno de los


mtodos ms utilizados en el anlisis qumico (Souza et al., 2000; Mller, 2005).

Aceptado por la A.O.A.C. (1984), no requiere de un equipo sofisticado y se adapta con


facilidad a los anlisis de rutina de un gran nmero de muestras.

El mtodo Kjeldahl (o alguna de sus modificaciones), es el mtodo patrn para determinar


la protena contenida en cereales, carnes y otros materiales biolgicos (Matissek et al.,
1996).

5.6.- Digestin

Con las muestras desecadas y atemperadas, se pesan en papel libre de nitrgeno alrededor
de 1 g de muestra y se colocan en un tubo para digestin de 250 mL, se adiciona, 1 Kjeltab
y 15 mL de cido sulfrico concentrado.
El calentamiento se lleva a cabo paulatinamente con las temperaturas y tiempos mostrados
en la tabla 5, se toma en cuenta que, a partir de los 400C los tiempos varan debido al
tamao y naturaleza de la muestra, el tiempo real consumido por bloque de ocho muestras
es de aproximadamente 4-6 hrs, la digestin se da por terminada cuando la muestra es
totalmente lquida y adquiere un color verde esmeralda claro (ERNESTO RENE 2007)

Tabla 5. Temperaturas y tiempos utilizados para llevar a cabo la digestin de la muestra

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El equipo digestor utilizado en este trabajo de investigacin se encuentra en el laboratorio


de Nutricin en las instalaciones del Instituto de Ciencias de la Salud (ICSA) de la
Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo (UAEH).

Consta de un bloque de digestin Kjeldatherm de aluminio con capacidad para ocho


tubos de digestin. Su ptima utilizacin de la energa as como el aislamiento efectivo en
todo su alrededor proporcionan una retencin de calor uniforme.

La gradilla de aluminio cuenta con pantalla de proteccin integrada y ventana para una
observacin fcil y segura de las muestras, adems, de que dispone de dos asas aisladas
trmicamente lo que reduce considerablemente el riesgo de quemaduras por cido y
temperatura lo cual es una ventaja para el trabajo realizado.

Para llevar a cabo el control de temperatura adecuado el equipo de digestin cuenta con un
controlador electrnico de temperatura instalado lateralmente en el sistema con ajuste de
valor terico mediante teclado, pantalla digital que muestra temperatura actual y
seleccionada y un intervalo de temperatura de 0 a 430C con una precisin menor a 0.5%.
(Otero, M. 2000)

Bloque de digestin Kjeldatherm (Gerhardt, 2000)

Conforme se aumenta la temperatura, el cido comienza a desprender gases, por ello,


anteriormente la digestin se llevaba a cabo bajo una campana de extraccin.

Los problemas de seguridad que presenta esta tcnica y por cuestiones ambientales el
sistema cuenta con una unidad depuradora Turbosog (Figura 15) que se utiliza para la
aspiracin y neutralizacin de vapores de cido pasndolos por agua destilada y despus se
neutraliza con una solucin de hidrxido de sodio al 10% p/v.

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5.7.-Destilacin

Despus que se lleva a cabo la digestin, los tubos se dejan enfriar hasta alcanzar
temperatura ambiente, se desconectan de la unidad depuradora y se colocan uno a uno en el
sistema de destilacin con valoracin integrada que se muestra en la figura17, Vapodest
50 (Gerhardt, 2000).

Sistema de destilacin con valoracin integrada Vapodest 50 (Gerhardt, 2000).


Este equipo cuenta con sistema de adicin de agua e hidrxido de sodio automtico, as
como control de tiempo y potencia de vapor y la determinacin se lleva a cabo mediante
diferencia de pH.

Para el presente trabajo se utilizaron valores predeterminados de volumen de soluciones y


potencia, que se programaron directamente en la memoria del equipo, lo que nos permiti
obtener una reproducibilidad en los resultados.
(Otero, M. , 2000,)

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La utilizacin de este tipo de destilador es segura debido a que cuenta con una puerta de
proteccin contra salpicaduras, adems de que todos los elementos de vidrio se encuentran
montados de forma visible lo cual facilita la observacin de la destilacin en marcha.
Este sistema cuenta con un sensor que permite que las destilaciones se inicien slo cuando
los tubos estn colocados correctamente. El generador de vapor, trabaja automticamente
con control de presin (GALDMEZ, M. Y OTROS)

5.8.-Titulacin

Para la titulacin es necesario contar con una solucin cido clorhdrico estandarizada 1N.
El contenedor de la solucin de cido brico denominado reservorio est conectado al
equipo destilador en donde la celda detector de pH debe registrar una medida igual a 4.6 +
0.01.

