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MICROBIOLOGIA 1

SEMANA 14

INACTIVACIN DE MICROORGANISMOS:
RADIACIONES ULTRAVIOLETAS, PULSO DE
LUZ, ALTAS PRESIONES, PULSOS
ELCTRICOS DE ALTO VOLTAJE,
ULTRASONIDO
30/05/2017

Dra. SONIA HERRERA SANCHEZ


30/05/2017 MICROBIOLOGIA 2

RADIACIONES
ULTRAVIOLETAS
RADIACIONES ULTRAVIOLETAS
Fundamento:
Radiaciones no ionizantes.
Fuente: Lmparas de mercurio de alta y baja presin

Ventajas:

Aumento de la temperatura inapreciable


Bajo costo
Poca prdida de nutrientes
Destruccin microbiana
No deja residuos
Efectivo en alimentos lquidos, principalmente aguas

Limitaciones:

Poca penetrabilidad
Poca inactivacin enzimtica
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RADIACIONES ULTRAVIOLETAS
Espectro electromagntico

Regin germicida

(Formacin de dmeros de T-T, C-C, C-T y U-U;


Cambios en las protenas)
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Radiacin ultravioleta =

Es efectiva para inactivar cepas


STEC en jugos de fruta ???
Concepto de DOSIS

Dosis = Intensidad x Tiempo de exposicin

Joule/cm2 Minutos

Cantidad de Energa por


unidad de rea en mW/cm2
4 Lmparas de baja presin de
mercurio (Lux 30W/G30 T8, Phillips)

H2= 15cm

H1= 40cm

Sistema de
ventilacin

Agitador orbital

Dosis (E) de UV se determinan con un Radimetro digital


(VLX-3X CE)
Visor Digital

Clula
Fotoelctica

Radimetro digital (VLX-3X CE)


Cual es la supervivencia de cepas
STEC en jugo de naranja
exprimido ??
0
-1
Sobrevivientes (Log N/N0)

-2
-3 Resistencia de cepas de E. coli
en jugo de naranja es un
-4
fenmeno cepa dependiente.
-5
-6
-7
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (das)

Todas las cepas son toxignicas. = O157:H7 EDL 933; = O157:H7 33/98;
= O157:H7 303/00; = O157:H7 547/03; = O157:H7 749/03; = O103:H2; =
O113:H21; = O145:NM; = O26:H11; = ATCC 25922. Medio de cultivo para el
crecimiento de sobrevivientes: Agar Triptona Soja (TSA).

Cepas cedidas por la Dra. Marta Rivas. Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriologa INEI -
ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn
Cuales son los factores que influyen
en la efectividad del tratamiento
con UV en la inactivacin de E. coli
en alimentos lquidos ??
Condiciones estudiadas
Alimentos lquidos con diferente coeficiente de absortividad (turbidez)

Alimentos lquidos pH Absortividad (cm-1) r2


Jugo de Manzana Esterilizado 3.53 (0.02) 0.071 (0.02) 0.997
Jugo de Naranja Esterilizado 3.47 (0.01) 0.352 (0.08) 0.998
Jugo Multifrutas Esterilizado 3.76 (0.05) 0.723 (0.12) 0.997

Cepas utilizadas: O157:H7 EDL 933 y ATCC 25922

Dosis (E, J/cm2) = Intensidad (I, mW/cm2) x tiempo de exposicin (t, seg)
Efecto de la I y de la E en la inactivacin por UV de E.coli (E= 0 y 8; I= 3.3 y 4.8)

Efecto del inculo inicial (N0= 106 UFC/ml y 104 UFC/ml)

Efecto del espesor de la pelcula expuesta al UV (0.7mm y 2.8mm)

Efecto de la agitacin del sistema (0 y 220 rpm)

Efecto del medio de cultivo empleado para el recuento de sobrevivientes (TSA y


SMAC)
Cepa E.coli O157:H7 (EDL 933) inoculada en Jugo de manzana estril

0 0
-1 -1
Sobrevivientes (Log(N/N0))

