Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia

Universidad Nacional de Tucumn

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

N 10

Pruebas bsicas y especiales para el

estudio de las plaquetas y sistema
fibrinoltico
 1

PRUEBAS GLOBALES PARA EL ESTUDIO DE PLAQUETAS

Introduccin: El estudio de las plaquetas en el laboratorio requiere extremos
cuidados con respecto a la toma de muestra y anamnesis del paciente,
teniendo en cuenta la principal caracterstica de las plaquetas que es su gran
capacidad de activarse y adherirse. Otro aspecto muy importante a tener en
cuenta es que las plaquetas son fragmentos del citoplasma de megacariocitos
y al carecer de ncleo son incapaces de sintetizar protenas, por lo cual una
medicacin que afecte la funcionalidad la plaqueta no podr repararla.

1- RECUENTO DE PLAQUETAS EN SANGRE ENTERA

1.a)- Mtodo Manual

Fundamento: La sangre entera se mezcla con una sustancia que lisa los
glbulos rojos dejando intactas las plaquetas.
Reactivos
EDTA disdico al 2%
Oxalato de amonio 0,1 N 0 al 1%
Obtencin de la muestra: Se extrae sangre por puncin venosa usando
material de plstico y EDTA como anticoagulante. El EDTA debe usarse en una
concentracin aproximada de 2 mg por mL de sangre ya que a concentraciones
mayores las plaquetas tienden a hincharse y romperse y a concentraciones
menores no se evita su apelotonamiento.
Procedimiento:
Se diluye la sangre con la solucin de oxalato de amonio al 1%, recientemente
filtrada, en una proporcin de 1:20. Se deja reposar 10 minutos para permitir la
lisis de los glbulos rojos, y posteriormente, se homogeneiza y se carga la
cmara de Neubauer. Se deja reposar la cmara en ambiente hmedo durante
10 minutos para que las plaquetas sedimenten. Se realiza el recuento de
plaquetas en el retculo central (se cuentan los cuatro cuadrados de las
esquinas y uno del centro).
Clculo:
N x 400 x 20 x 10 = nmero de plaquetas por L
80

N = n de plaquetas contadas en los cinco cuadrados

400 = n total de cuadrados pequeos de la cmara
80 = n de cuadrados pequeos contados
20 = inversa de la dilucin
10 = se multiplica por 10 para expresar el resultado en n de plaquetas por
mm3 (L)

Valores de referencia: 150.000 a 400.000/ L

150 a 400 109/litro (SI)

1-b) Mtodo automatizado:

Se emplean contadores hematolgicos donde el recuento plaquetario forma
parte del perfil celular sanguneo.
 2

Independientemente del mtodo de recuento empleado, es importante observar

al microscopio un frotis de sangre perifrica, para evaluar cantidad, distribucin,
forma y tamao plaquetario. Asimismo la observacin del mismo permitir
dilucidar una trombocitopenia producida como consecuencia de acmulos
plaquetarios.

Trombocitopenia inducida por EDTA: Algunos pacientes presentan en su

plasma un anticuerpo que reacciona con un criptoantgeno en presencia de
EDTA. Este criptoantgeno se encuentra en la GP IIb-IIIa, lo que lleva a la
aglutinacin in vitro de las plaquetas con la consiguiente disminucin en el
recuento de plaquetas en la muestra obtenida con EDTA. Este descenso no se
correlaciona con la cantidad de plaquetas presentes in vivo ni con la
observacin del frotis sanguneo. En estos casos el recuento de plaquetas se
debe realizar en muestras obtenidas con otros anticoagulantes como citrato o
heparina.

2-TIEMPO DE SANGRA
Es una prueba que permite estudiar la forma en que se realiza la hemostasia
espontnea de pequeas heridas. Cuando se produce la injuria tisular se
exponen componentes del subendotelio, como el colgeno tipo IV y V, a los
cuales se adhieren las plaquetas.
El tiempo de sangra (TS) se modifica fundamentalmente por la cantidad y
calidad de las plaquetas as como tambin por muy bajas concentraciones de
protenas plasmticas como el fibringeno y disminucin de von Willebrand.
Podemos tener alterado el TS en trombocitopatas congnitas (Bernard Soulier,
Trombostenia de Glazman, Sndrome de Pool de Depsito) o trombocipatas
adquiridas (uremia, en presencia de paraprotenas, afibrinogenemias),
sndromes mielodisplsicos, trombocitemia esencial).

