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CAPTULO

Electroforesis
David Alejandro Lpez de la Mora Ana Soledad Sandoval Rodrguez 13
Introduccin Gel
En biologa molecular, una gran cantidad de tcni La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con
cas que se realizan comnmente requiere el uso de la la finalidad de evitar perturbaciones mecnicas durante la
electroforesis, lo que supone una parte importante del separacin. El soporte idneo es un gel semislido o gela-
procedimiento sistemtico del anlisis (separacin, puri tinoso, compuesto por polmeros que forman una especie
ficacin, preparacin) de los cidos nucleicos y las pro de malla o microporos tridimensionales a travs de los cua-
tenas. La mayora de las biomolculas poseen una carga les las molculas avanzan, segn el peso molecular, lo que
elctrica cuya magnitud depende del pH del medio en permite la separacin por tamao de los diferentes com-
el que se encuentran; como consecuencia, pueden des
ponentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa
plazarse cuando se someten a un campo elctrico hacia
el polo de carga opuesta al de la molcula. A diferencia
o poliacrilamida. Para la separacin de cidos nucleicos se
de las protenas, que pueden tener una carga positiva o usan geles de agarosa o acrilamida y para protenas, slo
negativa, los cidos nucleicos slo poseen carga negati de acrilamida.
va, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en
una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia Geles de agarosa
el polo positivo, es decir, el nodo. En el caso de las
protenas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pre La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que
tratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a tem-
sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se peratura ambiente, que se disuelve con facilidad en tempe-
homogeneizan las protenas de la muestra y todas migra ratura de 50 a 60C, se torna lquida y se solidifica cuando
rn hacia el polo positivo; slo se separarn por tamao. se enfra formando un gel altamente poroso. El gel de aga-
El principio de la electroforesis consiste en la mi rosa es la manera ms efectiva de separar fragmentos de
gracin proporcional de las molculas a travs de un gel cido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)
u otro tipo de matriz porosa, segn su peso molecular o
que van de 100 pb a 25 kb. Para elaborar el gel se pesa la
tamao; movimiento generado por el campo elctrico.
cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solucin
amortiguadora adecuada de la misma composicin y con-
centracin que el buffer de corrimiento y se calienta hasta
Elementos necesarios para una formar una solucin. Sin dejar enfriar, se vaca de forma
inmediata sobre un molde de forma rectangular y en uno
electroforesis de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine
Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de con la finalidad de generar los pocillos u orificios en los que
elementos descritos a continuacin y enlistados en la fi- se colocarn las muestras (figura 13-3). La agarosa posee
gura 13-1. ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto
txico y permite realizar el anlisis de cidos nucleicos con
pesos moleculares variados, segn la concentracin de
Cmara de electroforesis agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolu-
La cmara de electroforesis es un dispositivo que permite la cin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La con-
generacin de un campo elctrico alrededor de un gel en el centracin de agarosa se escoge segn el tamao del cido
que se depositan las muestras. Este campo se genera dentro nucleico que se vaya a analizar (cuadro 13-1). El tamao de
de una solucin amortiguadora en la que se encuentra su- los poros de la matriz del gel depende de la concentracin
mergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido de agarosa utilizada y la concentracin de agarosa es inver-
de electrolitos permite la transmisin de la corriente elc- samente proporcional al tamao del poro obtenido; esto
trica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La es, a mayor concentracin, menor tamao de los poros, y
cmara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente viceversa, si los poros son pequeos la migracin del cido
de energa. En las cmaras de electroforesis vertical el polo nucleico es ms lenta. La figura 13-4 representa la migra-
positivo se encuentra en la parte inferior de la cmara (fi- cin de las molculas de DNA en un gel de agarosa. Du-
gura 13-2A) y en las horizontales, en uno de los extremos rante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un
(figura 13-2B). En ambos tipos de cmaras el polo positivo peso molecular alto migran al nodo con ms lentitud que
se identifica con color rojo y el negativo con negro. los de menor peso molecular. Esto se debe a que los cidos
118 Metodologa del DNA recombinante

Cmara de A)
electroforesis Peine para pocillos

MIGRACIN DE LA MUESTRA
Gel

Transiluminador Fuente de poder B)

