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Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

Yazmn Cuervo Usn


Marcos Espadas Resndiz
Gloria de los ngeles Zita Padilla

FITOPATOLOGA
(MANUAL DE PRCTICAS DE
INGENIERA AGRCOLA)
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRCOLAS
SECCIN DE SUELOS, SANIDAD Y MAQUINARIA

FITOPATOLOGA
(Manual de Prcticas de Ingeniera Agrcola)

Asignatura: Fitopatologa
Clave de la Asignatura: 2222

Carrera: Ingeniera Agrcola


Clave de la carrera: 222

Autores:

Yazmn Cuervo Usn


Marcos Espadas Resndiz
Gloria de los ngeles Zita Padilla
ndice
Introduccin 7
Objetivos 8
Reglamento Interno de los Laboratorios del Departamento de Ciencias 9
Agrcolas
Relacin de prcticas 14
Relacin de anexos 14
Material necesario para las prcticas 15
Manejo de los residuos biolgicos peligrosos 15
PRCTICA 1. Mtodos de colecta 17
PRCTICA 2. Preparacin de medios de cultivo y tcnicas de 25
aislamiento de microorganismos
PRCTICA 3. Identificacin de bacterias fitopatgenas 33
PRCTICA 4. Identificacin de hongos fitopatgenos 39
PRCTICA 5. Identificacin de nematodos fitopatgenos 43
PRCTICA 6. Identificacin de sntomas en plantas enfermas 49
PRCTICA 7. Control biolgico 57
ANEXOS 61
Anexo I. Proyecto semestral 63
Anexo II. Elaboracin de medios de cultivo 65
Anexo III. Purificacin de partculas virales 73
Anexo IV. Microcultivo 75
Anexo V. Medida de estructuras de agentes fitopatgenos con 79
microscopio ptico
Anexo VI. Cuantificacin de la concentracin de inculo 81
Introduccin
La Fitopatologa, como una ciencia de fines prcticos, podra considerarse relativamente
joven. Si bien es cierto que desde la poca antigua todas las culturas se interesaron en el
conocimiento de las enfermedades de las plantas y su control (aplacando la ira de los dioses
con sus sacrificios y ofrendas), es slo hasta mediados del siglo XIX cuando su estudio se
intensifica, primero con el descubrimiento de los agentes causales de las enfermedades y el
desarrollo de la metodologa para su estudio y, despus, ensayando medidas preventivas al
iniciarse la produccin masiva de alimentos.

En la actualidad esta ciencia ha adquirido una importancia relevante, porque su eficiente


conocimiento y aplicacin redundan en una mayor produccin alimenticia, tan importante
para mantener el nivel y estabilidad de vida de un pueblo.

Al ser la Fitopatologa la ciencia que estudia las enfermedades de las plantas, sus agentes
7
causales, su interaccin con los hospederos, as como su sintomatologa y medios de con-
trol, es notorio el papel que desempea dentro de esta ciencia el trabajo de gabinete; es decir,
el anlisis de laboratorio, debido a que es en este lugar donde se establece el conocimiento
de cada uno de los enunciados anteriores.

El objeto del laboratorio es el adiestramiento en las principales tcnicas de colecta, cultivo,


identificacin e inoculacin de los organismos causales de las enfermedades de las plantas.
El presente manual tiene la intencin de brindar a los alumnos la mnima informacin ne-
cesaria en el trabajo prctico de la Fitopatologa, tratando siempre de establecer la relacin
hospedero-patgeno, al aportarles el conocimiento bsico para que en un futuro puedan
diagnosticar cuando un cultivo est enfermo o daado, y tengan nocin de los mtodos y
tcnicas de control que podran emplear para lograr una mejor produccin.

FITOPATOLOGA
OBJETIVO GENERAL DEL CURSO
Que los alumnos sean capaces de reconocer los principales agentes causales de enfermeda-
des en las plantas (abiticos y biticos), saber manejar de forma adecuada la terminologa
y metodologas fitopatolgicas, discriminar entre los mecanismos de control ms efectivos
para una enfermedad determinada y describir el ciclo de las enfermedades.

OBJETIVOS DEL CURSO EXPERIMENTAL


8 Preparar a los alumnos en los principales mtodos de colecta, elaboracin de medios de cul-
tivo, tcnicas de asilamiento, identificacin e inoculacin de los organismos causales de las
enfermedades de las plantas, para poder diagnosticar una enfermedad vegetal y recomendar
los mtodos de control que se emplean para lograr una mejor produccin.

Adquirir la destreza en el manejo de las principales tcnicas del diagnstico fitosanitario y


podr discriminar entre ellas cundo se aplican a determinado grupo fitopatgeno para su
reconocimiento y diagnstico (hongos, bacterias, nemtodos, virus).

FITOPATOLOGA
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
CUAUTITLN
SECRETARA DE PLANEACIN
DEPARTAMENTO DE CERTIFICACIN

REGLAMENTO INTERNO DE LOS LABORATORIOS DEL


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRCOLAS

CAPTULO PRIMERO. DISPOSICIONES GENERALES

Artculo 1. El presente reglamento tiene por objeto establecer las normas relativas a la orga-
nizacin y funcionamiento de los laboratorios pertenecientes al Departamento de Ciencias
Agrcolas.

Artculo 2. Para los efectos del presente reglamento, se entender por usuarios:
9
I. Los alumnos de la carrera de Ingeniera Agrcola que oficialmente se encuentren ins-
critos y cursando alguna asignatura que requiera la realizacin de prcticas en los
laboratorios, algn trabajo de investigacin o servicio social.
II. Los acadmicos de la facultad que estn impartiendo alguna de las asignaturas adscri-
tas a alguno de los laboratorios o que requieran el uso de ese espacio, previa autoriza-
cin del responsable del laboratorio.
III. Los estudiantes que al haber concluido con sus estudios y que se encuentren desa-
rrollando alguna de las opciones sealadas en el Reglamento de Evaluaciones de la
Facultad de Estudios Superiores Cuautitln para obtener su titulacin, previa solicitud
al responsable del rea en la que se est desarrollando la opcin por titulacin y que
demuestre que se necesita el laboratorio para su trabajo.
IV. Personal administrativo adscrito al laboratorio.

Artculo 3. Las disposiciones de este reglamento son de orden general y se aplicarn sin
perjuicio de las particularidades que cada laboratorio tenga, de acuerdo a las actividades
propias de cada asignatura prctica que se imparta en ellos.

FITOPATOLOGA
CAPTULO SEGUNDO. DE LA ESTRUCTURA

Artculo 4. La administracin, vigilancia y operacin de equipo especializado depende di-


rectamente del departamento de Ciencias Agrcolas a travs del responsable del laboratorio,
el cual se auxiliar para ejercer sus funciones, del personal administrativo adscrito al labo-
ratorio.

Artculo 5. El responsable de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Dirigir el laboratorio de acuerdo a su reglamento.


II. Velar por el buen funcionamiento del equipo a su cargo.
III. Coordinar las actividades acadmicas del laboratorio.
IV. Coordinar las actividades del laboratorista y del auxiliar de laboratorio.
V. Las dems funciones que le sean asignadas por el Jefe de Departamento de Ciencias
Agrcolas.

Artculo 6. El jefe de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Supervisar y controlar el funcionamiento del laboratorio.


10 II. Elaborar y presentar informes peridicos del laboratorio.
III. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin
mixta de tabuladores.

Artculo 7. Son funciones del laboratorista.

I. Mantener el material y equipo en condiciones de higiene y limpieza.


II. Llevar el inventario de material, equipo y reactivos del laboratorio, reportando al res-
ponsable de laboratorio cualquier inexistencia.
III. Reportar fallas en equipo y en el suministro elctrico, de agua, gas y vaco.
IV. Suministrar el material a los usuarios del laboratorio.
V. Cumplir el horario que se le asigne para atender a las necesidades que se tengan en el
laboratorio.
VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mix-
ta de tabuladores.

FITOPATOLOGA
Artculo 8. Son funciones del auxiliar de laboratorio:

I. Asear, lavar, esterilizar, secar y guardar el material, instrumental, equipo y mobiliario.


II. Apoyar en el levantamiento del inventario del laboratorio.
III. Proporcionar, recuperar y controlar el material, substancias, equipo e instrumental del
laboratorio, reportando faltantes, desperfectos y anomalas al responsable del labora-
torio.
IV. Asear, lavar y mantener ordenada el rea del laboratorio.
V. Trasladar mobiliario y equipo de laboratorio, instrumental y substancias a los lugares
que le sean indicados.
VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mix-
ta de tabuladores.

CAPTULO TERCERO. DE LAS RESTRICCIONES

Artculo 9. Queda prohibido dentro de los laboratorios:

I. Ingresar y consumir cualquier tipo de alimento o bebida.


II. Fumar.
III. Usar telfono celular o localizador.
IV. Cometer desorden, bullicio o cualquier acto de indisciplina que vaya en contra de la
11
Legislacin Universitaria.
V. Realizar acciones que pongan en peligro la integridad fsica de los dems usuarios
del laboratorio.
VI. Utilizar y manipular cualquier instrumento, equipo o reactivo sin autorizacin del
profesor responsable de la prctica o del responsable del laboratorio.
VII. El ingreso a toda persona ajena que interfiera con el desarrollo de las actividades que
se realizan en stos.
VIII. El almacenaje de cualquier material ajeno a las labores propias del laboratorio.

Artculo 10. Se deber respetar el horario asignado para el desarrollo de cada prctica. Los
usuarios que estn desarrollando trabajos de investigacin, servicio social u otros, no podrn
realizar trabajos durante el horario asignado a las prcticas de las materias que se impartan
en alguno de los laboratorios.

FITOPATOLOGA
CAPTULO CUARTO. DEL USO Y LOS USUARIOS DEL LABORATORIO

Artculo 11. Todos los usuarios de los laboratorios tienen los mismos derechos y obligacio-
nes.

Artculo 12. El usuario tiene la obligacin de conocer las normas del presente reglamento,
para ejercer sus derechos y cumplir con las obligaciones y responsabilidades derivadas del
uso del laboratorio.

Artculo 13. Los alumnos para poder obtener calificacin aprobatoria en el curso de ense-
anza experimental debern haber asistido durante el semestre como mnimo el 80%.

Artculo 14. Los usuarios del laboratorio tendrn derecho a utilizar el material y equipo ne-
cesario para la realizacin de sus prcticas curriculares.

Artculo 15. Los usuarios tienen el derecho de ser atendidos con eficiencia para el desarrollo
de las prcticas programadas.

Artculo 16. Los profesores que tengan programado realizar prcticas de laboratorio debe-
12 rn elaborar una lista de los requerimientos al inicio del semestre para que el responsable o
laboratorista proporcione el material solicitado en tiempo y forma.

Artculo 17. Para el uso de los equipos de laboratorio debe revisarse el manual de uso de
cada equipo y registrar el tiempo de uso en la bitcora.

Artculo 18. Para el uso del equipo de laboratorio, el usuario deber llenar el formato co-
rrespondiente y dejar credencial de la universidad. En caso de deterioro o dao causado al
material o equipo se deber llenar el formato correspondiente de adeudo y quedar como
garanta la credencial de la UNAM vigente.

Artculo 19. Los materiales y equipos debern ser entregados a los laboratoristas en las
mismas condiciones en que los recibieron. En los casos en que el manual indique algn
procedimiento previo, ste deber seguirse.
Artculo 20. El usuario conservar y mantendr el orden y limpieza de las instalaciones y
equipo del laboratorio.

Artculo 21. El usuario deber reportar cualquier falla del equipo ante el profesor titular del
grupo o responsable del laboratorio o laboratorista, inmediatamente para deslindar respon-
sabilidades.

Artculo 22. Est prohibido a los alumnos el paso al interior de los anexos.

FITOPATOLOGA
Artculo 23. Cuando el manual de prcticas lo indique los usuarios debern usar: bata, lentes
de proteccin, guantes, o ropa especial.

Artculo 24. El tiempo de tolerancia para llegar y entrar al laboratorio ser de un mximo
de 15 min.

Artculo 25. Al trmino de la prctica, cerciorarse que las llaves de gas, vaco y agua queden
cerradas; y que el equipo elctrico quede desconectado.

Artculo 26. A los residuos generados durante la realizacin del trabajo experimental, debe-
r de drsele el manejo indicado en el manual de prcticas.

Artculo 27. En caso de accidente, se debe avisar inmediatamente al profesor o a los labo-
ratoristas.

CAPTULO QUINTO. DE LAS SANCIONES

Artculo 28. Toda persona ajena que ingrese sin la autorizacin correspondiente, se har
responsable de los daos que se ocasionen a los experimentos o prcticas que se realizan y
se fincar responsabilidad de acuerdo a la legislacin universitaria vigente.
13
Artculo 29. El material consumible que sea extraviado o deteriorado por el usuario deber
ser repuesto por l.

Artculo 30. Cualquier uso indebido del laboratorio, equipo u otros recursos dar lugar,
segn la gravedad y circunstancias del caso, a cualquiera de las sanciones que aplican en la
legislacin universitaria.

