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Valorizacin del glicerol a travs de la produccin de biopolmeros: El caso PHB con Bacillus

megaterium
Javier M. Naranjo, John A. Posada, Juan C. Higuita, Carlos A. Cardona
Instituto de Biotecnologa y Agroindustria, Departamento de Ingeniera Qumica, Universidad Nacional de Colombia sede Manizales, Cra. 27 No. 64-60, Manizales, Colombia

highlights

" Polyhydroxybutyrate production from glycerol with Bacillus megaterium was evaluated.
" Polyhydroxybutyrate production at industrial conditions using glycerol was simulated.
" Polyhydroxybutyrate production costs and glycerol valorization were assessed.

article info abstract

Article history: En este trabajo se realizaron anlisis tcnicos y econmicos para evaluar la transformacin
Received 12 December 2012
Received in revised form 22 January 2013 del glicerol en polihidroxibutirato usando Bacillus megaterium. La produccin de PHB se
Accepted 23 January 2013 Available
online 30 January 2013
compar utilizando glicerol o glucosa como sustratos y se obtuvieron rendimientos
similares. Los costes de produccin totales para la generacin de PHB con ambos
sustratos se estimaron a escala industrial. En comparacin con la glucosa, el glicerol
Keywords:
Bacillus megaterium mostr una disminucin de 10% y 20% en los costes de produccin de PHB utilizando
Glycerol dos esquemas de separacin diferentes respectivamente. Adems, un margen de beneficio
Adaptation
PHB bioproduction del 20% en el precio de venta de PHB utilizando glicerol como sustrato dio como
Simulation process
resultado una valorizacin del 166% del glicerol bruto. En este trabajo se demuestra la
viabilidad del glicerol como materia prima para la produccin de PHB en laboratorio
(hasta un 60% de acumulacin PHB) e industrial (2.6US$/kgPHB) scales is demonstrated.
2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduccin biodiesel se ha visto afectada directamente. Con el fin de convertir el


glicerol en productos de valor aadido, se han analizado las
El glicerol bruto se genera como co-producto en la produccin de
transformaciones qumicas y biolgicas (Wu et al., 2011). Las
biodiesel. Por cada 100 libras de biodiesel producido, se generan 10
conversiones biolgicas ofrecen la oportunidad de sintetizar una
libras de glicerol bruto (10% en peso) (Yazdani y Gonzlez, 2007).
amplia gama de productos con diversas funcionalidades. El glicerol
Aunque el glicerol puro es una materia prima industrial importante
puede utilizarse como una fuente de carbono sustituyendo los
utilizada en las industrias de alimentos, drogas, cosmticos,
azcares en varios procesos microbiolgicos. La produccin de
farmacuticos, pulpa y papel, cuero, textiles y tabaco, el crecimiento
polihidroxiacanoato (PHA) es una alternativa interesante para la
de la industria del biodiesel ha producido un excedente de glicerol que
transformacin biolgica del glicerol. Los PHA son homo o
ha provocado una importante disminucin del precio de mercado de
heteropolisteres y pueden ser sintetizados y almacenados
Glicerol (Posada et al., 2011). As, la economa de la industria del
intracelularmente por muchos procariotas en forma de grnulos, y
pueden representar hasta el 80% del peso seco bacteriano total (Khanna
Corresponding author. Tel.: +57 6 8879300x50417; fax: +57 6 8859300x50199. E-mail
address: ccardonaal@unal.edu.co (C.A. Cardona).

0960-8524/$ - see front matter 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2013.01.129
J.M. Naranjo et al./ Bioresource Technology 133 (2013) 3844 39

