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Biocaracterización

SECUENCIACIÓN DE ADN

Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido.
Un polímero es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre sí, como si
fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagón es un nucleótido, y cada nucleótido,
a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser
adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como enganche de
cada vagón con el siguiente. Lo que distingue a un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base
nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando solo la secuencia de sus bases.
La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los
cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la información genética: por
ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC...

El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos.

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN se necesitan los siguientes
compuestos:

 El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Además, debe estar en estado
de hélice sencilla.
 Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4, ya
que va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".
 Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de
longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos.
 Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), son los nucleótidos
precursores utili para incorporar la base nitrogenada adenina al DNA durante el proceso de
replicación de
 Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los
nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la
posición 3' de la desoxirribosa. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido didesoxi se
termina la síntesis de la cadena de ADN.

Preparación de la muestra

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada
mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN
polimerasa I, un cebador marcado con un fluorocromo y un nucleótido didesoxi, por ejemplo
ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo)
competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando,
produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora.

Breve descripción del método automático de secuenciación

En el método automático se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción,
cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema
permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva
síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.

La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo
tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han

permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y. Geometría del equipo El Analizador Genético AB 3130 consta de:  Unidad de Electroforesis Capilar con placa de calentamiento capaz de controlar la temperatura desde 18ºC hasta 65°C.sido detectados se dejan escapar del gel. capaz de obtener secuencias de hasta 1000 bases.  Fuente de alimentación que controla la tensión hasta 20. .5 nm. En 24 horas pueden ser procesadas hasta un máximo de 150 muestras. en cada secuenciación. Equipos secuenciadores Dispone de un equipo ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer de 16 capilares de 80cm de longitud.  Unidad óptica compuesta por un laser de argón iónico con potencia de 10mV y con líneas espectrales de 488 nm y 514.000 voltios. El siguiente esquema representa de forma abreviada el método automático de secuenciación. por consiguiente.  Un detector simultáneo de distintas emisiones de fluorescencia con capacidad de detección de hasta 5 fluorocromos.

* Programa de Análisis de Fragmentos. Monitor color de 17 pulgadas.  Un sistema de control de temperatura de los capilares que asegura la máxima reproducibilidad.. unidad lectora CD-ROM (40x).  Un Soporte electroforético de 4 capilares de 50 micras. Dispone de dos estrategias de marcaje fluorescente de fragmentos de ADN: Marcaje fluorescente del cebador con cuatro posibles fluorocromos diferentes y marcaje fluorescente de los nucleótidos. Unidad de detección compuesta por cámara CCD que recoge en multi-frecuencia todas las emisiones de fluorescencia de 514 a 680 nm  Sistema de excitación de doble haz óptico. * SeqScape: contiene funciones de llamadas da base de datos..  Ordenador PC con procesador Pentium 4. BTG. Bases de datos * Programa SeqScape v2. que se rellenan de forma automática. ensamblando las secuencias y realizando el alineamiento de las mismas. unidad grabadora de CD’s. 1GB de RAM.5: permite el uso de herramientas de comparación de secuencias e identificación y descubrimiento de SNP’s. y 80 cm... 36 cm. que compensa la diferencia de energía a lo largo de los 4 capilares y proporciona así una mayor sensibilidad en la detección de las distintas emisiones de fluorescencia en todas y cada una de las muestras. sistema operativo Windows® XP. tarjeta Ethernet e impresora color Manejo de datos El AB 3130 Genetic Analyzer incluye el control del sistema y el análisis de los datos que se realiza mediante los programas cargados en una WorkStation en Windows® XP lo que permite que el equipo funcione sin intervención del usuario de forma automática y continuada durante las 24 horas alcanzando una capacidad de procesamiento de muestras mayor de 144 secuencias ó 144 análisis de fragmentos diarios. disponible en 22 cm. 50 cm. Consumibles Calibración espectral/Generación de la matriz Antes de realizar un análisis del tamaño de los fragmentos de ADN es necesario realizar una calibración espectral con las cinco etiquetas fluorescentes 6-FAM. 2GHz. dos discos duros de 36 GB. BTR y BTO para cada . BTY.  Cargador automático de muestras compuesto por una bandeja de 96 ó 384 pocillos y un sistema automático de inyección electrocinética de los fragmentos de ADN.