100

MIGRACIN DE LA MUESTRA

Figura 13-2. Cmaras de electroforesis. A) En las cmaras de


Buffer de corrimiento

Marcador de peso

BUFFER
Buffer de carga

electroforesis vertical el corrimiento de la muestra sigue la


gravedad, ya que el polo positivo se encuentra en la parte
Buffer
molecular

1KB

inferior de la cmara. B) En la electroforesis horizontal debe


cuidarse que el nodo se coloque hacia el extremo del gel
donde corren las muestras, de lo contrario las muestras se
saldrn del gel.
Figura 13-1. Elementos necesarios para una electroforesis.
En la imagen se aprecian los elementos que se requieren para
el corrimiento electrofortico y visualizacin del gel. geles con un amplio intervalo de tamaos de poro. El gel de
poliacrilamida es el resultado de la polimerizacin qumi-
ca de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. El tamao
nucleicos de peso elevado tardan ms tiempo en atrave- del poro de un gel de acrilamida est determinado por la
sar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicos no concentracin total de acrilamida presente (acrilamida +
linearizados, como plsmidos circulares (conformacin bisacrilamida), que generalmente se maneja en proporcin
nativa), cido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) con
estructuras secundarias o DNA de gran longitud, la mi-
gracin no slo depende del peso molecular, sino tambin
del grado de empaquetamiento que presenten. En la elec-
troforesis de un plsmido, por ejemplo, se visualizan tres
conformaciones distintas de la misma molcula: la forma
superenrrollada, la semirrelajada y una relajada. Esto se re-
fleja en tres bandas de tamao diferente, aunque se trate
del mismo plsmido (figura 13-5). Por ello, antes de una
electroforesis es importante la linearizacin y la elimina-
cin de estructuras secundarias por desnaturalizacin de Figura 13-3. Preparacin de un gel de agarosa. La agarosa es
la muestra. La concentracin de agarosa ms utilizada para un polvo que para disolverse requiere calentarse hasta la
electroforesis de cidos nucleicos es de 0.5 a dos por ciento. ebullicin del solvente. Una vez obtenida la solucin de
agarosa, antes de que se enfre a menos de 50C se coloca
Geles de acrilamida en una cmara para formar el gel. El gel se coloca de manera
que los pocillos queden en el extremo donde se localiza el
La acrilamida es un polmero sinttico, termoestable, inco- polo negativo de la cmara de electroforesis, para permitir que
loro y qumicamente inerte, con el que se pueden generar la muestra corra a lo largo del gel.
Electroforesis 119

Cuadro 13-1. Concentraciones de agarosa para geles de cidos


nucleicos. El cuadro indica las concentraciones de agarosa
recomendadas segn el peso molecular que se espera encon-
trar en las muestras. Al aumentar la concentracin de agarosa
se reduce el poro del gel, lo que permite la discriminacin de
Muestra fragmentos de menor tamao.

Agarosa (%) Tamao de banda

0.3 > 700 pb

Migracin
Patrn o 0.5 700 pb a 25 kb
Ladder
0.8 500 pb a 15 kb
Banda de DNA
1.0 250 pb a 12 kb

1.2 150 pb a 6 kb

1.5 80 pb a 4 kb
Gel
2.0 100 pb a 3 kb

Figura 13-4. Electroforesis de cidos nucleicos. Se representa 3.0 500 pb a 1 kb


un gel de agarosa en el cual se visualiza un marcador de peso
4.0 100 pb a 500 pb
molecular junto a las muestras para ayudar en la determi-
nacin del peso molecular de los fragmentos. La muestra se 6.0 10 pb a 100 pb
carga en los pocillos y se deja correr hacia el polo negativo.