FITOPATOLOGA
RELACIN DE PRCTICAS
Nmero y nombre de la
Unidad Temtica en el
Nmero Ttulo Programa de la
Asignatura

1 Mtodos de colecta 1 Introduccin


Preparacin de medios de cultivo y 1 Introduccin
2 tcnicas de aislamiento de 2 Generalidades de microorganismos
microorganismos
3 Identificacin de bacterias 2 Generalidades de microorganismos
fitopatgenas
4 Identificacin de hongos 2 Generalidades de microorganismos
fitopatgenos PRIMERA PARTE
5 Identificacin de nematodos 2 Generalidades de microorganismos
14 6
fitopatgenos
Identificacin de sntomas en 3 Principios de la Fitopatologa
plantas enfermas
4 Mtodos de control de las
7 Control biolgico enfermedades de las plantas
5 Enfermedades de importancia

RELACIN DE ANEXOS
Anexo I. Proyecto Semestral
Anexo II. Elaboracin de medios de cultivo
Anexo III. Purificacin de partculas virales
Anexo IV. Microcultivo
Anexo V. Medida de estructuras de agentes fitopatgenos con microscopio ptico
Anexo VI. Cuantificacin de la concentracin de inculo

FITOPATOLOGA
MATERIAL NECESARIO PARA LAS
PRCTICAS
POR EQUIPO POR GRUPO
1 m de franela 1 caja de portaobjetos
1 m de manta de cielo 1 caja de cubreobjetos
0.5 l de blanqueador de ropa 1 bolsa de detergente
1 marcador indeleble 1 rollo de papel aluminio
cerillos 1 paquete de algodn
1 rollo de maskin-tape 1 rollo de papel adherente
1 charola de plstico tipo panera 10 goteros con frasco de color mbar
etiquetas engomadas

15
MANEJO DE LOS RESIDUOS BIOLGICOS PELIGROSOS

En las prcticas 2, 3, 4 y 5, cuando los aislamientos de microorganismos (bacterias, hongos


y nematodos) se desechan, se convierten en residuos biolgicos peligrosos. Por lo tanto, es
muy importante darle el manejo adecuado que contrarreste su peligrosidad. Todos los reci-
pientes que contengan estos cultivos (principalmente cajas de PETRI), debern envolverse
en papel peridico en paquetes de tres cajas cada uno. Una vez envueltos se esterilizarn en
autoclave para destruir el inculo patgeno. El medio de cultivo sobrante y las cajas de Petri
desechables debern ponerse en bolsas especiales para incinerarse en el horno de veterinaria.
As mismo, los restos que contengan nematodos debern seguir el mismo procedimiento.

FITOPATOLOGA
Prctica 1
MTODOS DE COLECTA

El diagnstico de las enfermedades de las plantas se refiere a la determinacin del agente


causal de una enfermedad, y es una de las bases indispensables para lograr un control eficaz.
Slo cuando se conoce el agente causal puede consultarse la literatura especializada que re-
vela la experiencia de otros fitopatlogos y puede servir para planear las medidas de control.

Ciertas enfermedades pueden ser reconocidas fcilmente; es decir, a simple vista, basndose
en la experiencia y en las particularidades de los patgenos que los hacen inconfundibles,
pero hay muchas otras que se confunden, y entonces el diagnstico se complica, teniendo
que realizar las siguientes actividades: colecta, aislamiento, identificacin del patgeno,
inoculacin, reaislamiento y reidentificacin.
17
La colecta inicia con una observacin de alteraciones en nuestro cultivo, y ser ms precisa
si el que la realiza ha examinado de manera personal la enfermedad en el campo. Un obser-
vador cuidadoso puede obtener datos valiosos que faciliten todo el proceso. Por ejemplo,
la distribucin local de una enfermedad vara de acuerdo con las circunstancias; es decir,
pueden estar atacadas todas las plantas por igual, algunas ms que otras, plantas sanas al-
ternadas con plantas enfermas, reas bien definidas de plantas enfermas, en hileras en los
bordes de la plantacin, en las partes ms bajas o distribuidas al azar. Es importante notar
la presencia de focos de infeccin inicial, a partir de los cuales se extiende la enfermedad,
debido a que esa informacin da idea del patrn de diseminacin y de la fuente de inculo
primario. En el desarrollo de la Fitopatologa prctica es de suma importancia la colecta del
material enfermo, puesto que de esto depender el que se puedan realizar las tcnicas con-
ducentes a una identificacin acertada del patgeno en cuestin.

Manejar las tcnicas ms comunes de colecta y preservacin de material de estudio fitopa-


tolgico.

FITOPATOLOGA
Para el desarrollo de esta prctica, los alumnos debern resolver y entregar el siguiente
cuestionario:

1. Qu es el diagnstico de las enfermedades?


2. Por qu es indispensable llevar a cabo un diagnstico?
3. En cules casos es fcil diagnosticar una enfermedad?
4. Qu actividades se deben realizar cuando el diagnstico se complica?
5. Qu es una colecta?
6. Por qu y cundo se debe realizar una colecta?
7. Qu observaciones se deben hacer en el campo?
8. Cul es el objetivo de esta prctica?
9. Qu material se necesita para realizar una colecta?
10. Cmo se detectan los problemas fitopatolgicos?
11. De qu dependen las partes vegetales que es necesario colectar?
12. Qu se debe colectar en un cultivo anual?
13. Qu se debe colectar en un cultivo perenne?
18 14.
15.
Qu se debe hacer si el tejido es carnoso?
Qu se debe hacer si la planta presenta nodulaciones en la raz?
16. Qu se debe anotar en la libreta de campo con respecto al material colectado?
17. Qu usos se le puede dar al material colectado?
18. Qu se debe hacer si el material colectado se va a utilizar para realizar
aislamientos?
19. Qu se debe hacer si el material colectado se destinar al herbario fitopatolgico?
20. Qu es una solucin fijadora?

Pala recta Navaja de campo Libreta de campo


Tijeras de podas Lupa de campo Hielera porttil
Serrucho Bolsas de papel secante Ligas
Cmara fotogrfica Prensa botnica Engrapadora
Etiquetas Peridico y cartn co- Frascos
Papel secante rrugado Soluciones fijadoras

FITOPATOLOGA
Prctica 1
F.A.A.
Formol al 40 % 10 mL
cido actico glacial 10 mL
Alcohol al 50 % 100 mL

SOLUCIN DE HESLER
Agua destilada 1000 mL
Cloruro de Zinc 50 mL
Formalina 25 mL
Glicerina 25 mL

Se discutir el cuestionario antes de salir a efectuar la colecta.

Los problemas fitopatolgicos se pueden presentar en hojas, races. tallos, etc. y se de-
tectan cuando las plantas crecen de modo anormal, se secan o se mueren, disminucin de
la cosecha, alteraciones en el crecimiento, decoloraciones, sobrepigmentaciones, manchas,
19
rayados, pudriciones, marchitamientos, etc. Es conveniente disponer del mayor nmero de
elementos vegetales colectados que permitan lograr la identificacin del agente causal.

Las partes vegetales que deben colectarse dependen del tipo de cultivo que se trate:

Cultivo anual. Se debern colectar varias plantas completas que presenten sntomas
iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad, pero que no estn en
estado de descomposicin o totalmente muertas, pues as no son tiles para su estudio
en el laboratorio. Si el cultivo ya est muy desarrollado, se deben colectar slo por-
ciones de los rganos atacados. Es conveniente colectar tambin una planta sana que
sirva de comparacin.

Cultivo perenne. Se colectan partes representativas, como raz, tallo hojas, flores y
frutos; de igual forma con sntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de
la enfermedad, y partes sanas para la comparacin. Tampoco se deben colectar partes
que estn por completo muertas o en estado de descomposicin.

FITOPATOLOGA
Para partes vegetales carnosas, como frutos y bulbos, se deben colectar en frascos con so-
luciones fijadoras. En el caso de que la planta presente nodulaciones en la raz, es muy
probable que se trate de infestaciones de nematodos, por lo que se deben tomar muestras del
suelo que hayan estado en contacto con la raz. En el caso de que las plantas sean pequeas,
se debe sacar la planta entera y, sin sacudir el suelo de las races, se debe meter en una bolsa
de plstico junto con aproximadamente 250 gr de suelo y cerrarla con una liga para evitar
que los nematodos mueran. Las bolsas no deben exponerse al sol.

Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, se acompaen de la mayor can-
tidad de datos posibles, que se anotarn en la libreta de campo.

El material colectado puede emplearse para realizar aislamientos del agente causal, en cuyo
caso se puede prensar o conservarse en refrigeracin, o bien, como material de herbario,
emplendose el prensado o la preservacin en fijadores como el alcohol al 70 %, el F.A.A.
o la solucin de Hesler.

El material de herbario se debe montar en cartulinas blancas de 30 x 40 cm, siguiendo las


tcnicas de herbario acostumbradas. Todo material preservado debe llevar su etiqueta co-
rrespondiente.
20 Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan acompaados con los
siguientes datos:

1. Datos generales

Muestra No. _____________________ Variedad _________________________


Localidad_________________________ Edad del cultivo ___________________
Fecha ___________________________ Cultivos anteriores __________________
Cultivo (hospedero)_________________ Predio _________________________

2. Apariencia general del cultivo

Marchitez_____________________ Tizones___________________________
Amarillamiento________________ Desarrollo anormal__________________
reas muertas_________________ Otros_____________________________
Manchas foliares_______________

FITOPATOLOGA
Prctica 1
3. Partes atacadas de las plantas

Raz______________________________ Brotes o tallos______________________


Hojas_____________________________ Flores_____________________________
Frutos____________________________

4. Distribucin de la enfermedad

Plantas aisladas _____________________ Manchones o grupos de plantas_________


reas grandes ______________________ reas pequeas_____________________
Bandas o franjas____________________ Bordes de cultivo____________________

5. Condiciones prevalecientes durante la aparicin de los primeros sntomas y el


desarrollo de la enfermedad

Precipitacin _______________________ Humedad relativa ___________________


Vientos____________________________ Heladas___________________________
Granizo___________________________ Otros______________________________

6. Labores culturales 21
Frecuencia de riego__________________ Fertilizaciones ______________________
Incorporacin de materia orgnica______ Aclareos___________________________
Podas_____________________________ Otros______________________________

7. Qumicos aplicados al cultivo (concentraciones y dosis)

Fertilizantes_______________________ Fungicidas ________________________


Herbicidas________________________ Insecticidas ________________________
Defoliantes________________________ Otros_____________________________

8. Caractersticas del suelo

Drenaje___________________________ Textura____________________________
pH_______________ ________________ Otros_____________________________

9. Posibles deficiencias o excesos nutricionales

Zn _________ Mn _________ N _________


K _________ Mg _________ Bo _________
P _________ Otros _________

FITOPATOLOGA
Datos del laboratorio que nos ayudarn al diagnstico de la enfermedad y a la identificacin
del agente causal.

a) Caractersticas de las lesiones.


b) Presencia de esporas, micelio, cuerpos fructferos o cualquier estructura (hacer
esquemas).
c) Exudaciones (color, consistencia etc.)
d) Presencia de insectos o caros.
e) Evidencia de daos mecnicos.

El material colectado puede emplearse para:

a) Realizar aislamientos del agente causal. En este caso se puede prensar o preser-
varse en refrigeracin.
b) Como material de herbario, emplendose el prensado, o bien la preservacin
en fijadores como alcohol al 70 %, F.A.A. o solucin de Hesler. En el primer
caso los ejemplares deben ser montados en cartulinas blancas de 25 x 45 cm.,

22 siguiendo las tcnicas de herbario acostumbradas. Todo el material preservado


debe llevar su etiqueta correspondiente.

Esta prctica por su naturaleza no incluye tablas de resultados, slo la entrega de los ejem-
plares colectados.

En la parte de los datos de laboratorio que ayudan al diagnstico y a la identificacin del


agente causal se debe de entregar un reporte escrito de estos resultados y apoyar a la colecta
fitopatolgica.

1. Cuestionario previo resuelto. PERSONAL.


FECHA DE ENTREGA: el da de la prctica
FECHA DE RETROALIMENTACIN:

2. 10 ejemplares diferentes para el herbario fitopatolgico, debidamente montados y eti-


quetados. POR EQUIPO
FECHA DE ENTREGA:
FECHA DE RETROALIMENTACIN:

FITOPATOLOGA
Prctica 1
Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatologa General. Herrero Hnos.
Mxico.

Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods.


CRC Press. 355 pp.

Gonzlez, L.C. 1977. Introduccin a la Fitopatologa. I.I.C.A. San Jos de Costa


Rica.

Lpez A.G. 1978. Tcnicas de uso comn en el manejo de Hongos fitopatgenos.


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Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel


Dekker Inc. 518 pp.

Roberts, G. y C. Boothroyd. 1972. Fundamentos de Patologa Vegetal. Acribia.


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23
Tuite, J. 1964. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria. Burges Pobl. Co.
Minneapolis.

Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,


Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

FITOPATOLOGA
Prctica 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y TCNICAS
DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

En el diagnstico de las enfermedades vegetales, el trabajo de laboratorio es de suma im-


portancia debido a que ah se efecta la identificacin del agente causal, lo que posibilita la
aplicacin de los mtodos de control ms adecuados.

El proceso de identificacin de un patgeno requiere el aislamiento del mismo, para lo que


es necesaria la elaboracin de medios de cultivo que permitan el desarrollo de dicho pat-
geno.