Cuando comienza la destilacin el amoniaco liberado y condensado cae en dicho


contenedor y es agitado, al combinarse con el cido brico se forma el in hidrgeno
borato, base relativamente fuerte, que produce un incremento en el pH de la solucin, el
incremento es detectado por el electrodo de pH y cuando el incremento es igual a una
unidad de pH, automticamente inicia la adicin de la solucin de cido clorhdrico 1N.

La destilacin de detiene y la adicin de cido clorhdrico contina hasta que el electrodo


detecta nuevamente un pH= 4.6 +0.1, ah se da por terminada la titulacin, por ltimo el
sistema procesa los datos obtenidos, enva la seal y el resultado aparece en la pantalla
expresado en porcentaje de nitrgeno. La adicin de cido se lleva a cabo mediante una
bomba de micro dosificacin integrada en el equipo destilador. (GALDMEZ, M. Y
OTROS,)

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VI.-MATERIALES

1 matraz de digestin Kjeldahl con capacidad de 125 ml.


1 matraz de Erlenmeyer de 10 ml.
1 matraz volumtrico de 100 ml.
1 mechero de Bunsen.
2 pinzas (nueces).
1 soporte universal
1 pipeta de 5 ml.
1 pipeta de 10 ml.
1 frasco gotero de 25 ml.
1 frasco lmbar con capacidad de 1 litro.
1 piseta grande con agua destilada.
1 microbureta.
3 cuerpos de ebullicin.
1 par de guantes de asbesto.
1 pinzas largas.
1 embudo de cristal chico o mediano.

EQUIPO

Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).


1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo).

REACTIVOS

Verde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%.


Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%.
cido brico al 2%.
cido clorhdrico 0.01N (solucin valorada).
Hidrxido de sodio al 30%.
cido sulfrico concentrado.
Mezcla catalizadora para la digestin: 2.5 g de dixido de selenio + 100 g de sulfato
de potasio + 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada por la
coordinacin de laboratorios).

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VII.-PROCEDIMIENTO

DIGESTIN

Se pes 0.15g de harina de lenteja y haba en un matraz de micro-Kjeldahl


cuidando que la muestra no se adhiera a las paredes o al cuello del matraz.
Aada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullicin y aproximadamente 1.0 g de
mezcla catalizadora.
Someta a digestin la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo una campana de
extraccin, con el matraz ligeramente inclinado usando baja temperatura al inicio y
aumentando el calor a medida que procede la digestin, rotando los matraces de vez
en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestin terminar
cuando el color de la muestra sea azl-verde claro. El proceso tomar
aproximadamente 90 minutos.
Enfre el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al solidificarse la
muestra.
Aada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida. Mezcle y
permtale enfriarse.

DESTILACIN

Encienda la unidad destiladora.


Si es posible ajuste la velocidad de destilacin a aproximadamente 5 ml. por minuto
Abra la llave del agua para tener H2O circulando por el refrigerante todo el tiempo.
Aada la muestra a la cmara de ebullicin por medio de un embudo (para recuperar
las perlas de ebullicin) y enjuague el matraz con aproximadamente 5ml. de H2O
destilada.
Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de cido brico y 2 gotas de indicador bajo
la salida de destilacin.
Aada aproximadamente 10 ml. de la solucin de NaOH a la cmara de ebullicin
lentamente. La mezcla digerida se tornar oscura (azl-gris o caf oscuro). Si no
cambia de color aada ms NaOH.
Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.
Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El destilado estar
listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor.
Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagando la cmara
de ebullicin varias veces con agua destilada. Cada vez que se aada agua destilada
hasta llenar la copita superior de la unidad destiladora para el enjuague deje que sta

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hierva primero. Luego abra la llave de la parte que permite salir las muestras hacia
fuera de la unidad destiladora. Una vez vaca la parte en donde se procesa la
muestra asegrese de que est bien vaca. Si queda todava un poco de agua en el
fondo permita que hierva para que se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad
destiladora. El matraz estar listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada
para lavar la unidad destiladora. Esta operacin se repite al menos unas 4 veces.

NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conduce la muestra


procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posicin horizontal) durante el
procesamiento de la muestra. Slo se abre cuando se enjuaga el destilador.

TITULACIN

Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de la
titulacin. Comprese este color con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado
corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en la muestra original.
El peso del N en mg est dado por miliequivalentes del cido X 14 (el peso
equivalente del N).

VIII.-CALCULOS Y RESULTADOS

Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra

% N = NHCl x Volumen de cido corregido x 14 g N x 100


g de muestra mol

En donde:

NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml.


Volumen del cido corregido = (ml. del cido estandarizado para la muestra) - (ml.
de cido estandarizado para el blanco).

14 = Peso atmico del nitrgeno.

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Para la lenteja:

Gasto = 3,7 de Hcl

% N = N x 14 x V x100 = 0.1 x 14 x 3.7 x 100


M x 1000 0.15 x 1000

%N = 3.45

%P = %N x F

%P = 3.45 x 5.7

%P = 19.68%

Para la haba:

% N = N x 14 x V x100 = 0.1 x 14 x 5.2 x 100


M x 1000 0.15 x 1000

%N =

%P = %N x F

%P = x

%P = %

IX.-DISCUSIONES:

Sin embargo, el mtodo de Kjeldahl sigue siendo el de referencia para la cuantificacin de


protenas de la leche (Barbano y Lynch, 1990),

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X.-CONCLUSION:

El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico


concentrado, formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera
amonaco, el que se destila recibindolo en:

a) cido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado


con hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo.

b) cido brico formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico.

Existe una gran necesidad del anlisis de protenas con el fin de obtener el contenido
proteico total, composicin de aminocidos contenido de alguna protena particular,
contenido proteico durante el aislamiento y purificacin de una protena, nitrgeno no
proteico y valor nutritivo relacionados con un alimento especfico a analizar.
Constituyen fuentes de error en del mtodo de Kjeldahl son: la inclusin de nitrgeno
no proteico como parte de la protena; la prdida de nitrgeno durante la digestin, la
digestin incompleta de la muestra.

Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al cido (para
elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una descomposicin por calor y la
consecuente prdida de amonaco; generalmente se recomiendan temperaturas de
digestin de 370-410C.

XI.-BIBLIOGRAFIA
1. bonilla, g. 1997,estadstica ii, mtodos prcticos de inferencia estadstica, 4 edicin.,
uca editores. vol. 2.

2. fajardo, m. y otros, 1995, aceptabilidad de tortillas elaboradas a base de maz y soya en


tres comunidades del oriente de guatemala, universidad de san carlos, guatemala.

3. figueroa, c. y otros, 2001, fortificacin y evaluacin de tortillas de nixtamal, vol.51,


no.3, p.293-302.cuba.

4. galdmez, m. y otros, 2002 desarrollo de producto extrudo (nacho) fortificado con


hierro a partir de smola de malanga y posible inclusin en escuela saludable, facultad de
qumica y farmacia, ues, el salvador.

5. martnez c., 1974, estudio bromatolgico de la colocasia sculenta (malanga) cultivada


en el salvador como fuente de nutricin, facultad de qumica y farmacia, ues, el salvador

XII.- CUESTIONARIO

1. mencione los mtodos oficiales que se puede emplear para determinar


protenas en diferentes alimentos, adems descrbelos cada uno de ellos?

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Mtodo volumtrico de sorensen pool: Se basa en que el formaldehido va a actuar


bloqueando los grupos aminos, dando como resultado la liberacin de los grupos carboxilos
con el consiguiente aumento de la acidez, la cual se valora con NaOH al 0.1N.

Mtodo de Lowry.

