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Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias

Bsicas
ISSN: 0120-4211
revistabistua@unipamplona.edu.co
Universidad de Pamplona
Colombia

Vega Romero, C.; Ramn Camargo, J.


Determinacin por cromatografa Liquida (HPLC) el contenido de cido flico y hierro en una bebida
lctea fermentada tipo yogurt enriquecida a partir de materias primas naturales.
Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Bsicas, vol. 5, nm. 2, julio-diciembre, 2007, pp. 42-48
Universidad de Pamplona
Pamplona, Colombia

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BISTUA
BISTUA VOL 5 No.
VOL 2
5 No. 2 Pag 42 -48
JULIO-DICIEMBRE 2007
ISSN 0120-4211
Determinacin por cromatografa Liquida (HPLC) el
contenido de cido flico y hierro en una bebida
lctea fermentada tipo yogurt enriquecida a partir
de materias primas naturales.

Vega Romero C., Ramn Camargo J

Departamento de Alimentos, Grupo de investigaciones en Operaciones Unitarias para la Industria de


Alimentos, GOUIA. Universidad de Pamplona, Colombia.
cromero@unipamplona.edu.co

ABSTRACT
A methodology was developed to quantify folic acid in melon, soya and lentils, since
they contain large amounts of this vitamin according to tests done. In order to add
iron and folic acid to yogurt in the percentage that a gestating mother needs. The
extraction of the vitamin was compared using three methods: magnetic agitation,
ultrasound and radiation by microwaves. The samples analyzed by HPLC in reverse
phase in a chromatographer Agilent 1100, from the standard of folic acid (MERCK
98%). The extractions were carried out in triplicate to evaluate the precision of the
method. The results obtained were that soya has a greater concentration of folic
acid with relation to melons and lentils; the folic acid was then added to the yogurt.

KEY WORDS
Atomic absorption, Folic Acid, Iron, HPLC, Melon, Lentils, Agilent 1100.

RESUMEN
Se desarrollo una metodologa para cuantificar Hierro en soja y acido flico en el
meln, soya y lentejas, ya que contienen gran cantidad de dicha vitamina segn
literatura, para luego adicionar al yogurt el porcentaje de hierro y acido flico que
una madre gestante necesita.
El hierro se determin por mtodo gravimetrico y por absorcin atmica. Se comparo
la extraccin de la vitamina por tres mtodos: agitacin magntica, ultrasonido y
radiacin de microondas.
Las muestras para cido flico se analizaron por HPLC en fase reversa en un
cromatgrafo liquido Agilent 1100, a partir de un estndar con acido flico (MERCK
98%). Las extracciones se llevaron a cabo por triplicado para evaluar la precisin
del mtodo.
Como resultado se obtuvo que la soya tiene mayor concentracin de cido flico
con relacin al meln y las lentejas, el cual se adicion al yogurt y se determin su
cantidad por el anlisis ya mencionado.