y Srivastava, 2005; Mahishi et al., 2003). Los PHA pueden ser de PHB en presencia de una fuente de exceso de carbono y restriccin
producidos a partir de fuentes renovables mediante un proceso de de nitrgeno (Lpez et al. 2012). Los cultivos de reserva se cultivaron
fermentacin bajo condiciones de crecimiento restringido para a 33C en caldo nutriente y se mantuvieron a 4C despus del
nitrgeno, fsforo, azufre y / u oxgeno en presencia de una fuente de crecimiento en agar nutritivo. El cultivo de reserva adaptado al
carbono excesiva y pueden ser biocompatibles y completamente glicerol como nica fuente de carbono se mantuvo a 4C despus del
biodegradados (Steinbchel, 2001; Lee, 1996). El polihidroxibutirato crecimiento en un medio de agar formulado. Las clulas de B.
(PHB) fue el primer tipo de PHA descubierto y el ms ampliamente megaterium adaptadas se almacenaron a 80C en crio-viales de 2 ml
estudiado. PHB tiene propiedades mecnicas similares a plsticos que contenan 30% de glicerol y 70% del cultivo lquido cultivado.
convencionales como polipropileno o polietileno, pero sus costos de
produccin son ms altos que los plsticos petroqumicos. El coste total 2.2 Medios culturales
de produccin del PHB depende del microorganismo (rendimiento y
productividad), de las fuentes de carbono y nitrgeno (sustratos), de las El medio de siembra se prepar con las siguientes
condiciones de fermentacin (temperatura, aireacin, valor pH) y de los concentraciones: (NH4)2SO4, 1 g/l; KH2PO4, 1.5 g/l; Na2HPO4, 9 g/l;
procesos de recuperacin y purificacin. La fuente de carbono podra MgSO47H2O, 0.2 g/l; and 1 ml of a trace element solution composed
representar el 25-45% de los costos totales de produccin (Nath et al., by: FeSO47H2O, 10 g/l; ZnSO47H2O, 2.25 g/l; CuSO45 H2O, 1 g/l;
2008), por lo tanto, la necesidad de encontrar fuentes de carbono ms MnSO44H2O, 0.5 g/l; CaCl22H2O, 2 g/l; H3BO4, 0.23 g/l;
baratas. Los residuos agroindustriales son candidatos atractivos ya que (NH4)2Mo7O24, 0.2 g/l; y HCl, 10 ml. Las fuentes de carbono
tienen algunas de las caractersticas deseadas, es decir, bajos precios y analizadas fueron glicerol y glucosa. La fuente de carbono y el
alta disponibilidad. Adems, cuando se utilizan residuos MgSO47H2O were autoclaved separately and added aseptically to the
agroindustriales como sustratos para la produccin de PHB, se evita su medium after cooling.
disposicin final directa resolviendo as un problema ambiental. Se ha
utilizado una amplia variedad de sustratos como el suero, los materiales
lignocelulsicos y el glicerol (obtenidos de la produccin de biodiesel)
con diferentes microorganismos para mejorar los rendimientos y la
produccin de PHB (Nath et al., 2008, Koller et al., 2008, 2005 , Y, en
el caso de los autores de la presente invencin, los autores de la presente
invencin, Pantazaki et al., 2009, Kim, 2000, Silva y otros, 2004, Yu y
Stahl, 2008, Cavalheiro y otros, 2009, Bormann y Roth, 1999, Nikel et
al.
Unas variedades de microorganismos son capaces de producir PHB de
diversos desechos agroindustriales. Estos microorganismos pueden ser
cepas silvestres tales como Cupriavidus necator (Cavalheiro et al.,
2009), Methylobacterium rhodesianum (Borman et al., 1999) o
microorganismos recombinantes tales como Escherichia coli CT1061
(Nikel et al., 2008). Las cepas bacterianas Gram positivas y Gram
negativas estn en el grupo de bacterias productoras de PHB.
Actualmente, el PHB se produce a escala industrial utilizando bacterias
Gram negativas. Sin embargo, los organismos Gram negativos
contienen lipopolisacridos (LPS) que co-purifican con los PHAs e
inducen una fuerte reaccin inmunognica (Valappil et al., 2007), lo
cual es indeseable para aplicaciones biomdicas. Las bacterias Gram
positivas carecen de LPS y son potencialmente mejores fuentes de PHA
cuando se usan con fines biomdicos (Chen y Wu, 2005).
Bacillus megaterium es una bacteria formadora de esporas grampo-
positiva, estrictamente aerobia, no motil, en forma de varilla, que tiene
la capacidad de producir PHB usando glucosa o glicerol como fuentes
de carbono (Lpez et al., 2012). En este trabajo se estudi la influencia
de diferentes condiciones de fermentacin para la produccin de PHB
utilizando B. megaterium. Adems, se realiz un anlisis
tecnoeconmico de la produccin de PHB a escala industrial y se
demostr una valorizacin del glicerol bruto.
2. Mtodos
2.1 Cepas bacterianas
La cepa Bacillus megaterium utilizada en este trabajo es una cepa
silvestre aislada de los sedimentos superficiales del estuario de Baha
Blanca (Buenos Aires, Argentina) y caracterizada como productora
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2.3 Adaptacin de microorganismos y condiciones de cultivo

Se usaron clulas de megaterium cultivadas en caldo nutriente a


30C para inocular placas de agar nutritivo suplementadas con 20 g
/ l de glicerol. Se inocularon colonias individuales de las placas de
agar nutricional cultivadas suplementadas con glicerol en matraces
erlenmeyer de 100 ml que contenan 10 ml de medio de caldo
nutriente estril suplementado con 20 g / l de glicerol y se
incubaron a 30C en un agitador orbital a 200 rpm durante 2-3 das.
Un mililitro de estos cultivos se transfiri de nuevo a 10 ml del
medio de siembra descrito anteriormente con glicerol. 2-3
subculturas sucesivas se realizaron para asegurar una buena
adaptacin de las clulas al medio de siembra con glicerol como
nica fuente de carbono.

2.4 Cultivos en lote

Las fermentaciones para producir PHB se llevaron a cabo durante


42 h en un fermentador de laboratorio de 3,7 l (Bioengineering,
Suiza) con un volumen de trabajo de 1,5 l, 8% v / v de un medio
formulado cultivado se us como preinoculum. Se analizaron varias
variables como: concentracin inicial de sustrato, temperatura de
fermentacin, pH y concentracin de oxgeno disuelto. Adems, se
estudiaron dos fuentes de carbono diferentes: glucosa y glicerol.
Las concentraciones iniciales de glicerol fueron: 10, 20 y 50 g / l.
La concentracin inicial de glucosa fue de 20 g / l. Las temperaturas
analizadas fueron: 30C y 33C. La concentracin de oxgeno
disuelto se control a tres niveles de saturacin: 30%, 60% y 80%.
La saturacin de oxgeno en el medio se control por agitacin
(entre 200 y 300 rpm) y con un flujo de aire constante de 12 l / min.
La influencia del pH se analiz por fermentacin sin control de pH,
ya tres valores de pH controlados distintos 5,0, 7,0 y 9,0 el pH se
control con soluciones de NaOH 1 N y H2SO4 1 M.