Preciso para la determinacin de concentraciones proteicas es probablemente el mtodo de


hidrlisis cida. La mayor parte de los otros mtodos son sensibles a la composicin de
aminocidos de las protenas y no pueden ser obtenidas concentraciones absolutas. El
procedimiento de Lowry no es la excepcin, pero es sensiblemente constante de protena a
protena, lo cual ha hecho que sea ampliamente usado y que las determinaciones sean una
alternativa completamente aceptable con un rigor absoluto en todas las determinaciones en
casi todas las circunstancias en donde se involucren mezclas de protenas o extractos
crudos.

Mtodo de Kjeldahl

El mtodo de Kjeldahl se basa en la hidrlisis cida de la materia orgnica de la muestra


por calentamiento con cido sulfrico concentrado y sulfato de potasio en presencia de un
catalizador sulfato de cobre. El nitrgeno se reduce en la sal sulfato de amonio, de la cual
se libera con hidrxido de amonio en la forma de amoniaco y se destila. El destilado se
valora con una solucin patrn de cido clorhdrico o sulfrico.

Mtodo de Dumas

Se caracteriza por pirlisis completa de la muestra y medicin del contenido de nitrgeno


de los gases de combustin.

El nitrgeno puede ser medido con manmetro despus de absorber el dixido de carbono
en una solucin alcalina o por conductividad trmica en mtodos automatizados.

Mtodos qumicos

Las protenas presentan un amplio rango de comportamiento qumico debido a la propiedad


de los aminocidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a las reacciones
qumicas de estos grupos y a los enlaces peptdicos.

Mtodo de Biuret

Principio qumico

La reaccin se caracteriza por una coloracin prpura cuando los iones cpricos son
complejados por los enlaces peptdicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo
de protena y su intensidad depende del contenido de protena presente.

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b) Mtodo "dye-binding"

Principio qumico

Se caracteriza por la formacin de un cogulo de protena, coloreado e insoluble producto


de la reaccin de la protena con una solucin coloreada de cido sulfnico a pH 2. El
anin coloreado se une por asociaciones electrostticas a los sitios bsicos de la protena,
por ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y
aminos terminales. Adems se producen atracciones intermoleculares por interacciones
hidrofbicas entre la protena y la mitad no inica del anin y entre el anin unido a
protena y la mitad no inica del anin en solucin.

El cogulo se separa por filtracin y se mide colorimtricamente el exceso de tintura en el


sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de protena.

Mtodos fsicos

Son ms simples, rpidos y el costo por anlisis es menor aunque el costo de los equipos es
elevado. La exactitud de estos mtodos se relaciona con las caractersticas del material a
analizar. La concordancia con nitrgeno total depende de que el material no vare de
muestra en muestra.

a) Espectroscopa infrarroja

Se aprovecha la absorcin del grupo amida del enlace peptdico a 6,46 Tm.

Ventajas

Rpido, anlisis de multicomponentes No destructivo.

Desventajas

Interferido por agua.


Proceso de calibracin complejo.

b) Espectroscopa infrarroja reflectante

La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiacin infrarroja (0,75-
2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.

Es necesaria la calibracin contra un conjunto de muestras estadsticamente significativas,


analizadas por mtodos de referencia tradicionales.

c) Espectrofotometra ultravioleta

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Mide protenas en solucin con absorcin mxima a 280 nm atribuible a los anillos
aromticos de tirosina y triptfano y entre 180-220nm.

d) Mtodos refractomtricos

Mide la refraccin directa de la protena en solucin o el cambio de ndice de rafraccin


causado por la remocin de la protena de la solucin.

e) Mtodo turbidimtrico

Mide la reduccin de la intensidad de la luz al pasar por una suspensin de partculas de


protenas. Este cambio se relaciona con el contenido de protena.

f) Espectroscopa electrnica

Irradiacin del material con rayos X y cuantificacin de los fotoelectrones liberados


caractersticos al tomo de N del grupo amida de la protena.

2. Cul es la finalidad de agregar al proceso de digestin mezcla catalizadora?


3. Dibuje y detalle el equipo kjeldahl utilizado el proceso de digestin
4. Dibuje y detalle el equipo kjeldahl utilizado el proceso de destilacin

5. Mencione las desventajas que incurre el mtodo utilizado en la practica.


Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.

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XIII.-ANEXOS

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