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INTRODUCCION

En microbiologa el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante


informacin para la identificacin temprana y definitiva de los microorganismos.

En la valoracin de las muestras, es trascendente el poder de resolucin del microscopio, el cual


se define como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mnima entre dos
puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de
resolucin de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de
la imagen, y depende de la longitud de onda () del haz de luz utilizado y de la apertura numrica
del objetivo empleado. El mximo poder de resolucin en un microscopio de luz emitida es de
0.2 m, por lo que se requiere de una amplificacin entre 1000-1400x, mientras que el poder de
resolucin del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los
microscopios, se han desarrollado tcnicas tintoriales que destacan las caractersticas
morfolgicas de los microorganismos.

Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la
microbiologa.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tie del mismo color
y se utiliza un slo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tincin diferencial, cuando se
visualiza ms de un color porque se utiliza ms de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tincin
especfica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molcula fluorescente para
identificar una estructura celular en particular (inmunocitoqumico). El control de calidad de los
mtodos tintoriales es importante, ya que as se asegura que la preparacin de la muestra haya
sido adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluacin de la muestra
clnica, la tincin de un agente infeccioso ya identifi cado mediante esa tincin, el cual funcionar
como un control positivo. Algunas tcnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren
antes de su proceso la fijacin de las muestras, con la finalidad de preservar la arquitectura
estructural y qumica de las clulas. Existen dos tipos de fijadores: fsicos y qumicos. Entre los
procesos de fijacin fsicos se tienen los siguientes: desecacin, calor seco, calor hmedo,
ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de fijacin qumicos se pueden clasificar
como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades qumicas. Entre los agentes
qumicos oxidantes se encuentran: xido crmico, cido actico, cido pcrico, acetona,
dicromato de potasio. Los agentes qumicos reductores son: formaldehdo, glutaraldehdo,
etanol, metanol, paraldehdo, etctera. Quiz el mtodo fsico con mayor utilizacin en
microbiologa es el calor seco, que consiste en exponer directamente la laminilla a la fl ama del
mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las clulas y los microorganismos. Sin
embargo, la sobreexposicin, o la exposicin en una zona incorrecta de la flama (zona fra, zona
caliente y zona de fusin) repercutir en el efecto deseado; es muy comn provocar alteraciones
morfolgicas y destruccin celular. Este mtodo preserva el extendido por poco tiempo, por lo
que se recomienda utilizar un mtodo qumico, que precipite protenas, antes de teir. Los
mtodos qumicos ofrecen mejores resultados para la fijacin, ya que son lquidos con potencial
alto de difusin intracelular y detienen procesos enzimticos que provocan autolisis. Los
reactivos poseen la capacidad de interactuar con biomolculas como protenas, glicoprotenas,
peptidoglicanos, lpidos, glicolpidos, lipoprotenas, pigmentos, cidos pcticos y nucleicos. El
metanol es el reactivo que se encuentra al alcance de todos los laboratorios; es un reactivo
reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante, de tal manera, coagula
protenas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Se preserva la arquitectura de la pared
celular y evita la sobrecoloracin. El metanol tiene un potencial reductor mayor que el etanol.
La concentracin ideal es > 12 Investigacin en Discapacidad Las tinciones bsicas en el
laboratorio de microbiologa www.medigraphic.org.mx 99%. El metanol preserva la integridad
de los cidos nucleicos, por lo que tambin es ideal para inmunohistoqumica e hibridacin in
situ .A continuacin se mencionarn las principales tcnicas de tincin utilizadas en
microbiologa, as como su fundamento e interpretacin para realizar la correcta identificacin
de los microorganismos.

TIPOS:

a) Simples: Se utiliza un solo colorante (bsicos).


