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a

INSTITUTO TECNOLGICO DE CELAYA

Estudio paramtrico para la


produccin de melanina en
Escherichia coli recombinante

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:


INGENIERO BIOQUIMICO

P R E S E N T A
Victor Hugo Lagunas Muoz

Celaya, Guanajuato Enero 2004


b

El presente trabajo se realiz bajo la direccin del


Dr. Alfredo Martnez Jimnez en el Departamento
de Ingeniera Celular y Biocatlisis del Instituto de
Biotecnologa de la Universidad Nacional
Autnoma de Mxico.

Para la realizacin del mismo se cont con el


financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnologa (CONACyT) a travs del proyecto NC-
230 y de la beca de tesis de licenciatura No. 4842.
i

NDICE

NDICE ............................................................................................................................. i
NDICE DE FIGURAS .....................................................................................................iii
NDICE DE TABLAS ....................................................................................................... v
NOMENCLATURA ......................................................................................................... vi
1. RESUMEN .................................................................................................................. 1
2. INTRODUCCIN Y JUSTIFICACIN ......................................................................... 3
3 ANTECEDENTES ........................................................................................................ 5
3.1 Melanina ............................................................................................................ 5
3.2 Tipos de melaninas............................................................................................ 5
3.3 Enzima tirosinasa .............................................................................................. 6
3.4 Biosntesis de melanina ..................................................................................... 7
3.5 Propiedades de la melanina .............................................................................. 9
3.6 Funciones biolgicas de la melanina ............................................................... 10
3.7 Usos de la melanina ........................................................................................ 10
3.8 Procesos de sntesis de melanina ................................................................... 11
3.9 Justificacin del proyecto y preguntas relevantes en relacin al mismo .......... 12
4. OBJETIVOS DEL PROYECTO ................................................................................. 13
4.1 General ............................................................................................................ 13
4.2 Particulares...................................................................................................... 13
5. MATERIAL Y MTODOS .......................................................................................... 14
5.1 Cepas bacterianas ........................................................................................... 14
5.2 Preparacin de bancos celulares y medios de cultivo ..................................... 14
5.3 Evaluacin de cultivos ..................................................................................... 15
Monmero de Feomelanina ................................................................................... 16
5.4 Condiciones de los cultivos y parmetros estudiados ..................................... 16
5.5 Determinacin de crecimiento bacteriano........................................................ 17
5.6 Recuperacin y cuantificacin de melanina..................................................... 18
5.7 Espectro de absorcin de melanina................................................................. 18
5.8 Determinacin de glucosa ............................................................................... 19
5.9 Determinacin de L-tirosina ............................................................................. 19
ii

5.10 Ensayos de actividad enzimtica especfica.................................................. 20


6. RESULTADOS Y DISCUSIN.................................................................................. 21
6.1 Preparacin de un banco de clulas................................................................ 21
6.2 Proceso de recuperacin y cuantificacin de melanina. .................................. 22
6.3 Efecto del marcador de seleccin (ampicilina) y del cofactor (Cu). ................. 26
6.4 Efecto de la temperatura.................................................................................. 28
6.5 Efecto del pH ................................................................................................... 33
6.6 Efecto del IPTG ............................................................................................... 36
6.7 Efecto de la concentracin de cobre................................................................ 39
6.8 Cultivo lote con adiciones de tirosina............................................................... 41
6.9 Cultivo lote con alta concentracin de tirosina................................................. 43
6.10 Produccin de melanina en medio Luria........................................................ 44
10.11 Produccin de feomelanina ......................................................................... 46
7. RESUMEN DE RESULTADOS ................................................................................. 50
8. CONCLUSIONES...................................................................................................... 51
9. PERSPECTIVAS....................................................................................................... 53
10. REFERENCIAS....................................................................................................... 55
11. ANEXO: Estimacion de los paramtros cinticos y estequeomtricos. ................... 60
11.1 Velocidad especfica de crecimiento .............................................................. 60
11.2 Rendimiento biomasa sustrato (YX/S) ............................................................. 61
11.3 Velocidad especfica de consumo de glucosa (qS)......................................... 61
11.4 Modelos para la formacin de productos ....................................................... 62
iii

NDICE DE FIGURAS

Figura 3.1 Dominios de estructura de tirosinasa de diferentes grupos....................... 7


Figura 3.2 Modelo propuesto del sitio activo y de unin a cobre de tirosinasa de
mamfero. ............................................................................................................. 8
Figura 3.3 Biosntesis de eumelanina y feomelanina. ................................................ 9
Figura 5.1 Estructura y pesos moleculares de tirosina y de monmeros de eu y
feomelanina........................................................................................................ 16
Figura 5.2 Curva de calibracin de absorbencia a 230 nm en funcin de la
concentracin de tirosina para cuantificarla por HPLC. ..................................... 19
Figura 6.1. Proceso implementado para la recuperacin de melanina..................... 23
Figura 6.2. Espectro de absorcin de eumelanina Sigma (grado analtico) y
eumelanina obtenida en el presente trabajo a partir de tirosina en medio mineral-
glucosa............................................................................................................... 24
Figura 6.3 Curva de calibracin de absorbencia a 400 nm en funcin de la
concentracin de eumelanina. ........................................................................... 25
Figura 6.4 Efecto de niveles de ampicilina y Cu sobre las cinticas de crecimiento y
de formacin de melanina. ................................................................................. 27
Figura 6.5 Efecto de la temperatura sobre las cinticas de crecimiento, consumo de
glucosa y produccin de eumelanina. ............................................................... 30
Figura 6.6 Relacin entre la temperatura y la velocidad especfica de crecimiento. 31
Figura 6.7 Relacin entre la velocidad especfica de crecimiento y la velocidad
especfica de consumo de glucosa. ................................................................... 31
Figura 6.8 Aplicacin del modelo tipo Arrhenius para representar la dependencia de
la velocidad especfica de crecimiento con el recproco de la temperatura para E.
coli W3110/pTrcMutmelA. .................................................................................. 32
Figura 6.9 Velocidad especfica de formacin de eumelanina como funcin de la
temperatura........................................................................................................ 33
Figura 6.10 Rendimiento de conversin de tirosina en eumelanina en funcin de la
temperatura........................................................................................................ 33
iv