2.a) Mtodo de Duke

Fundamento: Consiste en medir el tiempo de duracin de una hemorragia
provocada por una incisin realizada en el lbulo de la oreja.
Procedimiento
Se desinfecta el lbulo de la oreja y se practica en su borde inferior, con una
lanceta afilada, una incisin en sentido vertical. El corte debe ser suficiente
profundo (3 a 4 mm) para que la sangre fluya espontneamente sin ejercer
presin. Cada 30 segundos se recogen las gotas de sangre sobre un papel de
filtro, sin tocar el borde de la incisin. Cuando la sangre fluye con mayor
rapidez se debe recoger con intervalos de tiempo menores. Se mide con
cronmetro el tiempo que transcurre entre la primera y ltima gota.
Valores de referencia: 1 a 4 minutos
Este mtodo tiene la desventaja de su escasa sensibilidad.

2.b) Mtodo de Ivy

Fundamento: Es la medida del tiempo de sangra en tres puntos del antebrazo
bajo presin continua.
Procedimiento
Se coloca en el brazo del paciente, por encima del codo, el brazal de un
aparato de presin (esfigmomanmetro) manteniendo una presin constante de
 3

40 mm de mercurio durante toda la prueba (a fin de llenar los capilares y

eliminar la variabilidad del tono capilar).
Se desinfecta con alcohol y se hacen tres punciones separadas, de 3 mm de
profundidad, en una zona del antebrazo en la cual no existan venas visibles.
Simultneamente se pone en marcha el cronmetro y sin tocar los bordes de la
incisin se recoge cada 30 segundos la gota de cada herida, mediante un papel
de filtro, hasta que las punciones dejen de sangrar. El promedio de los tiempos
obtenidos, es el tiempo de sangra.
Valores de referencia: 2 a 7 minutos
Es ms sensible que el mtodo de Duke.

2.c) Mtodo de Mielke y colaboradores

El fundamento y procedimiento es igual al mtodo de Ivy. La modificacin
consiste en practicar un corte de 1 cm de longitud por 1 mm de profundidad
usando hojas de bistur calibradas.
Valores de referencia: 2 a 9 minutos

2.d) Mtodo de Template de Mielke modificado

El fundamento y procedimiento es igual al anterior pero el corte se realiza
empleando con dispositivos comerciales (Template).

3. FRAGILIDAD CAPILAR

Las petequias o equimosis se forman por la extravasacin indiscriminada de

clulas sanguneas fuera de la vasculatura capilar hacia la piel, tejido
subcutneo o ambos.
En esta prueba intervienen la cantidad y funcionalidad plaquetaria; la calidad
del vaso y sus tejidos adyacentes y el gradiente de presin transmural que
produce la extravasacin sangunea.
Se encuentra alterada en trombocitopenias, trombocitopatas, prpuras
vasculares, disproteinemias, Sndrome de Ehlers-Danlos, dficit de vitamina C,
etc.
Para determinar la fragilidad capilar existen dos tipos de mtodos: a) mtodos
de stasis (hiperpresin) y b) mtodos de succin (hipopresin).