PALABRAS CLAVES
Absorcin Atmica, Acido flico, Hierro, HPLC

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INTRODUCCION incluyendo rin, placenta, y plexo coroideo,
Los folatos y el hierro son nutrientes esenciales ocurre va protena ligadora de folato asociada
para el crecimiento celular y para su divisin y a membranas, que acta como un receptor de
diferenciacin, por lo que su aporte adecuado membranas, facilitando as el ingreso tisular
resulta esencial durante el embarazo de folato. Una vez dentro de las clulas, el 5-
(ATUKORALA et al, 1994) metiltetrahidrofolato es demetilado y convertido
a la forma poliglutamato por una sintetasa.
Se denominan folatos de forma genrica todos Debido a que el folato poliglutamato no
los derivados de la vitamina B que tienen la atraviesa las membranas celulares como
actividad biolgica del cido resultado de la carga de su cadena lateral, el
pteroilmonoglutmico. El cido flico es la folato queda secuestrado dentro de la clula.
forma completamente oxidada del Antes que sea liberado de los tejidos a la
monoglutamato de la vitamina, mientras que circulacin, el folato poliglutamato es
las otras formas que se encuentran en la reconvertido a monoglutamato por la hidrolasa
naturaleza se denominan folatos. Los poliglutamato (ROSNBLATT, WHITEHEAD,
suplementos de cido flico en periodos 1999).
cercanos a la concepcin reducen el riesgo
de que el feto tenga defectos del tubo neural Los hallazgos ms comunes asociados con
(MRC, 1991; CZEIL, DUDAS, 1992). Cuando la deficiencia de folatos son la anemia
los requerimientos diarios no son cubiertos megaloblstica y trastornos de nervios
adecuadamente los tejidos pueden depletarse perifricos, mdula espinal y trastornos
en unos pocos meses. Actan como un psiquitricos depresivos. (BOTTIGLIERI et al,
cofactor en diversas reacciones enzimticas 1994; PRUTHI, TEFFERI, 1994). Se ha
aceptando y transfiriendo 1 carbono (1-C), las demostrado que los niveles de folato
que estn involucradas en la sntesis, plasmtico son ms altos en la sangre de
interconversin y modificacin de nucletidos, cordn que en la sangre materna
aminocidos y otros componentes celulares (HENDERSON et al, 1995). Se conoce como
claves en la sntesis de ADN y protenas biodisponibilidad del hierro, a la proporcin del
(BAILEY et al, 2001). hierro dietario que es absorbido y utilizado por
el cuerpo. El principal factor que influye sobre
Los folatos se presentan en los alimentos la biodisponibilidad de este mineral es su forma
como poliglutamatos, los que deben ser qumica. El hierro se presenta en la naturaleza
convertidos a monoglutamatos por la gamma- como: hierro hemnico y hierro no hemnico. El
glutamil-hidrolasa localizada en el ribete hierro hemnico forma parte exclusivamente de
estriado de los enterocitos del yeyuno. El cido alimentos de origen animal, ya sea como
flico se absorbe como tal por tratarse de un hemoglobina y/o mioglobina (SHARMA, 2003).
monoglutamato. Luego, el folato El hierro no hemnico se encuentra
monoglutamato atraviesa la membrana por un principalmente en los alimentos de origen
mecanismo transportador dependiente del pH. vegetal y su absorcin est determinada por
Antes de entrar en la circulacin portal, todas mltiples factores dietarios que favorecen o
las formas de folato sufren la transformacin impiden su solubilidad. El hierro no hemnico
a tetrahidrofolato, y son metilados en las clulas requiere de un pH cido para reducirse y pasar
de la mucosa. (BAILEY et al, 2001) La forma de Fe III a Fe II; la forma ferrosa se puede unir
predominante en el plasma es el 5- a complejos de bajo peso molecular que son
metiltetrahidrofolato, la que es ligada solubles. Existen diferentes compuestos que
libremente a albmina, con un pequeo contribuyen a estabilizar el Fe II, como el cido
porcentaje unido con alta afinidad a la protena clorhdrico, los cidos orgnicos de los
ligadora de folato. El transporte de folatos a alimentos (ascrbico principalmente) y algunos
travs de las membranas de ciertos tejidos, aminocidos (cistena principalmente). Por el

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contrario, otros compuestos presentes en los A continuacin se pesan una cantidad de 20
alimentos ms bien dificultan su absorcin. Entre gramos y se depositan:
estos se encuentran: los oxalatos, fitatos, taninos 10 gramos en un vidrio reloj, con 5 gotas de
y algunos nutrientes inorgnicos como calcio y cido ntrico libre de hierro y 5 minutos de
aluminio (QUINTERO, 2002).El porcentaje de calentamiento. Se adicionan 3 gotas de
absorcin del hierro no hemnico depende ferrocianuro de potasio.
exclusivamente del efecto concomitante de los
alimentos ingeridos. Debido a la gran cantidad 10 gramos en un vidrio reloj, con 5 gotas de
de factores que pueden determinar el porcentaje cido ntrico libre de hierro y 5 minutos de
de absorcin, la tasa vara entre el 2 y el 20% calentamiento. Se adicionan 3 gotas de
(SHARMA, 2003).Si bien es cierto que en sulfocianuro de potasio.
algunas dietas puede presentarse el 2% de
absorcin, su biodisponibilidad puede DETERMINACIN CUANTITATIVA DE
incrementarse inclusive hasta cuatro veces ms, HIERRO EN SOJA.
si se vigilan adecuadamente los factores Mtodo gravimetrico
dietticos (RUIZ et al, 2002). El hierro hemnico Se obtiene la soja en polvo, por el mtodo
(derivado de hemoglobina y mioglobina de tejidos anterior descrito.
animales), es una importante fuente diettica de
hierro porque es absorbido con mucha mayor Se pesaron 0.5, 1.0 y 2.0 gramos de soja en
eficiencia que el hierro no hemnico y ms an, polvo, se colocan en un vaso de precipitado
porque potencia la absorcin de este ltimo. Su de 250 ml y se agregan cido clorhdrico y
elevado porcentaje de absorcin obedece a la agua, se colocan en bao de mara hasta
estructura hemo, que le permite entrar disolucin total de la muestra, luego se agrega
directamente en las clulas de la mucosa del cloruro de amonio y hidrxido de amonio hasta
intestino en forma de complejo hierro-porfirina, precipitar todo el hierro presente, se filtra y se
es as como la presencia de sustancias transfiere a un crisol y se calienta en llama, se
inhibidoras o potenciadoras prcticamente no enfra el crisol y se pesa, se reporta el
afectan su absorcin, a excepcin del calcio porcentaje de FeO y Fe2O3 en la muestra.
(MARTINEZ et al, 1999), que en condiciones muy
especiales, puede ser un inhibidor hasta de la Mtodo Absorcin Atmica
tercera parte del hierro hemnico ingerido. Del Se pesa 0.5 gramos de soja en polvo por
total de hierro que tiene la carne, entre el 45% al tripiclado, se colocan en crisoles y se adiciona
60% se encuentra en forma hemnica, para cido ntrico; se hace precenizas a 92C por 1
efectos de clculos sobre la estimacin de hierro hora y cenizas 105C por 5 horas, se agrega
hemnico en la dieta, se utiliza como promedio cido ntrico hasta disolucin total de la
40%(VIDAL, FARRE, 2001). muestra, se filtra y se afora a 25 ml.