Sobrevivientes (Log(N/N0))
2.8 mm sin agitacin
-2 -2
-3 -3
-4 -4
-5 2.8 mm con agitacin
-5
-6
-6
a Smbolos cerrados Nivel de inculo
-7
-7inicial 106 CFU/ml b
0 1 2 3 4 5 6 7
a 2 0 1 2 3
Smbolos abiertos=
4 5 6 7
Dosis (J/cm Nivel de inculo
Dosis (J/cm ) 2
)
inicial 104 CFU/ml
0 0
0.7mm
-1 con agitacin 0.7mm sin agitacin -1
Sobrevivientes (Log(N/N0))

Sobrevivientes (UFC/ml)

-2 -2 Log N/No = - k E
-3 La cintica de -3

-4 inactivacin es -4
donde k es la constante de
independiente del N0 inactivacin, y E la dosis de UV
-5
-5
aplicada
-6 -6
Parmetro D = 1/k (Dosis de UV necesaria para reducir la
poblacin microbiana en un 90%)
Espesor de pelcula a irradiar (mm)
E.coli 0.7 2.8
O157:H7
EDL 933 Con agitacin Sin agitacin Con agitacin Sin agitacin
DSMAC DTSA DSMAC DTSA DSMAC DTSA DSMAC DTSA

Jugo de 0.02 0.03 0.59 0.99 1.23 1.51 5.26 6.67


Manzana (0.001) (0.002) (0.02) (0.04) (0.04) (0.04) (0.19) (0.13)

Jugo de 0.07 0.11 1.31 2.50 2.85 3.70 8.33 16.60


Naranja (0.002) (0.006) (0.10) (0.06) (0.03) (0.14) (0.49) (0.55)

Jugo 0.16 0.19 2.78 5.26 4.54 7.69 14.28 20.00


Multifrutas (0.008) (0.006) (0.08) (0.17) (0.12) (0.35) (0.61) (0.60)

Los valores de D resultaron entre 1.2 y 1.8 veces mayores en


TSA que en SMAC.
Por otra parte....

Alimentos con mayor coeficiente de absortividad presentaron


menor letalidad para ambas cepas de E. coli.

La inactivacin por UV depende del producto de la intensidad


por el tiempo de exposicin, es decir de la dosis (J/cm2).

La agitacin del alimento conjuntamente con el menor espesor


de la pelcula de lquido (0.7mm) present el mayor efecto
bactericida.

Se recomienda el empleo de TSA como medio de cultivo para la


recuperacin de clulas sometidas a la accin de la radiacin UV.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
b Absortividad
20 2.8mm (0 rpm)
Valores D (J/cm2) 15
10
2.8mm (220 rpm)
5 0.7mm (0 rpm)

0 0.7mm (220 rpm)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8


Absortividad Igualmente para SMAC y
para ATCC 25922
JME
Manzana JNE
Naranja Multifruta JMFE

Relacin entre coeficientes de absortividad y valores de D obtenidos para


E.coli O157:H7 EDL 933. Medio de Cultivo: TSA

Relacin lineal entre los coeficientes de absortividad y


los valores de D para ambas cepas de E.coli.
Cual es la influencia del contenido de
levaduras presentes en el jugo de
naranja, en la inactivacin de cepas
STEC por accin del UV ??
La presencia de levaduras en el jugo de naranja, podra aumentar el
coeficiente de absortividad, disminuyendo la accin de la radiacin UV