3.a) Prueba del lazo o del torniquete

Se denomina tambin prueba de Rumpel-Leede, prueba de Hess o de la

fragilidad capilar.
Fundamento: Consiste en someter a los capilares de la piel del antebrazo a un
aumento de presin, obstruyendo la circulacin venosa de retorno, respetando
la arterial y, en observar el nmero de petequias cutneas que aparecen por
debajo del pliegue del codo.
Procedimiento
Se realiza colocando el brazal de un aparato para tomar la presin sangunea
en el tercio medio del brazo y se mide la presin. Se mantiene el brazal durante
5 minutos a una presin intermedia entre la sistlica y la diastlica (entre 80 y
100 mm de mercurio en un individuo normal). Se retira el brazal y durante los 5
minutos siguientes se cuenta el nmero de petequias que aparecen en la cara
anterior del antebrazo. Se puede repetir la prueba en el otro brazo, pero una
 4

vez practicada en ambos brazos, se debe esperar una semana para poder
repetirla.
Valores de referencia: En condiciones normales pueden formarse hasta 5
petequias.
La positividad de la prueba se expresa en cruces.
Positiva (+): pocas petequias en la cara anterior del antebrazo
Positiva (++): muchas petequias sobre la superficie anterior del antebrazo.
Positiva (+++): muchas petequias sobre todo el antebrazo y mano.
Positiva (++++): petequias de gran tamao y confluentes en todo el antebrazo y
a veces se extienden al dorso de la mano. En algunos casos debido a la
abundancia y confluencia de las petequias, todo el antebrazo adquiere una
tonalidad violcea.

3.b) Prueba por succin o aspiracin

Se conoce tambin con el nombre de prueba de presin negativa de la ventosa

o del petequimetro.
Fundamento: Consiste en aplicar durante 1 minuto una presin negativa sobre
la piel en una regin que puede ser el brazo o el antebrazo.
Procedimiento
Se realiza colocando durante 1 minuto una ventosa plstica de 2 cm de
dimetro, conectada a un tubo que contiene un mbolo, que permite producir
una presin negativa que puede graduarse por medio de un manmetro.
Como en el mercado es difcil conseguir este aparato, distintos autores han
diseado pequeos instrumentos con esta finalidad.
Este mtodo tiene la ventaja de tener una estandarizacin ms exacta, ya que
la superficie examinada, es siempre exactamente igual, la presin negativa
aplicada tambin puede ser medida con exactitud, lo mismo que el tiempo
utilizado y puede repetirse con intervalos de tiempos muy cortos.
Valores de referencia: 0 a 3 petequias a 200 mm de mercurio.
La prueba es positiva cuando aparecen ms de tres petequias.

4- RETRACCIN DEL COGULO

Fundamento: La retraccin del cogulo se produce por la interaccin de la

GPIIb-IIIa con la actina del citoesqueleto, producindose un reordenamiento de
la membrana plaquetaria. Se utiliza ATP como fuente de energa.
Esta prueba depende de: cantidad y funcionalidad de las plaquetas;
concentracin del fibringeno y del hematocrito.
Se encuentra alterada en disfunciones plaquetarias congnitas o adquiridas,
principalmente la Trombastenia de Glanzmann e insuficiencias renales.
Procedimiento
Se coloca en tres tubos de hemlisis bien limpios 1 mL se sangre en cada uno
y se los mantiene a 37C durante 1 hora. Luego se observa la magnitud de la
retraccin.
Valores de referencia: El cogulo normal debe separarse de las paredes y del
fondo del tubo.
Cuando el cogulo al final de la primera hora no se separa de las paredes del
tubo, se lo puede desprender mediante una varilla delgada, incubando
nuevamente el tubo, si la retraccin es normal esta tiene lugar rpidamente.
 5

Se informa: retraccin del cogulo aumentada (hiperretrctil), normal

(normorretrctil), disminuida (hiporretrctil) o nula (arretrctil).

PRUEBAS PLAQUETARIAS ESPECFICAS

1- ADHESIVIDAD PLAQUETARIA in vivo (Mtodo de Borchgrevik)
Al producirse una injuria tisular quedan expuestos componentes del
subendotelio, en un primer momento la plaqueta se adhiere a los componentes
del subendotelio como el colgeno y FvW mediante las glicoprotena
plaquetaria (complejo Ib-V-IX). La plaqueta adherida forma una monocapa
sobre la herida y se activa.
Fundamento: Se mide la adhesividad plaquetaria comparando el nmero de
plaquetas presentes en una muestra de sangre obtenida por puncin venosa
frente a otra obtenida a partir de una incisin realizada en el antebrazo. La
diferencia entre ambas expresa el nmero de plaquetas adheridas al tejido
lesionado o adhesividad plaquetaria.
Procedimiento
Se realiza el tiempo de sangra segn el mtodo de Ivy o Mielke y a los 2
minutos, se toma con micropipeta una muestra de la sangre que fluye de la
incisin practicada para el tiempo de sangra. Se realiza el recuento de
plaquetas en esta muestra (RT2). Al mismo tiempo se toma una muestra de
sangre venosa y se realiza el recuento plaquetario basal (RT0).
(RT0 RT2) x 100
% de Adhesividad =
RT0