2.5 mtodos analticos

2.5.1 Biomasa

La biomasa se midi usando la tcnica de masa seca. Brevemente,


se recogieron muestras de 1 ml en tubos de microcentrfuga
previamente pesados y secados y se centrifugaron a 12.000 rpm
durante 10 min. A continuacin, el sobrenadante resultante se
desech y el sedimento se lav con agua destilada, se centrifug de
nuevo y se desech el exceso de agua. La biomasa final se pes
despus de secar durante 48 h a 60C.

2.5.2Extraccin de PHB

Despus de la fermentacin, las clulas se cosecharon por


centrifugacin a 18C y 6.000 rpm durante 20 minutos y despus se
extrajo el PHB intracelular utilizando el mtodo de extraccin con
dispersin de Cloroformo-hipoclorito. En resumen, se trat el medio de
dispersin que contena 50 ml de cloroformo y 50 ml de una solucin
de hipoclorito sdico diluido (30% en peso) en agua en un agitador
orbital a 100 rpm y 30C durante 1 h. La mezcla obtenida se centrifug
entonces a 4000 rpm durante 10 min, lo que dio como resultado tres
fases separadas. PHB se recuper de la fase inferior que contiene PHB
disuelto en cloroformo. Entonces se precipita PHB usando 10
volmenes de metanol enfriado con hielo (Hahn et al., 1995).
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2.5.3 Cuantificacin PHB

La biomasa seca se utiliza para metanlisis de monmeros de


acuerdo con el mtodo descrito por Braunegg et al. (1978) y
modificado por Lageveen et al. (1998). Se hicieron reaccionar
aproximadamente 10 mg de masa celular en un tubo de ensayo
pequeo con una solucin que contena 1 ml de cloroformo, 0,85 ml
de metanol, 0,15 ml de cido sulfrico y 0,2 ml de patrn interno
(cido benzoico en metanol) durante 140 minutos A 100C.
Despus de la reaccin, se aadieron 0,5 ml de agua destilada y el
tubo de ensayo se agit vigorosamente durante 1 min. Despus de la
separacin de fases, se retir la fase orgnica (capa inferior) y se
transfiri a un pequeo vial de vidrio de tapn roscado. Se tomaron
500 \ mu l de esta fase orgnica y se aadieron a un tubo de ensayo
y se inyectaron en el cromatgrafo de gases-espectrmetro de
masas. Se utiliz un cromatgrafo de gases Agilent Technologies
6850 series II. El cromatgrafo de gases se equip con una columna
capilar HP-5MS (25 m de longitud, 0,32 mm de dimetro interno).
Se utiliz helio (velocidad a 5 cm / min) como gas portador. El
inyector y el detector fueron operados a 230 y 275C,
respectivamente. Se utiliz un programa de temperatura para la
separacin eficiente de los steres (120C durante 5 minutos, rampa
de temperatura de 8C por minuto, 180C durante 12 minutos). Se
utiliz un espectrmetro de masas Agilent Technologies 5975B
para la identificacin y cuantificacin del PHB derivatizado.

2.5.4Cuantificacin del sustrato

La concentracin de glicerol y glucosa se determin fuera de


lnea por HPLC (Hitachi LaChrom Elite) equipado con un
muestreador automtico (Hitachi LaChrom Elite L-2200), una
columna de monitorizacin de fermentacin Bio-Rad Aminex
(150 mm 7,8 mm), un horno de columna LaChrom Elite L-2300),
una bomba de HPLC (Hitachi LaChrom Elite L2130) y un
detector de ndice de refraccin Hitachi LaChrom Elite L-2490.
El volumen de inyeccin fue de 20 ll y la elucin se consigui
usando una solucin 50 mM de H2SO4. La columna se mantuvo
a 65C y la bomba se hizo funcionar a un caudal de 0,3 ml / min.

2.5.5Metodologa de simulacin

El proceso de simulacin se bas en una metodologa


previamente descrita (Posada y Cardona, 2010, Cardona y
Snchez, 2006, Quintero et al., 2008, Gutirrez et al., 2009). El
enfoque utilizado para el diseo del proceso fue una estrategia
basada en el conocimiento que considera tanto las reglas
heursticas como la experiencia del investigador. Los procesos de
produccin de PHB se simularon utilizando Aspen Plus (Aspen
Technologies Inc., EE.UU.). El anlisis econmico se realiz
utilizando el paquete Aspen Economic Analyzer (Aspen
Technology, Inc., EE.UU.). Este software calcula los costos de
capital de las unidades de proceso, as como los costos
operativos, entre otros datos valiosos, utilizando la informacin
de diseo proporcionada por Aspen Plus y los datos introducidos
por el usuario para condiciones especficas como la ubicacin del
proyecto, entre otros. Este anlisis fue estimado en dlares
estadounidenses por un perodo de 10 aos a un tipo de inters
anual del 16%, considerando el mtodo de depreciacin lineal y
un impuesto sobre la renta del 33%.

3. Resultados y discusin
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flujo de aire 12
Aunque el glicerol puro se ha utilizado como nica fuente de
carbono para la produccin de PHB, hay evidencia de que algunas
especies de Bacillus tienen la capacidad de producir PHB a partir de
glicerol bruto. Sindhu et al. (2011) trabaj con Bacillus sphaericus
NII 0838 y la acumulacin de PHB fue de 31% del peso seco
celular. Deepthi et al. (2011) trabaj con Bacillus firmus NII 0830 y
la acumulacin de PHB fue 53% del peso seco celular. Sin
embargo, Cavalheiro et al. (2009) demostraron que los rendimientos
de PHB y las productividades usando Cupriavidus necator se
pueden mejorar utilizando glicerol puro (una mejora del 78%).
Posada et al. (2011) verificaron que el margen de beneficio
obtenido cuando el glicerol se purific antes de la etapa de
fermentacin es mayor en comparacin con el glicerol bruto y
suministr los costes generados por las etapas de purificacin.