Figura 6.11 Efecto del pH sobre las cinticas de crecimiento y de produccin de


melanina............................................................................................................. 34
Figura 6.12 Efecto del pH en la velocidad especfica de formacin de eumelanina. 35
Figura 6.13 Efecto del pH sobre el rendimiento reconversin de tirosina en
eumelanina......................................................................................................... 36
Figura 6.14 Cinticas de crecimiento, consumo de glucosa y produccin de melanina
de cultivos lote a diferentes concentraciones de IPTG. ..................................... 38
Figura 6.15 Cinticas de crecimiento, consumo de glucosa y produccin de melanina
a diferentes concentraciones de CuSO4. ........................................................... 40
Figura 6.16 Cintica de crecimiento, consumo de tirosina y produccin de melanina
en medio M9 suplementado con tirosina, con alimentaciones graduales de
tirosina en la fase estacionaria........................................................................... 42
Figura 6.17 Cintica de crecimiento, consumo de glucosa y produccin de melanina
a altas concentraciones de tirosina .................................................................... 44
Figura 6.18 Cintica de crecimiento y de produccin de melanina con medio Luria. 46
Figura 6.19. Cintica de crecimiento y produccin de feomelanina.......................... 48
Figura 6.20 Curva de calibracin de feomelanina producida a 400nm..................... 49
Figura 11.1 Cinticas de crecimiento, de consumo de glucosa y diferentes modelos
para la formacin de producto: a) Modelo asociado a crecimiento P (A); b)
Modelo parcialmente asociado a crecimiento P (PA); c) Modelo no asociado a
crecimiento P (NA). ............................................................................................ 61
v

NDICE DE TABLAS

Tabla 5.1 Cepas de Escherichia coli utilizadas en el presente estudio..................... 14


Tabla 6.1 Efecto de los niveles de ampicilina y Cu sobre parmetros cinticos de
crecimiento y de formacin de melanina. ........................................................... 27
Tabla 6.2. Resumen de resultados de cultivos con diferentes concentraciones de
IPTG................................................................................................................... 37
Tabla 6.3 Datos cinticos a diferentes concentraciones de sulfato de cobre............ 39
vi

NOMENCLATURA
Smbolo Definicin Unidades

Amp Ampicilina.
Cys Cistena.
DCW Peso seco de clulas (por sus gDCW/l
siglas en ingls: Dry Cellular
Weight).
DOnm Densidad ptica a determinada
longitud de onda.
E. coli Escherichia coli.
EuMel Eumelanina.
FeoMel Feomelanina.
Glc Glucosa.
IPTG Isopropil -D-tiogalactopiransido.
p Plsmido.
P Producto.
qGlc Velocidad especfica de consumo de gGlc/gDWC.h
glucosa.
QP Productividad volumtrica de gEuMel/ l.h
eumelanina.
rpm Revoluciones por minuto. 1/min
Trc Promotor hbrido que contiene la
regin regulatoria -35 de trp y la
regin correspondiente a la caja -10
del promotor lac UV5 .
Tyr L-Tirosina.
UI Unidades internacionales. molesDOPACROMO/min
X Biomasa. gDCW/l
vii

YEuMel/TYR Rendimiento Eumelanina / tirosina. gEuMel/gTYR


YFeoMel/TYR-Cys Rendimiento Feomelanina/ Tyr-Cys. gEuMel/gTyr-Cys
YX/S YX/Glc Rendimiento biomasa / sustrato, gDWC/gGlc
(glucosa).
Velocidad especifica de formacin gEuMel/gDWC.h,
de producto en la fase estacionaria. gFeoMel/gDWC.h
-1
Velocidad especfica de crecimiento. h
1

1. RESUMEN
Las melaninas son heteropolmeros polifenlicos que presentan varios colores, por
ejemplo las feomelaninas (FeoMel) de amarillo a rojizo y las eumelaninas (EuMel) de
caf a negro. Las melaninas absorben luz ultravioleta, actan como intercambiadores
catinicos, semiconductores amorfos, biopolmeros de unin a drogas, protectores de
rayos X y gama, adems proporcionan actividad antioxidante y antiviral.

Se realiz un estudio paramtrico para caracterizar, a escala de fermentador de


laboratorio, cinticamente el crecimiento y la produccin de melanina a partir de
tirosina en una cepa de Escherichia coli recombinante: W3110/pTrcMutmelA.
W3110/pTrcMutmelA es derivada de E. coli K12 y est transformada con el plsmido
pTrcmelA, el cual tiene clonado, en el vector inducible pTrc99A, el gen melA que
codifica para la enzima tiosinasa de Rhizobium etli C3 modificada en el aminocido
535 (cido asprtico glicina). Esta enzima es una monofenol oxigenasa, que usa
como cofactor al cobre y cataliza la conversin de L-tirosina a dopacromo va L-
DOPA, el cual se polimeriza a melanina mediante una serie de reacciones
espontneas.