Resultados
Valores de referencia: 30 a 70 %
Se encuentran valores de adhesividad plaquetaria disminuidos en la
enfermedad de Bernard Soulier (donde est alterada la GP Ib-V-IX) y tambin
en la enfermedad de von Willebrand. Tambin se encuentra alterada en la
enfermedad de Pool de depsito y en trombocitopatas adquiridas como
sndromes mieloproliferativos, enfermedad renal crnica y sndrome de
plaquetas activadas.
2-AGREGACIN PLAQUETARIA

Cuando se produce una injuria tisular distintos estmulos inducen la agregacin

plaquetaria, entre ellos destacamos la exposicin de componentes del
subendotelio como el colgeno, productos formados por la activacin del
sistema de coagulacin como la trombina, sustancias que son secretadas por
la plaquetas o aportadas por la membrana del glbulo rojo como el ADP, o
sustancias liberadas en el lugar de la injuria como la adrenalina. Todas estas
sustancias solas o combinadas son capaces de convertir plaquetas en estado
de reposo a plaquetas en estado activado.
El mecanismo de agregacin plaquetaria es consecuencia de un proceso
metablico complejo.
Para cada activador interviene un receptor de la membrana plaquetaria
especfico, y esta unin ligando-receptor desencadena vas metablicas, las
cuales conducen a la agregacin plaquetaria.
 6

Fundamento: Se define como agregacin plaquetaria a la interaccin

plaqueta-plaqueta medida sobre PRP por mtodo ptico, requirindose para
este proceso la integridad metablica de las mismas, dado que este
mecanismo incluye cambios morfolgicos y qumicos.
Procedimiento
La valoracin de la respuesta de agregacin de las plaquetas puede realizarse,
con las mismas en su medio natural, en el plasma, o bien resuspendidas en
distintos medios.
Se usa un mtodo turbidimtrico que se basa en medir mediante un
agregmetro, la diferencia en la densidad ptica (DO) existente entre el plasma
rico en plaquetas (PRP) y el plasma pobre (PPP). A medida que las plaquetas
se agregan y permiten el mayor pasaje de luz, disminuyendo as la DO, se
inscriben las curvas de agregacin en funcin del tiempo.
El agregmetro tiene un sistema magntico que hace girar una barrita
agitadora incluida en la cubeta de PRP en el momento del ensayo. Esta barrita
agitadora simula la turbulencia sangunea, la cual es fundamental para que se
produzca la colisin entre las plaquetas y se mezcle el agente agregante
incluido en la muestra. La temperatura a la que se realiza el ensayo es de
37C.
La muestra no debe entrar en contacto con material de vidrio, porque en este
caso se originara la adhesividad de las plaquetas y la activacin de la muestra.
Obtencin de la muestra
Para los estudios de funcin plaquetaria es fundamental que el paciente no
tome medicamentos que contengan aspirina desde los 10 das previos al
estudio, y en lo posible que se suspendan 48 horas antes otros medicamentos
(especialmente si estos son anti-inflamatorios). Adems debe presentarse con
un ayuno de ms de 8 horas.
Se extrae sangre venosa con agujas 19G 1 , procurando una puncin sin
dificultades y un buen flujo sanguneo. Se deja drenar la sangre
espontneamente a tubos de plstico que contengan citrato de sodio al 3,8%
en una relacin 9:1 de sangre y anticoagulante respectivamente. Se debe
homogeneizar suavemente.
La relacin entre la sangre y el anticoagulante depende del hematocrito del
paciente, debido a que el exceso de citrato en el medio modificar la
disponibilidad de calcio ocasionando variaciones en la amplitud de las curvas
de agregacin.
Obtencin del PRP
Se centrifuga la muestra en centrfuga no refrigerada (el fro estimula las
plaquetas) durante 5 a 7 minutos a baja velocidad (180 g). Es importante que la
muestra est libre de glbulos rojos y blancos debido a que los primeros
modifican la disponibilidad de ADP y los segundos inhiben la agregacin
plaquetaria.
Posteriormente se separa el plasma rico en plaquetas con pipeta plstica y se
lo transfiere a tubos plsticos, que se tapan para evitar la oxidacin del plasma.
El resto de sangre se centrifuga nuevamente durante 20 minutos a alta
velocidad para obtener PPP que ser utilizado para calibrar el aparato.
Debido a que las plaquetas necesitan ser metablicamente activas deber
realizarse el ensayo de agregacin dentro de las 2 horas desde la extraccin
de sangre y no antes de los 20 minutos, ya que responden menos,
 7