3.1 Experimental

La productividad y el rendimiento de la produccin de PHB por B.


megaterium a partir de glicerol puro (98% en peso) se estudi a
diferentes niveles tales como: concentration of substrate,
fermentation temperature, pH and the dissolved oxygen
concentration.

Despus de la adaptacin de B. megaterium a glicerol como sustrato,


se analiz la influencia de la concentracin inicial de sustrato. Se
utilizaron tres concentraciones iniciales diferentes: 10, 20 y 50 g / l.
Las condiciones de fermentacin fueron: temperatura 30C, flujo de
aire 12 l / min, 200 rpm, y pH descontrolado. Higo. 1 muestra la
comparacin de la produccin de biomasa (a) y PHB (b) usando
glicerol como nica fuente de carbono.
Fig. 1. Comparison of biomass (a) and PHB (b) profiles from B. megaterium with different initial
Se estudi la influencia de la temperatura en la produccin de PHB. concentrations of glycerol, T = 30 C, air flow = 12 l/min, 200 rpm.
Fermentaciones con una concentracin inicial de glicerol de 20 g / l,

200 rpm y pH no controlado a tres temperaturas diferentes: 30, 33 y 35 C.


Los perfiles de biomasa y PHB obtenidos son Mostrado en la Fig. 2.

El pH del medio vara durante el crecimiento de la cepa de B. megaterium,


y afecta a la produccin de PHB segn lo discutido por Mona et al. (2001).
La influencia del pH en esta cepa de B. megaterium se analiz a tres
valores de pH diferentes (es decir, 5,0, 7,0 y 9,0) y se compararon con la
fermentacin realizada sin control de pH. Los resultados obtenidos
muestran que el PHB producido es mayor a pH 7,0 seguido por
condiciones no controladas> pH 5,0> pH 9,0. Por otra parte, la produccin
de PHB tambin se analiz usando diferentes niveles de saturacin de
oxgeno en los cultivos (es decir, 30%, 60% y 80%). La saturacin se
control por agitacin, con un flujo de aire constante de 12 l / min. Los
resultados mostraron que la mayor produccin de PHB se observ en el
80% de la saturacin de oxgeno.

Finalmente, se realiz una fermentacin usando glucosa como sustrato y se


compar con las fermentaciones usando glicerol como fuente de carbono.
Cuando se utiliz glucosa como fuente de carbono, las condiciones de
trabajo donde se utilizaron las mejores condiciones de fermentacin
cuando se utiliz glicerol como sustrato. La Tabla 1 muestra una
comparacin de los resultados experimentales obtenidos para la
produccin de PHB usando glucosa o glicerol como sustratos. Como se
muestra en la Tabla 1, las mejores condiciones de cultivo en trminos de
rendimiento y productividad de PHB fueron: temperatura 33C,
concentracin inicial de glicerol 20 g / l, pH controlado 7,0 y 80% de
saturacin de oxgeno. La produccin de PHB se mejora en
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aproximadamente un 10% (en comparacin con el enfoque no controlado) Thus, the purification step used for LPS depletion in the PHB produced by Gram-
negative bacteria is not necessary.

3.2 Simulacin

3.2.1 Descripcin del proceso

La simulacin del proceso es una herramienta til para tener una idea de los
costos totales de produccin en un proceso que incluye materias primas,
consumo de energa y los costos de instalacin para iniciar la produccin de un
producto deseado. El anlisis de procesos de bloques se eligi como el mejor
esquema tecnolgico para la produccin de PHB (purificacin, fermentacin,
separacin y purificacin de glicerol).