Jugo de naranja exprimido almacenado a 20C hasta alcanzar


diferentes rangos de concentraciones de levaduras

Rango de levaduras en el Coeficiente de


jugo de naranja (UFC/ml) Absortividad

1.0x101 5.0x102 0.6371 0.0155

5.1x102 5.0x103 0.6716 0.0215

5.1x103 8.0x104 0.7315 0.0104

8.1x104 2.0x106 0.8206 0.0182


5 cepas del serotipo O157:H7 de diferente origen

Inoculacin en jugo de naranja exprimido con diferentes rangos de


concentraciones de levaduras

Condiciones:
N0 = 107 UFC/ml; espesor de pelcula= 0.7mm; agitacin (220 rm)
Dosis de UV= entre 0 y 2 J/cm2; Intensidad= 4.8m 0.5 W/cm2;
Recuento de sobrevivientes= TSA; TC de tratamiento= 4 y 20C.
Concentracin de levaduras presentes en el jugo de naranja (UFC/ml)
Cepa de
1.0x1015.0x102 5.1x102-5.0x103 5.1x103 8.0x104 8.1x104 2.0x106
E. coli
O157:H7 D20C D4C D20C D4C D20C D4C D20C D4C
(J/cm2) (J/cm2) (J/cm2) (J/cm2) (J/cm2) (J/cm2) (J/cm2) (J/cm2)

303/00 0.296 0.311 0.3232 0.339 0.358 0.375 0.418 0.439


(0.008) (0.001) (0.0001) (0.001) (0.001) (0.001) (0.001) (0.0005)
749/03 0.169 0.190 0.2064 0.215 0.244 0.271 0.278 0.324
(0.003) (0.004) (0.0004) (0.0003) (0.0003) (0.001) (0.001) (0.001)

547/03 0.210 0.233 0.2421 0.262 0.280 0.299 0.327 0.357


(0.0003) (0.0003) (0.0004) (0.0004) (0.001) (0.0005) (0.0004) (0.001)
33/98 0.168 0.191 0.1970 0.217 0.235 0.261 0.275 0.306
(0.004) (0.005) (0.007) (0.005) (0.0004) (0.0005) (0.001) (0.001)
EDL 933 0.212 0.233 0.2441 0.272 0.298 0.317 0.346 0.363
(0.0003) (0.0003) (0.0002) (0.001) (0.0005) (0.0005) (0.001) (0.001)

5D= 1.48 J/cm2 Solo reducira 3.54 log


(NO cumple con la FDA)

Valores de D (D = 1/k) para cepas de E. coli O157:H7 inoculadas en en jugo de naranja


exprimido, conteniendo diferentes concentraciones de levaduras, empleando 20C y 4C
como temperatura de tratamiento.
Los valores de D aumentan con el incremento de la
concentracin de levaduras presentes en el jugo,
ya que aumentan la absortividad del sistema,
independientemente de la temperatura de
tratamiento con UV.

Las cepas de E. coli O157:H7 presentan una


mayor resistencia al UV cuando el tratamiento se
realiza a 4C.
Qu capacidad poseen las cepas de
E.coli de reparar los daos
producidos por la accin del UV ??
Mecanismos de reparacin de daos provocados por la
radiacin UV:

Foto-reparacin: se lleva a cabo en presencia de luz


visible.
Reparacin en oscuridad: se realiza en ausencia total de
luz.

Importante a la hora de seleccionar las caractersticas de


los envases (translcido u opaco) empleados para el
almacenamiento de jugos de naranja tratados con UV.
Jugo de Naranja exprimido pasteurizado, inoculado con 107 UFC/ml
de cepas de E.coli (n=10)

1 2 3

Tratamiento Tratamiento Tratamiento


con UV* con UV* con UV*

Recuento de 120 min bajo 4 120 min en


sobrevivientes fluorescentes oscuridad
en TSA (Control) luz da

Recuento de Recuento de
* Dosis entre 0 y 1.60 J/cm2 sobrevivientes
sobrevivientes
en TSA en TSA

Foto-reparacin Reparacin
en oscuridad
0 O157:H7 (EDL 933) O157:H7 (303/00) O103:H2
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Todas las cepas
presentan la capacidad
Sobrevivientes (Log (N/N0)

0 O157:H7 (547/03) O157:H7 (749/03) O145:NM


-1
-2 de reparar los daos
-3
-4 producidos por el UV
-5
-6 en condiciones de
-7
0 O157:H7 (33/98) O113:H21 O26:H11
exposicin a la luz, no
-1
-2
as en condiciones de
-3
-4 oscuridad.
-5
-6
-7
-8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
2
Dosis (J/cm )