Una identificacin cientfica debe realizarse segn los Postulados de Koch, que revisten
una importancia dentro de a Fitopatologa, y deben seguirse siempre que se est frente a una 25
enfermedad de la que se desconozca o se dude del agente causal.

Los Postulados de Koch son los siguientes:

1. El organismo o agente causal debe estar constantemente asociados con la enfermedad.


2. El organismo debe ser aislado y cultivado en cultivo puro (identificacin).
3. Al inocular una planta susceptible sana, debe desarrollarse la enfermedad original.
4. El organismo patgeno debe ser aislado de la planta infectada bajo condiciones expe-
rimentales (reidentificacin).

AISLAMIENTO

En la naturaleza abundan los microorganismos que se desarrollan estrechamente relacio-


nados entre s, de manera que encontramos bacterias, hongos y otros organismos de muy
diversos tipos, tanto de vida libre como parsitos. Para poder estudiarlos y conocerlos se
deben cultivar en medios adecuados aislndolos del suelo o de partes vegetales enfermas.
A partir de la primera muestra que se coloca en un medio de cultivo, se obtiene un cultivo
mixto del que se deben tomar nuevas muestras para realizar otros cultivos, seleccionando
las diferentes colonias hasta lograr que en el medio se desarrolle un solo tipo de organismo,
consiguiendo de esta forma un cultivo puro.

FITOPATOLOGA
Para realizar aislamientos a partir del suelo, existen diversas tcnicas como la de placa di-
recta y la de dilucin en serie. En el caso de que el patgeno se encuentre en las partes vege-
tales, se puede proceder a realizar aislamientos directos, utilizar cmaras hmedas, colocar
partes vegetales en el medio de cultivo a travs de trampas, etc.

MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el aisla-
miento, determinacin, desarrollo, reproduccin e identificacin de aquellos organismos
productores de enfermedades de las plantas, que se comportan como parsitos facultativos.
Para lograr el desarrollo y reproduccin de las diferentes especies fitopatgenas, los medios
de cultivo deben reunir caractersticas especiales, tomando en cuenta los factores que se
mencionan a continuacin:

Nutrientes. En el medio de cultivo debern estar presentes elementos nutri-


cionales tales como fuentes de carbono, nitrgeno, macroelementos (P, K, Mg,
Ca), microelementos (Fe, Zn, Mn, Cu, Mo), vitaminas, etc.
Humedad. Deber proporcionarse una humedad relativa favorable a los fitopa-
tgenos que se desee cultivar. Por lo general requieren del 50 % o ms.
26 Temperatura. Los valores ptimos de sta son muy variables para cada espe-
cie, pero la mayora de ellas pueden crecer en un rango de 20 a 25 C. Este es un
factor determinante para el desarrollo y la reproduccin.
pH. Tambin en este caso los valores ptimos son muy variables, pero en ge-
neral los hongos fitopatgenos se desarrollan y reproducen mejor en pH lige-
ramente cidos, mientras que las bacterias prefieren los ligeramente alcalinos.
Luz. Este factor en algunos casos afecta la reproduccin de los hongos fitopa-
tgenos, pero en general no influye.
Asepsia. Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo de
cualquier contaminacin por otros microorganismos.

Clasificacin de los medios de cultivo

Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo con su composicin o a su consistencia,


quedando de la siguiente manera:
Composicin

Medios de cultivo sintticos. Son aquellos medios de cultivo en los que se co-
noce con exactitud la composicin de cada uno de sus componentes, por ejem-
plo, agar y Czapek.
Medios de cultivo complejos o semisintticos. En estos la composicin de uno
de sus elementos no se conoce de manera exacta, o bien, se integran de sustan-
cias naturales y sustancias sintticas, por ejemplo PDA (papa-dextrosa-agar).

FITOPATOLOGA
Prctica 2
Medios de cultivo naturales. Se forman a partir de material vegetal natural,
por ejemplo: hojas, tallos, vainas, tubrculos, races, etc.

Consistencia

Medios slidos. Contienen esencialmente agar, gelatina, albmina, etc., mate-
riales que al enfriarse quedan slidos por completo. Son muy empleados para el
aislamiento y la reproduccin de hongos y bacterias.
Medios semislidos. Contienen bajas proporciones de agar y gelatina mezcla-
dos o separados; al enfriarse permanecen en estado coloidal. Se emplean para
mantener cultivos por largo tiempo.
Medios lquidos. Son preparados sin agar, gelatina u otras sustancias solidifi-
cantes, por lo que permanecen lquidos aun al enfriarse. Se emplean cuando se
necesita incrementar el inculo de hongos o bacterias.

Entre los medios de cultivo de uso frecuente en Fitopatologa estn los siguientes:

1. PDA (papa-dextrosa-agar) 10. HMA (harina de maz-agar)


2. AN (agar nutritivo) 11. JFA (jugo de frijol-agar)


3. HFA (harina de frijol-agar)
4. VM (Ougo Va agar)
12. JTA jugo de tomate-agar)
13. MSA (malta-sal-agar)
27
5. AVA (avena-agar) 14. BA (Bonner Addoat)
6. TSA (jugo de tomate-sal-agar) 15. BK (medio B de King)
7. MM (medio de Martin)
8. VFA (vainas de frijol-agar)
9. AA (agua-agar)

Adiestrar a los alumnos en la preparacin de medios de cultivo y en las tcnicas de aisla-


miento de agentes fitopatgenos ms utilizados.

1. Investigacin previa: la asepsia y su importancia en los laboratorios de microbiologa


(con anlisis-comentario y bibliografa).
2. Estudiar toda la informacin contenida en este manual acerca de esta prctica.

FITOPATOLOGA
Asa microbiolgica Mechero Balanza granataria
Pinzas de diseccin Soporte con anillo Papa, jugo de tomate,
Agujas de diseccin Tela de asbesto etc.
10 cajas de PETRI Partes vegetales enfer-
mas

Las actividades que se llevarn a cabo en esta prctica son tres:

1. Preparacin de los medios de cultivo.


2. Vaciado del medio de cultivo a las cajas de PETRI.
3. Aislamiento de los agentes causales.

1. PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

28 Cada equipo elaborar el medio de cultivo que le indique el profesor, de acuerdo con las
necesidades de su Proyecto Semestral.

2. VACIADO DEL MEDIO DE CULTIVO A CAJAS DE PETRI

Para llenar las cajas de PETRI con el medio de cultivo de una manera asptica se deben
realizar los siguientes pasos:
Limpiar la mesa con una solucin de cloro 5:1 en agua.
Colocar y encender el mechero o lmpara de alcohol.
Poner las cajas y recipientes con el medio sobre la mesa.
Tomar el recipiente con el medio de cultivo y destapando con la mano izquier-
da, pasar la boca del recipiente sobre la llama del mechero. Conservar el tapn
en la misma mano con que se sostiene el recipiente del medio.
Tomar con la mano derecha una caja de PETRI y levantar la tapa lo suficiente
para verter el medio de cultivo. Vaciar en cada una de 10 a 12 mL.
Colocar la tapa de la caja de PETRI suavemente, y tapar el recipiente del medio
de cultivo.
Distribuir de manera uniforme el medio con movimientos de rotacin.
Colocar las cajas en una superficie horizontal y dejar solidificar.
Una vez solidificado el medio, realizar pruebas de esterilidad por incubacin a
35 C durante 48 hrs.

FITOPATOLOGA
Prctica 2
3. AISLAMIENTO

Todos los aislamientos deben hacerse en un medio estril, es decir, a la flama del mechero,
para evitar contaminaciones. Existen varias tcnicas de aislamiento. El aislamiento que se
va a llevar a cabo es el que utiliza las partes vegetales enfermas, con sus tres variantes.

Aislamiento a partir de partes vegetales enfermas

Aislamiento directo. Si se observan las fructificaciones o el micelio en el ejemplar


enfermo, se toma una muestra de este material con una aguja de diseccin estril y se
coloca en directo sobre el medio de cultivo. Se incuba a 24 C y se observan resultados
despus de 4 a 5 das.

Partes vegetales en medio de cultivo. La porcin vegetal que muestra los sntomas
se desinfecta con una solucin de cloro (NaOCl) y agua destilada estril 5:1. Se en-
juaga con agua destilada estril y se coloca en cajas de Petri con medio de cultivo. Se
incuba a 24 C y se observan resultados despus de cuatro a cinco das.

Cmara hmeda. Cuando las partes vegetales afectadas presentan micelio, pero no
hay fructificaciones, o cuando no se aprecia el crecimiento del patgeno, se recurre al
uso de la cmara hmeda. Se toma una porcin del tejido enfermo y se desinfecta en
29
una solucin de cloro (NaOCl) y agua destilada estril 5:1. Se enjuaga con agua desti-
lada estril y se coloca en cajas de Petri con un papel filtro en su interior, previamente
esterilizadas. Se humedece con agua destilada estril y se tapa la caja Se incuba a 24
C y se observan resultados despus de cuatro a cinco das.

Tcnica de aislamiento de dilucin en serie.

1. Se pesa un gramo de suelo y se agrega a un tubo de ensayo con 10 mL de


agua destilada estril.
2. Se agita manualmente durante un minuto.
3. Se toma una alocuota de 1 mL con una pipeta y se agrega a otro tubo que
contenga 9 mL de agua destilada estril agitndose de igual manera durante un
minuto.
4. Se repite la operacin hasta llegar a la dilucin 10-4.
5. De cada dilucin se toma una alcuota de 1 mL y se siembra en placas Petri
que contengan medio de cultivo PDA distribuyendo uniformemente.
6. Se sellan con parafilm y se incuban en posicin invertida a una temperatura de
26 C durante siete das.
7. Transcurrido este tiempo, se hace el conteo de las colonias de microorganismos
presentes.

FITOPATOLOGA
La entrega del reporte consistir en la resolucin del siguiente cuestionario:

1. A qu tipo de medios de cultivo (natural, semisinttico o sinttico) pertenecen


los utilizados en esta prctica? Explique su respuesta.
2. Qu es la esterilizacin y cules son los mtodos ms frecuentes para esterili-
zar materiales fitopatolgicos?
3. Describa los tipos de colonias que surgieron en los aislamientos a partir del
suelo y partes vegetales enfermas.
4. Calcule el nmero de organismos que surgieron en los aislamientos a partir del
suelo por el mtodo de dilucin, de la siguiente manera:

C x D x VI = NO/mL
En donde
C= Nmero de colonias
D=Dilucin emleada
VI=Volumen inicial
NO= Nmero de organismos presentes en un mL
30 5. Cmo realizara un cultivo de Puccinia graminis tritici y del virus del mosaico
amarillo del frijol, a partir de vegetales enfermos?

MANEJO DE LOS RESIDUOS PELIGROSOS


Las instrucciones se encuentran en la pgina 15.

FITOPATOLOGA
Prctica 2
Agrios, G. N. 2005. Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam,
Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, san
Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. *

Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp.

Echandi, 1975. Op. cit.

French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA. Costa


Rica.

Gavio, G. C., C. Jurez y H. Figueroa. 1975. Op. cit.

Lpez A.G. 1978. Op. cit.

Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
31
Dekker Inc., 518 pp.

Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic
fungi. C A B International, 267 pp.

Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,


Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

FITOPATOLOGA
Prctica 3
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
FITOPATGENAS

En el proceso de diagnstico de las enfermedades de las plantas, la identificacin del agente


causal ocupa un lugar preponderante. Las tcnicas de identificacin particularizan en los
agentes biticos que causan enfermedades, en decir, en los microorganismos fitopatgenos,
entre los que encontraremos virus, fitoplasmas, espiroplasmas, bacterias, hongos y nemto-
dos. Los virus son tan pequeos y requieren de tcnicas tan elaboradas para su observacin
que es imposible llevarla a cabo en un laboratorio como ste. En cambio, es completamente
factible observar a las bacterias (y organismos semejantes a ellas), a los hongos y a los ne-
mtodos.
33
Las bacterias son microorganismos pertenecientes al Reino Procaryotae. Se encuentran
distribuidas con amplitud en la naturaleza. Su forma puede ser esfrica, de bacilo o de
espiral. Se encuentran constituidas con las siguientes estructuras: cpsula de secrecin, pa-
red celular, membrana celular y citoplasma, este ltimo conteniendo grnulos de grasa,
vacuolas, pigmentos y material gentico disperso, es decir, carecen de membrana nuclear
(procariontes). Algunas bacterias tienen flagelos y pueden desplazarse en medios lquidos.
La pared celular determina la forma de las bacterias y es selectiva, pudiendo contener ami-
nocidos aromticos, protenas, cidos teitoicos y diferentes azcares. Dependiendo de la
cantidad de stos, las bacterias pueden teirse de rojo o de violeta al seguir la tcnica de
tincin de Gram. Se conocen aproximadamente mil 600 especies de bacterias. La mayora
son saprfitas obligadas y como tales benefician al hombre porque ayudan descomponiendo
grandes cantidades de materia orgnica y deshechos animales y vegetales.

Reconocer las caractersticas morfolgicas que distinguen a las bacterias en preparaciones


temporales y permanentes.