Para llevar a cabo este estudio, los cultivos se realizaron en medio mnimo (M9) con
2 g/l de glucosa y 0.4 g/l de L-tirosina en fermentadores con 750 ml de medio. La
aireacin y la agitacin se mantuvieron constantes a 0.5 vvm y 600 rpm,
respectivamente. Los parmetros y niveles que se estudiaron fueron: a)
concentracin de cofactor (CuSO4: 20, 40, 80 y 400 g/ml); b) concentracin del
marcador de resistencia del plsmido (ampicilina: 100 y 200 g/ml); c) concentracin
del inductor (IPTG: 0-1 mM); d) temperatura de crecimiento y de produccin de
melanina (25-35C); y e) pH durante la etapa de produccin de melanina (5.5-8.5).

Para caracterizar el espectro de absorcin de la eumelanina (de color negro que se


obtiene a partir de tirosina), se implement un proceso de purificacin, con un
rendimiento del 85%. El espectro de absorcin, en el intervalo de 200 a 800 nm, fue
similar al que se obtiene con eumelanina grado analtico, con coeficientes de
2

extincin de 14.8 y 13.8 cm-1 (g/l)-1 a 400 nm para la eumelanina obtenida en este
trabajo y la analtica, respectivamente.

No obstante que la tirosinasa se produce intracelularmente durante la fase de


crecimiento, en todas las condiciones evaluadas la melanina se produjo nicamente
durante la fase estacionaria. Los parmetros estudiados se compararon en funcin
de la velocidad especfica de formacin de producto () durante dicha fase. En las
concentraciones evaluadas de ampicilina (100 y 200 mg/ml), la concentracin de 200
mg/ml favoreci la sntesis de melanina a una mayor . En concentraciones de 20 y
40 g/ml del cofactor Cu, fue ligeramente mayor (10%) que a 80 g/ml, a 400 g/ml
las clulas se lisan. Con concentraciones del inductor por debajo de 0.1 mM se
obtuvieron decrementos drsticos en , reducindose hasta un 98% para 0.01 mM.
La temperatura afecta drsticamente , siendo la favorable entre 30 y 32.5C,
logrndose la conversin total de L-tirosina en melanina. El cambio de pH en la fase
estacionaria afect drsticamente , incrementndose al doble (hasta 40
mgEuMel/gDCWh), a pHs de 7.5-8.0 respecto a pH 7. Adems el tiempo de cultivo, para
obtener la mxima conversin de tirosina en melanina, se redujo de 70 h para pH 7.0
a 30 h para pH 7.5 u 8. Estos resultados permiten sugerir que la actividad de la
tirosinasa de R. etli C3 se ve favorecida a pH de 7.5-8.0 y a 30C. Con las
condiciones que favorecen la produccin de melanina se obtuvo un rendimiento de
conversin de L-tirosina en melanina del 100% respecto al terico, alcanzando 0.45
gEuMel/l y una productividad volumtrica de 16.7 mgEuMel/l h.

As mismo, con estas condiciones se dise un cultivo, alimentando con una


concentracin inicial de glucosa de 8.5 g/l. La L-tirosina se aliment en dos pulsos,
uno durante la fase de crecimiento y otro en la estacionaria, hasta una concentracin
total de 5 g/l. El rendimiento de conversin tambin fue del 100%, obtenindose 6 g/l
de eumelanina con una productividad volumtrica de 95 mgEuMel/l h. Finalmente, se
logr producir feomelanina a partir de la mezcla molar 1:1 de los aminocidos
cistena y tirosina, con un rendimiento de conversin de los aminocidos del 93%
respecto al terico mximo y una de 23 mgFeoMEL/gDWCh.
3

2. INTRODUCCIN Y JUSTIFICACIN
En el laboratorio de Ingeniera de Vas Metablicas del Departamento de Ingeniera
Celular y Biocatlisis de la UNAM (Lab. IVM-DICB-UNAM), se est desarrollando un
proyecto enfocado a la produccin de molculas biolgicas de inters comercial.
Dicho proyecto pretende la optimizacin y diversificacin de las vas del metabolismo
central del carbono y una parte del mismo est centrado en la va de biosntesis de
compuestos aromticos en la bacteria Escherichia coli. El objetivo es diversificar y
optimizar la biosntesis de al menos tres metabolitos aromticos de inters comercial:
fenilalanina, catecol y melanina. Particularmente, el inters por polmeros del tipo de
la melanina ha crecido mucho en aos recientes, debido a que se han identificado
muchas propiedades fisicoqumicas y aplicaciones importantes. Las melaninas
pueden actuar como fotoprotectores, intercambiadores catinicos, agentes quelantes
y semiconductores amorfos (della-Cioppa et al., 1990; Wang et al, 2000). As mismo,
este tipo de polmeros poseen actividad antioxidante y antiviral (Wang et al, 2000).

En el Lab. IVM-DICB-UNAM (Cabrera y Gosset, comunicacin personal), se ha


transformado la cepa de E. coli W3110 (cepa no patognica procedente de K12) con
un plsmido derivado de pTrc99A, el cual es inducible por IPTG y contiene el gen
melA que codifica para la enzima tirosinasa proveniente de Rhizobium ethli C3
modificada en el aminocido 535 (cido asprtico glicina). Esta monofenol
oxigenasa es la responsable de la sntesis de melanina y utiliza como sustrato L-
tirosina. Con el propsito de caracterizar la produccin de melanina a escala de
fermentador de laboratorio y comprender el comportamiento fisiolgico de esta cepa,
E. coli W3110/pTrcMutmelA, se plante llevar a cabo estudios de parmetros
ambientales que potencialmente pueden afectar la formacin de melanina. Al iniciar
este proyecto no se conoca mucho a este respecto, por o cual se decidi llevar a
cabo un estudio de parmetros de manera individual, en lugar de un diseo
experimental con interrelacin de factores. Los parmetros que se decidi evaluar
son: temperatura, pH y las concentraciones de inductor, marcador de resistencia y
cofactor. Se caracterizaron las velocidades de crecimiento, de consumo de glucosa y
4