probablemente porque no se metaboliz toda la PGI2 que pudiera estar

presente en la muestra.
En cada prueba se utiliza una cubeta con 450 uL del PRP a la que se le
incorpora la barrita agitadora y el agente agregante a probar en la dilucin
correspondiente.
Los agentes agregantes o agonistas deben permanecer en gradillas enfriadas
una vez preparados.
Los agonistas que se pueden usar y su concentracin final en la cubeta de
reaccin son:
Acido Araquidnico: 2.5 mM
ADP: 3,3 x 10-6 M
Adrenalina: 10-6 M
Colgeno: 2 - 5 g/mL
Ristocetina: 1.5 mg/mL
Trombina: 0,2 - 0,5 U/mL
Procedimiento
Cada da al comenzar y al terminar el estudio de los pacientes deber
chequearse por lo menos un normal que asegurar la buena actividad de todo
el sistema.
El primer paso es la calibracin del agregmetro. Se ajusta el 100% de DO con
PRP y el 0% con PPP correspondiente, en ambos extremos del papel donde se
grafican las curvas que deber correr a 2 cm/minuto.
Al colocar la barrita agitadora dentro de los 450 uL de PRP, lo primero que se
observa son las oscilaciones caractersticas de las plaquetas discoides en
suspensin.
El segundo paso ser ensayar la agregacin espontnea durante 20 min.
Se considerar que existe agregacin espontnea cuando supere el 15 % de
agregacin.
Posteriormente se contina con los otros agonistas, obtenindose curvas
caractersticas con cada uno de ellos.
Las siguientes grficas ejemplifican el tipo de curva que se obtiene de acuerdo
al tipo de agonista (Fig N 1).