3.2.1.1. Purificacin de glicerol. Una composicin tpica para una corriente de


glicerol cruda obtenida del proceso de produccin de biodiesel es la siguiente (%
p / p): 32,59% de metanol, 60,05% de glicerol, 2,62% de NaOCH3, 1,94% de
grasas y 2,8% de cenizas. Aunque existen estudios que utilizan consorcios de
microorganismos para la produccin de PHB a partir de glicerol bruto (Dobroth
et al., 2012), en este trabajo el glicerol se purifica antes de la etapa de
fermentacin por mtodos fsicos hasta un 98% de peso segn la metodologa
descrita por Posada et al. (2009) (figura 3). Brevemente, el glicerol bruto se
evapora inicialmente y el 90% del metanol se recupera a 99% en peso. Esta
corriente de metanol resultante cumple las condiciones necesarias para ser
reutilizada en el proceso de transesterificacin para la produccin de biodisel.
La corriente de fondo resultante de la etapa de evaporacin se neutraliza usando
una solucin cida en la que tanto las sales producidas durante la neutralizacin
como las cenizas restantes se eliminan por centrifugacin. La corriente de fluido
se lava con agua usando una relacin en peso de 2,4 (corriente de agua / glicerol),
y de este modo se obtiene un glicerol acuoso libre de sales y slidos, con una
Fig. 2. Comparison of biomass (a) and PHB (b) profiles from B. megaterium with different baja concentracin de metanol y triglicridos. Ms de 90% de agua y el metanol
temperatures of fermentation, glycerol initial concentration 20 g/l, air flow = 5 l/min, 200 rpm. restante se eliminan por evaporacin. En este punto, la pureza del glicerol
obtenido es del 80% en peso, y la corriente de glicerol se purifica finalmente a
travs de una columna de destilacin hasta un 98% en peso.
Cuando el pH se controla a 7,0 pero la concentracin de oxgeno disuelto no
es constante. Sin embargo, se alcanza un aumento de aproximadamente el
3.2.1.2. Proceso de fermentacin. La Tabla 3 muestra la produccin de PHB, el
25% de la produccin de PHB cuando tanto el pH como la saturacin de
oxgeno se mantienen constantes (7,0 y 80%, respectivamente) en consumo de sustrato y la concentracin de biomasa del proceso de fermentacin
comparacin con el escenario no controlado. Por lo tanto, estos resultados usando glucosa o glicerol como sustratos. La etapa de fermentacin se realiza en
muestran la capacidad de B. megaterium para producir PHB a rendimientos un fermentador de una sola etapa. En este nivel, se produce el crecimiento celular
y productividades similares utilizando tanto un sustrato comn como y la acumulacin de PHB. La corriente de glicerol se diluye a 20 g / l en el
glucosa como un residuo industrial importante como el glicerol. fermentador de entrada y la concentracin de glicerol extrada del fermentador
La Tabla 2 muestra el porcentaje de acumulacin de PHB por algunos es de 8 g / ly el tiempo de residencia es de 42 h. Los resultados confirman la
microorganismos con diferentes residuos agroindustriales utilizados como capacidad de B. megaterium para utilizar el glicerol como el nico fuente de
sustratos. El% de acumulacin de PHB mostrado por B. megaterium se carbono. Los rendimientos obtenidos son muy similares en comparacin con la
puede comparar con otros microorganismos que utilizan glicerol como produccin de PHB a partir de glucosa.
sustrato. Una de las principales caractersticas de esta cepa bacteriana es que
produce PHB libre de LPS y se puede utilizar para aplicaciones mdicas.
3.2.1.3. Separacin y purificacin. Los procesos de separacin y purificacin de
PHB a partir de un caldo de fermentacin se pueden dividir en tres etapas:
Table 1
Comparison of the PHB production using glucose or glycerol as carbon sources. pretratamiento, extraccin y purificacin. Econmicamente prudente, Posada et
al. (2011) demostraron que el proceso ms apropiado en la parte inferior se basa
en el diagrama de flujo de BIOPOL. Este proceso comienza con una etapa de
pretratamiento de calor a 85C, Seguido de una digestin qumico-enzimtica
simultnea tanto con NaOCl (30% en peso) como con la enzima pancreatina
Burkholderia sp. PTU9 (2% en peso), a 50C y pH 9,0. A continuacin, la masa
celular disgregada se desecha mediante un proceso de centrifugacin. La
Total substrate consumption 59 71.5 57.5 corriente de PHB suspendida se lava luego con una corriente diluida de H2O2
(%) (1,2% v / v). Finalmente, el PHB se purifica hasta un 99,9% en peso por
Yield P/Sd (g/g) 0.3 0.3 0.4
evaporacin y secado por pulverizacin

a
Uncontrolled conditions: without control of both pH and oxygen saturation.
Para la separacin del PHB producido, se consideraron dos procesos
b Controlled conditions: pH = 7, oxygen saturation = 80%, temperature = 33 C. descendentes diferentes. Para los dos diferentes Procesos de Down Stream
c
CDW = cell dry weight. (DSP), denominados DSP A (Figura 4) y DSP B (Figura 5), ambas condiciones
d P/S = product/substrate consumed. de funcionamiento utilizadas y relacin de disolventes a la fase acuosa fueron las
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mismas que las descritas por Posada et al. (2011). Sin embargo, existen algunas
diferencias en las configuraciones de separacin
Table 2
Some PHB producing microorganisms from different agroindustrial wastes.
Substrate Microorganism PHB accumulation (%) References

Whey Methylobacterium sp. ZP24 64 Khanna and Srivastava (2005)


Pseudomonas hydrogenovora 28 Koller et al. (2008)

Glycerol Bacillus megaterium 62 This work


Cupriavidus necator DMS 545 62 Cavalheiro et al. (2009)

Ralstonia eutropha 55 Gzde et al. (2012)

Methylobacterium rhodesienum MB 126 50 Cavalheiro et al. (2009)

Escherichia coli CT1061 51 Nikel et al. (2008)

Sugarcane bagasse Burkholderia sacchari IPT 101 62 Silva et al. (2004)


Burkholderia cepacia IPT 048 41 Silva et al. (2004)

Fig. 3. Simplified flowsheet of the glycerol purification process up to 98% weight. E-1: evaporator I, R-1, neutralizing reactor I, cen-1: centrifuge I, D-1: decanter I, E-2: evaporator II, DC-1: Distillation
Column I.