Preparación de los estándares de la calibración espectral 2. La calibración espectral incluye los pasos siguientes: 1. Definición de la composición de la placa en el editor de placas (“Plate Manager” [Administrador de placas]) 5. PCR La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias de una región particular de ADN. La Taq polimerasa . Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador. el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo. Creación del protocolo del instrumento para la calibración espectral (“Protocol Manager” [Administrador de protocolos]) 4. podría ser un gen cuya función quiere entender un investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.analizador. La calibración crea una matriz que se utiliza para corregir la superposición de los espectros de emisión de fluorescencia de los colorantes. Carga de los estándares en la placa de reacción de 96 pocillos (una muestra por capilar) 3. Realización de un ciclo de calibración espectral y comprobación de la matriz Costos Ubicación Personal encargado Ejemplo En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Por lo general.

la polimerasa los extiende y la región que se encuentra entre ellos se copia. o amplificada. Cuando los cebadores se unen al molde. cebadores. La PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN. ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los pasos básicos son: . y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). se determina por los cebadores que el o la investigadora elija. Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla. En una reacción de PCR. Los ingredientes se colocan en un tubo. la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un cebador. Es decir. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa. Cebadores para PCR Al igual que otras ADN polimerasas. Los pasos de la PCR Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa. la región de ADN que será copiada. les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar. junto con los cofactores que necesite la enzima. Es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica.

El nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN. en el caso de pruebas . Templado (55 . Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa flotando en la reacción.Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar. Este ciclo se repite 25 – 35 veces en una reacción de PCR típica. las cadenas de ADN. El sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del crimen para este marcador es el #3). Aplicaciones La PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal. (Ejemplo en la imagen: Examinar un marcador genético determinado y ver si alguno de los tres sospechosos coincide con el ADN del cabello para este marcador. según la longitud de la región de ADN que se copia. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN. o desnaturalizar. Manejo de datos Habitualmente. por lo que el número de moléculas de ADN casi puede duplicarse en cada ciclo. que generalmente tarda 2 – 4 horas.65°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al usar electroforesis en gel. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento exponencial.

610 nm (LC Red 640). •Disponibilidad de un instrumento LightCycler de back-up (en las instalaciones de Productos Roche). Para otros equipos se ocupan kits de soluciones de calibración. La utilización de tubo capilar permite alcanzar las temperaturas rápidamente en el interior del tubo de reacción.prenatales). y 710 nm (LC Red 705). Consumibles  Pipetas. . Sensibilidad y Especificidad. 560 nm ((LC Red 640). PCR en tiempo real En comparación con las técnicas convencionales de amplificación es la posibilidad de realizar una amplificación semi-automatizada. La unidad óptica del Sistema LightCycler contiene seis canales de detección: 530 nm (SYBR Green I y Fluoresceina).  Verificación de la especificidad de los amplicones y detección de mutaciones.  Reproducibilidad. Los procesos de calentamiento y enfriamiento del aire son controlados alternando el calor y el aire del ambiente como medio de transferencia de temperatura. Calibración No necesita calibraciones ni validaciones en ningún momento de la operación.  Disminución de la contaminación: los procesos de amplificación y detección se realizan simultáneamente y en el mismo tubo capilar. Gracias a la baja masa del aire es posible obtener muy rápidas transiciones de temperatura dentro de la cámara térmica.  Disminución del tiempo de procesamiento de la reacción de PCR: 30-40 ciclos de reacción de la PCR se realizan en 20-30 minutos. es posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de sangre o tejido. puntas. para ser utilizado en caso que la reparación del instrumento de la institución/usuario requiera del retiro de su propio instrumento. Esto significa que se puede evitar pasos adicionales necesarios para visualizar el producto de amplificación y se reduce el riesgo de contaminación por manipulación posterior a la PCR.  Material para electroforésis Encargados Ventajas  Visualización del proceso de amplificación cuando éste se va produciendo: la medición de la fluorescencia on-line a tiempo real permite ver los resultados de cada ciclo de PCR. La PCR también puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente. combinado con un micro-fluorímetro que utiliza un sistema óptico de alta calidad Rodenstock. •Servicio de Atención Profesional (Call Center (0-810-810-5650) y Servicio Técnico propio y especializado entrenados en casa matriz. Equipo El Sistema LightCycler es un termociclador veloz que realiza amplificación y detección en forma simultánea. tubos. 640nm (LC Red 640). 670 nm (LC Red 705).