en algunos casos de tirosina, y de formacin de melanina, as como el rendimiento


de conversin de L-tirosina en eumelanina.
5

3 ANTECEDENTES
3.1 Melanina
Las melaninas son una familia de pigmentos de colores claros a negros, los cuales
se encuentran distribuidos en animales, plantas y microorganismos (della-Cioppa,
1990), son un grupo de heteropolmeros de alto peso molecular formados
principalmente por unidades de tipo indlico. Adems representan el principal
pigmento presente en varias estructuras que constituyen la superficie de los
vertebrados (Riley, 1997). Dentro de los microorganismos que pueden sintetizar
melanina se encuentran algunas bacterias y hongos microscpicos (Aurstad y Dahle,
1972; Sadasivan y Neyra, 1987; Hoti y Balaraman, 1993; Ikeda et al., 1996). La
produccin de melaninas por microorganismos silvestres ha sido reportada en
diversas especies bacterianas del gnero Aeromonas, Mycobacterium, Micrococcus,
Bacillus, Legionella, Streptomyces, Vibrio, Proteus, Shewanella (Wang, et al., 2000),
incluyendo las rizobacterias del genero Rhizobium, Azospirillum y Azotobacter
(Castro-Sowinski et. al., 2002).

3.2 Tipos de melaninas


Existen diversos tipos de melaninas, las cuales se originan a partir de diferentes
precursores qumicos (Mason, 1948). Cada tipo de melanina tiene diferentes
propiedades fsico-qumicas. En mamferos las melaninas se subdividen en 2 clases
qumicas, las eumelaninas (EuMel) y feomelaninas (FeoMel; Della-Ciopa, 1998). En
organismos vertebrados, la eumelanina es el principal pigmento presente en la piel.
Este tipo de melanina, de color caf a negro, se origina a partir de unidades
derivadas de productos de la oxidacin de la L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). En la
piel de algunos vertebrados tambin es comn encontrar feomelanina, la cual se
forma a partir de una mezcla de productos de oxidacin de L-DOPA con glutatin
L-cistena. Dependiendo de la proporcin de las unidades monomricas, la
feomelanina puede tener un color que va desde el amarillo hasta el rojo. En algunas
especies animales y microbianas, tambin se han identificado las alomelaninas, las
cuales se generan a partir de precursores fenlicos primariamente catecoles y 1,8
6

dihidroxinaftaleno (Della-Ciopa, 1998), as como las piomelaninas, que provienen del


cido homogentsico (Riley, 1997).

3.3 Enzima tirosinasa


La sntesis de melanina ocurre debido a reacciones de oxidacin sobre ciertos
compuestos fenlicos de tipo indol. A este proceso se le llama melanognesis y
depende de la accin de enzimas especficas que pertenecen a la familia de las
monofenol oxidasas (Lerner and Fitzpatrick, 1950). Un ejemplo de este tipo de
enzimas son las tirosinasas (EC 1.14.18.1), las cuales tienen como sustrato principal
al aminocido L-tirosina. Una caracterstica particular de este tipo de enzimas es la
de poseer dos tipos de actividades: monofenol oxidasa y catecolasa. La tirosinasa
puede hidroxilar monofenoles y convertirlos en o-difenoles (actividad de monofenol
oxidasa, EC 1.14.18.1). Tambin puede oxidar o-difenoles convirtindolos en o-
quinonas (actividad de catecol oxidasa). Las tirosinasas son metaloenzimas que
contienen tomos de cobre formando parte de su sitio activo (Pialis et al., 1996). La
tirosinasa es sintetizada como una apoenzima que carece de cobre y el mecanismo
por el cual se lleva a cabo la unin del cobre a la enzima vara dependiendo de la
naturaleza de la enzima. Existen protenas especializadas que transfieren tomos de
cobre a la apotirosinasa, para convertirla en tirosinasa activa. Estas protenas
activadoras, llamadas tambin chaperonas de cobre, han sido identificadas en
mamferos, plantas y microorganismos que sintetizan melaninas (Garca-Borrn y
Solano, 2002). En el caso de Streptomyces, se ha identificado a la protena MelC1
como la chaperona de cobre que activa a la tirosinasa MelC2. Los genes que
codifican para estas dos protenas forman un opern en el genoma de Streptomyces
(Liaw y Lee, 1995). En las plantas superiores y hongos la enzima tirosinasa se
encuentran en varias isoformas: inmaduras, madura latente y activa. Sin embargo la
descripcin bioqumica con respecto a la caracterizacin cintica y su relacin entre
esas isoformas an no ha sido establecida (Seo et al., 2002).

La forma activa de las tirosinasas de Agaricus bisporus, Neurospora crasa,


Aspergillus orizae, al igual que las tirosinasas de plantas superiores se encuentran
7

organizadas en tetrmeros (Van Gelder et. al, 1997). Bsicamente la tirosinasa tiene
tres dominios, de los cuales el dominio central contiene 2 sitios de unin a cobre,
llamados CuA y CuB. Varias secuencias conservadas estn presentes en las
tirosinasas de diferentes fuentes, como se muestran en la Figura 3.1 (Van Gelder et
al, 1997).

Susceptibles a corte
Cu A CuB In vivo e in vitro
Probable
pptido seal 170 400 470 530
Eucariotes
superiores
Rico en Cys Trans membranal
Pptido transitorio 170 370 430 600

Plantas
Rico en Cys Rico en His
50 300 390 400 600

Hongos

30 220 270

Bacterias

Figura 3.1 Dominios de estructura de tirosinasa de diferentes grupos.