- Azul de metileno
- Safranina
- Cristal violeta: Bacillus megaterium
b) Compuestas especiales: Se utilizan dos ms colorantes. Pueden usar mordentes y
decolorantes

- Giemsa

- Wrigth : Frotis sanguneo con Yersinia pestis, Trypanosoma sp en sangre

- May Grnwald (Eosina -Azul de metileno): Mdula sea

c) Positivas: se observa teida la clula sobre un fondo claro.

- Frotis sanguneo
d) Negativas: El fondo se tie de oscuro para observar la clula o estructuras refringentes.

- Cryptococcus neoformans

E) Tincin negativa de Cpsula: Streptococcus pneumoniae

f) Selectivas: Son utilizadas para dar color y aislar partes especficas de los microorganismos

- Endosporas: Bacillus subtilis

- Flagelo: Proteus sp

- Ncleo

g) Diferenciales: Reaccionan de manera diferente entre las distintas clases de bacterias.


Ziehl-Neelsen

- Gram

Tincin de Gram

Esta tincin es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se


manejan pruebas microbiolgicas. Es definida como una tincin diferencial, ya que utiliza dos
colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias
Gram positivas. Fue desarrollada por el cientfico dans Hans Christian Gram en 1884; hoy en
da, sigue siendo una de las tinciones ms utilizadas universalmente debido a lo econmico,
sencillo y eficaz que resulta. En microbiologa clnica resulta de gran utilidad, ya que a partir de
muestras clnicas directas provenientes de sitios estriles se puede saber de manera rpida las
caractersticas de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos
causantes de una infeccin. Los principios de la tincin de Gram estn basados en las
caractersticas de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes
a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas est constituida por
una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias
Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no
cuentan con membrana celular externa; as pues, la composicin qumica y el contenido de
peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y
determina las caractersticas tintoriales. La tincin de Gram se basa en colocar como colorante
primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta
por la formacin de un complejo cristal violetayodo que satura los espacios del peptidoglicano
de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata
la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, tambin destruye la membrana externa de
las bacterias Gram negativas debido a que sta es soluble a la accin de solventes orgnicos,
como la mezcla de alcoholacetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad
de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas
no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por ltimo, se coloca
safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratincin y sirve para teir
las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. Hay bacterias de un
mismo gnero que pueden observarse en la misma muestra como Gram positivas y como Gram
negativas, a este evento se le llama tincin Gram variable secundaria a alteracin en nutrientes,
temperatura, pH o concentracin de electrolitos. No todas las bacterias se pueden teir por esta
tcnica, ya que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composicin
qumica diferente (micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de cidos miclicos). Las
muestras tiles para su uso son lquidos estriles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados,
crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan
de color azul obscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a
rojo

Tincin de Wright

La tincin de Wright es una tcnica que se emplea generalmente para la diferenciacin de


elementos celulares de la sangre y es clasificada como una tincin policromtica, dado que
puede teir compuestos cidos o bsicos presentes en una clula. Fue desarrollada por el
patlogo James Homer Wright en 1902 a partir de la modificacin de la ya existente tincin de
Romanowsky, utilizada para diferenciar elementos formes de la sangre. Esta tincin tiene
diversos usos en microbiologa; en la parasitologa, se le emplea en la bsqueda de
hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright est compuesto por eosina y azul
de metileno, cuando ste se oxida se conoce como azur B a una concentracin de 0.8 g/L
empleando como solvente alcohol metlico. La eosina es un colorante cido que tiene afinidad
por componentes alcalinos. Existen dos compuestos conocidos como eosina y que estn
intrnsecamente relacionados: eosina Y, conocida tambin como tetrabromofluorescena o,
comnmente, eosina amarilla, y la eosina B, conocida como dibromodinitrofluorescena o
eritrosina B azulada. Ambos compuestos son intercambiables, sin que sean notables las
diferencias entre ellos en el resultado de la tincin, por lo que la preferencia de una sobre otra
no sigue un criterio objetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la ms utilizada en procedimientos
rutinarios. Es un compuesto cido cuya propiedad est basada en su polaridad negativa, lo que
le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva; por esta razn, colorea
componentes citoplasmticos y se les conoce como acidfilos. La tonalidad resultante de la
tincin con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los
eritrocitos. El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente morado, se basa en la
interaccin molecular entre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. La intensidad de la
coloracin depende del contenido de azur B y de la relacin con la eosina amarilla. El resultado
de la tincin puede ser influido por diferentes factores, como el valor del pH de los colorantes y
de la solucin amortiguadora, esto debido a que la tincin se funda menta en la relacin de las
caractersticas cido-base, y la variacin de estos factores podra cambiar las caractersticas
tintoriales de la muestra a teir al verse favorecida por caractersticas ms cidas o bsicas.21
Las muestras tiles para su uso son el frotis de sangre perifrica y frotis de mdula sea. Los
diferentes colores que se observan en la clula provocan el llamado efecto Romanowsky, que
tie de prpura a los ncleos y grnulos neutroflicos y de color rosa al citoplasma. Los cidos
nucleicos se tien de azul, permitiendo as distinguir a los parsitos en el interior de los
eritrocitos. Esta tincin es utilizada en la bsqueda de Plasmodium spp. En micologa esta tincin
es de gran ayuda en la bsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimrfico) en extendidos
de mdula sea.