Las enzimas que se utilizan en estos estudios se clasifican de acuerdo a su función y se representan con una sigla de tres letras. no obstante permanecen como caracteres útiles en la identificación de materiales dado que representan un conjunto de caracteres que pueden ser evaluados con métodos sencillos y a bajo costo. pero como su composición de aminoácidos varía. MARCADORES GENÉTCOS Un marcador genético es un segmento de ADN con una ubicación física conocida en un cromosoma. es decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de ADN (mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la composición de aminoácidos. pero cuya localización aproximada es conocida. 1.Limitaciones  La muestra clínica no es adecuada para este análisis  El ADN no es adecuado para PCR (debido a la presencia de inhibidores de PCR o por el uso de un método de extracción no apropiado). Los marcadores genéticos pueden ayudar a vincular una enfermedad hereditaria con el gen responsable. tamaño o altura. Los segmentos de ADN que se encuentran cerca en un cromosoma tienden a heredarse juntos. se han utilizado varios tipos de marcadores: morfológicos. Marcadores morfológicos Son características fenotípicas de fácil identificación visual tales como forma. Por ejemplo: . Si estos cambios se producen. podrían tener diferente carga neta y por tanto diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Un marcador ideal debe ser:  altamente polimórfico o variable dentro y entre especies. los marcadores morfológicos presentan algunas limitaciones. isoenzimas. Muchos de ellos se convierten en importantes “descriptores”. Tipos de marcadores genéticos En los análisis genómicos. proteínas y marcadores basados en ADN. Isoenzimas Se definen como diferentes formas moleculares de un tipo de enzima. las proteínas podrían tener la misma actividad biológica. Como se describió anteriormente.  de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes). que poseen una actividad catalítica común. color. El marcador genético en sí puede ser parte de un gen o puede no tener ninguna función conocida.  de rápida identificación y simple análisis  de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo.  El kit no se ha almacenado correctamente. a la hora de inscribir nuevas variedades. 2. Los marcadores genéticos se utilizan para rastrear la herencia de un gen cercano que aún no ha sido identificado. Estas diferencias determinan patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas.  insensible a los efectos ambientales.

que puede o no corresponder a un gen. • isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) • transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Debido a que las proteínas de reserva carecen de actividad enzimática. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Existen diversas técnicas de biología molecular disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. se basa en el hecho que las proteínas de diferentes individuos. • deshidrogenasas (alcohol deshidrogenasa ADH. 3. sistemática y biología evolutiva así como en identificación de variedades. • oxidasas (peroxidasas PRX). Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura genética. poblaciones y especies son homólogas. ADN y marcadores moleculares Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma. Almidón y proteínas son las dos macromoléculas más importantes. las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares. 4. las enzimas de restricción. glutamato deshidrogenasa GDH). la separación electroforética de los fragmentos de ADN. • hidrolasas (fosfatasas ácidas ACP. y que al separarse en un gel producirán bandas similares o diferentes. y cubrir la totalidad del genoma de un organismo. esterasas EST). Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos: Aplicaciones . Proteínas de reserva El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. El uso de proteínas de almacenamiento en estudios de diversidad genética sistemática. ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas generales de teñido.

dATP: 259 nm. Para evaluar la pureza de la muestra debe determinarse la proporción OD 260nm/OD 280nm. 3) Para analizar la pureza de la muestra. Cuantificación de ácidos nucleicos en solución 1) Tomar 2 µl de la muestra de ácidos nucleicos y agregar 98 µl de agua desionizada. Este método proporciona una estimación simple y precisa de la concentración de una muestra.6 puede estimarse que la muestra es lo bastante pura para confiar en la cuantificación espectrofotométrica. hacen que la contribución de estas dos vías al flujo total varíe de acuerdo a la especie.Ejemplo Estimación del flujo génico El flujo génico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. CUANTIFICACIÓN Luego de la extracción del ADN. Determinar la relación de OD a 260nm / OD a 280 nm. sin contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a longitudes de onda cercanas. Uno de los métodos más utilizados para la cuantificación del ADN es el análisis de la absorción UV. Si es menor a 1. La morfología de semilla y polen. Mezclar y transferir a una cubeta. dCTP: 272 nm.6 a 2) la absorción es mayoritariamente debida a ácidos nucleicos. pero sólo si ésta se encuentra pura. 2) Medir en el espectrofotómetro la densidad óptica (OD) a 260 nm. etc. dTTP: 247 nm). hay proteínas u otras moléculas que absorben a la misma longitud de onda en la muestra y es recomendable una re-extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol o isopropanol. ya que los nucleótidos poseen máximos de absorción alrededor de 260 nm (por ejemplo. son necesarias la cuantificación y el análisis de la calidad de las moléculas obtenidas. Los marcadores moleculares permiten cuantificar cada uno de estos procesos.. Si ésta es aproximadamente 2 (de 1.6. . Si la relación es mayor a 1. tomar una segunda lectura a 280 nm. el tipo de polinización. los mecanismos de dispersión.