= Sin reparacin
= Reparacin en oscuridad
= Reparacin en presencia de luz
Sera recomendable el mantenimiento de jugos de
naranja exprimidos, tratados con UV en envases
no permeables a la luz, ya que las cepas de E.coli
poseen la capacidad de reparar los daos
provocados por el tratamiento con UV cuando se
encuentran expuestas a la luz por perodos de 2
horas, no as en ausencia total de la misma.
Cual es el tiempo de vida til de
los jugos de naranja tratados con
UV ??
Temperatura de almacenamiento (C)
Tratamiento aplicado
4 10 20
Vida til (das)
Sin tratamiento (Control) >15 6.3 0,2 2.6 0.1

E= 1.60 J/cm2; I= 3.3 mW/cm2; TC de >15 14.8 0.5 2.8 0.1


tratamiento= 20
E= 1.60 J/cm2; I= 3.3 mW/cm2; TC de >15 13.7 0.1 2.7 0.1
tratamiento= 4
E= 1.60 J/cm2; I= 4.8 mW/cm2; TC de >15 14.3 0.3 3.3 0.1
tratamiento= 20
E= 1.60 J/cm2; I= 4.8 mW/cm2; TC de >15 14.8 0.6 2.9 0.1
tratamiento= 4

Los jugos de naranja tratados con UV y almacenados a 4 y 20C,


presentan una mayor vida til que los jugos sin tratamiento tanto

Las intensidades as como la temperatura de tratamiento, no


influyeron en forma significativa en el tiempo de vida til.
La aplicacin de radiacin UV constituye una alternativa
interesante para el tratamiento de jugos de naranja
exprimidos, ya que disminuye los niveles de cepas
patgenas de E.coli obteniendo productos seguros.
El tratamiento de eleccin para jugos de naranja
exprimido resultara ser:

Aplicacin de dosis de 1.60 J/cm2, Intensidades de


4.8mW/cm2 y 4C como temperatura de tratamiento,
empleando pelculas de 0.7mm y agitacin. Con dichas
condiciones se logr:

Obtener jugos de naranja con una mayor vida til que los
jugos sin tratamiento cuando estos se almacenan a 4C o
10C en condiciones de oscuridad.
Obtener jugos con una retencin de cido ascrbico del
orden del 90% al final de su vida til.

Obtener un producto de buena aceptacin por parte de


los consumidores.

Obtener un producto seguro desde el punto de vista


microbiolgico ya que adems de provocar disminuciones de
5log en E.coli O157:H7, acta disminuyendo la carga de
microorganismos de deterioro propios del jugo.
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ALTAS PRESIONES
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ALTAS PRESIONES
Fundamento:

Sometimiento del producto a una elevada presin hidrosttica (200 - 900


MPa 2.000 9.000 atm), desde minutos hasta algunas horas
Fluido transmisor: agua
Ventajas:

Transmisin isosttica y casi instantnea de la presin a todos los puntos


del alimento
Destruccin de microorganismos
Inactivacin enzimtica
Mantenimiento de vitaminas, aromas y sabor
Producto entero
Puede modificar la textura y/o funcionalidad del alimento
Limitaciones:

Alto costo
Limitaciones con algunos envases
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El alimento se somete a presiones uniformes entre 2000 y
9000 atm.

Donde encontramos estas


presiones?

1 Pascal = 1 N/m2
1 Pa = 10-5 bar
1 bar = 0.989 atm = 1.03322 kg/cm2
El estudio de los efectos de las altas presiones sobre diversos
sistemas data del siglo XIX.

El alto costo y las dificultades tcnicas de su aplicacin industrial


impidieron que se empleara en la prctica, en especial en el rea de
alimentos.