La tincin de Ziehl-Neelsen

Es la tcnica comnmente usada en el diagnstico rutinario de tuberculosis. Es una tcnica


rpida, fcil y de bajo costo, lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio
clnico. Esta tincin permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces
de resistir la decoloracin con alcohol-cido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta
tincin para identificar bacilos cido-alcohol resistentes es del 74% y la especificidad del 98%,
teniendo un lmite de deteccin de 5,000-10,000 bacilos/mL de muestra. El agente etiolgico de
la tuberculosis fue descrito por Heinrich Hermann Robert Koch, quien, basndose en las
caractersticas de las micobacterias, desarroll una de las primeras tinciones utilizando azul de
metileno seguido de la tincin de Bismarck. Sin embargo, fueron los trabajos de Paul Ehrlich los
que definieron la resistencia a la decoloracin por alcohol-cido, y las ltimas modificaciones a
la tincin fueron realizadas por los cientficos alemanes Franz Ziehl y Karl Adolf Neelsen.26 El
gnero Mycobacterium es el nico miembro en la familia Mycobacteriaceae y est relacionado
con otros gneros que contienen cidos miclicos (Gordonia, Tsukamurella y Rhodococcus), los
cuales tambin pueden ser teidos con esta tincin. La pared celular de las micobacterias es
extremadamente compleja en cuanto a su composicin bioqumica; dicha caracterstica es la
que se ha aprovechado para realizar la tincin de Ziehl-Neelsen. La pared celular est compuesta
por cido mesodiaminopimlico, alanina, cido glutmico, glucosamida, cido murmico,
arabinosa y galactosa. Los cidos miclicos (70-90 n- mero de tomos de carbono) junto con
lpidos libres (ej. trealosa-6,6-dimicolato) proveen a la clula de una barrera hidrofbica. Otros
cidos grasos importantes son: ceras, fosfolpidos, cidos micosricos y phtienoico.18 La tincin
se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparacin ligeramente para solubilizar las ceras,
lpidos y otros cidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del colorante, el
cual tiene una enorme afinidad por los cidos miclicos presentes en la pared. Al enfriar con
agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la accin abrasiva del
alcohol-cido, y el azul de metileno se utiliza como contratincin. Las muestras clnicas tiles
para su uso son mltiples, como el lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido sinovial,
lquido pericrdico, biopsias para cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento de colonias aisladas
en medios de cultivo, expectoraciones, aspirados endotraqueales y lavados bronquioalveolares.
Una tincin positiva es aqulla en la que se observan bacilos cido-alcohol resistentes, los cuales
son de color rojo fucsia.