MATERIALES Y METODOS EXTRACCION DEL ACIDO FOLICO


DETERMINACIN CUALITATIVA DE Segn los reportes bibliogrficos la soya, el
HIERRO EN LA SOJA meln y las lentejas son alimentos con alto
Se seleccionan los granos de soja que se contenido de cido flico, por lo tanto es
encuentren en perfecto estado morfolgico. El importante determinar su concentracin y cual
lavado de la soja se realiza con agua potable a tiene mayor porcentaje para luego adicionarlo
temperatura ambiente, y se procede a un al yogurt.
secado manual. Posteriormente se procede a
obtener la soja en polvo, primero se muele y Teniendo en cuenta las propiedades qumicas
luego se tamiza con un dimetro de grosor de de este compuesto se lleva a cabo la
la malla de 260 micrmetros, se tomaron 500 extraccin tomando 100gr de cada muestra y
gramos de soja. aadiendo 100mL de NaOH 0.1 N, al cabo de

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TABLA 1. Variacin en el contenido de cido flico en yogurt con adicin de soya, obtenido por
diferentes mtodos de extraccin

Mtodo de Extraccin Concentracin cido Flico Microgramos de cido


en la muestra (ppm) Flico en 200ml de Yogurt
Agitacin Magntica 2.54 5080
Microondas 2.58 5160
Ultrasonido 3.27 6540

12 horas de extraccin se filtra el precipitado y temperatura ambiente (18C); la fase mvil


se toma el extracto obtenido. utilizada fue Acetonitrilo: Buffer Acetato pH 3.5
en una relacin 10:90 hasta 24:76 en 9 minutos,
Una muestra de soya de 100gr tambin fue con un flujo de 0.5 mL/min.; se utilizo tambin un
extrada con 100ml de H2SO4 0.1 N, siguiendo detector UV con arreglo de diodos y se cuantific
el mismo procedimiento. el compuesto de inters a 290 nm. Las
extracciones se llevaron a cabo por triplicado
Como la soya presenta un mayor contenido de para evaluar la precisin del mtodo. La curva
cido flico segn la literatura (INHA, 1996) y de calibracin se hizo utilizando un patrn de
anlisis realizados se emplea este alimento como cido flico marca MERCK (98%), con inyeccin
fuente natural de las vitaminas y se elabora un por triplicado de 20 L. El nivel mnimo de
yogurt con adicin de soya al 1.5% en peso. Para deteccin del mtodo cromatogrfico fue 100ppb.
la determinacin del analito en el yogurt elaborado
se compara la extraccin de la vitamina por 3 CUANTIFICACION
mtodos: agitacin magntica (10min.) A partir de un estndar con cido flico (MERCK
ultrasonido (10min.) y radiacin microondas (1 98%) se prepararon 6 soluciones patrn entre
min). En un horno convencional de uso 0.800 y 100 ppm usando como solvente Buffer
domestico marca Whirpool adaptado para tal fin; fosfato (pH 6.5).
al 10% potencia).(Ver Tabla N 1).
Se analizan por triplicado estos patrones con las
Se toma un 1gr de yogurt con adicin de soya y mismas condiciones cromatogrficas teniendo
se aade 3 mL de KOH (0.1M) con el fin de extraer as la curva de calibracin respectiva (factor de
el compuesto de inters, luego se aplican los correlacin: 0.99988). (Ver figura N 1)
mtodos mencionados; a cada extracto se
adiciona 3 ml de H 2SO4 (0.1M) y 350 L de cido
tricloroacetico para precipitar las protenas. Luego
se afora cada extracto a 10mL con buffer fosfato
(pH 6.5) centrifugamos por 2 horas a 1800 rpm
y se filtra cada muestra con un cartucho PTFE
de 0.45m (VAHTERISTO et al, 1996; RICHTER,
KINGTON, 2001).

Los extractos se soya, meln y lentejas


obtenidos, se sometieron al mismo
procedimiento con ultrasonido.