600 kg/h
* 1 cepa de E.coli O157:H7
* N0= 106-107 UFC/ml
* Buffer fosfato (PBS, 1M, pH= 7) y jugo de naranja (pH = 3.8)
* Presiones de entre 300-600 MPa durante 20minutos a TC
ambiente
3 5
a 5 b
3

1 1

Reduccin (Log) de E.coli O157:H7 ATCC 35150 inoculada en: a) PBS (pH 7); b) Jugo de naranja
(pH 3.8), tratada con 1, 3 o 5 pases de 200 MPa. No= 106 UFC/ml; TC 20C

Completa inactivacin: PBS= 3 y 5 pasajes. Jugo de naranja= 5 pasajes

Control 200 MPa , 1 pasaje 200 MPa , 5 pasajes

Completa ruptura celular


Parcial deformacin y ruptura celular Prdida citoplasmtica
Poros en la membrana celular
* 3 cepas de E.coli O157:H7
* N0= 106-107 UFC/ml.
* Inoculadas en caldo y en leche descremada
* Presiones de entre 300-600 MPa durante 20minutos a TC ambiente
Mayor inactivacin en caldo que en leche
Reducciones de hasta 7 log en caldo y hasta 4.0 - 4.2 en leche.
Efecto protector de la leche sobre las bacterias
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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE
Fundamento:

Aplicacin de pulsos elctricos de microsegundos de alta intensidad de


campo elctrico (104 V) en alimentos colocados entre dos electrodos.
El equipo incluye un generador de alto voltaje, una cmara de
tratamiento, un sistema de refrigeracin y un equipo de envasado
asptico, adems de los sistemas de control.
Ventajas:

Tratamiento a baja temperatura


Destruccin microbiana
Posibilidad de trabajo en continuo
Alta eficiencia energtica
Limitaciones:

Alimentos viscosos y homogneos de tamao de partcula pequeo (<1cm)


Desconocimiento de efectos sobre algunos alimentos
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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO VOLTAJE


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PULSOS ELETRICOS DE ALTO


VOLTAJE
N0= 107-108 UFC/ml. Medio de Recuperacin= PCA
Dao provocado por PEF
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ULTRASONIDOS
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ULTRASONIDOS (1)
La combinacin de ultrasonidos con calor o
presin inactiva microorganismos y enzimas
especialmente resistentes al calor. Estas
combinaciones han resultado ser muy tiles en la
inactivacin de microorganismos y enzimas
especialmente resistentes al calor.
La manosonicacin y la manotermosonicacin
pueden ser particularmente eficaces en la
pasterizacin y esterilizacin de mermeladas,
salmueras o huevo lquido, y para la
descontaminacin de vegetales crudos.
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ULTRASONIDOS (2)
Para llevar a cabo un tratamiento exitoso con
ultrasonidos (con o sin combinacin con otros
procesos) han de tenerse en cuenta factores como
la amplitud de las ondas, el tiempo de exposicin,
el tipo de microorganismo o enzima, el volumen,
composicin y pH del alimento, as como la
temperatura y la presin en los procesos
combinados. Uno de los sustratos en los que ms
ha sido estudiado el efecto de los ultrasonidos es la
leche. Es particularmente til ya que se reduce la
formacin de depsitos y se mejora la calidad de la
leche tratada.
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ULTRASONIDOS (3)
Se han realizado estudios sobre la aplicacin de
la manotermosonicacin al procesado de leche y
zumo de naranja y se ha observado que, en
general, la calidad nutritiva de estos alimentos no
se ve significativamente afectada. Este mismo
proceso se ha empleado en el tratamiento de
leche destinada a la elaboracin de yogur,
comprobndose que los yogures obtenidos
presentaban una adecuada consistencia y
viscosidad
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ULTRASONIDOS (4)
Tambin se ha desarrollado un mtodo que permite eliminar
hasta el 99% del agua de los vegetales sin daar su calidad.
Este mtodo es ms rpido que el secado con aire caliente y
provoca daos ms reducidos que otros procesos como la
liofilizacin. Aunque el tratamiento con ultrasonidos resulta
un mtodo eficaz en tecnologa de los alimentos es difcil
que constituyan por s mismos una tecnologa de
conservacin debido al escaso efecto de las ondas sobre los
microorganismos y enzimas. Sin embargo, parece que, y
segn los resultados obtenidos hasta el momento, cuando
se combinan los ultrasonidos con temperatura y/o presin
pueden llegar a ser una tecnologa alternativa a los
tratamientos trmicos convencionales
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PULSO DE LUZ (1)