Tincin negativa

La tincin negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de rodear
y delinear las bacterias no teidas u otros materiales biolgicos. Utilizamos diferentes mtodos
de tincin negativa para evaluar estructuras individuales, tan pequeas como las vesculas
sinpticas e incluso de gran tamao, como los microorganismos unicelulares. Este mtodo es
muy til, aunque est limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitir la correcta
identificacin de forma ntida y detallada de los componentes de dichas estructuras. En
microbiologa, la tincin negativa proporciona un resultado presuntivo de la presencia de
Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresin, siendo la tcnica ms utilizada para poner de manifi esto su cpsula. Este
hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la
primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemacin y puede ser
visualizada por medio de la tinta china. El principio es simple, ya que slo se requiere depositar
una gota de la muestra clnica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el colorante y
se observa al microscopio sin necesidad de fijacin, algunas estructuras difundirn el colorante
y otras no, lo que permitir un contraste de las estructuras observadas. Se han utilizado
diferentes colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tie el fondo de la
muestra de un color oscuro y la cpsula del C. neoformans permanece sin teir. La principal
dificultad con la tincin negativa es que los microorganismos tienden a contraerse durante el
periodo de secado; para evitarlo, se ha optado por usar la tincin negativa hmeda, en la cual
los organismos se suspenden en una pelcula de tinta china o mancha oscura y el contorno de la
cpsula puede ser observado sin el peligro de contraccin. Adems de ser una tcnica sencilla,
es muy barata, ya que no requiere equipos o material costoso para su realizacin. Pueden
producirse falsos positivos en presencia de levaduras de los gneros Rhodotorula, Candida y
otras especies de Cryptococcus, igual que por artificios como los leucocitos. Es importante
diferenciar bien la levadura con doble pared refringente, con su cpsula, y siempre hay que
confirmar el diagnstico inicial con cultivo. En los pacientes con diagnstico previo de
criptococosis que se encuentren bajo tratamiento, es probable que la cpsula no se observe, ya
que el tratamiento antifngico est dirigido hacia sta; sin embargo, pueden observarse
estructuras levaduriformes. Adems de proporcionar informacin temprana sobre un
microorganismo patgeno y propiciar as el inicio del tratamiento adecuado, se considera un
examen til para la monitorizacin del tratamiento y pronstico de los pacientes. Se recomienda
utilizar como control negativo una gota de tinta china y colocarle un cubreobjetos; esto
permitir discernir entre burbujas formadas al agregar el cubreobjetos o el acmulo de
partculas que podran crear una zona de aclaramiento que pudiera confundir al realizar la
revisin de las laminillas. Durante el procedimiento de la tincin se deben tener precauciones,
por lo que se debe realizar en una campana de bioseguridad 2A. La muestra ms til para su
aplicacin es el lquido cefaloraqudeo, por la predisposicin que tiene este hongo en los
pacientes inmunosuprimidos para infectar el sistema nervioso central. La cpsula aparece como
un halo claro y ntido en torno a una levadura redonda, delimitada por las partculas de carbn
en suspensin coloidal de la tinta china, exhibiendo un ntido contraste Tincin de azul algodn
de lactofenol El examen microscpico es de gran importancia en micologa para la observacin
de las diferentes especies de hongos de inters clnico. Se deben utilizar tinciones que logren
preservar la integridad de las estructuras fngicas. Para la correcta identificacin de hongos de
inters clnico, ya sea con fines de diagnstico o estudios taxonmicos, es necesario observar las
estructuras fngicas con una alta calidad y contraste; para ello se utilizan diversos compuestos
qumicos que permitan la tincin entre la pared y el citoplasma de las clulas fngicas. La tincin
de azul algodn de lactofenol no es considerada una tincin diferencial, sin embargo, posee
caractersticas tintoriales que permiten observar cada uno de los componentes fngicos y
apreciar fcilmente las estructuras para una adecuada identificacin. El fenol inactiva las
enzimas lticas de la clula e impide que sta se rompa; de igual forma, destruye la flora
acompaante e inactiva a la clula, quitndole el grado de patogenicidad; adems, acta como
mordiente cuando se usa en combinacin con colorantes. El cido lctico preserva las
estructuras fngicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior
fngico, lo que genera una pelcula protectora. El azul de algodn es un colorante cido, que
tie el citoplasma y la quitina presente en las clulas fngicas, mientras que el glicerol mantiene
hmeda la preparacin. Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiolgica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una
impresin de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).
COLORANTES