1. Investigacin bibliogrfica de la importancia de las bacterias en la agricultura.

FITOPATOLOGA
Portaobjetos Cristal violeta Sulfato de cobre
Cubreobjetos Safranina Alcohol etlico
Agujas de diseccin Agua destilada Lugol
Cultivos de bacterias

Las actividades que se llevarn a cabo en esta prctica son cuatro:

1. Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes de bacterias.


2. Tincin de bacterias por el mtodo de Gram.
3. Tincin de productos de excrecin y cpsula de bacterias.
4. Tincin de flagelos de bacterias.

34 ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR,


DESINFECTA LA MESA CON CLORO

1. Tcnica para realizar preparaciones temporales

Trabaja cerca de la flama. Flamea el asa o la aguja de diseccin hasta obtener el


rojo vivo, para evitar contaminaciones.
Con el asa o aguja toma una pequea muestra de bacterias del cultivo, colcala
en un portaobjetos limpio con una gota de agua destilada.
Coloca el cubreobjetos inclinado, evitando que se formen burbujas. Cuando el
fluido se extiende por el borde, se deja caer suavemente.
Observa la preparacin al microscopio utilizando diferente objetivos. Siempre
debes empezar con el aumento de 10X y avanzar de manera progresiva. Recuer-
da que con el objetivo de 100X debes agregar una gota de aceite de inmersin
sobre la preparacin, antes de colocar el lente.
Si observas bacterias, puedes teir la preparacin, utilizando alguna de las tc-
nicas sugeridas.

FITOPATOLOGA
Prctica 3
2. Tincin de GRAM

En una gota de agua coloca una pequea masa de bacterias esparcindolas a lo


largo del portaobjetos. El cultivo debe ser de preferencia de 24 horas.
Fija la preparacin al aire o directamente a la flama.
Cubre la preparacin con cristal violeta durante un minuto y decanta.
Cubre la preparacin con lugol durante un minuto y lava con agua corriente.
Decolora con alcohol etlico por 30 segundos agitando para una decoloracin
homognea. Lava con agua corriente.
Cubre con safranina durante un minuto y lava con agua corriente.
Absorbe el agua con papel.
Observa al microscopio. Si las bacterias tien de rojo son Gram (-), y si tien de
violeta son Gram (+). Esquematiza lo observado.

3. Tincin de flagelos de bacterias

Se prepara un frotis y se seca al aire.


Se aade el mordiente filtrado y se deja de uno a cinco minutos.

35
Se lava con agua cuidadosamente.
Se cubre con cristal violeta se deja actuar dos minutos.
Se repite el lavado de la misma forma.
Se seca la preparacin al aire.
Se observa al microscopio con el objetivo de inmersin.

4. Tincin de productos de excrecin y cpsula de bacterias

Coloque en un portaobjetos una gota de tinta china bacteriolgica, agregue una


pequea muestra de bacterias, coloque el cubreobjetos y observe.
Haga un frotis, squelo al aire, agregue cristal violeta durante dos minutos.
Lave con Sulfato de Cobre al 2 %. Squelo con papel absorbente. Las cpsulas
aparecen en color azul y violeta y los cuerpos bacterianos en azul oscuro.

FITOPATOLOGA
1. Introduccin: importancia de las bacterias.
2. Descripcin de las colonias CON ESQUEMAS A COLORES, indicando el me-
dio de cultivo utilizado.
3. Descripcin de las bacterias observadas en el microscopio CON ESQUEMAS
A COLORES, indicando la tcnica de tincin utilizada.
4. Discusin y conclusiones.
5. Bibliografa.

FECHA DE ENTREGA:
FECHA DE RETROALIMENTACIN:

MANEJO DE LOS RESIDUOS PELIGROSOS


Las instrucciones se encuentran en la pgina 15.

36

Agrios, G. N. 2005. Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam,
Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San
Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp.

Barne H, H. L. end Hunter B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi. Fourth


edition. MacMillan Publishing Company. 218 pp.

Bridge, P. D. 1998. Applications of PCR in mycology. CAB, International.

Cummins, G. B. and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. Third


Edition. APS Press 225 pp.

Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp

French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Mtodos de investigacin fitopatolgico, I.I.C.A.


San Jos, Costa Rica.

FITOPATOLOGA
Prctica 3
Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of ascomycetes. Volume 1. APS Press.
263 pp.

Len Gallegos, H. M. y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de Mxico.


SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp.

Klman Vnky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. Second edition.
238 pp.

Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos:


Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp.

Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory
and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp.

Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
Dekker Inc., 518 pp.

Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic
fungi. C A B International, 267 pp. 37
Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,
Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, 413
pp.

FITOPATOLOGA
Prctica 4
IDENTIFICACIN DE HONGOS
FITOPATGENOS

Los hongos y los organismos semejantes a estos comprenden el grupo ms numeroso de


microorganismos fitopatgenos (ocho mil especies) y son los causantes de la mayora de las
prdidas econmicas agrcolas, debido al gran nmero de enfermedades que ocasionan. Se
considera que todas las plantas son atacadas al menos por un hongo, y muchas son afectadas
por un gran nmero de estos organismos.

El hbitat de los hongos es muy amplio, puesto que se encuentran en el suelo, en el agua y
en las plantas y animales. Pueden desarrollarse en condiciones climticas muy variadas, en
todo tipo de ecosistemas.
39
Los organismos semejantes a los hongos pertenecen a los reinos Protozoa y Chromista, y los
hongos al reino Fungi. Son microscpicos y macroscpicos, uni y pluricelulares. Presentan
pared celular y carecen de clorofila.

Estn constituidos por clulas redondas u ovales solitarias o en plasmodios, o ms frecuen-


temente por estructuras alargadas y ramificadas llamadas hifas, cuyo conjunto se denomina
micelio. Cada hifa est conformada por una pared celular que protege a la membrana celular
y al contenido protoplasmtico, en donde se encuentran dispersos sus ncleos verdaderos,
as como las mitocondrias, ribosomas, retculo endoplsmico y grnulos de sustancias de
reserva. Si las hifas estn separadas en celdas, se dice que el micelio es septado, y si el
protoplasma es continuo en las hifas el micelio es cenoctico. En algunos hongos el micelio
llega a formar pseudotejidos. Prosnquima y pseudoparnquima.

Entre las estructuras de reproduccin asexual estn los odos, clamidosporas, esporangios
y conidios, estos ltimos solitario o agrupados en sinemas, esporodoquios, acrvulos o pic-
nidios. Las esporas sexuales son las siguientes: cigosporas, oosporas, ascas-libres o en apo-
tecios, peritecios y cleistotecios- y basidios, que nacen de forma directa de una espora de
resistencia o en basidiocarpo, o dentro de basidiocarpos.

FITOPATOLOGA
Reconocer las caractersticas morfolgicas que distinguen a los hongos en preparaciones
temporales y permanentes.

Portaobjetos Agua destilada Agujas de Lugol


Cubreobjetos Azul de metileno diseccin Rojo congo
Cultivos de
hongos

1. Investigacin bibliogrfica del papel de los hongos en la agricultura.

40 Las actividades que se llevarn a cabo en esta prctica son tres:

1. Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes de hongos, utilizando


diferentes tcnicas de tincin.
2. Observacin de las preparaciones elaboradas.
3. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.

PREPARACIONES TEMPORALES
1. Pon una gota de agua en un portaobjetos, y agrega una masa de micelio y espo-
ras de un cultivo de hongos.
2. Observa al microscopio.
3. Si hay micelio y esporas, agrega una pequea gota del colorante para una mejor
observacin de las estructuras.
4. Coloca el cubreobjetos y observa nuevamente al microscopio. Esquematiza lo
observado.

FITOPATOLOGA
Prctica 4
PREPARACIONES PERMANENTES

1. Pon una gota de lugol en un portaobjetos, y agrega una masa de micelio y espo-
ras de un cultivo de hongos.
2. Observa al microscopio.
3. Si hay micelio y esporas, agrega una pequea gota del colorante para una mejor
observacin de las estructuras.
4. Coloca el cubreobjetos y observa de nueva cuenta al microscopio. Esquematiza
lo observado.
5. Sella tu preparacin con barniz transparente y etiqutala.

1. Introduccin: importancia de los hongos.


2. Descripcin de las colonias CON ESQUEMAS A COLORES, indicando el me-
dio de cultivo utilizado.
3. Descripcin de los hongos observados en el microscopio CON ESQUEMAS
A COLORES, sealando las estructuras observadas, y el nombre del gnero
o de la especie, si se conoce. As mismo, se debe indicar la tcnica de tincin
utilizada.
41
4. Discusin y conclusiones.
5. Bibliografa.

FECHA DE ENTREGA:
FECHA DE RETROALIMENTACIN:

Agrios, G. N. 2005. Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam,
Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San
Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp.

Barne H, H. L. end Hunter B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi. Fourth


edition. MacMillan Publishing Company. 218 pp.

Bridge, P. D. 1998. Applications of PCR in mycology. CAB, International.

Cummins, G. B. and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. Third


Edition. APS Press 225 pp.

FITOPATOLOGA
Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp.

French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Mtodos de investigacin fitopatolgico, I.I.C.A.


San Jos, Costa Rica.

Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of ascomycetes. Volume 1. APS Press. 263


pp.

Len Gallegos, H. M. y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de Mxico.


SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp.

Klman Vnky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. Second edition.
238 pp.

Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos:


Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90 pp.

Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory

42
and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777 pp.

Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
Dekker Inc., 518 pp.

Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic
fungi. C A B International, 267 pp.

Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,


Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, 413
pp.

FITOPATOLOGA
Prctica 5
IDENTIFICACIN DE NEMATODOS
FITOPATGENOS

Los nematodos son organismos que pertenecen al reino Animalia, y son quiz los animales
pluricelulares ms abundantes en el mundo, despus de los insectos. Su tamao flucta entre
unas cuantas micras hasta 0.5-1 mm.

Los nematodos son gusanos cilndricos con cuerpo alargado y delgado con simetra bilate-
ral. Su cutcula es lisa, son no segmentados y carecen de patas u otros apndices. Presentan
todos los sistemas fisiolgicos principales de todos los animales, como lo son los sistemas
excretor, nervioso, reproductor y digestivo. 43
Durante su ciclo de vida, los nematodos llegan a presentar cinco estados y cuatro mudas.
En algunas especies la primera y segunda etapas larvales no pueden infectar a las platas,
realizando sus funciones metablicas a expensas de la energa almacenada en el huevecillo.

Los nematodos fitopatgenos presentan gneros ectoparsitos, los cuales pasan toda su vida
en el suelo y se alimentan externamente de las races de las plantas hospederas, como es el
caso de Cricononemoides, Hemicycliophora y Cacopaurus. Otros gneros son endopar-
sitos, produciendo lesiones internas en los tejidos vegetales. Por lo general se ubican en el
parnquima cortical, o bien llegan hasta el cilindro central de las races hospederas, en don-
de permanecen o migran hacia otros rganos de las plantas, por ejemplo, Aphelehchoises,
Anguina y Ditylenchus. Otros ms pasan parte de su vida como endoparsitos y la otra en el
suelo que se encuentra alrededor de las races que parasitan, por lo que se les conoce como
semiendoparsitos, entre los que destacan: Meloidogyne, Heterodera y Tylenchus.

Reconocer las caractersticas morfolgicas que distinguen a los nematodos en preparaciones


temporales (extraccin) y permanentes.

FITOPATOLOGA
Plstico de 1 m 2 Piseta Centrfuga
Probeta Caoln Agitadores
2 cubetas Muestras de suelo Cajas de Petri pequeas
Tamices de 100, 200 y Tubos de centrfuga Solucin azucarada (55
350 mallas Vasos de precipitados gr/100 ml H2O)

1. Investigacin bibliogrfica de tcnicas de extraccin para nematodos fitopatgenos.

Las actividades que se llevarn a cabo en esta prctica son cuatro:

1. Extraccin de nematodos.
2. Observacin de nematodos vivos.

44
3. Observacin de preparaciones permanentes y temporales de nematodos.
4. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.
EXTRACCIN DE NEMATODOS POR EL MTODO DE TAMIZADO-CENTRIFUGADO

1. Se coloca la muestra de suelo sobre un plstico, se deshacen los terrones y se


retiran las basuras, piedritas, races, etc. Se remueve bien la tierra para homo-
geneizarla.

2. En una probeta o vaso de precipitados se ponen 200 mL de agua y se agrega


suelo hasta que la marca de agua llegue a 400 mL. Esto se hace con el objeto de
tener una referencia del tamao de la poblacin que se encuentra en 200 mL de
suelo, sobre todo si se desea hacer un estudio cuantitativo.

3. Esta mezcla se vaca en la cubeta A con un poco ms de agua, se deshacen los


grumos y se vaca el sobrenadante en los tamices de 100, 200 y 325 sobrepues-
tos y se recoge en la cubeta B. Esta operacin se repite dos veces ms.

4. La arenilla que qued en el tamiz de 325 se recoge en un vaso de precipitados


con una pizeta, procurando que el ngulo que forma el chorro de agua con el
tamiz sea lo ms agudo posible, nunca recto, puesto que de esta forma el agua
ayudara a pasar a los nematodos a travs de la malla del tamiz y los daara.

5. El agua que se recogi en la cubeta B se vierte a travs del tamiz de 325 y se


recoge en la cubeta A. Esta operacin se repite dos veces ms.