El sistema aloja una amplia gama de muestras. RFLPs y purificación y caracterización de proteínas. permitiendo análisis de imágenes y documentación de digestiones de restricción. ácidos nucleicos amplificados. El sistema es fácil de usar y permite capturar imágenes en tiempo real y verlas directamente en un PC. El sistema Gel Doc XR + es controlado por el software Image Lab ™ para optimizar el rendimiento de la imagen para una captura de imagen rápida. desde grandes geles de poliacrilamida a mano. Estas opciones flexibles de iluminación hacen que sea adecuado para generar imágenes de una amplia variedad de muestras fluorescentes. purificación y sistemas de electroforesis. además es posible producir imágenes de geles de electroforesis teñidos El sistema Gel Doc XR + se basa en la tecnología de detección CCD de alta resolución y alta sensibilidad y en opciones modulares para acomodar una amplia gama de muestras y soportar múltiples métodos de detección incluyendo fluorescencia y detección colorimétrica. huellas genéticas. . hasta pequeños geles ReadyAgarose ™ y varios blots. Para la determinación de la cantidad de proteína existen varios métodos para su identificación: FOTODOCUMENTACIÓN El sistema proporciona imágenes digitales de alta resolución para la documentación de geles.Cada tipo de cuantificación posee un protocolo en particular para la preparación de la muestra. integrada y automatizada y el análisis de varias muestras. El sistema es un acompañamiento ideal para PCR.

blots y macroarrays con unos pocos clics del ratón. cámara CCD y lente motorizada controlada por software. El sistema soporta fluorescencia y métodos de detección colorimétricos. iluminadores de luz UV y blanco. Usando algoritmos propietarios. garantizando al mismo tiempo la seguridad del usuario • Análisis cuantitativo exhaustivo y automatizado de muestras de proteínas y ADN en segundos • Personalizar y organizar los datos en los informes Calibración El sistema optimiza la reproducibilidad y fiabilidad de los datos experimentales. No se requiere entrenamiento • Guardar y recuperar todos los pasos del flujo de trabajo para obtener resultados repetibles y reproducibles • Optimice el sistema en la configuración para obtener datos de imagen siempre precisos. SYBR ® Safe y SYBR ® Green I •Mantener los procedimientos operativos estándar o los criterios para el rendimiento de la muestra ya que no hay pérdida de sensibilidad en comparación con la tinción con UV y el bromuro de etidio Aplicaciones:  Fluorescencia  Colorimetría/densitometría . permitiendo comparaciones cuantitativas entre diferentes experimentos. manos libres. El sistema le permite: •Aumentar la eficacia de la clonación y la producción de proteínas mediante la protección de las muestras de electroforesis de ADN de la exposición a los rayos UV utilizando la pantalla de conversión XcitaBlue ™ y las manchas excitables con luz azul como GelGreen. reproducibles y libres de artefactos de imagen • Amplia gama de aplicaciones con accesorios especiales para preservar la integridad de la muestra para la investigación posterior.Características y beneficios del sistema Gel Doc XR + • Las imágenes y análisis de gel y blot son rápidos y precisos • Rutinas automatizadas. independientemente del nivel de zoom o de la posición de la muestra  La corrección de alineación plana apropiada se aplica de forma automática y consistente a los datos de imagen para cada aplicación  Los artefactos de imagen se corrigen automáticamente El Gel Doc XR + System permite una visualización rápida y sencilla. documentación y análisis de geles de ácidos nucleicos y proteínas. Componentes: El sistema Gel Doc XR + consta de un capó de cámara oscura. este sistema de imagen se calibra en la instalación para asegurar:  Las imágenes están enfocadas en todo momento. filtro deslizante con filtro estándar y escudo de protección UV.

7. Enfocar. Apagar la luz ultravioleta y abrir la puerta para poder sacar el gel. Cerrar la puerta. 11. 10. Prender la luz ultravioleta del fotodocumentador. 8. Tomar foto y guardarla en una memoria externa. los valores de las bandas del marcador molecular. 5.  Documentación de geles Visualización del gel 1. etiquetar los carriles con respecto a la muestra de DNA. Abrir la puerta del fotodocumentador. Inicializar el programa para la visualización de geles de agarosa. trans white. 4. 3. epi-white Costo Técnico encargado . Desechar el gel en un contenedor para residuos con bromuro de etidio Tamaño máximo de la muestra: 28x26 cm Iluminación: trans-UV. Visualizar la imagen en la pantalla de la computadora. 6. Con la ayuda de una espátula de plástico se coloca el gel en el fotodocumentador. Prender la computadora conectada al fotodocumentador. 2. 9.