FIGURA N 1: Agregacin plaquetaria. Curvas normales empleando ADP y

adrenalina

ADP Adrenalina
 8

FIBRINOLISIS
Los componentes del sistema fibrinoltico pueden ser evaluados en conjunto
mediante pruebas globales (las cuales son pruebas funcionales) o estudiando
especficamente la funcionalidad cada uno de sus componentes (pruebas
antignicas y/o estudios de biologa molecular)
Tambin se puede evaluar si hubo activacin de este sistema investigando la
presencia de los productos generados por su activacin.
Debemos tener en presente que los ensayos que evalan el sistema
fibrinoltico en el laboratorio son pruebas in vitro. En las mismas se trabaja con
una muestra de sangre del paciente (ex vivo), de tal manera que solo
evaluamos los componentes del sistema fibrinoltico que tenemos en el tubo
(principalmente las protenas), es decir no intervienen las clulas (endoteliales,
plaquetas, micropartculas) ni los receptores celulares que fisiolgicamente
desarrollan una funcin importante in vivo. Debido a sto los resultados del
laboratorio presentan cierta limitacin.
Obtencin de la muestra
Para el estudio de la fibrinlisis se debe tener presente algunas
consideraciones:
o Algunos componentes presentan fluctuaciones diarias debido al ritmo
circadiano, por ejemplo el pico de sntesis del Inhibidora del activador
plasmingeno (PAI) es entre las 3 y 6 de la maana y su valle por la tarde,
mientras que el activador tisular del plasmingeno (tPA) presenta un nivel
mximo a las 9 de la maana. Para que las tcnicas de fibrinlisis puedan ser
reproducibles se estableci que el horario de extraccin debe realizarse
siempre entre las 8 y 10 de la maana.
o Como varios de los componentes de este sistema son sintetizados por
las clulas endoteliales, la puncin venosa debe ser limpia procurando el
menor stasis posible (no superior a 2 minutos) para evitar la activacin del
endotelio y la posterior liberacin de tPA.
o Existen factores externos que potencian el sistema fibrinoltico, entre
ellos: isquemia, oclusin venosa, ejercicio fsico, fro intenso, sustancias
vasoactivas, ingestin moderada de alcohol, tratamiento para la
hipertrigliceridemia, la raza blanca y un factor etreo (cuanto ms joven ms
activo). Disminuyen su accin: Tabaco, diabetes, ingesta excesiva de alcohol,
anticonceptivos orales, aterosclerosis, hipertrigliceridemia.
o Para minimizar los posibles efectos de factores externos en la
evaluacin de la funcin fibrinoltica se solicita la paciente la restriccin del
consumo de alcohol 18 a 24 h previas a la toma de la muestra y del consumo
de cigarrillos por lo menos 15-20 das previos al estudio. Se recomienda no
realizar actividad fsica (no hacer gimnasia, no subir escaleras, no correr, etc);
el paciente deber permanecer en reposo, en un ambiente tranquilo, entre 20 a
30 min antes de la extraccin.
o El anticoagulante recomendado para la lisis de euglobulinas es el citrato
cido de sodio (pH 5) porque preserva el tPA (tiene vida media corta) y evita la
formacin in vitro del complejo tPA-PAI. Para el resto de las pruebas se utiliza
citrato de sodio 0,11 M. Es recomendable la pronta separacin del plasma del
paquete globular, obtenindose el PPP por doble centrifugacin dentro de los
20 minutos realizada la extraccin.
 9

PRUEBAS GLOBALES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO

1-Tiempo de lisis de sangre entera diluida

Fundamento: El tiempo de lisis del cogulo formado a partir de sangre entera

diluida en buffer, depende de los niveles de fibringeno, plasmingeno, FXIII y
del equilibrio entre los activadores e inhibidores del sistema fibrinoltico. Si los
niveles de fibringeno, plasmingeno y FXIII son normales, el tiempo de lisis
depender fundamentalmente del equilibrio tPA-PAI.
Procedimiento
Colocar en un tubo de vidrio en bao de agua a 37C:
0,9 mL de tampn acetato de sodio (0,12 M, pH 7,4)
0,1 mL de sangre entera citratada
0,05 mL de trombina (solucin 5 U/mL en tampn acetato)
Incubar y registrar el tiempo de lisis del cogulo. Se informa el tiempo que tarda
en lisarse el cogulo.
Valores de referencia
En individuos normales el tiempo de lisis del cogulo de sangre entera diluida
es variable. Cada laboratorio debe establecer el rango de referencia. Se
considera normal un tiempo de lisis superior a 18 horas. Tiempos de lisis
menores a 2 h indican un aumento de la actividad fibrinoltica a expensas
fundamentalmente de los activadores del sistema.