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a clulas, tejidos, fibras, etctera.
De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extrados
de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Qumicamente, el colorante est constituido de un componente
cromforo y un auxcromo. El cromforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que
tiene una absorcin caracterstica en la regin ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la
capacidad que tiene la molcula para que sus electrones absorban energa o luz visible, se
exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del
cambio en el nivel energtico. Cabe mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango
de espectro visible. Los cromforos se pueden presentar en dos formas fundamentales: en
sistemas conjugados pi o complejos metlicos. Los cromforos son principalmente grupos
funcionales con dobles y triples enlaces carbono-carbono, anillos aromticos, grupos carbonilos,
imino, diazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es un tomo con pares libres).Los aux- cromos
son grupos funcionales o radicales que constituyen una molcula y poseen carga parcial positiva;
tienen la funcin de intensificar la formacin de color mediante la accin de grupos de tomos
no saturados; su funcin es desplazar a los cromforos hacia longitudes de ondas largas para
aumentar la intensidad. Los siguientes grupos funcionales son considerados auxcromos: grupo
metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi y amino. Aunque los microorganismos vivos se pueden
observar directamente en fresco al microscopio ptico, la mayora de las veces es necesario
teirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho ms fcil su identificacin;
adems, la presencia de ciertas estructuras, as como su reaccin a determinadas tcnicas, nos
permite clasificar a las bacterias.

As pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes.

2. Revelan su forma y tamao.

3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

4. Producen reacciones qumicas especficas

Adems son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color;
estn formados por un grupo cromforo que es la parte responsable del color, y un grupo
auxcromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse.
Tipos de colorantes azo Las dos principales formas de clasificar los colorantes azo son por, su
estructura qumica y por su mtodo de aplicacin en el teido.

La constitucin, propiedades, preparacin, fabricacin se encuentran en el Color Index (Cruz,


2003).

Colorantes cidos

Este trmino se le da a los colorantes capaces de tener interacciones de carga con el sustrato
como la fibra de lana o seda. Los colorantes cidos son compuestos orgnicos aninicos que
requieren para fijarse a la fibra que sta est disponible con sitios catinicos. La ionizacin del
colorante se logra al aplicar junto con l un cido orgnico, puede ser cido actico o sulfrico,
a un pH entre 2-6 unidades. El colorante que sobresale por su produccin es el colorante diazo
Rojo cido.

Colorantes bsicos

Son colorantes cationicos que llevan una carga positiva en la porcin cromfora de la molcula,
aunque tambin la caga puede estar deslocalizada o distribuida a travs de la porcin catinica
del colorante. El catin es formado por protonacin bajo condiciones cidas. En condiciones
alcalinas o neutras estos colorantes se comportan como colorantes dispersos (Cruz, 2003) Estos
colorantes se utilizan a menudo para teir fibras de polister y nylon modificado debido a que
producen alta intensidad de color y mayor brillantez en la fibra que otros colorantes. Se aplican
en solucin acuosa con suficiente cido actico para mantener el pH entre 4 y 6 unidades, tienen
gran capacidad de teido ya que slo 1 mg/l de colorante produce una fuerte coloracin al agua,
adems de que tiene la capacidad de ser adsorbido en muchos minerales y en la materia
orgnica del agua (Kirk-Othmer, 1993).Colorantes azo reactivos Son colorantes aninicos con
varios grupos sulfnicos, que los hacen ser muy solubles en agua.