de 19:1. Regulando la concentracin de ambas y su propor- cadena larga. El polmero en disolucin no forma un gel,
cin se consiguen distintas porosidades, siempre menores sino que se encuentra en estado viscoso debido a que las
que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se en- cadenas pueden deslizarse unas sobre otras; la formacin
cuentra en disolucin acuosa experimenta autopolimeri- del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo
zacin de forma espontnea y lenta, con el resultado de que se consigue con la bisacrilamida). La acrilamida es una
que las molculas de acrilamida se unen cabeza con cola. neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaucin.
En presencia de un sistema generador de radicales libres Tambin es esencial almacenarla en un lugar refrigerado,
se da una polimerizacin vinlica en la cual se activan los seco y oscuro para reducir la autopolimerizacin y la hi-
monmeros de acrilamida, quedan en estado de radical drlisis. La bisacrilamida, o N,N-metilenbisacrilamida,
libre y reaccionan rpidamente para formar polmeros de est compuesta por dos molculas de poliacrilamida enla-
zadas por sus grupos amino, no reactivos. Este compuesto
se polimeriza junto con la acrilamida y establece puentes
entre las cadenas lineales de poliacrilamida, con lo que se
evita su deslizamiento y conduce a la formacin del gel. El
gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que
A
la agarosa y es susceptible de teirse por varios procedi
mientos; tambin puede desteirse en caso necesario. Los
geles de acrilamida pueden digerirse para extraer fraccio-
nes separadas (bandas) o desecados para su exposicin ra-
B diogrfica y registro permanente. La electroforesis con geles
de acrilamida siempre se realiza en cmaras verticales. La
electroforesis de protenas emplea geles de acrilamida de
dos capas a diferente concentracin de acrilamida, un gel
C superior o concentrador y un gel inferior de separacin o
de resolucin. El gel de concentracin tiene un tamao de
Figura 13-5. Perfil electrofortico de un plsmido. Aunque
la molcula de DNA (en este caso un plsmido) tenga la
poro grande y se prepara con un amortiguador de Tris/HCl
misma longitud en pb, puede demostrar diversos patrones con pH de 6.8, dos unidades de pH menor que el buffer
de corrimiento electrofortico segn la conformacin de la de corrimiento hecho de Tris/SDS/glicina. Estas condi-
estructura. A) Plsmido superenrrollado. B) Plsmido circular. ciones proporcionan un ambiente para que las protenas
C) Plsmido linearizado. recubiertas con SDS se concentren. El tamao del gel de
120 Metodologa del DNA recombinante

apilamiento debe ser del doble de la altura del pozo donde


se va aplicar la muestra. Este gel se coloca sobre el gel
de resolucin, un gel de poliacrilamida de poro pequeo
hecho de un amortiguador de Tris/HCl, con un pH de 8.8.
En el gel de resolucin es donde las protenas se separan de
acuerdo con su tamao, de manera dependiente del por-
centaje de acrilamida utilizado para su preparacin, como Muestra
se describe en el cuadro 13-2. La adicin de SDS a los geles
de poliacrilamida es opcional; cuando se hace, mantiene a
las protenas en estado extendido, lo que facilita la movilidad Gel de
electrofortica de la protena mediante el gel y permite que la

Migracin
empacamiento
movilidad dependa exclusivamente de su masa molecular.
En la figura 13-6 se representa la electroforesis de prote- Patrn o
Ladder
nas en gel de acrilamida. Banda de
protenas

Buffer de corrimiento
El buffer de corrimiento es de la misma composicin y pH Gel de
que el buffer con el que se prepara el gel de resolucin, ya resolucin
sea de agarosa o de acrilamida. ste proporciona el medio
para la transmisin de la corriente elctrica y mantiene el
pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En Figura 13-6. Electroforesis de protenas. Las protenas se
el caso de los cidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE corren en geles de acrilamida formados por dos fases.
como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris Una fase superior donde las molculas se concentran y una
base, cido brico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El inferior donde la muestra se separa en sus componentes
buffer TAE contiene Tris base, cido actico y EDTA, ajus- segn su peso molecular. Al estar pretratadas con SDS, las
tado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de protenas se rodean de cargas negativas, lo que les permite
protenas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, migrar hacia el polo positivo con independencia de su carga
inicial.
a un pH 8.3.