2-Tiempo de lisis de euglobulinas

Fundamento: La dilucin y acidificacin del plasma produce la precipitacin de

una fraccin proteica que contiene el fibringeno, el plasmingeno, los
activadores del plasmingeno y la plasmina. Esta fraccin denominada
euglobulinas, es resuspendida en un buffer alcalino, coagulada e incubada a
37C, para registrar finalmente el tiempo de lisis del cogulo. Mediante este
procedimiento se eliminan los inhibidores de la fibrinlisis (sobrenadante)
acortndose significativamente el tiempo de lisis en comparacin con el de
sangre entera.
Procedimiento
Una vez obtenida la muestra debe mantenerse en bao de hielo hasta su
procesamiento, el cual debe llevarse a cabo dentro de los 20 min. de extrada
la misma. La sangre se centrifuga durante 10 min. a 3.000 rpm para obtener
PPP. La prueba debe realizarse por duplicado.
En un tubo de vidrio agregar:
8 mL de agua destilada fra.
0,5 mL de PPP
0,15 mL de cido actico 1%
Se mezcla por inversin y se dejan durante 30 minutos en heladera a 4C para
que se complete la precipitacin de las euglobulinas.
Centrifugar a 5 min a 3.000 rpm. Descartar el sobrenadante y colocar los tubos
invertidos sobre un papel de filtro, durante 2 minutos para que escurra todo el
lquido.
A continuacin agregar 0,5 mL de solucin de borato de sodio (9 g de NaCl, 1 g
de borato de Na y agua destilada csp 1000 mL). Mezclar con una varilla hasta
disolucin total del precipitado.
 10

Mantener el tubo a 37C y agregar 0,5 mL de Cloruro de Ca 0,025 M. Registrar

el tiempo al cual la mezcla coagula.
Controlar cada 15 minutos hasta observar la lisis total del cogulo. Informar el
tiempo de lisis del cogulo de euglobulinas.
Valores de referencia: El cogulo no debe lisarse antes de las 2 horas.
Tiempos de lisis menores de 1 hora 30 minutos indican un aumento de la
actividad fibrinoltica a expensas fundamentalmente de los activadores del
plasmingeno. La prueba puede, sin embargo, estar afectada por la
concentracin del fibringeno y del plasmingeno presentes en la muestra a
analizar.

3-RESPUESTA FIBRINOLTICA POST-ISQUEMIA

Fundamento: Esta prueba permite evaluar la respuesta del sistema fibrinoltico

a un estmulo como la isquemia, provocada por la oclusin de la circulacin
sangunea. Esta oclusin produce la estimulacin de las clulas endoteliales
que liberan componentes del sistema fibrinoltico y tambin una menor
depuracin heptica de los componentes (tPA, PAI, etc) lo cual conduce a un
acortamiento de la prueba.
Procedimiento
La prueba consiste en tomar una muestra basal y otra post isquemia. La
isquemia se produce colocando en el brazo del paciente un esfigmomanmetro
durante 10 minutos a una presin media entre la mxima y la mnima de la
presin arterial del paciente, lo cual impide su flujo sanguneo. Concluido los 10
minutos, antes de retirar el esfigmomanmetro se obtiene la muestra de sangre
post-oclusin.
Sobre la muestra basal y post-oclusin se realiza alguna de las pruebas
globales de la fibrinlisis como la lisis de sangre entera diluida o la lisis de
euglobulinas.
Resultados de lisis de euglobulinas:
Se puede expresar el resultado: Lisis pre isquemia: > 120 minutos
Lisis post isquemia: < 45 minutos
Tambin se pueden expresar los resultados como la diferencia en minutos del
tiempo de lisis basal y el tiempo de lisis post isquemia, como el cociente entre
post isquemia lisis / lisis basal. Se considera que la respuesta a la isquemia es
buena si el cociente es menor de 0.70-0.75.
Niveles basales aumentados de PAI conducen a una respuesta fibrinoltica al
estasis venoso pobre o ausente, debido a el PAI bloquear el tPA liberado por
el estmulo impidiendo su accin fibrinoltica. Una menor liberacin de tPA
producir una respuesta similar.

PRUEBAS ESPECFICAS FUNCIONALES DEL SISTEMA

FIBRINOLITICO
DOSAJE DE PLASMINGENO

Existen mtodos directos e indirectos para estudiar el plasmingeno.