FITOPATOLOGA
Prctica 5
6. La arenilla que qued en el tamiz se recoge con una pizeta de la forma indicada
en el nmero 4 y se pasa al mismo vaso de precipitados.

7. La arenilla recogida se distribuye en los tubos de centrfuga y se le agrega un


poco de caoln a cada tubo. Se agitan bien.

8. Se centrifugan durante cinco minutos a 2900 rpm.

9. Se tira el sobrenadante.

10. Al sedimento se le agrega la solucin azucarada y se agita bien.

11. Se centrifugan durante tres minutos a 2900 rpm.

12. Se pasa el sobrenadante por el tamiz de 325 y se lava perfectamente bien hasta
eliminar por completo la solucin azucarada.

13. Se recoge el sedimento con una pizeta y se pasa a una caja de Petri pequea con
un poco de agua.

14. Se observa al microscopio.


45
Este mtodo de extraccin brinda la oportunidad de obtener casi todos los nematodos del
suelo de una forma rpida. El suelo retenido en los tamices se centrifuga para separar a los
nematodos de las partculas orgnicas mediante la flotacin de los mismos en una solucin
de gravedad especfica mayor de la que poseen los nematodos. Se emplea el caoln para se-
dimentar a los nematodos y poder eliminar el agua sobrenadante de la muestra. La solucin
azucarada, como tiene una gravedad especfica mayor a la que presentan los nematodos,
hace que stos floten y queden suspendidos en la solucin.

FITOPATOLOGA
1. Introduccin: importancia de los nematodos.
2. Descripcin de los nematodos observados en el microscopio CON ESQUE-
MAS A COLORES, sealando las estructuras observadas y el nombre del gne-
ro o de la especie, si se conoce.
3. Discusin y conclusiones.
4. Bibliografa.

FECHA DE ENTREGA:
FECHA DE RETROALIMENTACIN:

Agrios, G. N. 2005. Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam,
Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San
46 Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp.

Barne H, H. L. end Hunter B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi. Fourth


edition. MacMillan Publishing Company. 218 pp.

Bridge, P. D. 1998. Applications of PCR in mycology. CAB, International.

Cummins, G. B. and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. Third


Edition. APS Press 225 pp.

Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp.

French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Mtodos de investigacin fitopatolgico, I.I.C.A.


San Jos, Costa Rica.

Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of ascomycetes. Volume 1. APS Press.


263 pp.

Len Gallegos, H. M. y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de Mxico.


SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp.

Klman Vnky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. Second edition.
238 pp.

FITOPATOLOGA
Prctica 5
Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos:
Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90 pp.

Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory
and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777 pp.

Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
Dekker Inc., 518 pp.

Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic
fungi. C A B International, 267 pp.

Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004. Plant pathology,


Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, 413
pp.

47

FITOPATOLOGA
Prctica 6
IDENTIFICACIN DE SNTOMAS EN
PLANTAS ENFERMAS

La Sintomatologa es la rama de la Fitopatologa que estudia los sntomas y los signos que
producen los patgenos en las plantas que atacan. Su conocimiento es indispensable para el
diagnstico de las enfermedades.

Un sntoma es la manifestacin visible de una condicin patolgica en una planta sensible,


y un signo es la estructura o evidencia del patgeno mismo, producida dentro o fuera de los
tejidos del hospedero.

Debido a la gran cantidad de sntomas que existen, se han agrupado bajo diversas denomi-
49
naciones, dependiendo de mltiples factores tales como el lugar de aparicin, del efecto del
medio ambiente, del nmero de patgenos involucrados, etc. As, tenemos que los sntomas
que ocurren en los rganos directamente atacados por los patgenos se llaman sntomas
primarios, en cambio, a los que aparecen en otro rgano de la planta no atacado de forma
directa por el patgeno, sino como una secuela de ste, se les llama sntomas secundarios.
En algunas ocasiones los hospederos son atacados de manera simultnea por ms de un pa-
tgeno, provocando sntomas complejos. Otras veces los sntomas no se expresan del todo,
debido a condiciones ambientales favorables al patgeno, denominando a stos sntomas
enmascarados. De modo tpico, cada enfermedad produce varios sntomas caractersticos,
que en lo habitual aparecen en series subsecuentes durante el curso de la enfermedad; a este
conjunto de sntomas se le conoce con el nombre de sndrome.

Desde el punto de vista morfofisiolgico, los sntomas se agrupan en necrosis (muerte de


clulas, tejidos, rganos o la planta completa), hipoplasias (disminucin del desarrollo) e
hiperplasias (exceso en el desarrollo).

Identificar los diferentes sntomas y signos que ocurren en las enfermedades vegetales, me-
diante la observacin de material fresco.

FITOPATOLOGA
Ejemplares vegetales fitopatolgicos frescos
Ejemplares vegetales fitopatolgicos montados
Microscopio estereoscpico
Agujas de diseccin
Navaja
Cartulinas para herbario
Etiquetas

Traer 10 ejemplares fitopatolgicos por equipo, prensados y con datos de identificacin.

1. Identificacin de sntomas y de signos en ejemplares vegetales enfermos utili-


zando la clave de identificacin de sntomas y signos.

50
2. Los ejemplares a identificar se observan cuidadosamente, utilizando la lupa y
el microscopio cuando sea necesario, siguiendo la Clave de identificacin de
Sntomas y Signos.

CLAVE DE IDENTIFICACIN DE SNTOMAS Y SIGNOS

SNTOMAS

1. NECROSIS. Caracterizadas por la degeneracin y muerte celular. 1.1. PLESIONECRSIS

Si se presentan antes de que ocurra la muerte celular 1.2. HOLONECROSIS

Si se manifiestan hasta que las clulas y los tejidos mueren

1.1. PLESIONECROSIS

El tejido foliar toma coloraciones amarillentas debido a la AMARILLAMIENTO


destruccin de la clorofila

FITOPATOLOGA
Prctica 6
Presencia de tejidos dbiles y flcidos debido a la prdida de la MARCHITEZ
turgencia celular provocada por la carencia de agua, casi siempre
por el taponamiento de los vasos conductores a causa de los
patgenos.
HIDROSIS
Manchas traslcidas, acuosas, como pequeas gotas de agua
contenidas dentro de los espacios intercelulares. Estas
acumulaciones de lquidos provienen de clulas que han sufrido
daos en sus membranas celulares.

1.2. HOLONECROSIS

Si se presentan en tejidos de almacenamiento 1.2.1.

Si se presentan en tejidos verdes 1.2.2.

1.2.3.
Si se presentan en tejidos leosos

1.2.1. Tejidos de almacenamiento


Los tejidos sufren rpidamente una descomposicin 1.2.1.1. PUDRICIN 51
1.2.1.1. PUDRICIN

Si es antecedida por hidrosis y con un reblandecimiento de los PUDRICIN BLADA


tejidos

El agua es eliminada muy rpido de los tejidos, por lo que el MOMIFICACIN


rgano atacado se seca, quedando con un aspecto arrugado, duro y
seco

1.2.2. Tejidos verdes


AHOGAMIENTO O
Marchitez y cada de las plantitas de almcigo, como consecuen- DAMPING-OFF
cia de la muerte (necrosis) de las clulas del cuello del tallo

CHAMUSCADO
Necrosis localizada alrededor del borde de la hoja
TIZN
Necrosis extendida en toda la lmina foliar
MANCHADO

Zonas de tejido necrtico bien definidas, de diversos colores y


tamaos, en ocasiones rodeadas por un borde prpura o de algn
otro color

FITOPATOLOGA
Manchas necrticas muy pequeas que despus se rasgan y se TIRO DE MUNICIN
caen dejando pequeos orificios

Manchas necrticas sobre las que existe crecimiento micelial RONCHA O ERUCIN
oscuro
ABIGARRADO
Manchas necrticas muy pequeas extendidas en todo el rgano

Zonas alargadas de necrosis, a lo largo de venas y tallos RAYADO

Zonas necrticas alargadas, en las regiones intervenales de la BANDEADO


lmina

Repentina desecacin, debilitacin y muerte de toda la hoja QUEMADURA


debido a la accin indirecta de la actividad del patgeno

Necrosis epidrmica que da como resultado un blanqueado de la


ESCALADADURA
epidermis y de los tejidos adyacentes en el fruto y las hojas

52 Muerte repentina de brotes o yemas foliares AGOSTAMIENTO

Necrosis extensiva que provoca la cada de los frutos DESGRANAMIENTO

1.2.3. Tejidos leosos

Necrosis restringida a los tejidos corticales del tallo o raz, CNCER O CANCRO
generalmente rodeado de un callo de tejido sano

Necrosis extensiva que se origina en el pice de brotes y corre MUERTE REGRESIVA


hacia la base, por lo general despus de la hibernacin

Exudado de tejidos leosos, de consistencia acuosa, generalmente SANGRADURA


de colores vivos

Exudados de consistencia viscosa o gomosa, generalmente en GOMOSIS


frutos

2. HIPOPLASIAS. Caracterizadas por la debilidad de rganos o


plantas para desarrollarse por completo

Debilidad para alcanzar un tamao normal ENANISMO

FITOPATOLOGA
Prctica 6
Crecimiento escaso de los entrenudos, lo que ocasiona que las ARROSETADO
hojas estn juntas

Supresin completa de color en las hojas y los frutos BLANQUEO

Las plantas adquieren tonalidades entre verde claro y amarillo, CLOROSIS


debido a la no formacin de la clorofila

Clorosis en forma circular ANILLOS


CLORTICOS

Moteado de colores verdes y amarillos, o verde claro y verde MOSAICO


oscuro
SUPRESIN O
Debilidad completa de la planta para desarrollar algn rgano ETINCIN

ETIOLACIN
Tono amarillento blanquecino, en ocasiones acompaado de
enanismo; los tallos muestran un crecimiento excesivo y se tornan
quebradizos. Aparece en plantas que se encuentran en la oscuridad 53
3. HIPERPLASIA. Existe un desarrollo excesivo en tamao y
color de algn rgano de la planta o de la planta completa, o bien
por un desarrollo precoz de los rganos
3.1. GIGANTISMO
Desarrollo excesivo de la planta en general
3.2. HIPERCROMA
Acumulacin excesiva de pigmentos
3.3. METAPLASIA

Los rganos se desarrollan fuera de lugar o con otras formas

3.1 GIGANTISMO VERRUCOSIS


Se da un torcimiento de los brotes o enrollamiento de las hojas por O ENCHINAMIENTO
crecimiento excesivo de una parte del rgano
COSTRA O ESCARA
Sobrecrecimiento de tejido epidrmico, en forma de pequeas
lesiones, speras, elevadas, formadas por clulas con paredes
suberizadas
INTUMESCENCIA
Marchitez causada por hinchamientos de las clulas epidrmicas y
subepidrmicas, provocada por la acumulacin excesiva de agua
SARCOSIS
Hinchazn provocada por la acumulacin excesiva de material

FITOPATOLOGA
nutritivo, generalmente encima de un rea constreida TUMEFACCIN (tu-
Hinchazn localizada que envuelve a rganos completos mores, ndulos agallas)

FASCICULACIN
Desarrollo de rganos adventicios alrededor de un punto local ESCOBA DE BRUJA

FASCICACIN

Crecimiento laminar de tallos u otros rganos cilndricos, provo-


cando que estos tomen forma aplanada y extendida
PROLIFERACIN
Desarrollo continuado despus de que se alcanza el desarrollo
normal

3.2. HIPERCROMIA
VIRESCENCIA
Coloracin verdosa en tejidos normalmente carentes de clorofila,
debido a la produccin y acumulacin de sta en los rganos

54
ANTOCIANESCECIA
Coloracin prpura resultante del desarrollo excesivo de antocia-
ninas
BRONCEADO
Coloracin cobriza como resultado de diversos procesos que acu-
mulan pigmentos, como puede ser la deficiencia de potasio

3.3 METAPLASIA
HETEROTROPAS
Desarrollo de rganos en posiciones anormales
FILODIOS

Desarrollo de ptalos u otros rganos florales en forma de hojas JUVENILODIOS

Desarrollo de hojas juveniles en plantas maduras


SIGNOS
ZOOGLEAS
Exudados bacterianos de tipo cremoso y de color blanquecino
MILDIU O
Se observa el crecimiento de organismos semejantes a los hongos, CENICULLA
VELLOSA
en particular sus micelios y esporangios, que dan una apariencia
de fieltro suave, localizado en el envs de las hojas. Casi siempre
se observa en el haz una mancha en correspondencia. Son produ-
cidos por Peronosporales

FITOPATOLOGA
Prctica 6
ODIO O
Se observa el crecimiento vegetativo del hongo, como un micelio CENICILLA
de color blanquecino o grisceo, en pequeos manchones o de POLVOSA
forma continua, que aparentas polvo sobre las hojas. En algunas
ocasiones se observan conidios y cleistotecios. Todos son produci-
dos por Erisifales
ROYA
Presencia de pstulas que contienen una gran cantidad de esporas
de hongos Uredinales. Son circulares en dicotiledneas y alarga-
das en monocotiledneas. Su color vara entre amarillo, naranja y
caf oscuro, dependiendo del tipo de espora que contengan (ure-
dosporas o teliosporas)
CARBN
Se presenta una masa de color negro, compuesta por teliospo-
ras de hongos Ustilaginales, la cual puede estar cubierta por una
membrana de la planta, o bien puede estar desnuda
FUMAGINA
Micelio y conidios de hongos de color oscuro, producidos por Me-
lioalaceas o Capnodiaceas. A pesar de que son saprfitos, llegan a
formar verdaderas costras sobre la epidermis de las hojas, de los
frutos o de las ramas que disminuyen el rea fotosinttica
55

Entrega de los datos de identificacin de los sntomas y de los signos.