Marcador de peso molecular las muestras sometidas a electroforesis. Los marcadores de


Los marcadores de peso molecular son una mezcla de mo- peso molecular estn disponibles comercialmente en una
lculas de DNA o de protenas de tamao conocido que amplia variedad. En el caso de marcadores de peso mo-
permiten determinar por comparacin el tamao de las lecular de cidos nucleicos, stos pueden ser bacterifagos
molculas (cidos nucleicos o protenas) contenidos en o plsmidos sometidos a corte con enzimas de restriccin
que generan fragmentos de diversos tamaos; tambin
puede tratarse de molculas de DNA sintticas denomina-
Cuadro 13-2. Concentraciones de acrilamida para geles das escaleras, porque contienen fragmentos con incremen-
de cidos nucleicos. El cuadro indica las concentraciones de tos de tamao gradual. En la figura 13-7 se pueden ver las
acrilamida recomendadas segn el peso molecular que se bandas que se obtienen de los fragmentos con un marca-
espera encontrar en las muestras. Al aumentar la concentra- dor de uso comn, como es el fago Phi X174/Hae III y una
cin de acrilamida se reduce el poro del gel, lo que permite la escalera denominada 1 Kbase plus ladder. Los marcadores
discriminacin de fragmentos de menor tamao. de peso molecular de protenas suelen ser una serie de pro-
tenas de peso molecular conocido (que van desde 10 hasta
Acrilamida (%) Pares de bases
300 kDa), las cuales pueden estar teidas o coloreadas. En
3.5 1000 a 2000 los casos en que la electroforesis sea un paso previo para
la tcnica de Western blot, tambin se dispone de marca-
5.0 80 a 500
dores de peso molecular de protenas recombinantes que
8.0 60 a 400 contienen un sitio de unin a inmunoglobulina (Ig) G. El
sitio de unin a IgG puede ser reconocido por un anticuer-
12.0 40 a 200
po primario o secundario empleado para la deteccin de la
15.0 25 a 150 protena buscada por Western blot. Este sistema es com-
patible con quimioluminiscencia, el marcaje cromognico
20.0 6 a 100
y la fluorescencia.
Electroforesis 121

molcula cromognica que emite energa fluorescente y


12 000 permite visualizarla. El transiluminador es el sistema em-
pleado con ms frecuencia por ser simple y efectivo. En
1 353
1 078 general emiten energa a una longitud de onda a 302 nm,
872 5 000 aunque tambin existen para 254 y 365 nm; suelen contar
603
con un botn para baja/alta intensidades por si se requiere
una menor exposicin de la muestra a la luz ultravioleta.
Algunos tambin permiten la seleccin de entre dos longi-
tudes de onda, lo que los hace ms flexibles. Los epitrans
310 iluminadores (365, 480 nm) generan la emisin visible por
271 281 2 000
fluorescencia igual que el transiluminador pero, a diferen-
234
1 650 cia de ste, la fuente de energa se encuentra reflejada y no
194 pasa a travs de la muestra. El epiiluminador es efectivo en
geles muy densos.
Una vez que se tienen los materiales necesarios existen
1 000
188 dos maneras de realizar la electroforesis: de forma hori-
850 zontal y vertical.
650
72
Electroforesis horizontal
500
Se lleva a cabo con gel de agarosa para cidos nucleicos.
400
Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la fina-
300 lidad de evitar que se seque por el calentamiento inducido
por el paso de la corriente elctrica. Al momento de cargar
200 las muestras en los pocillos, se puede optar por hacerlo en
100
seco; esto es, llenar parcialmente la cmara con lquido de
corrimiento de tal manera que la parte superior del gel no
se cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin
Figura 13-7. Marcadores de peso molecular para DNA. En la interferencia del lquido. Una vez cargada la muestra, se
la imagen el primer carril corresponde a las bandas que se corre por unos minutos a bajo voltaje hasta que la muestra
obtienen de los fragmentos con un marcador como es el fago entre en el gel y entonces se cubre del todo con el buffer de
Phi X174 digerido por la enzima Hae III, mientras el segundo corrimiento. Tambin existe la tcnica denominada elec-
carril muestra los fragmentos de una escalera formada por
troforesis submarina, en la que la totalidad del gel se cubre
segmentos sintticos de DNA.
con buffer de corrimiento, desde el momento de cargar las
muestras en los pocillos, como se ejemplifica en la figura
13-8. En esta tcnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y
Buffer de carga se llama submarina porque la muestra se coloca con el gel
Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad sumergido en el buffer.
y color a la muestra, lo que facilita su depsito en el poci-
llo y evita su salida del gel; permite, adems, monitorear el
corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relacin Electroforesis vertical
1:3 para cidos nucleicos o 1:6 para protenas, respecto a la
Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se
cantidad de muestra. El buffer de carga de cidos nucleicos
utiliza para protenas o cidos nucleicos de pequeo tama-
contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glice-
o. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangula-
rol. Mientras que el buffer de carga para protenas contiene
res de vidrio donde la corriente elctrica se genera gracias
Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul
al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las
de bromofenol. En el caso de que se deseen condiciones
cubetas o compartimientos del nodo y el ctodo como se
reductoras y desnaturalizantes, deber aadirse betamer-
aprecia en la figura 13-9.
captoetanol a este buffer y habr que calentar las muestras
a 95C por cinco minutos.
Procedimiento general de una
Transiluminador ultravioleta electroforesis
El transiluminador es un aparato que transmite luz del es- A continuacin se exponen los pasos de los que consta una
pectro ultravioleta a travs de la muestra, lo cual excita la electroforesis tpica.
122 Metodologa del DNA recombinante