En comparacin con Posada et al. (2011) el trabajo. Cuando se utilizan


bacterias Gram negativas como C. necator, la etapa de lavado con una
corriente diluida de H2O2 es necesaria ya que el PHB producido contiene
lipopolisacridos (LPS) y este tratamiento con H2O2 limina estos estos
compuestos txicos. Cuando se utilizan bacterias Gram positivas, se omite la
purificacin con H2O2.
Table 3
PHB concentration, substrate consumption and biomass production in the fermentation step.
.
Feature Glycerol Glucose
Fig. 4 muestra la configuracin DSP A. Este esquema de separacin tiene una
Initial substrate concentration (g/l) 20 20 recuperacin de disolvente en las unidades 13 y 14. Higo. 5 muestra la DSP B en la
Final substrate concentration (g/l) 8.2 10.7 que no hay recuperacin de disolvente. La Tabla 4 muestra algunos rendimientos en
Conversion 0.6 0.5 las etapas de separacin y purificacin usando glicerol o glucosa como sustratos con
Concentration of PHB output (g/l) 4.8 4.8 las configuraciones DSP A o DSP B. Aunque el esquema de proceso utilizado fue el
Concentration of biomass output (g/l) 7.7 7.1
Fermentation time (h) 42 42
J.M. Naranjo et al./ Bioresource Technology 133 (2013) 3844 45

mismo para ambos

Fig. 4. Flowsheet for PHB production from glycerol using the Down Stream Process A (DSP A). (1) Pump; (2) Sterilizer; (3) heat exchanger I; (4) fermenter; (5) heater; (6) digestor; (7) centrifuge; (8) heat
exchanger II; (9) heat exchanger III; (10) decanter I; (11) distillation column I; (12) spray drier; (13) distillation column II; (14) decanter II;
(15) mixer I; (16) mixer II.

Fig. 5. Flowsheet for PHB production from glycerol using the Down Stream Process B (DSP B) (1) pump; (2) sterilizer; (3) heat exchanger I; (4) fermenter; (5) homogenizer; (6) centrifuge I; (7) heat
exchanger II; (8) heat exchanger III; (9) extractor; (10). centrifuge II; (11) heat exchanger IV; (12) decanter; (13) distillation column; (14) spray drier;
(15) mixer. Comparison of the total PHB production costs from both glycerol and glucose with two different
downstream processes.

Table 4
Yields in the separation and purification stages using glycerol or glucose as substrates with the
DSP B DSP B
DSP A or DSP B configurations. Raw materials (US$/kg PHB) 0.2 0.2 0.7 0.7
Feature Glycerol Glucose Utilities (US$/kg PHB) 1.3 0.8 1.2 0.9
Operating labor (US$/kg PHB) 0.1 0.1 0.1 0.1
Yield DSP A (%) 98.0 97.99
Maintenance (US$/kg PHB) 0.4 0.3 0.4 0.4
DES losses in DSP A (%) 0.3 0.2 Operating charges (US$/kg PHB) 0.2 0.2 0.2 0.2
PHB purity (%) 99.9 99.9 Plant overhead (US$/kg PHB) 0.06 0.04 0.07 0.05
Yield DSP B (%) 98.9 98.9 G and A cost (US$/kg PHB) 0.3 0.2 0.3 0.3
DES* losses in DSP B (%) 0.3 0.3 Depreciation of capital (US$/kg PHB) 1.0 0.7 1.0 0.7
Total (US$/kg PHB) 3.5 2.6 3.9 3.3
Purity PHB (%) 99.9 99.9
*
DES: diethylsuccinate.
Table 5
Mismo para ambos substratos con las configuraciones DSP A mostr ms de destilacin en todos los casos requiere la definicin de las especificaciones
prdidas de dietilsuccinato (DES) cuando el glicerol fue la fuente de preliminares utilizando el mtodo de acceso directo DSTWU incluido en
carbono comparado con la glucosa. Sin embargo, el rendimiento del proceso Aspen Plus. Este mtodo utiliza el procedimiento de Winn-Underwood-
de separacin fue el mismo en ambos casos (98% aproximadamente). En Gilliland proporcionando una estimacin inicial del nmero mnimo de etapas
DSP B, los rendimientos y las prdidas de DES fueron los mismos con tericas, la relacin mnima de reflujo, la localizacin de la etapa de
ambos sustratos.Simulation procedure
alimentacin y la divisin de productos. Para realizar el clculo riguroso de
3.2.2. Procedimiento de simulacin
las columnas de destilacin, se utiliz el mdulo Rad-Frac (basado en las
ecuaciones MESH).
Los procesos de produccin de PHB se simularon utilizando Aspen Plus
(Aspen Technologies Inc., EE.UU.). Por lo tanto, el diseo de las columnas
46 J.M. Naranjo et al. / Bioresource Technology 133 (2013) 3844