Detallaremos un mtodo directo amidoltico.
Los mtodos amidolticos se basan en la capacidad que tienen las enzimas en
actuar sobre sustratos especficos. Los sustratos cromognicos son pptidos
 11

sintticos que presentan el mismo enlace que el sustrato natural de la enzima a

estudiar. Al producirse la ruptura de dicha unin liberan un cromgeno (p-
nitroanilina) cuya intensidad se puede leer en espectrofotmetro a 405 nm.
El plasmingeno circula como un zimgeno (protena sin actividad). Para que
esta protena exprese su funcionalidad debe ser activada por activadores que
pueden ser exgenos (estreptoquinasa) o endgenos (tPA). El plasmingeno
de la muestra del paciente al ser colocado junto a un activador
(estreptoquinasa) se convierte en plasmina (enzima activa). La plasmina
liberada acta sobre el sustrato cromognico especfico liberando un
cromgeno que es medido a 405 nm

Plasmingeno (muestra) + SK en exceso Plg-SK Plasmina

Plasmina + sustrato p-nitroanilina 405 nm

PRODUCTOS GENERADOS POR LA ACTIVACIN DEL SISTEMA

FIBRINOLTICO
Como consecuencia de la activacin del sistema fibrinoltico se genera
plasmina, enzima proteoltica que puede actuar sobre distintos sustratos. Su
principal sustrato fisiolgico es la malla de fibrina. Cuando la plasmina degrada
la fibrina el producto final de este proceso son los Dmeros D (fibrinlisis).
Cuando la cantidad de plasmina generada degrad completamente la malla de
fibrina y super la capacidad de los inhibidores (2 antiplasmina) capaces de
frenarla, esta enzima sigue actuando sobre otros sustratos como el fibringeno,
cuyos productos finales de degradacin son los PDF (fibringenolisis).

COAGULACIN

TROMBINA FXIII

FIBRINGENO MONMEROS COGULO DE FIBRINA

DE FIBRINA

X
Y
D
E PLASMINA

D D
PDF
Dmeros D
 12

DETERMINACIN DE DMEROS D-D

Mtodos de aglutinacin de partculas de ltex

Es una tcnica rpida, semicuantitativa, para la determinacin de productos de
degradacin de la fibrina D-D dmeros en el plasma.
Se utilizan partculas de ltex recubiertas con un anticuerpo monoclonal de
ratn anti D-D humano.
La prueba es positiva con concentraciones de D-D que superen los 0,5 ug/mL.
Es menos sensible que la determinacin de D-D por enzimoinmunoensayo,
pero resulta til ya que es una tcnica rpida que aporta informacin para el
diagnstico de emergencia o en el control de la terapia tromboltica.
El ensayo es insensible a la presencia de fibringeno, productos de
degradacin tempranos (fragmentos X e Y) y al fragmento E.
Valores de referencia: Valores menores de 500 ng/mL (plasma de individuos
de ambos sexos con edades entre 18 y 55 aos).
El hallazgo de dmero D indica la activacin del sistema de coagulacin con
generacin de trombina y posterior accin del sistema fibrinoltico.
Son de utilidad en el diagnstico de Coagulacin Intravascular Diseminada.
Para el diagnstico temprano de trombosis venosa profunda y
tromboembolismo pulmonar es necesario utilizar una metodologa altamente
sensible que le otorgue un valor predictivo negativo alto como el ELISA o
micropartculas de alta sensibilidad.
La determinacin de dmeros D resulta til tambin para la evaluacin de
estados protrombticos como neoplasias, leucemias agudas (M3) y en
hepatopatas.

BIBLIOGRAFA
Manual de Hematologa de la Academia Nacional de Medicina. 1990.
Manual de Hemostasia y Trombosis - Grupo Cooperativo de Hemostasia y
Trombosis (Grupo CLAHT). 1990
Hemostasia y Trombosis Tcnicas e interpretacin. Dr. Edgardo Iglesias
1978.
Gua de trabajos prcticos de Hemostasia. Universidad de Buenos Aires.
Departamento de Anlisis Clnicos 1987.
Wintrobes Clinical Hematology. 9 Edicin 1993 .
Trombosis. Tomo 1. Ral Altman y colaboradores. 2005.
Fundamentos para el Manejo Prctico en el Laboratorio de Hemostasia.
Grupo CAHT (Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis).
2003.
Guas de Trabajo Prctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia
1999. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.