mero es igual al doble del nmero de pares de bases. Dado


que la forma de la molcula de DNA siempre es la misma,
la movilidad de la electroforesis depender nicamente
+ de la longitud del DNA (pb) y se representar en bandas
(figura 13-10). El corrimiento se realiza a voltajes de entre
25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimien-
to. El avance electrofortico se monitorea a travs de la vi-
sualizacin de los colorantes (azul de bromofenol y azul de
xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mez-
cl la muestra previa a su colocacin en el pocillo. Si los
fragmentos de DNA son pequeos (menos de 50 pb) o bien
se requiere discernir entre fragmentos de cidos nucleicos
con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda
Migracin de la muestra
utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolu-
cin. Las agarosas con un punto de fusin bajo permiten la
Figura 13-8. Ejemplificacin de electroforesis submarina. La
muestra se coloca despus de haber vertido el buffer de preparacin de geles a elevadas concentraciones y se acon-
corrimiento y retirado el peine que sirve de molde para la seja para obtener una buena separacin de molculas de
formacin de los pocillos. DNA con < 1000 pb. Son ideales para preparar geles anal-
ticos de productos procedentes de tcnicas de reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction)
1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentra- u otras. Algunas son capaces de separar fragmentos que
cin requerida. difieren entre 10 y 20 pb. Para la preparacin del gel debe
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga estandarizarse primero qu concentracin de agarosa es la
adecuado. ms adecuada, segn la muestra que se desee separar.
3. Cargar las muestras en el gel. El volumen de agarosa depende del tamao de la c-
4. Realizar la corrida electrofortica al voltaje pertinente. mara de electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para
5. Visualizar los cidos nucleicos o las protenas. las dimensiones ms comunes del gel: 8 6 0.5 cm
(L A A). Inmediatamente despus de vaciar la agarosa
a la cmara, debe insertarse el o los peines necesarios. La
Electroforesis de cidos nucleicos agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 min, mientras
El mtodo ms comn para la electroforesis de DNA es que la poliacrilamida, unos 30 min. Una vez solidificado el
elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentra- gel, se aade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a con-
cin de 0.5 a 2%. La carga elctrica de la molcula de DNA centracin 1X, cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm
la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa, y cuyo n- por encima del gel) y se retiran los peines. Las muestras se

Buffer interno

Buffer externo

Figura 13-9. Electroforesis vertical. En esta cmara se aprecia cmo el gel de acrilamida ha quedado embebido en el buffer de
corrimiento en su extremo superior gracias a la colocacin de amortiguador en la parte interna de la cmara. El buffer de la parte
externa permite que el polo positivo cuente con la misma solucin buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.
Electroforesis 123

Mayor intensidad

V
mA

Mayor tamao V/A


STOP RUN/PAUSE VOLTS/AMPER

Menor intensidad

Figura 13-11. Fuente de poder. La imagen muestra una tpica


fuente de poder donde se indica el miliamperaje a que est
siendo corrida la muestra. La seleccin de las condiciones de
corrimiento puede ser con un amperaje constante o bien a
Menor tamao voltaje constante, como en este caso.