FECHA DE ENTREGA:
FECHA DE RETROALIMENTACIN:

FITOPATOLOGA
Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam,
Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San
Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp.

Blancard, Dominique. 1990. Enfermedades del Tomate: Observar, Identificar,


Luchar. Mundi-Prensa. Espaa.

Blancard, Dominique. 1991. Enfermedades de Cucurbitaceas: Observar,


Identificar, Luchar. Mundi-Prensa. Espaa.

Brunt, Alan; Crabtree K., Gibbs A. 1990. Viruses of Tropical plants. Descriptions
and List from the VIDE Database. CAB International Australian Center for
International Agricultural Research (ACIAR). U.K. Redwood Press Ltd.
London. 707 pp.
56 Shew H.D. and G.B. Lucas 1991. Compendium of tobacco diseases. St. Paul
Minnesota American Phitopatologhical Society. U.S.A.

Hull, R. 2002. Matthews Plant Virology. Fourth Ed. Academic Press. San Diego,
San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo. 1001 pp.

Kurstak, R.E.F. 1991. Plant virus infections. Elselvier/North-Holland. Biomedical


Press.

Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York. London,
Toronto, Sydney, S. Francisco. 897 pp.

Matthews, R.E.F. 1992. Diagnosis of Plant Virus Diseases, Ed. C.R.C. Press. USA.
374 pp.

FITOPATOLOGA
Prctica 7
CONTROL BIOLGICO

En la agricultura convencional moderna, los fungicidas son la principal herramienta emplea-


da para el control de hongos fitopatgenos. El uso continuado de estos productos qumicos
para el control de estos microorganismos ha provocado a travs del tiempo el desarrollo de
resistencia a los fungicidas utilizados y la contaminacin en los agroecosistemas producti-
vos, afectando de manera negativa los servicios ambientales bsicos. Por ello, la tendencia
actual ha sido racionalizar el uso de fungicidas y desarrollar nuevas alternativas de control
a travs del uso de agentes de control biolgico. En la actualidad, se han desarrollado bio-
preparados con base en microorganismos antagonistas como Trichoderma spp, que pueden
reducir el impacto de los patgenos vegetales. Este hongo antagonista permite el control de
patologas fungosas en rboles frutales, forestales y hortalizas, es posible aislarlo localmen-
te y reproducirlo en forma masiva para su aplicacin a nivel de campo. 57
Comprobar el efecto antagonista de Trichoderma spp. con algunos hongos fitopatgenos.

1.Investigacin bibliogrfica de la importancia del antagonismo en el control biolgico.

Cepas puras de Trichoderma spp. Cepas pura de hongos Fitopatgenos


Cajas de Petri estriles con PDA Mechero
Papel parafilm Bistur
Alcohol en matraz erlenmeyer Incubadora
Alcohol en atomizador Cerillos
Papel absorbente Agua destilada estril
Campana de flujo laminar

FITOPATOLOGA
1. Preparar la campana de flujo laminar y trabajar en la zona de asepsia.
2. Rotular las cajas de Petri en donde se van a llevar a cabo las pruebas duales.
3. Esterilizar el bistur y enfriarlo.
4. De la cepas puras de cada una de las especies antagnicas se toma un cuadro de
aproximadamente 1 cm2 y se coloca dentro de uno de los extremos de la caja
Petri, opuesto a ste y de forma equidistante se coloca un cuadro del mismo
tamao pero de la especie fitopatgena correspondiente.
5. Se incuba a 27 C, cuando desaparezca la condensacin en el botoon de la caja
de Petri sellar las cajas con papel parafilm.
6. Se hacen las observaciones hasta que los crecimientos cubran la totalidad de la
superficie de crecimiento de las cajas de Petri.
7. Clasificar el grado de antagonismo de las pruebas duales de acuerdo con la es-
cala de Bell et al (1982) (tabla 1)-.
8. A los siete das de crecimiento de las colonias antagnicas, medir los centme-
tros de crecimiento de cada una de ellas. Registre los datos en una tabla compa-
rativa entre los gneros evaluados.

58 Tabla 1. Escala de clases para evaluar el grado de antagonismo de una especie.

Clase 1 El agente de control biolgico crece completamente sobre la colonia del


patgeno y cubre toda la superficie del medio de cultivo.
Clase 2 El agente de control biolgico crece al menos sobre dos terceras partes
de la superficie del medio de cultivo.
Clase 3 El agente de control biolgico y el patgeno cubren aproximadamente
la mitad de la superficie del medio de cultivo.
Clase 4 El patgeno crece al menos en las dos terceras partes del medio de cul-
tivo limitando el crecimiento del agente de control biolgico.
Clase 5 El patgeno crece sobre la colonia del agente de control biolgico ocu-
pando toda la superficie del medio de cultivo.

Fuente: Bell et al, 1982.

1. Introduccin: importancia de Trichoderma spp. como agente de control


biolgico.
2. Clasificacin de los antagonismos observados de acuerdo a la tabla 1.
3. Discusin y conclusiones.
4. Bibliografa.

FITOPATOLOGA
Prctica 7
Bell, D.K., Well, H.D. and Markham, C.R. 1982. In vitro antagonism of Trichoderma
species against six plant pathogens. Phytopathology 72: 279-382.

Chet I. 1987. Trichoderma- application, mode of action, and potential as a


biocontrol agent of soliborne plant pathogenic fungi. In Innovative approaches
to plant disease control (I. Chet,Ed.), pp. 137-159. Wiley, New York.

Harman, G.E.; Howell .Ch; Viterbo, A; Chet. I. and Lorito. M. 2004. Trichoderma
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Sutton, J.C. and Peng, G. 1993. Biocontrolof Botrytis cinerea in Strawberry leaves.
Phytopathology 83:615-621.

59

FITOPATOLOGA
ANEXOS

FITOPATOLOGA
Anexo I
PROYECTO SEMESTRAL
El Proyecto Semestral es un trabajo particular que deber desarrollar cada equipo a travs
del semestre. Este trabajo pretende que el alumno se familiarice con algn patgeno en par-
ticular, siguiendo los postulados de Koch, para lograr la correcta identificacin del agente
causal, de tal forma que pueda extrapolar sus conocimientos para un diagnstico adecuado
de cualquier enfermedad vegetal en su ejercicio profesional.

En la primera sesin de laboratorio se les proponen algunos temas a escoger, aunque puede
ser el mismo equipo el que lo sugiera. En la segunda sesin todos los equipos deben tener
su tema definido. En la tercera sesin deben entregar su proyecto de trabajo, el cual debe
contener los siguientes puntos:

1. INTRODUCCION: justificacin del trabajo; es decir, el QU, el PORQU y el


PARA QU.
63
2. OBJETIVOS: ante el planteamiento de un problema, se deben proponer objeti-
vos a cumplir para poder solucionarlo.
3. HIPTESIS: es la probabilidad que se supone como la solucin al problema
planteado y, por lo tanto, debe corresponder a los objetivos.
4. METODOLOGIA: es la descripcin de los pasos a seguir para cumplir los obje-
tivos.
5. BIBLIOGRAFA.

Cada equipo tiene que programar la fecha de siembra de las plantas que necesite, indicn-
dolo en la metodologa.

Una vez que se terminen las prcticas, todas las sesiones subsecuentes se dedican exclusiva-
mente al desarrollo del seminario.

Al finalizar el semestre, hay una sesin para la EXPOSICIN DE LOS PROYECTOS SEMES-
TRALES. Cada equipo tiene 15 minutos para exponer y cinco minutos para preguntas.

El mismo da de la exposicin, se entrega un reporte final que contenga los siguientes pun-
tos:

FITOPATOLOGA
1. INTRODUCCIN.
2. OBJETIVOS.
3. HIPTESIS.
4. REVISIN BIBLIOGRFICA. sta debe incluir:
4.1 Historia y distribucin geogrfica del patgeno.
4.2 Importancia econmica.
4.3 Etiologa.
4.3.1 Clasificacin.
4.3.2 Morfologa.
4.3.3 Patognesis.
4.4 Sintomatologa.
4.5 Epidemiologa.
4.6 Control.
5. METODOLOGA.
6. RESULTADOS: se describe lo obtenido en el experimento.
7. DISCUSIN: es la parte ms importante del trabajo, pues se hace el anlisis
de los resultados, interrelacionndolos con los objetivos e hiptesis planteados,
fundamentndose en la informacin obtenida en la revisin bibliogrfica).
8. CONCLUSIONES: conocimiento obtenido a travs de todo el trabajo
64 9.
experimental.
BIBLIOGRAFA.

El reporte debe ser en Word Arial 12, impreso y en electrnico y con buena presentacin.
A la entrega de este reporte, debe de anexarse:

La copia de por lo menos tres artculos recientes referentes al tema del seminario.

Material didctico de apoyo, en referencia al seminario (diapositivas, lminas,


preparaciones, material de herbario).

FITOPATOLOGA
Anexo II
ELABORACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
1.- PDA (papa-dextrosa-agar)

Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento, crecimiento y reproduccin de varios


hongos y de bacterias como Xanthomonas y Agrobacterium.

Ingredientes:

Papa 200 gr Dextrosa 20 gr


Agar 15 gr Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

Partir 200 gr. de papa sin cscara y cubrirlos con agua destilada.
65
Se deja hervir durante 15 minutos. Concluido este tiempo se cuela la infusin o
caldo de papa a travs de manta de cielo.
Se disuelve el agar en 500 mL de agua destilada, calentando ligeramente, se le
agrega la dextrosa y se disuelve.
Se aade la solucin de agar dextrosa al caldo de papa mezclando bien y se
afora con agua destilada a 1000 mL y se esteriliza.

2.- AA (agua-agar)

Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de hongos del suelo como Pythium y
algunos actinomicetos.

Ingredientes:

Agar 15 gr.
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

Se disuelve el agar en el agua destilada, calentando ligeramente, se afora a 1000 ml y se


esteriliza.

FITOPATOLOGA
3. AN ( agar nutritivo o extracto de carne-agar)

Este medio de cultivo nos sirve para cultivar bacterias como Erwinia, Pseudomonas y
Corynebacterium.

Ingredientes:

Extracto de carne de res 3 gr


agua destilada aforar a 1000 mL
Peptona 15 gr
Agar 5 gr

Procedimiento:

Disolver el agar en 500 ml. de agua destilada calentando ligeramente, luego agregar la pep-
tona y el extracto de carne y disolver, por ltimo aforar con agua destilada a 1000 ml.

4.- HMA (harina de maz-agar)

66 Este medio de cultivo sirve para aislar hongos de los gneros Pythium y Phytophthora.

Ingredientes:

Harina de maz 20 gr agar 20 gr


Peptona 20 gr dextrosa 20 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

En 500 ml. de agua destilada a 70 C se agrega la harina de maz y se calienta por 1 hr. a 60
C se filtra la infusin a travs de manta de cielo. La solucin filtrada se clarifica centrifu-
gando por 20 minutos a 3000 RPM. Decantar y juntar el lquido sin slidos producto de la
centrifugacin. Disolver el agar, la dextrosa y la peptona en 300 ml de agua destilada calen-
tando ligeramente. Aadir el lquido centrifugado a la solucin de agar-dextrosa-peptona y
aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar.

FITOPATOLOGA
Anexo II
5.- HFA (harina de frijol-agar)

Este medio de cultivo se utiliza para cultivar algunas especies del gnero Phytophthora.

Ingredientes:

Harina de frijol 30 gr
Agar 20 gr
Agua destilada aforar a1000 mL

Procedimiento:

En 500 mL de agua destilada se agregan los 30 gr. de harina de frijol, se calienta la solucin
a 60-70 C. Se filtra la infusin a travs de manta de cielo. La solucin filtrada se clarifica
centrifugando durante 20 minutos a 300 RPM. Se decanta y se junta el lquido sin slidos,
producto de la centrifugacin.

Disolver el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Aadir el lquido cen-
trifugado a la solucin de agar mezclndolo bien. Por ltimo, aforar con agua destilada a
1000 ml. Esterilizar. 67
6.- JFA ( jugo de frijol-agar)

Este medio de cultivo se emplea para cultivar Colletotrichum lindemuthianum.

Ingredientes:

Jugo de frijol 215 mL (proveniente de vainas prensadas o molidas)


Agar 10 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

Obtener el jugo de frijol prensado o moliendo las vainas verdes.


Disolver el agar en 285 mL de agua destilada, calentando ligeramente. Aadir la solucin de
agar al jugo de frijol y esterilizar.

FITOPATOLOGA
7.- V8A (jugo V8-agar)

Este medio se prepara de dos formas, segn la especie de hongo que desee cultivar.

a) Para aislar a Phytophthora infestans y Phythium.