De hecho el nico dominio parecido que se encuentra conservado en todas las


tirosinasas es el dominio central. Donde seis residuos de histidina se encuentran
conservados, los cuales unen a un par de iones cobre en el sitio activo de la enzima,
el cual interacta con el oxgeno molecular y el sustrato fenlico (Figura 3.2; Garca-
Borrn y Solano, 2002).

3.4 Biosntesis de melanina


El primer paso en la formacin de eumelanina es la ortohidroxilacin de la monofenol
L-tirosina a o-difenol (actividad de creolasa o monofenolasa) por la enzima tirosinasa
para dar lugar a L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) usando oxgeno molecular (Figura
3.3). El segundo paso es la oxidacin del o-difenol o difenol (actividad difenolasa o
8

catecolasa) a dopaquinona en presencia de oxgeno molecular (Sung-Yum et al.,


2003). La dopaquinona es un compuesto altamente reactivo que espontneamente
sufre una ciclizacin intramolecular para formar leucodopacromo, el cual
posteriormente se convierte en dopacromo. Reacciones de oxidacin espontneas
subsecuentes dan lugar a los compuestos 5,6-dihidroxiindol (DHI) y cido 5,6-
dihidroxiindol-2-carboxlico (DHICA). La polimerizacin, tambin espontnea, de
dopacromo, DHI, DHICA y sus correspondientes quinonas, causa la formacin de la
eumelanina (Figura 3.3; della-Cioppa, 1998).

Figura 3.2 Modelo propuesto del sitio activo y de unin a cobre de tirosinasa de
mamfero.
9

OH
tirosinasa O CO2H
dopa
dopaquinona
-
O N H
H+
HO 2C NH 2 HO dopacromo
tirosina
HO OH
CO2H
tirosinasa
HO N + CO 2H
H EUMELANINA
OH N OH N
OH ciclodopa H H
O
DHI DHICA
OH O
tirosinasa
cisteina

dopaquinona
OH OH
HO 2C NH2
CO 2H NH2
OH N
SR
R
S
S
R
CO2H NH 2 FEOMELANINA
N
cisteindopas tricocromos
Dopaquinona OH
tirosinasa OH
dopa CO 2H
N

R
S

Figura 3.3 Biosntesis de eumelanina y feomelanina.

La sntesis de feomelanina inicia tambin con la accin de la tirosinasa sobre la L-


tirosina (Fig. 3.3). Sin embargo, la presencia de L-cistena en el medio de reaccin da
lugar a la formacin de derivados tioles, entre los cuales predomina la 5-S-
cisteinilDOPA (5-S-CD). La oxidacin de los derivados tioles va la formacin de
intermediarios de benzotiazina, da lugar a la formacin de feomelanina (Ozeki et al.,
1997; Wakamatsu e Ito, 2002). La sntesis de otros tipos de melaninas sigue una ruta
similar pero utilizando diferentes sustratos. La presencia de mezclas de sustratos
(aminocidos, pptidos u otros) durante el proceso de melanognesis da lugar a la
sntesis de melaninas con una composicin qumica heterognea (della-Cioppa,
1998).

3.5 Propiedades de la melanina


Las melaninas presentan muchas propiedades interesantes, debido al alto grado de
conjugacin de la molcula la que ms resalta es su amplio espectro de absorcin de
luz. La melanina presenta tambin propiedades de intercambiador en reacciones de
10

oxido-reduccin, especialmente las eumelaninas, ya que stas pueden tomar parte


en las reacciones redox de uno o dos electrones. Uno de los efectos de la absorcin
de luz es la foto-oxidacin del pigmento, por la cual aumenta el contenido de grupos
carboxilo, cambiando las propiedades de absorcin de la melanina, la cual es
llamada reaccin de oscurecimiento de la melanina (Riley, 1997), debido a que
presenta funciones aninicas con los grupos carboxilo y grupos hidroxilo
desprotonados, la melanina tambin funciona como un poderoso quelante (Sarna et
al., 1976).

3.6 Funciones biolgicas de la melanina


Las melaninas cumplen diversas funciones biolgicas (Riley, 1992). Aparentemente,
todas ellas estn relacionadas a la proteccin contra agentes dainos en el medio
ambiente. Una de ellas es de tipo estructural, cuando se entrecruza con protenas las
protege de la degradacin (Riley, 1997). La melanizacin de vainas de semillas en
plantas y cutculas de los insectos le confieren mayor rigidez (Riley, 1997). La
melanina tambin le confiere a diversas especies de hongos resistencia a la
desecacin y a temperaturas extremas (Bell y Wheeler, 1986; Fogarty y Tobin, 1996).
En el caso de organismos superiores, la melanina cumple el papel de pigmento
protector contra la radiacin ultravioleta (UV) que proviene del sol (Krol y Liebler,
1998; Ortonne, 2002). Por otro lado, durante la sntesis de melanina, se generan
ortoquinonas, estructuras de DHI y DHICA oxidadas (Garca-Borrn, 2002), las
cuales pueden tener un papel antibitico (Riley, 1997). Finalmente, la melanina
puede jugar un papel quimioprotector al servir como agente absorbente de radicales
libres (Riley 1997).

3.7 Usos de la melanina


Las propiedades fsico-qumicas de las melaninas las hacen atractivas para ser
utilizadas en diferentes aplicaciones industriales. Las melaninas son utilizadas
actualmente en productos y tratamientos mdicos y cosmticos. (Weiner, 1997;
Rozanowska et al., 1999; Hung et al., 2002; Sava et al., 2001; Nofsinger et al., 2002).
Son usadas comercialmente como componente fotoprotector en cremas (Riley,
11

1997). As mismo, se utilizan experimentalmente para la eliminacin de metales


como parte de procesos para el tratamiento de agua (Fomina y Gadd, 2002).
Considerando la gran diversidad qumica de las melaninas, es de esperarse que se
continen desarrollando nuevas aplicaciones industriales para este polmero.