Figura 13-10. Movilidad de fragmentos de DNA. La imagen de 0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar
muestra fragmentos de DNA de mayor a menor tamao a un fragmento de DNA de 4 kb, mientras que el azul de
(parte superior hacia parte inferior) visualizados con un agente bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb.
intercalante. Se aprecia cmo la intensidad de la banda obser- La electroforesis se detiene cuando se considera que la
vada es variable, lo que indica groso modo cul fragmento se muestra se localiza en la posicin deseada, o bien cuando
encuentra en mayor cantidad y cul en menor. la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes
del gel.
Hay mltiples factores que pueden afectar la migra-
mezclan con el buffer de carga y se depositan de forma cui-
cin del DNA, como la concentracin del gel utilizado, el
dadosa en los pocillos, con lo que se evita que se salgan y
tamao de la molcula de DNA muestra, el empaqueta-
puedan contaminar el pocillo contiguo. Debe considerarse
miento del DNA, el voltaje, la temperatura del buffer de
el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos,
corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje
uno de los carriles, para la determinacin del peso molecu-
es muy alto), la contaminacin con agentes intercalantes
lar de la muestra. Este marcador tambin debe mezclarse
en la muestra, la composicin del buffer de corrimiento,
con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado
etctera.
para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos, se
procede a la transmisin de la corriente elctrica. Se co-
Visualizacin de las muestras
nectan los cables de la fuente de energa de cada polo elc- Para la visualizacin de los cidos nucleicos se utiliza un
trico a la cmara de electroforesis en el electrodo que le colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que tiene la
corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del
molecular de las molculas de DNA que se va a separar. DNA y el RNA. Debido a esta propiedad es un agente mu-
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb) tagnico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de
se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 etidio, por lo general, se incorpora a la agarosa (0.5 mg/
V. Para muestras de DNA genmico y plasmdico (> 2 kb) ml) antes de permitir la solidificacin, o puede incorporar-
se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V. En la figu- se luego del corrimiento, incubando el gel en una solucin
ra 13-11 se aprecia una fuente de energa, con su pantalla, que lo contenga a 0.5 mg/ml. El bromuro de etidio emite
que indica el amperaje. Es importante que se estandarice el fluorescencia de color naranja cuando se expone a la luz ul-
tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor reso- travioleta con longitud de absorcin de 254 nm, y longitud
lucin posible. de emisin de 366 nm. La seal fluorescente es proporcio-
Durante el corrimiento se monitorea la migracin de nal a la cantidad de producto, como puede observarse en
la muestra con colores que contiene el buffer de carga, en la figura 13-12. Su sensibilidad permite detectar cerca de
que se observa el color azul y el verde correspondientes 30 pg de cido nucleico por banda (segn el grosor del gel).
a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, de El bromuro de etidio es teratognico, mutagnico y cance-
forma respectiva. En geles de agarosa, dentro del rango rgeno, por lo que para este procedimiento se recomienda
124 Metodologa del DNA recombinante

el uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio rando la polimerizacin total del primero, para continuar
se ha sustituido por un compuesto comercial, SYBR Safe, con la del segundo; de lo contrario, en estado lquido, se
que se une de manera no covalente a los cidos nucleicos. mezclaran.
Este colorante tiene una fluorescencia a 280, una excita- Para el caso de los geles de acrilamida para cidos
cin mxima a 502 nm y una emisin mxima a 530 nm. nucleicos slo se tiene una fase, conformada por el gel de
Con este colorante, el DNA puede visualizarse con una luz resolucin, en el que las molculas de DNA migrarn, ge-
ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm. Por otro lado, nerando un patrn electrofortico, segn su tamao.
el colorante de cianina asimtrico el SYBR-Green es un Para electroforesis de protenas, la acrilamida se pre-
fluorforo que se une con gran afinidad al surco menor del para a partir de una solucin al 30% de acrilamida-bisacri-
DNA bicatenario, y es unas 25 veces ms fluorescente que lamida 19:1. sta se mezcla con el buffer correspondiente y
el bromuro de etidio. Este colorante con epiiluminacin de una solucin de SDS; adems, se aade persulfato de amo-
254 nm puede detectar 60 pg de dsDNA/banda; 1 a 2 ng nio (APS) y N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina (TEMED)
de oligonucletidos, y 100 a 300 pg de RNA o ssDNA/banda. como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a
Para los geles de acrilamida una alternativa al bromuro de 10 mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un ini-
etidio es el nitrato de plata; sin embargo, ste utiliza reac- ciador de la reaccin de polimerizacin que al final forma
tivos peligrosos, como el formaldehdo. Por otro lado, la el gel. El TEMED funciona como otro iniciador de polime-
tincin con plata es ms sensible que el bromuro de etidio, rizacin. Las propiedades del gel resultante dependen de la
ms barata a largo plazo y menos txica. En la figura 13-12 concentracin de APS y TEMED, ya que un aumento en
se aprecia una muestra visualizada por bromuro de etidio su concentracin disminuye la longitud media de la cadena
y otra por SYBR Safe. de polmero y, por lo tanto, disminuye su elasticidad y le
resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la menor
concentracin posible de catalizadores que permita la po-
Electroforesis de protenas limerizacin en un tiempo ptimo.
El mtodo ms empleado para electroforesis de protenas El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el
se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento
gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de dentro de la cmara vertical de electroforesis. En el mo-
resolucin y otro de compactamiento), que difieren en su mento de sumergir los geles en el tanque, se debe asegurar
concentracin, composicin y pH. Los geles estn unidos que los pocillos del gel estn totalmente cubiertos por el
pero limitados por una fase de separacin visible a contra buffer. Es comn en los geles de acrilamida realizar un pre-
luz; para lograrlo, deben prepararse por separado, espe- corrimiento de unos 10 a 30 min a voltajes bajos, con el

A) B)

Figura 13-12. Visualizacin de fragmentos de DNA. Estas imgenes son de un gel de agarosa donde la muestra fue visualizada por
A) bromuro de etidio y B) colorante de cianina asimtrico (SyberR-Green).
Electroforesis 125