Ingredientes:

Jugo V8 centrifugado* 20 mL
CaCO3 4.5 gr
Agar 15 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

b) Para aislar a Phytophthora parastica y P. palmivora.

Ingredientes:

Jugo V8 centrifugado* 100 mL


CaCO3 2 gr
68 Agar
Agua destilada
15 gr
aforar a 1000 mL

*En ambas frmulas se puede sustituir el jugo V8 por jugo de tomate simple.

Procedimiento:

Agregar el CaCO3 al jugo V8 o de tomate. Agitar hasta disolverlo. Dejar reposar la solucin
durante 10 min. Centrifugar para clarificar durante 20 minutos a 3000 rpm. Se decanta y
se junta el lquido sin slidos, resultante de la centrifugacin, hasta completar la cantidad
requerida.

Para la frmula A) disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente. Aadir a la


solucin de agar el jugo V8 o de tomate centrifugado y aforar con agua destilada a 1000 mL.

Para la frmula B) utilizar 900 mL de agua destilada para disolver el agar, mezclando esta
solucin con el jugo V8 o de tomate centrifugado.

FITOPATOLOGA
Anexo II
8.- JTA ( jugo de tomate-agar)

Este medio de cultivo se utiliza para aislar a Phytophthora capsici.

Ingredientes:

Jugo tomate natural 60 mL


CaCO3 0.6 gr
Agar 14 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

Se muelen los tomates y se cuelan a travs de una manta de cielo. El jugo se mezcla con
el CaCO3, se agita bien y se deja reposar durante 10 minutos. Para clarificar, se centrfuga
durante 20 minutos a 3000 rpm. Se decanta y se junta todo el lquido centrifugado hasta
completar la cantidad requerida. Se disuelve el agar en otro poco de agua destilada (800 mL)
y se aade la solucin centrifugada, mezclando bien. Se esteriliza.

9.- AvA (avena-agar) 69


Este medio de cultivo se utiliza para aislar especies de los gneros Phytophthora y Pythium.

Ingredientes:

Avena 60 gr
Agar 12 gr
Extracto de levadura 2 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

En 600 mL de agua remojar 60 gr de avena durante 24 horas. Despus hervir durante 30


minutos. Filtrar la infusin a travs de una manta de cielo. Para clarificar la solucin colada,
centrifugar durante 20 minutos a 300 RPM. Decantar y juntar el lquido sin slidos producto
de la centrifugacin. Disolver el agar en 400 ml de agua destilada calentado ligeramente.
Disolver el extracto de levadura en la solucin de agar. Aadir a esta solucin la infusin de
avena centrifugada, mezclar bien y aforar con agua destilada a 1000 mL. Esterilizar.

FITOPATOLOGA
10. MSA (malta -sal-agar)

Este medio de cultivo se utiliza para aislar principalmente a los hongos que atacan granos
almacenados.

Ingredientes:

NaCl 7.5 gr
Extracto de malta 20 gr
Agar 7.5 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

En 400 mL de agua disolver el agar calentando ligeramente. Disolver el extracto de malta


en la solucin de agar. En 500 mL de agua destilada disolver la sal calentando ligeramente.
Aadir la solucin de extracto de malta-agar, la solucin de sal, mezclando bien. Aforar con
agua destilada a 1000 mL. Esterilizar por NO MS de 15 minutos.

70 11. TSA (JUGO DE TOMATE-SAL-AGAR)

Este medio de cultivo se utiliza para aislar hongos de granos almacenados.

Ingredientes:

Jugo de tomate de lata 90 mL


NaCl 100 gr
Agar 15 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

En 500 mL de agua destilada se disuelve el jugo de tomate-agar (medio deshidratado) y


el agar, calentando ligeramente. Si se mezcla con el agar y 200 mL de agua, se centrifuga
durante 20 minutos a 3000 rpm, y se mezcla bien calentado de modo ligero. En 400 mL
de agua se disuelve la sal calentando ligeramente. Se aade a esta solucin la de jugo de
tomate-agar mezclando bien y se afora a 1000 mL. Esterilizar.

FITOPATOLOGA
Anexo II
12. BA (Bonner-Addicott)

Este medio de cultivo sirve para aislar y desarrollar a Phymatotrichum omnivorum.

Ingredientes:

KNO3 (Nitrato de potasio 0.808 gr


MgSO4 o7H2C (Sulfato de magnesio) 0.0369 gr
Ca(NO3)H2O (Nitrato de calcio) 0.236 gr
KH2PO4 (Fosfato dicido de potasio) 0.0108 gr
KCl (Cloruro de potasio) 0.6486 gr
FeCl3 (Tartato Frrico) 0.0010 gr
Glucosa 20.00 gr
Agar 25.00 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

En 500 ml de agua destilada disolver el agar y la glucosa calentando ligeramente. En 500 ml


de agua destilada disolver todos los dems componentes uno por uno. Aadir a la solucin
de glucosa-agar la solucin del resto de los componentes, mezclando bien. Ajustar el pH a
71
7.0-7.5, midiendo con papel pH y agregando HCl si se necesita acidificar o NaCl si se trata
de alcalinizar.

13. MM (medio de Martin)

Este medio de cultivo se utiliza para aislar a los hongos del suelo.
Ingredientes:

Dextrosa10 gr Estreptomicina...1gr
Peptona.. 5 gr MgSO4.7H2O(Sulfato de Magnesio Hidratado)..0.5 gr
KH2PO4.1 gr Rosa de bengala3.5 mL
Agar..20gr Agua destiladaaforar a 1000 mL

Procedimiento:

Para preparar la solucin de rosa de bengala se disuelve 1 gr de colorante en 100 ml de agua;


de esta solucin se toman los 3.5 mL para agregarlos a 1000 mL de medio de cultivo.

En 500 mL de agua destilada se disuelve el agar, calentando ligeramente, y en los restantes


500 mL se disuelven uno a uno los dems componentes. Despus se mezclan bien las dos
soluciones.

FITOPATOLOGA
La estreptomicina se prepara de manera separada, momentos antes de vaciar el medio en las
cajas de Petri. Se disuelve 1 gr de estreptomicina en 150 mL de agua destilada estril. Se
agrega 0.05 ml de estreptomicina en solucin a cada caja de Petri (esto es para inhibir el
crecimiento de las bacterias).

14. BK (B de King)

Este medio de cultivo sirve para aislar diferentes gneros de bacterias.

Ingredientes:

Peptona 20 gr
K2HPO4 1.5 gr
MgSO4 1.5 gr
Agar 15 gr
Glicerina 10 mL
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:
72 Se disuelve el agar en 500 mL de agua calentando ligeramente y despus se le aade la gli-
cerina. En otros 300 mL de agua se disuelven los dems componentes agregndole a esta
solucin la de agar-glicerina. Se mezcla bien y se esteriliza.

15. VFA (vainas de frijol-agar)

Este medio de cultivo sirve para aislar a Colletotrichum lindemuthianum.

Ingredientes:

Vainas de frijol 250 g.


Agar 15 gr
Agua destilada aforar a 1000 mL

Procedimiento:

En 500 mL de agua destilada se aaden las vainas cortadas en trozos muy pequeos. Se ca-
lienta a 60 C durante 30 minutos. Se filtran a travs de una manta de cielo y papel filtro. Se
disuelve el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente, se le aade la infusin
filtrada, mezclando bien y se afora a 1000 mL. Esterilizar.

FITOPATOLOGA
Anexo III
PURIFICACIN DE PARTCULAS VIRALES
Purificacin de partculas virales

REACTIVOS
Fosfato potsico
Sulfito de sodio
Cloroformo
Tetracloruro de carbono
Glicol-polietileno (PEG)

SOLUCIONES

Solucin 1: Fosfato potsico 0.5 M (1:2 p/v), pH=7.5, con 0.5 % sulfito de sodio.
Solucin 2: Glicol-polietileno al 6 % (PEG).
73
Solucin 3: Fosfato de potasio 0.25 M, pH=7.5
Solucin 4: Glicol-polietileno al 20.0 % (PEG).

METODOLOGA

1. Pesar un gramo del tejido cosechado.


2. Lavarlo bajo el chorro de agua corriente.
3. Someterlo a un lavado con Tween 20 sobre agitador magntico por tres minutos.
4. Lavarlo con una solucin de cloro al 10 % por cuatro minutos en agitador mag-
ntico.
5. Enjuagar con agua destilada estril (150 mL en vaso de precipitado) sobre agi-
tador magntico por un minuto.
6. Dar un enjuague final con agua destilada estril (150 mL en vaso de precipitado)
sobre agitador magntico por un minuto.
7. Secar en papel filtro.
8. Colocar en bolsa para macerar.
9. Agregar 2 mL de la solucin 1.
10. Macerar.
11. Agregar 1 mL de la solucin al macerado.
12. Macerar.

FITOPATOLOGA
13. Decantar en un tubo tipo Ependorf, en caso necesario agregar 1 mL de solucin
1 para facilitar la decantacin.
14. El macerado se homogeniza durante un minuto.
15. Enseguida se agregan al homogenizado cloroformo y Tetracloruro de Carbono
(0.5:1 v/p de cada uno).
16. Homogeneizar dos minutos ms.
17. Centrifugar a 5000 rpm durante cinco minutos.
18. El sobrenadante que resulta se trata con la solucin 2 y se agita en fro (4C)
durante dos horas.
19. Se centrfuga a 8 500 rpm durante diez minutos.
20. El precipitado obtenido se resuspende en la solucin 3 y se incuba durante seis
horas.
21. Despus se centrfuga a 10,000 rpm durante diez minutos.
22. Al sobrenadante se aade la solucin 4 (2 mL PEG/5 mL sobrenadante).
23. Se incuba durante una hora en fro (4 C).
24. El precipitado se centrfuga a 12,000 rpm durante diez minutos.
25. Despus se resuspende en la solucin 3 (0.5 mL de solucin por cada 100 g de
tejido).
26. Despus de 12 horas, se centrfuga a 10,000 rpm durante diez minutos.
74 27. Se usa el sobrenadante para el diagnstico.

FITOPATOLOGA
Anexo IV
MICROCULTIVO

Una vez que se tiene el resultado de las diferentes tcnicas de aislamiento como lo es la ob-
tencin de la cepa pura, el siguiente paso para cumplir a cabalidad con el segundo postulado
de Koch es la identificacin del agente causal y una herramienta ms para cumplir con este
objetivo, en caso que este agente causal sea un hongo como en la mayora de las enferme-
dades que limitan la produccin agrcola: es la tcnica de microcultivo; con sta se obtienen
las distintas fases del ciclo de vida de los hongos, que va de germinacin de la espora, for-
macin del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciacin de las estructuras reproductivas
asexuales y sexuales. Se debe dar un manejo de tiempos en el desarrollo de los hongos para
poder observar las estructuras desde el inicio de su formacin.
Por ejemplo, esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongos en los que es difcil
observar la formacin de los condios sobre los conidiforos y la forma y estructura de es-
tos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se desprenden o se rompen. Mediante
75
este mtodo se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y esporulacin en todos
sus detalles y as tener elementos morfolgicos de estructuras somticas y reproductivas
completas para as poder hacer la identificacin con mayor confiabilidad y conocer a los
hongos como agentes causales de enfermedades en los cultivos de importancia agrcola
(Dhingra, and Sinclair, 1985; Trigiano, Windham,. and Windham, 2004).

Conocer la tcnica de microcultivo para la caracterizacin de estructuras somticas y repro-


ductivas para identificar morfolgicamente a los hongos fitopatgenos.

Recipiente con alcohol al 96 %. Agua estril.


Pinzas de diseccin. Papel parafilm.
Aguja de diseccin. Punta.
Bistur.
Caja de Petri estriles con PDA.
Caja con cepa pura.
Caja de Petri con portaobjeto,
cubreobjeto y triangulo de vidrio (estril).
Pipeta.

FITOPATOLOGA
1. Con un bistur estril se cuadricula el medio de cultivo de la caja de Petri con
PDA en cuadros de aproximadamente 1 cm2. este paso se realiza en el interior
de una campana de flujo laminar preparada para trabajar bajo condiciones asp-
ticas.
2. Dentro de la cmara de flujo laminar, con la ayuda de un bistur estril, uno de
los cuadros de PDA se transfiere al portaobjetos que est en la cmara de micro-
cultivo; este portaobjetos debe de estar sobre el tringulo de vidrio.
3. Con la aguja de diseccin estril o con un asa bacteriolgica estril se lleva el
inculo a las orillas superiores e inferiores del cuadro de PDA.
4. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de PDA inoculado, procurando que
quede bien centrado.
5. Se agregan 2 mL de agua estril, en el fondo de la cmara de microcultivo para
mantener la humedad, sin mojar el rea de crecimiento del hongo. Los pasos
1-5 se llevan a cabo en el interior de una campana de flujo laminar o en mesas
de trabajo en condiciones aspticas.
6. Se sella el dispositivo de microcultivo con papel parafilm y se rotula.
7. El crecimiento del hongo se detiene cada 24 horas.
8. Se repiten los pasos del 1 al 7 para ms microcultivos, y detener su desarrollo a
la 48, 72 y 96 horas respectivamente.
76

FITOPATOLOGA
Prctica 1
Dhingra, O. D. and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press.
355 pp SB 732.5 D45.

Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos: Mtodos


de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55.

Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory and
monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84.

Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37.

Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi.
C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63.

Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts
and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C.,
77
413 pp. C.B. SB732.56 P53.

Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel


Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.

FITOPATOLOGA
Anexo V
MEDIDA DE ESTRUCTURAS DE
AGENTES FITOPATGENOS CON
MICROSCOPIO PTICO
Para identificar a un agente fitopatgeno y cumplir cabalmente con el segundo postulado de
Koch, adems de los datos correspondientes al aspecto de los sntomas que hayan causado
en su hospedante, o de las colonias que hayan formado sobre las placas en medios de cul-
tivo, de los datos morfolgicos que hayan resultado de la tcnica de microcultivo es nece-
sario saber las medidas de las estructuras somticas y reproductivas que se observan en el
microscopio ptico para tener una identificacin confiable del agente causal. Por ejemplo,
79
si se habla de hongos fitopatgenos las estructuras que se miden para identificarlos son:
picnidios, acrvulos, esporodoquios, sinemas, peritecios, apotecios, clestotecios, entre otras.
The American Phytopathological Society en todas sus obras de enfermedades de los culti-
vos agrcolas, las claves que usa para la identificacin de los diferentes grupos de hongos
fitopatgenos estn en funcin del tamao de las estructuras somticas y de reproduccin
de este grupo de fitopatgenos. La identificacin del agente causal es bsica para precisar el
diagnstico y as poder establecer el mejor mtodo de control para estas limitantes biolgi-
cas en la produccin agrcola.

Que el alumno aprenda a calibrar y medir clulas, estructuras somticas y reproductivas de


importancia taxonmica de agentes fitopatgenos con el microscopio ptico para su identi-
ficacin morfolgica.

FITOPATOLOGA
Un microscopio ptico.
Un micrmetro ocular.
Un portaobjetos micromtrico.
Preparaciones tanto temporales como permanentes de estructuras fitopatgenas.

a) Calibracin de los lentes objetivos.

1. Se coloca en el ocular del microscopio ptico el micrmetro ocular -aunque a menudo se


trabaja con el ocular micromtrico permanente puesto en el microscopio-. Hay que evitar
que quede invertida la escala (ver Fig. 1).

80

Fig. 1. A) Colocacin de la reglilla ocular, B) Escala de la reglilla ocular micromtrica

2. Sobre la platina del microscopio se pone el micrmetro del objeto similar portaobjeto
como si fuese una preparacin.

Fig. 2.- Escala de la reglilla portaobjeto

3. Moviendo la platina se hace coincidir el margen de una raya del ocular micromtrico con
una del portaobjetos micromtrico. Puesto que las rayas del portaobjetos aparecen tanto ms
gruesas cuanto mayor son los aumentos, la superposicin de las lneas ha de ser siempre al
comienzo del margen exterior de stas.

FITOPATOLOGA
Anexo V
4. Moviendo la platina se observa a travs de microscopio con ambas reglillas colocadas se
les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuntas lneas del micr-
metro ocular concuerdan con cuntas lneas del micrmetro del objeto se hace coincidir el
margen de una raya del micrmetro ocular con una del micrmetro del objeto. Ver figura 3.


Fig. 3.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica

5. Cuando se observa a travs del microscopio con ambas reglillas micromtricas colocadas,
se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuntas lneas del micr-
metro ocular concuerdan con cuntas lneas del micrmetro del objeto. En el campo visual,
la reglilla ocular se encuentra graduada del 0 al 10 a un lado la reglilla del objeto con 100
divisiones; como cada lnea del micrmetro del objeto corresponde a 10 micras, se hacen
coincidir ambas reglillas en el cero, en el otro extremo de las reglillas se observa cul de las
100 lneas de la reglilla ocular coinciden con otra de la reglilla del portaobjetos. Y se hacen
los clculos correspondientes.
81
Ejemplos 1: se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 1) y se observa

que en el otro extremo de las reglillas el 100 de la reglilla ocular coincide con el 97
de los trazos de la reglilla del objeto; es decir 0.97 mm; por lo tanto, una lnea del
micrmetro ocular es equivalente a 0.009 mm = 9 m y este valor es el que utilizamos
para definir el tamao de cada estructura que se mide. Es obvio que esta calibracin
es para este microscopio, con ese ocular y objetivos respectivamente. Esta operacin
se deber repetir cuando se cambie de microscopio o de objetivos para evitar errores.

Ejemplo 2: se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 2) y se observa

que siete divisiones del ocular micromtrico coinciden con dos divisiones del por-
taobjetos micromtrico. Puesto que cada divisin de ste equivale a 10 m, el valor
de cada divisin del ocular se obtiene mediante una simple regla de tres: 7 divisiones
del ocular = 20 m; una divisin del ocular = 20/7 = 2.8 m (Ver Fig.4).


Fig. 4.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica, donde coinciden la primera lnea de las dos
reglillas y la lnea 2 de la reglilla portaobjetos con la siete de la ocular

FITOPATOLOGA
b) Medicin de ejemplares y estructuras de micromicetes.

1. Una vez que se ha cuantificado el valor de cada lnea en la reglilla del ocular ( 9 y 2.8 m
en los ejemplos), se puede retirar el portaobjetos micrmetro y en su lugar se puede colocar
un portaobjetos normal con el espcimen a medir y se deja colocado el micrmetro ocular,
de manera que se puede colocar una clula o estructura celular cualquiera, en este caso, se
hace coincidir una raya de la escala con los mrgenes de la estructura fngica elegida, y se
cuenta el nmero de divisiones de la escala comprendidas en la longitud y en el ancho de
dicha estructura.

Ejemplo 3: si la estructura del hongo se extiende a lo largo de 16 lneas y cada una de


ellas vale 9 micras, segn se explic antes, por tanto el tamao total de esta clula es
de 16 x 9, es decir 144 micras.

2. Si se llega a cambiar el objetivo por otro menor aumento se debe repetir la operacin para
encontrar nuevos valores en la reglilla, esta medicin se puede realizar en un microscopio
mono o binocular, pero en este ltimo caso se tiene que mantener inalterada la distancia
interpupilar, puesto que el cambio altera la distancia mecnica y el valor del micrmetro
depende de ella.
82

Barrera, E. H y R. Crdenas 1997 El microscopio ptico FES- Iztacala-UNAM P y V


editores. Estado de Mxico. 86pp.

Barthelemy, E. R. Dawson, R. J., y A. E. Lee. 1984. Tcnicas para el Laboratorio de


Biologa. 2. Edicin. CECSA editor. Mxico, D. F. Mxico. 148 pp.

Mateu, B. 1972. Atlas de Microscopia. 4. Edicin. Jover Ediciones. Barcelona, Espaa.


96 pp.

Muntaola, M. 1999. Gua de los hongos microscpicos. 1. Edicin. Omega editores.


Barcelona, Espaa. 167 pp.

____________. 1996. El Microscopio ptico. FES Zaragoza UNAM. Mxico, D. F.


Mxico.

FITOPATOLOGA
Anexo VI
CUANTIFICACIN DE LA
CONCENTRACIN DE INCULO

Cuando se trata inocular hospedadores para cumplir con los postulados de Koch y as efec-
tuar el diagnstico fitosanitario, evaluar la resistencia de las plantas a enfermedades, efec-
tuar estudios especficos (epidemiolgicos) del patgeno, o para desarrollar un micoherbici-
da, es necesario recurrir a la inoculacin artificial, ya sea en invernadero o en campo. Para
esto se utiliza inculo a una concentracin especfica (es decir, un nmero determinado de
esporas por mililitro), segn el patgeno y hospedero en estudio, con la finalidad de obtener
una buena infeccin que permita observar las diferencias entre los materiales evaluados.
Conocer el nmero de esporas por mililitro, para el caso de micoherbicidas, adems de que
se requiere en las pruebas de patogenecidad, en las pruebas seguridad y en estudios epide-
83
miolgicos; el conocimiento de la concentracin de esporas por mililitro es bsico para el
manejo del producto comercial y la aplicacin de micoherbicidas en campo.

Para determinar la concentracin se usa una cmara Neubauer o hemacitmetro, con el cual
se hacen conteos de esporas en campos de dimensiones conocidas, que darn el nmero de
esporas por mililitro de la suspensin inicial. De esta forma, por medio de diluciones se
obtiene el inculo en la concentracin deseada.

Conocer y manejar la cmara Neubauer para realizar el clculo de la concentracin de


inculo, que permitan entender las concentraciones comerciales y la aplicacin de micoher-
bicidas.

Cultivos puros de hongos aislados de malezas enfermas, tubos falcn de 15 mL, 100 mL de
agua destilada estril, agitadores de vidrio esteriles, vortex, centrifuga, tween 20 R, pipetas,
colorantes (slo en caso necesario), cmara de Neubauer, microscopio compuesto, matraz
erlenmeyer de 250mL.

FITOPATOLOGA
1. Prepare en agua destilada estril una suspensin de propgulos a contar de mayor concen-
tracin que la deseada (solucin madre).

a) Colocar un volumen conocido de agua destilada estril o solucin fisiolgica en


los cultivos de hongos en las cajas de Petri y raspar los cultivos.
b) Decantar el raspado en tubos de centrfuga, someterlos un minuto en vortex y
centrifugar de tres a cinco minutos a una velocidad de 6000 revoluciones, sepa-
rar el sobrenadante del precipitado. Si los propgulos tienden a permanecer uni-
dos o aglomerados agregue tween 20 R a razn de 60 ppm mezclando sin agitar.

2. Si los propgulos son hialinos y pequeos, tome una alcuota pequea y agregue un tinte
vital azul de algodn, fucsina cida que indique las clulas vivas, el tinte facilita la obser-
vacin de las clulas poco refractivas. Use el tinte en forma concentrada, o si no tome en
cuenta el factor de dilucin que interviene.

3. Coloque el cubreobjetos especial sobre los rieles paralelos a ambos lados de la cmara,
frotando ligeramente para conseguir un buen contacto, con una pipeta delgada (que no go-
te) tome una muestra de la suspensin y aplquela a la ranura al centro del margen de la
cmara donde ser absorbida con rapidez por la fuerza capilar, qutela a tiempo para que no
84 entre un exceso que se rebose en los bordes, lo que introducira un factor de error.

4. Monte al microscopio y ubique el rallado de la cmara con el objetivo de menor aumento,


girando luego el revolver para mayores aumentos (no se debe usar el de inmersin). Deje el
tiempo necesario para que los propgulos se asienten en el fondo de la cmara (dos minutos).

5. El fondo de la cmara tiene un rayado Nueubauer (Fig.1) de 9 mm2 (3 mm por lado)


dividido en 9 cuadrados principales (CP) de 1 mm por lado. El campo de conteo que se debe
utilizar depende del tamao de los conidios del hongo con el que se est trabajando. Si stos
son grandes, lo ms conveniente es contar en los cuatro cuadros de las esquinas (A, B, C, D)
ms el cuadro del centro (E) (Fig.1). El conteo se repite por lo menos seis veces y se saca
un promedio (Tabla 1). ste se multiplica por una constante. De ese producto se obtendr la
concentracin en conidios/ml.

FITOPATOLOGA
Anexo VI

Figura 5 Rayado del hemacitmetro que muestra los campos de conteo (A, B, C, D, E).

85


Tabla 2. Promedios de conteo de estructuras

Como el volumen sobre cada C.P. es 0.1mm3, para calcular la concentracin por cc (10000
veces mayor), se procede en la forma siguiente:

SUMA de 5 C.P.x 2000= nmero/cc

Cuando los propgulos son pequeos se usa el C.P. central que est dividido en 25 cuadros
secundarios (C.S.) de 0.2 mm por lado, cada uno de los cuales est dividido en 16 cuadrados
menores de 0.05 mm por lado. Entonces la concentracin se calcula as:

NMERO en el C.P. CENTRAL x 10000 = nmero/ cc

FITOPATOLOGA
Esta concentracin corresponde a la de la suspensin inicial. Cuando se desea calcular una
dilucin determinada, se aplica la frmula siguiente:

C1 V1 = C2 V2

Donde:

C1 = Concentracin inicial (conocida en el conteo)


V1 = Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inculo)
C2 = Concentracin final deseada (segn el estudio a realizar)
V2 = Volumen final (desconocido)

6. Limpie las superficies de la cmara, entre cada observacin enjuague con agua destilada
estril y seque por contacto con papel o tela absorbente y por ltimo con papel seda. Se
puede utilizar un jabn suave o alcohol.

86
Dhingra, O. D. and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press.
355 pp.

French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA. Costa


Rica. 287pp.

Douglas Bollete, C., Charles Quimby, P., Connick,Jr.,W., Daigle,D.,and


Fulgham,F.1991. Progress in the production, formulation, and application of
mycoherbicides. 209-222 pp. In TeBeest,D. Microbial control of weeds. Chapman
and Hall.

Duveiller, R.P. Singh, M. Henry e I. Garca A. 2005. Gua prctica para la identificacin
de algunas enfermedades de trigo y cebada. Segunda edicin. Mxico, D.F.:
CIMMYT 69 pp.

Narayanasamy, P., 2001. Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
Dekker Inc., 518 pp.

Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology, Concepts
and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C.
413 pp.

FITOPATOLOGA