Consisten bsicamente de tres componentes: un colorante o grupo cromforo, un grupo de


unin y un grupo reactivo. Durante el teido, el colorante se hidroliza lo que causa baja fijacin
de la fibra, adems de incrementar su solubilidad. Estos colorantes se caracterizan por tener en
su estructura uno o ms grupos reactivos complejos que pueden ser sensitivos a la hidrlisis.
Ejemplos de grupos reactivos son mono o diclorotriazina y tricloropirimidina entre otros.
Preparados

Los preparados se dividen en:

Preparados en fresco: (microorganismo vivos)

Permiten observar los organismos suspendidos en un liquido en condiciones de vida normal, sin
sufrir alteraciones ocasionadas por algunos colorantes, permite apreciar la movilidad, los
cambios citolgicos durante el proceso de divisin celular y en la formacin de esporas.

1. Tcnica del montaje hmedo:


Las preparaciones hmedas se efectan colocando una gota del liquido que contiene los
microorganismos en estudio sobre una lmina portaobjeto y cubrindolo con una
laminilla, evitando la formacin de burbujas.
2. Tecnica de la gota pendiente:
Persigue el mismo propsito que el montaje hmedo, con la ventaja que hay menor
distorsion por el peso de la lmina cubreobjeto. Se utiliza lmina portaobjeto con
excavacin central.
La tcnica consiste en colocar en el centro de lamina cubreobjeto una gota de
suspensin en estudio. El borde de excavacin de la lamina portaobjeto se cubre con
una delgada capa de vaselina y luego se invierte sobre la laminilla presionando
suavemente, guiando la gota de suspensin hacia el centro de la concavidad, luego se
procede a colocar en posicin normal la lamina portaobjeto para el examen
microscpico.

Preparado en seco: (microorganismo muertos)

Es cuando entre la lente frontal del objetivo y el preparado existe una sustancia llamada aceite
de cedro con un ndice de refraccin como el vidrio.

En general las bacterias y otros microorganismo son transparentes, lo que dificulta su estuido
cuando los exmenes se realizan en fresco. Por tal razn cuando se quiere conocer los detalles
morfolgicos, es necesario recurrir a tincin, es decir debido a que el ndice de refraccin de las
bacterias y otros microorganismos es muy semejante al del medio de montaje, las bacterias
pueden a menudo no ser visibles al microscopio ptico compuesto. Por ende, es necesario
utilizazr extensiones o frotices de muestras fijadas y teidas.
Como preparar una lmina y laminilla:

Este tipo de preparacin permite observar vivos a los microorganismos y resulta muy til cuando
se quiere determinar su motilidad. Estas preparaciones son muy fciles de realizar, pues slo se
coloca sobre la lmina portaobjeto la suspensin de microorganismos a observar y luego sta se
cubre con una laminilla. Entre los principales inconvenientes que tiene esta preparacin, es que
al no estar los microorganismos teidos, se dificulta su observacin al microscopio y se puede
confundir el movimiento microbiano con las corrientes internas que se producen a causa de la
evaporacin del medio a travs del borde de la laminilla.

PROCEDIMIENTO
PREPARACIN DE LAS LMINAS
Para realizar una coloracin, ya sea simple o diferencial, es necesario como primer paso,
preparar el extendido de la muestra sobre la lmina portaobjeto y fijarlo, para posteriormente
aadir el o los colorantes y observar la muestra teida bajo el microscopio de luz.

Preparacin del extendido


1. Colocar en cada una de las lminas limpias, secas y desgrasadas, una gota de solucin
salina utilizando el asa de platino previamente esterilizada.
2. Tomar aspticamente con el filamento una pequea muestra del cultivo slido
suministrado por el profesor y mezclar con la gota de solucin salina para obtener una
suspensin. Tambin puede utilizarse un cultivo lquido, en dicho caso, la muestra se toma con
el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solucin salina.