ANALISIS CROMATOGRAFICO
Las muestras se analizaron por HPLC en fase
reversa en un cromatgrafo liquido Agilent 1100
con bomba cuaternaria, columna Agilent Zorbax
FIGURA N 1
Eclipse XDB C8 ( 150 mm * 4.6 mm * 0.5 m ) a

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DISCUSION DE RESULTADOS Muestra de 2.0 gramos
DETERMINACION DE HIERRO EN LA %Fe= 8.1399%
SOJA
Mtodo Absorcin Atmica
Los ensayos con las muestras de soya que
Tres muestras de 0.5 gramos diluidas
se le adicionaron 3 gotas de ferrocianuro de
y aforadas a 25 ml
potasio (color azul) y con sulfucianuro de
potasio (color rojo) fueron positiva, presencia
0.5(1) = 325 mg Fe
de hierro (Ver figura N 2)
100 gr
Mtodo Gravimetrico
0.5(2) = 299 mg Fe
Se obtiene la soja en polvo se pesan 0.5, 1.0 y
100 gr
2.0 gramos de soja en polvo, se colocan en
vasos de precipitado de 250 ml y se agrega
0.5(3) = 269.5 mg Fe
cido clorhdrico y agua, se coloca en bao de
100 gr
mara hasta disolucin total de la muestra,
luego se agrega cloruro de amonio y hidrxido
Teniendo como promedio 297.83 mg Fe
de amonio hasta precipitar todo el hierro
100 gr
presente, se filtra y se transfiere a un crisol y
Se identificaron tambin en la soja:
se calienta en llama, se enfra el crisol y se
Sodio: 46.51 mg Na
pesa, se reporta el porcentaje de FeO y Fe2O3
100 gr
en la muestra
Potasio: 1339.16 mg K
100 gr
Fe= FeO = 71 = 1.29 (factor)
PM Fe 55
Calcio: 34.69 mg Ca
100 gr
% Fe =
(peso del crisol + muestra peso crisol) * factor * 100
Muestra utilizada
EXTRACCIN DEL ACIDO FLICO
Muestra: 0.5 gramos El contenido de acido flico en los extractos
%Fe= 3.61% vegetales tratados con ultrasonido se reporta
en la Tabla N 2.
Muestra de 1.0 gramo
%Fe= 28.67% El meln y las lentejas presentan una cantidad

FIGURA N 2

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TABLA 2. Contenido cido flico en extractos de fuentes naturales obtenidas por ultrasonido

Fuente Natural de cido Concentracin de cido Flico Microgramo cido Flico en


Flico en la Muestra (ppm) 100gr de Muestra.
Meln No Detectado -
Lentejas No Detectado -
Soya (NaOH) 0.997 997
Soya (H2SO4) 0.687 687

TABLA N 3 Reproducibilidad del Mtodo Cromatogrfico

Concentracin rea rea rea Promedio Desviacin Coeficiente


(ppm) Replica 1 Replica 2 Replica 3 rea Estndar Desviacin
(%)

de acido flico menor a la que se puede detectar CONCLUSIONES


con el mtodo de extraccin empleado, mientras Se desarrollo un mtodo Cromatogrfico
que la concentracin del analito de soya si se adecuado para la cuantificacin de acido flico
pudo determinar con este procedimiento y se en yogurt y extractos vegetales.
obtuvo mayor eficiencia en la extraccin en medio
bsico (NaOH). Se obtiene mayor concentracin de acido flico
a partir de yogurt aplicando el mtodo de
El acido flico presenta un tiempo de retencin extraccin por ultrasonido.
de 6.104 min. (Ver figura N 3) analizado con las
condiciones descritas. Para verificar la La extraccin con solucin alcalina (KOH 0.1 mol/
reproducibilidad del sistema Cromatogrfico se L), con agitacin ultrasonido por 10 minutos, se
inyectaron 3 replicas de los patrones, como se presenta como una alternativa adecuada de
observa en la Tabla N 3, los coeficientes de determinacin de cido flico en yogurt con soya..
variacin estuvieron por debajo de 5% que es el
mximo permitido por las buenas practicas de Se determina un sistema de detencin a travs
laboratorio. de detector ultravioleta a 290 nanmetros, para
yogurt y leches enriquecidas, debido a

Cromatograma cido flico presenta un tiempo de retencin de 6.104 min. Muestra analizada por HPLC
en fase reversa en un cromatgrafo liquido Agilent 1100.

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neural tube defects: results of the Medical Research
temperatura de refrigeracin (4C). No obstante Council Vitamin Study. Lancet (1991);338:131-135
se sugiere un estudio multivariado ms rgido
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La soya es una buena fuente natural de Hierro y
cido flico y se puede emplear para producir un Quintero, G. A. Desarrollo de un alimento funcional a
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