B. megaterium se simul como un compuesto slido mientras que las References


enzimas se simularon como compuestos no convencionales. Para el anlisis
termodinmico se utiliz el modelo UNIFAC. La digestin enzimtica se Bormann, E.J., Roth, M., 1999. Production of polyhydroxybutyrate by Methylobacterium
rhodesianum and Ralstonia eutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates.
simul basndose en un enfoque estequiomtrico. El clculo del consumo de Biotechnol. Lett. 21, 10591063.
energa se bas en la energa trmica requerida por los intercambiadores de Braunegg, G., Sonnleitner, B., Lafferty, R.M., 1978. A rapid gas chromatographic method for the
calor, los rehervidores, las unidades de secado rpido y la fuente de determination of poly-b-hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Microbiol.
alimentacin requerida por las bombas. Biotechnol. 6, 2937.
El anlisis econmico se realiz utilizando el paquete Aspen Economic Cardona, C.A., Snchez, O.J., 2006. Energy consumption analysis of integrated flowsheets for
production of fuel ethanol from lignocellulosic biomass. Energy 31, 24472459.
Analyzer (Aspen Technology, Inc., EE.UU.). Este software calcula los
Cavalheiro, J., De Almeida, A., Grandfils, C., Da Fonseca, M.M.R., 2009. Poly(3 hydroxybutyrate)
costos de capital de las unidades de proceso, as como los costos operativos, production by Cupriavidus necator using waste glycerol. Process Biochem. 44, 509515.
entre otros datos valiosos, utilizando la informacin de diseo Chen, G.Q., Wu, Q., 2005. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering
proporcionada por Aspen Plus y los datos introducidos por el usuario para materials. Biomaterials 26, 65656578.
condiciones especficas como la ubicacin del proyecto, entre otros. Este Deepthi, S.K., Binod, P., Sindhu, R., Pandey, A., 2011. Media engineering for production of poly-
anlisis fue estimado en dlares estadounidenses por un perodo de 10 aos b-hydroxybutyrate by Bacillus firmus NII 0830. J. Sci. Ind. Res. 70, 968975.
Dobroth, Z.T., Hu, S., Coats, E.R., McDonald, A.G., 2012. Polyhydroxybutyrate synthesis on
a un tipo de inters anual del 16%, considerando el mtodo de depreciacin
biodiesel wastewater using mixed microbial consortia. Bioresour. Technol. 102, 33523359.
lineal y un impuesto sobre la renta del 33%. El costo del glicerol bruto fue Gzde, G., Prechtl, C., Kirschhfer, F., Mothes, G., Ondruschka, J., Brenner-Weiss, G., Obst, U.,
de USD $ 0.1 / l. El costo de mano de obra para operarios y supervisores fue Posten, C., 2012. Electrofiltration as a purification strategy for microbial poly-(3-
de USD $ 2.1 / h y USD $ 4.3 / h, respectivamente. Adems, los precios de hydroxybutyrate). Bioresour. Technol. 123, 272278.
electricidad, agua y vapor a baja presin fueron de USD $ 0.03 / kWh, USD Gutirrez, L.F., Snchez, O.J., Cardona, C.A., 2009. Process integration possibilities for biodiesel
$ 1.252 / m3 y USD $ 8.2 / ton, respectivamente. Todos estos valores se production from palm oil using ethanol obtained from lignocellulosic residues of oil palm
industry. Bioresour. Technol. 100, 2271237.
basan en las condiciones colombianasEconomic analysis
Hahn, S.K., Chang, Y.K., Lee, S.Y., 1995. Recovery and characterization of poly(3hydroxybutyric
1. Los costes totales de produccin de PHB a partir de dos sustratos acid) synthesized in Alcaligens eutrophus and recombinant Escherichia coli. Appl. Environ.
diferentes tales como glicerol y glucosa se muestran en la Tabla 5. Se Microbiol. 61, 3439.
compararon los dos procesos descendentes (DSP A y DSP B). Con la DSP A, Khanna, S., Srivastava, A.K., 2005. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process
los costos totales de produccin de PHB fueron de 3,9 US $ / kg y 3,5 US $ / Biochem. 40, 607619.
kg para glucosa y glicerol, respectivamente. A su vez, con la DSP B, los costos Kim, B.S., 2000. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates. Enzyme
Microb. Technol. 27, 774777.
totales de produccin del PHB fueron de 3,3 US $ / kg y de 2,6 US $ / kg para Koller, M., Bona, R., Braunegg, G., Hermann, C., Horvat, P., Kroutil, M., Martinz, J., Neto, J.,
la glucosa y el glicerol, respectivamente. En trminos generales, los menores Pereire, L., Varila, P., 2005. Production of polyhydroxyalkanoates from agricultural waste
costes de produccin de PHB se obtuvieron cuando no hay recuperacin de and surplus materials. Biomacromolecules 6, 561565.
disolvente en el esquema de separacin y se utiliza glicerol como sustrato. Koller, M., Bona, R., Chiellini, E., Grillo, E., Horvat, P., Kutschera, C., Hesse, P., Braunegg,
G., 2008. Polyhydroxyalkanoate production from whey by Pseudomonas hydrogenovora.
Bioresour. Technol. 99, 48544863.
2. Los precios actuales de venta de PHB se encuentran entre 3.1 y 4.4
Lageveen, R.G., Huisman, G.W., Preusting, H., Ketelaar, P., Eggink, G., Witholt, B., 1998.
USD / kg, utilizando como fuente de carbono glucosa y / o sacarosa. El costo Formation of polyesters by Pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and
total de produccin del PHB calculado en este trabajo usando glicerol como composition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3hydroxyalkenoates. Appl.
fuente de carbono es de 2,6 USD / kg con aproximadamente un 20% de margen Environ. Microbiol. 54, 29242932.
de beneficio (0,5 USD / kg). Por lo tanto, el impacto del glicerol en la cadena Lee, S.Y., 1996. Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in