Los pulsos de luz son producidos utilizando tecnologas
de ingeniera que multiplican la potencia varias veces. La
potencia se magnifica por la acumulacin de energa
elctrica en un condensador que almacena energa por
tiempos relativamente largos (fracciones de segundos).
Esta energa almacenada se utiliza para realizar el
trabajo en tiempos mucho ms cortos (millones o miles
de segundos). El resultado es una potencia elevada
durante el ciclo de trabajo, con un gasto moderado en el
consumo de energa (Dunn, 1996).
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PULSO DE LUZ (2)

Las tecnologas de Pure Pulse han desarrollado dos


nuevos procesos para matar microorganismos, asociados
con el envasado de productos alimenticios, suministros
mdicos, farmacuticos, agua y aire (Dunn,1996).

Estos nuevos procesos son denominados por su nombre


en ingls Pure Bright y Cool Pure.
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PULSO DE LUZ (3)


Los pulsos de luz denominados Pure Bright utilizan rayos de
luz de corta duracin en el espectro amplio de luz blanca para
matar un amplio nmero de microorganismos incluyendo
esporos y hongos.
Cada pulso de luz dura solamente millonsimas de segundos.
Durante cada pulso que pasa la intensidad de la luz es de unas
200.000 veces la intensidad de la luz en la superficie terrestre
(Dunn, 1996).
El proceso de campos elctricos pulsantes de alta intensidad
(Cool Pure) utiliza mltiples pulsos de corta duracin, y campos
elctricos pulsantes de alta intensidad para inactivar los
microorganismos en los alimentos transportados por tuberas.
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PULSO DE LUZ (4)


El intervalo de temperaturas durante la aplicacin de este
proceso es muy bajo, por lo que no causa daos trmicos
apreciables. El sabor original, textura y mcionalidad de
los productos alimenticios se mantiene (Dunn, 1996).
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Mecanismos de Inactivacin con Pulsos


de Luz (PL)
La letalidad de los pulsos de luz es diferente a distintas
longitudes de ondas. Por lo tanto, para tratar los
alimentos se puede utilizar el espectro completo o la
longitud de onda seleccionada. Las longitudes de onda
conocidas que producen productos indeseables en los
alimentos se eliminan a travs de filtros de vidrio o filtros
lquidos. Los pulsos de luz inducen reacciones
fotoqumicas o fototrmicas en el alimento.
La luz ultravioleta causa cambios fotoqumicos mientras
que la luz visible e infi:-arroja causan cambios
fototrmicos. Los efectos antimicrobianos de estas
longitudes de ondas son primariamente mediados a
travs de la absorcin de sistemas conjugados de dobles
enlaces carbono-carbono en protenas y cidos nucleicos
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Mecanismos de Inactivacin con Pulsos


de Luz (PL)
El material a esterilizar se expone como mnimo a un
pulso de luz con una densidad de energa en el intervalo
de 0,01 a 50 J/cm^ en la superficie, usando una
distribucin de longitudes de onda, de tal manera que por
lo menos un 70% de la energa electromagntica se
distribuya en un intervalo de longitudes de onda de 170 a
2600 nm (Barbosa-Cnovas y col., 1997). La duracin de
los pulsos vara entre 1 y 0,01 |LIS. LOS rayos se aplican
a una tasa de 1 a 20 rayos por segundo. Para la mayora
de las aplicaciones, pocos rayos aplicados en fracciones
de segundo suministran un alto nivel de inactivacin
microbiana. Por lo tanto el proceso es muy rpido y
sencillo para la obtencin de altos rendimientos
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CONCLUSIONES
La aplicacin de tecnologas alternas para pasteurizar y
esterilizar alimentos sin calor, como los campos elctricos
pulsantes de alta intensidad, los pulsos de luz y los
campos magnticos oscilantes, constituyen un potencial a
ser explotado por la industria alimentaria.
Su forma nica de aplicacin a bajas temperaturas hace
de estas tecnologas una alternativa de sustitucin de los
procesos trmicos tradicionales utilizados en la
pasteurizacin y esterilizacin de alimentos lquidos