cual se asegura que los pocillos se limpien antes de cargar Muchas variables pueden influir en la intensidad del
las muestras. color y todas las protenas tienen caractersticas distintas
Para la preparacin de la muestra de protena se reali- de tincin.
za una reaccin fisicoqumica, en la que se rompen enlaces Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para
peptdicos y puentes disulfuro por accin de detergentes ello, primero se deshidrata en glicerol-metanol y, poste-
inicos (SDS), reactivos reductores (betamercaptoetanol) riormente, se coloca en una lmina de celofn hidrof li-
y temperaturas elevadas (95C), que al final consigue des- co y no plastificado que cubra totalmente el gel. Se cubre
naturalizar la protena hasta su estructura primaria. La el gel con un segundo celofn previamente remojado en
muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con agua y se sella con calor. Aqu se deja secar en condiciones
cuidado en los pocillos, evitando la contaminacin del po- ambientales por aproximadamente dos das o se acelera el
cillo contiguo. Hay que considerar el uso de un marcador proceso con el uso de desecadores de geles.
estndar de protenas para la medicin del peso molecular Algunas protenas pueden migrar de forma irregular
de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamien- y aparecer con un peso molecular mayor que el esperado;
tos que la protena. esto puede deberse a que presentan modificaciones pos-
Una vez colocadas las muestras de protenas en cada traduccionales en su estructura, como residuos de gluco-
pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes silacin, fosforilacin y acetilacin, que podran retardar
de los electrodos a la fuente de energa, con la seleccin de la migracin de las muestras. Asimismo, si existe desna-
voltaje o amperaje adecuados. Para el clculo del voltaje turalizacin de las protenas, se considera que la protena
es importante conocer la distancia en centmetros del gel est degradada y suelen aparecer manchas difusas en todo
desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia el carril.
multiplicada por 8-15 V permitir determinar el voltaje del
corrimiento. El voltaje ptimo depender de la molcula
que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda es- Aplicaciones de la electroforesis
tandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o co-
Algunos de los usos de la electroforesis para cidos nuclei-
rriente elctrica (medida en amperios o miliamperios) de-
cos en geles de agarosa son determinar los tamaos mo-
pender de la fuerza inica del buffer. En el caso de trabajar
leculares de los cidos nucleicos, analizar los fragmentos
con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25
cortados con enzimas de restriccin (mapa de restriccin),
a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante,
comparar los tamaos de distintos tipos de DNA, aislar y
visualizado como una lnea azul, haya llegado a los lmites
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonacio-
de la parte inferior del gel.
nes moleculares, y analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a
Visualizacin de las muestras las tcnicas de hibridacin, como el Southern blot (DNA)
Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente que con- o el Northern blot (RNA), en que la presencia de deter-
tiene el colorante azul brillante de Coomassie y se incuba minada secuencia del cido nucleico en una mezcla de
por unos minutos; esto permitir la visualizacin de las molculas se distingue por su tamao, la cual se confirma
bandas de protenas. El proceso de coloracin se basa en la por hibridacin con una sonda especfica. En el caso de
atraccin electrosttica del enlace peptdico de las prote- las protenas, la electroforesis se aplica para la identifica-
nas sobre grupos de cido sulfnico, que tien la protena cin de fracciones proteicas o protenas particulares por
de color azul. Asimismo, las fuerzas de van der Waals y tamao, como es el caso de la electroforesis de globulinas,
las interacciones hidrofbicas participan en este proceso o protenas sricas; pero, sobre todo, para la identifica-
de unin mecnica. La tincin de Coomassie Blue clsi- cin de molculas particulares empleando despus una
ca, por lo general puede detectar bandas de protena de reaccin antgeno-anticuerpo especfica en la tcnica de
50 ng mientras que la tincin con plata incrementa este Western blot. Asimismo, la electroforesis es crucial en tc-
lmite de sensibilidad unas 50 veces. La tincin con plata nicas como la secuenciacin, en que, tras un corrimiento
consiste en desarrollar el color en el gel por incubacin en electrofortico de las cuatro reacciones de elongacin con
soluciones de metano al 140%: cido actico al 10%, luego los dideoxinucletidos (vase el captulo 18), se puede de-
metanol al 40%, seguido de agua y posteriormente tiosul- ducir la secuencia del segmento de cido nucleico. Incluso,
fato de sodio al 0.01%. Despus de este proceso, se lava y los secuenciadores automticos modernos emplean una
se procede a la incubacin en fro (4C) en cloruro de plata electroforesis capilar para el discernimiento de la secuen-
al 0.1%; posteriormente, se lava e incuba con carbonato de cia. Tambin, los termocicladores en tiempo real basan la
sodio al 2% en formalina al 0.04% (llamada tambin formol deteccin de los fragmentos amplificados en una electrofo
al 35%), que acta como revelador. Por ltimo, se incuba resis capilar, en que es posible la deteccin inmediata de los
con soluciones de cido actico antes de fotografiar o es- segmentos amplificados y su lectura por el lser correspon-
canear. diente al flurocromo con que el producto est marcado.
126 Metodologa del DNA recombinante

Ejercicios de integracin 4. En qu carril y qu peso tiene la banda de menor con


centracin?
Con base en la imagen de una electroforesis de agarosa para 5. Suponiendo que son muestras de DNA digeridas por
fragmentos de DNA representada en la imagen, conteste las enzimas de restriccin, qu carriles contienen aparen
siguientes preguntas: temente la misma muestra. Explique su respuesta?
1. De qu peso molecular es la banda de menor tamao 6. En qu carril se localiza el marcador de peso mo
del carril C? lecular?
2. De qu peso molecular es la banda de mayor tamao 7. Indique el sentido de corrimiento de las muestras con
del carril D? una flecha.
3. En qu carril y qu peso molecular presenta la banda 8. Seale la polaridad correspondiente a cada extremo
que tiene mayor concentracin? del gel.