bacteria. Tibtech 14, 431438.
de suministro de biodiesel se analiza de la siguiente manera: el precio de venta
Lpez, J.A., Naranjo, J.M., Higuita, J.C., Cubitto, M.A., Cardona, C.A., Villar, M.A., 2012.
del glicerol bruto obtenido en la produccin de biodiesel es de 0,1 USD / kg. La Biosynthesis of PHB from a new isolated Bacillus megaterium strain: outlook on future
conversin de glicerol en PHB utilizando las condiciones establecidas en este developments with endospore forming bacteria. Biotechnol. Bioprocess Eng. 17, 250258.
trabajo es de 0,6 kg de PHB / kg de glicerol. Teniendo en cuenta el margen de Mahishi, L.H., Tripathi, G., Rawal, S.K., 2003. Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) synthesis by
beneficio demostrado en la produccin de PHB a partir de glicerol bruto, se recombinant Escherichia coli harbouring Streptomyces aureofaciens PHB biosynthesis
obtiene una valorizacin de aproximadamente el 166,2% de este compuesto. genes: effect of various carbon and nitrogen sources. Microbiol. Res. 158, 1927.
Mona, K.G., Azza, E.S., Sanaa, H.O., 2001. Production of PHB by a Bacillus megaterium strain
Aunque B. megaterium demostr producir PHB usando glicerol como fuente de
using sugarcane molasses and corn steep liquor as sole carbon and nitrogen sources.
carbono, se deben estudiar otros microorganismos productores (como C. Microbiol. Res. 156, 201207.
necator) y analizar su produccin de PHB utilizando los esquemas de proceso Nath, A., Dixit, M., Bandiya, A., Chavda, S., Desai, A.J., 2008. Enhanced PHB production and
propuestos en este estudio. scale up studies using cheese whey in fed batch culture of Methylobacterium sp. ZP24.
Bioresour. Technol. 99, 57495755.
4. Conclusiones Nikel,P.I.,Pettinari, M.J.,Galvagno, M.A., Mndez,B.S., 2008.Poly(3-hydroxybutyrate)
synthesisfromglycerolbyarecombinantEscherichiacoliarcAmutantinfed-batch
microaerobic cultures. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77, 13371343.
La conversin microbiolgica de glicerol en PHB es una alternativa interesante Pantazaki, A.A., Papaneophytou, C.P., Pritsa, A.G., Liakopoulou-Kyriakides, M., Kyriakidis,
para obtener productos de valor agregado usando esto por producto de la D.A., 2009. Production of polyhydroxyalkanoates from whey by Thermus thermophilus
industria del biodiesel. La produccin de PHB utilizando B. megaterium podra HB8. Process Biochem. 44, 847853.
mejorarse cuando el pH y la saturacin de oxgeno se controlan en las Posada, J.A., Cardona, C.A., 2010. Design and analysis of fuel bioethanol production from raw
glycerol. Energy 35, 52865293.
condiciones de fermentacin. Utilizando programas de simulacin, se
Posada, J.A., Orrego, C.E., Cardona, C.A., 2009. Biodiesel production: biotechnological approach.
estimaron los costos de produccin totales de PHB a escala industrial con Int. Rev. Chem. Eng. 1, 571580.
ambos sustratos (glicerol y glucosa). PHB produccin utilizando glicerol Posada, J.A., Naranjo, J.M., Lpez, J.A., Higuita, J.C., Cardona, C.A., 2011. Design and
mostr un 10-20% menor costo de produccin en comparacin con la glucosa. analysis of PHB production processes from crude glycerol. Process Biochem. 46, 310317.
El glicerol bruto generado en la produccin de biodiesel puede ser valorado en Quintero, J.A., Montoya, M.I., Snchez, O.J., Giraldo, O.H., Cardona, C.A., 2008. Fuel ethanol
166,2% a travs de la produccin de PHB production from sugarcane and corn: comparative analysis for a Colombian case. Energy
33, 385399.
Silva, L.F., Taciro, M.K., Michelin, M.E., Carter, J.M., Pradella, J.G.C., Gomez, J.G.C., 2004.
.Acknowledgements Poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) production by bacteria from xylose, glucose and
sugarcane bagasse hydrolysate. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31, 245254.
To the National University of Colombia at Manizales for funding this Sindhu, R., Ammu, B., Binod, P., Deepthi, S.K., Ramachandran, K.B., Soccol, C.R., Pandey,
A., 2011. Production and characterization of poly-3-hydroxybutyrate from crude glycerol
research and to Dr. M.A. Villar and his group at PLAPIQUI (UNS-CONICET) by Bacillus sphaericus NII 0838 and improving its thermal properties by blending with
in Argentina for the B. megaterium strain. other polymers. Braz. Arch. Biol. Technol. 54, 783794.
Steinbchel, A., 2001. Perspectives for biotechnological production and utilization of
biopolymers: metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate biosynthesis pathways as a
successful example. Macromol. Biosci. 1, 124.
J.M. Naranjo et al./ Bioresource Technology 133 (2013) 3844 47

Valappil,S.P., Misra, S.K., Boccaccini,A.R., Keshavarz, T., Bucke, C., Roya,I., 2007.
Largescale production and efficient recovery of PHB with desirable material properties,
from the newly characterized Bacillus cereus SPV. J. Biotechnol. 132, 251258.
Wu, K.J., Lin, Y.H., Lo, Y.C., Chen, Y.C., Chen, W.M., Chang, J.S., 2011. Converting glycerol
into hydrogen, ethanol and diols with a Klebsiella sp. HE1 strain via anaerobic
fermentation. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. 42, 2025.
Yazdani, S.S., Gonzalez, R., 2007. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability
for the biofuels industry. Curr. Opin. Biotech. 18, 213219.
Yu, J., Stahl, H., 2008. Microbial utilization and biopolyester synthesis of bagasse hydrolysates.
Bioresour. Technol. 99, 80428048.