3.8 Procesos de sntesis de melanina


Dependiendo del uso al que se les destinar, las melaninas pueden ser obtenidas a
partir de procesos qumicos, material biolgico procesos biotecnolgicos. La
sntesis qumica bioqumica de las melaninas permite obtener material con un alto
grado de pureza. Estos procesos se basan en la utilizacin de precursores qumicos
con una alta pureza, los cuales se polimerizan por la accin de tirosinasas o
condiciones qumicas especficas (Bridelli et al., 1999). Normalmente el material
obtenido de esta manera es utilizado para estudios analticos, ya que el costo de
produccin es relativamente alto. La extraccin a partir de materia vegetal tiene la
ventaja de que las melaninas pueden ser obtenidas a un costo relativamente bajo
(Sava et al., 2001). Sin embargo, el producto obtenido consiste en una mezcla de
melaninas cuya composicin puede variar con cada lote procesado. Otra fuente de
melaninas son los cultivos con hongos microscpicos. Varias especies
pertenecientes a los gneros Cladosporium y Aureobasidium pueden producir
melaninas en cultivos sumergidos (Fomina y Gadd, 2002).

Uno de los procesos ms eficientes para la produccin industrial de melanina se ha


logrado en cultivos con Streptomyces lividans TK64/pIJ702. Con este proceso se ha
reportado una concentracin mxima de melanina de 2 g/l (della-Cioppa et al., 1990).
Por otro lado, con la utilizacin de las tcnicas de ADN recombinante se han
trasformado cepas de E. coli con plasmados que expresan el gen de la tirosinasa
melC1 y el gen melC2 que codifica para la protena activadora chaperona de cobre,
provenientes de Streptomyces antibioticus IMRU 3720 (della et al., 1998). Con esta
cepa recombinante de E. coli se han logrado producir 3 g/l de melanina con cultivos
en fermentador.
12

3.9 Justificacin del proyecto y preguntas relevantes en relacin al mismo


Al mismo tiempo de incorporarse el que suscribe al Lab. IVM-DICB-UNAM para llevar
a cabo el proyecto de tesis de licenciatura, se requera en el proyecto enfocado a la
produccin de molculas biolgicas de inters comercial, particularmente para
produccin de melanina, caracterizar la produccin de sta a escala de fermentador
de laboratorio, evaluar el comportamiento fisiolgico de la cepa de E. coli
W3110/pTrcMutmelA y valorar la capacidad con este biocatalizador para obtener
concentraciones de melanina mayores a las ya reportadas para cultivos sumergidos.
Para este propsito, al iniciar esta tesis existan varias preguntas que requeran ser
contestadas para conducir otras investigaciones relacionadas con este proceso.
Entre las preguntas que se tenan estn:
Es posible llevar a cabo la produccin de melanina en medio mineral-glucosa-
tirosina?
Cules son las concentraciones del marcador de resistencia (ampicilina), cofactor
(cobre) e inductor (IPTG) que se requieren para obtener una produccin de melanina
con altos rendimientos?
Cul es el rendimiento mximo que se puede obtener de conversin de tirosina en
melanina?
Cules son los parmetros ambientales, tales como el pH, temperatura y nivel de
oxgeno disuelto, que favorecen un alto rendimiento de conversin de tirosina en
melanina?
A que velocidad se sintetiza la melanina?
Cul es el nivel de actividad enzimtica en la cepa recombinante?
Es posible obtener eumelanina y feomelanina con la cepa W3110/pTrcMutmelA?
Se pueden obtener concentraciones mayores al mximo reportado en la literatura, 3
g/l, de eumelanina con este biocatalizador?
Para contestar varias de estas preguntas se decidi llevar a cabo el estudio
paramtrico aqu presentado, cuyos objetivos se describen continuacin.
13

4. OBJETIVOS DEL PROYECTO


4.1 General
Evaluar, a escala de fermentador de un litro, el efecto del cofactor, inductor,
marcador de resistencia, temperatura y pH sobre la produccin de melanina, en
medio mineral con glucosa y L-tirosina en Escherichia coli W3110/pTrcMutmelA.

4.2 Particulares
1. Estandarizar mtodos para cuantificar y semi-purificar la melanina.
2. Evaluar el efecto de los siguientes parmetros, sobre las cinticas de
crecimiento y produccin de melanina: pH, temperatura, concentraciones del
cofactor (Cu), marcador de resistencia (ampicilina) e inductor (IPTG).
3. Determinar la actividad enzimtica de tirosinasa en condiciones de cultivo
selectas.
4. Maximizar la productividad y rendimiento en E. coli W3110/pTrcMutmelA en
medio mineral-glucosa para la conversin de L-tirosina en eumelanina
5. Disear e implementar una estrategia, basndose en los parmetros
estudiados para lograr concentraciones mayores a 3 g/l de eumelanina.
6. Evaluar la potencialidad de E. coli W3110/pTrcMutmelA para producir
eumelanina y feomelanina.
14

5. MATERIAL Y MTODOS
5.1 Cepas bacterianas
Las cepas utilizadas en este trabajo se presentan en la Tabla 5.1.

Tabla 5.1 Cepas de Escherichia coli utilizadas en el presente estudio.

Cepa Genotipo o fenotipo relevante


W3110 F-, -, INV (rnnD-rnnE) 1, RecA+, Trp+,Lac+
W3110/pTrc99A W3110 conteniendo el vector pTrc99a sin insertos
W3110/pTrcMutmelA W3110 conteniendo el plsmido pTrcMutmelA.

El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech) es un derivado del vector pkk23-2, que tiene
el promotor fuerte trc (ubicado antes de un sitio de clonacin mltiple) y el terminador
transcripcional rrnB. Todas las cepas pertenecen a la Coleccin del Laboratorio de
Ingeniera de Vas Metablicas del Departamento de Ingeniera Celular y Biocatlisis
del Instituto de Biotecnologa de la UNAM.

5.2 Preparacin de bancos celulares y medios de cultivo


Para obtener cultivos homogneos y reproducibles se generaron bancos de clulas
con la cepa W3110/pTrcMutmelA como se describe a continuacin. Se creci la cepa
en medio slido agar 1.5% (Luria) Luria-Bertani (Sambrook et al.,1989) y en el medio
mineral M9 agar 1.5% (Atlas, 1993) suplementados con 2 g/l de glucosa y 200 g/ml
de ampicilina. Las cajas se incubaron a 37C por aproximadamente 24 horas, hasta
que se formaron colonias de aproximadamente 1.5 mm de dimetro, posteriormente
se trasfirieron de 3 a 5 colonias a un tubo de ensaye estril, conteniendo 1 ml del
medio lquido correspondiente, se resuspendieron y se trasfirieron a un matraz de
500 ml con 100 ml del medio de cultivo respectivo. Se incubaron a 37C y 250 rpm
(incubadora C24KC, New Brunswick Scientific), aproximadamente por 12 h hasta que
alcanzaron una DO600nm 1.5. Se tomaron muestras de 1 ml de estos cultivos y se
transfirieron, bajo condiciones aspticas, a crioviales conteniendo 1 ml de glicerol al
80%, inmediatamente las suspensiones se mezclaron, con ayuda de un vortex, y se
15

congelaron sobre hielo seco. El banco as preparado, conteniendo aproximadamente


50 viales, se almacen a -70C.

La composicin del medio Luria fue: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura y
5 g/l de NaCl (Sambrook et al., 1989). La composicin del medio M9 (Atlas, 1993) por
litro fue: 6 g Na2HPO4 ; 3 g KH2PO4; 1 g NH4Cl; 0.5 g NaCl; 1 ml de solucin MgSO4
7H2O 1M;1 ml de solucin CaCl2 0.1M; 1 ml de solucin tiamina 1mg/ml; y 10 ml de
solucin de glucosa 20%, es decir a una concentracin inicial de glucosa de 2 g/l (a
menos que se indique otra cosa). Una vez disueltas en agua destilada, las primeras 4
sales se esterilizaron en autoclave, a 121C por 15 minutos. Las soluciones del resto
de las sales se esterilizaron por separado. La tiamina se esteriliz por filtracin (0.22
m).

5.3 Evaluacin de cultivos


La evaluacin de los cultivos se realiz calculando los siguientes parmetros
cinticos o estequiomtricos; rendimiento biomasa/sustrato (YX/S), velocidad
especfica de crecimiento (), velocidad especfica de consumo de sustrato (qS),
velocidad especfica de formacin de melanina () y rendimiento terico de
produccin de melanina (Consultar el anexo para ver los detalles de clculo de estos
parmetros).

Los monmeros que conforman la eumelanina son del tipo DHICA (Figura 5.1), cuyo
peso molecular aproximado es 208 g/mol (Sarna y Sealy, 1984), el de la tirosina es
181 g/mol y dado que cada molcula de tirosina da origen a una molcula de DHICA,
el rendimiento terico mximo (YEuMel/TYR) es: (208/181) = 1.15 gEuMel/gTYR.

Para el caso de la feomelanina, se consider que los monmeros que la conforman


son del tipo de benzotiazinas, cuyo peso molecular promedio aproximado es de 295
g/mol (Sarna y Sealy, 1984), y que para que se forme una molcula de stas, se
necesita una molcula de cistena (PM = 121.6 g/mol) y una de tirosina (PM = 181
16

g/mol). Entonces el rendimiento terico mximo de formacin de feomelanina es


YFeoMel/Tyr-Cys = [295/(121.6+181)] = 0.97 gFeoMel/TYR-Cys.

OH
OH
CO2H
NH2 OH N
HO2C H

Tirosina
PM = 181 g/mol Monmero de eumelanina
PM = 208 g/mol

(HOOC)
S
N (COOH)

NH 2

Monmero de Feomelanina
PM = 295 g/mol

Figura 5.1 Estructura y pesos moleculares de tirosina y de monmeros de eu y


feomelanina.

5.4 Condiciones de los cultivos y parmetros estudiados


Los cultivos se realizaron en fermentadores Applikon de 1 litro con un volumen de
operacin de 0.75 L, agitados por medio de una turbina Rushton de 6 paletas planas.
La velocidad de agitacin fue constante a 600 rpm con un flujo de aire constante de
0.5 vvm (a menos que se indique otra cosa). Bajo estas condiciones el oxgeno
17

disuelto nunca fue menor al 50% (con respecto al valor de saturacin de aire). En
algunas ocasiones, tambin se llevaron a cabo cultivos en matraz de 500 ml (100 ml
de medio).

Dependiendo del cultivo y de la etapa de crecimiento, el pH se control en diversos


niveles (5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, y 8.5), mediante la adicin automtica de base
(NH4OH al 2.5%) y cido fosfrico 0.5 M. La temperatura fue controlada en el
fermentador a diferentes valores mediante un sistema de control Proporcional-
Integral-Derivativo (PID), con las constantes PID de 10, 2700 y 0, respectivamente.
Cuando se estudi el efecto de la temperatura los valores estudiados fueron: 25,
27.5, 30, 32.5 y 35 C.

En el estudio de los parmetros cinticos en medio M9 para la produccin de


melanina, el medio fue suplementado con diferentes concentraciones de CuSO4 (20,
40 y 80 g/ml), amplicilina (100 y 200 g/ml), IPTG (0.01, 0.1 y 1mM), y L-tirosina
(0.4 g), a menos que se indique otra cosa. Para ello se prepararon soluciones patrn
de CuSO4, ampicilina e IPTG las cuales se esterilizaron por filtracin (0.22 m). La L-
tirosina se agreg en polvo sin esterilizar. Para el caso del estudio con Luria sin
glucosa se us solo una condicin de los suplementos antes mencionados.

5.5 Determinacin de crecimiento bacteriano


El crecimiento bacteriano se cuantific en funcin de la turbidez, midiendo la
absorbencia de los cultivos a 600 nm en un espectrofotmetro (Beckman DU-70).
Durante la etapa de crecimiento y cuando la produccin de eumelanina era menor a
0.4 g/l, se tomaron muestras de 1.5 ml del cultivo, en diferentes etapas del mismo, y
una vez medida la DO600nm del medio con clulas y producto, se centrifugaban a
6,000xg por 5 min., al sobrenadante se determinaba de nuevo la absorbancia a 400 y
600. En este caso el valor para estimar la masa celular fue obtenido de la sustraccin
de ambos valores. Dicha absorbencia fue convertida a peso seco mediante la
siguiente relacin 1 DO600nm corregida = 0.37 gDCW/l (DCW = peso seco de clulas;
Hernndez-Montalvo et al., 2001). Cuando se obtuvieron concentraciones de
18

eumelanina mayores a 0.4 g/l, sta precipita y al centrifugar se acumula una cantidad
indeterminada en el paquete celular, ocasionando que el mtodo anterior no sea
confiable para cuantificar la biomasa. En estos casos la biomasa se tom como
constante, asignndole el valor que se obtena hasta concentraciones de eumelanina
menores o iguales a 0.4 g/l. Como se explica adelante, la DO400nm del sobrenadante
fue utilizada para cuantificar la melanina. En los casos requeridos, el sobrenadante
se almacen a -20C, para posteriormente analizar los productos del cultivo.

5.6 Recuperacin y cuantificacin de melanina


Para la recuperacin de melanina se procesaron algunos caldos de fermentacin al
final de los cultivos. Se centrfugo a 6,000xg (Centrfuga de Banco Eppendorf,
Modelo 5403) por 5 min., el sobrenadante se recuper y la melanina se precipit
bajando el pH a 2 con cido clorhdrico 6 N, de nuevo se centrifug, en est ocasin
a 12,000xg durante 12 min., el sobrenadante se desech y el precipitado se sec en
un horno a 100C por 72h.

Del producto seco se tom una muestra y se solubiliz en agua a pH 10 con NaOH 6
N. Posteriormente se reajust el pH a 7 con cido clorhdrico 6 N, quedando la
melanina a una concentracin final de 0.05 g/l. Se midi la absorbencia de la
solucin a 400 nm y a otras concentraciones menores a 0.05 g/l. Con sto se obtuvo
la curva de absorbencia a 400 nm en un espectrofotmetro (Beckman DU-70,
Fullerton, CA), en funcin de la concentracin de melanina y se determin el
coeficiente de extincin de los productos obtenidos.

5.7 Espectro de absorcin de melanina


A diferentes soluciones de melanina con una concentracin de 0.05 g/l, a pH 7, se
les midi la absorbencia en un barrido continuo de longitudes de onda cada 2 nm
desde 190 a 800 nm.
19

5.8 Determinacin de glucosa


La glucosa fue determinada con un analizador enzimtico (EKTACHEEM DT60 II
Multiple Analyzer, Kodak), en la cual la oxidacin de glucosa esta acoplada,
mediante la glucosa oxidasa, a la generacin de H2O2 .

5.9 Determinacin de L-tirosina


De muestras selectas de los cultivos almacenadas a 20 C se descongelaron y se
diluyeron 1:1 con una solucin filtrada (0.22 m) de cido trifluoroactico (TFA) 2% y
metanol al 40%. Estas muestras se analizaron por HPLC, con una columna de fase
reversa (Discovery C-18 Supelco) de 250x4.6mm, 5m y 4.5 cm3. El mtodo utilizado
fue isocrtico y se us como fase mvil una solucin de TFA al 2% y metanol al 40%
en agua, con un flujo de 0.5 ml/min. Para detectar la tirosina se utiliz un detector de
arreglo de iodos a una longitud de onda de 230 nm (Waters 2996 PDA) y usando
como sistema procesador de datos el software Millenium versin 3.03 (Waters).

Para elaborar la curva patrn de tirosina se utilizaron diluciones 1:1 del medio M9 sin
glucosa con tirosina y la fase mvil antes mencionada, en las cuales las
concentraciones finales de la tirosina fueron 0, 0.01, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4 g/l
(Figura 5.2).

1.510 07
rea = 2.973x107x [L-Tirosina] + 0.067x107
r2 = 0.998
1.010 07
rea

5.010 06

0.010 -00
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
L-Tirosina (g/l)

Figura 5.2 Curva de calibracin de absorbencia a 230 nm en funcin de la


concentracin de tirosina para cuantificarla por HPLC.
20

5.10 Ensayos de actividad enzimtica especfica


Para los ensayos enzimticos se tomaron muestras a las 8 y 24h de cultivos
selectos, las clulas se centrifugaron a 6,000xg, durante 5 minutos y se
resuspendieron en amortiguador de fosfatos de Na 0.2 M pH 7.5. La DO600 se ajust
a 8. Las clulas fueron divididas en 2 volmenes de 10 ml y mantenidas en un bao
fro a 4 C y a una de ellos se agregaron 100 l de inhibidor de proteasas y la
suspensin fue lisada por presin a 900 psi y 4 C (Prensa de French, Thermo
Espectronic).

Como mezcla de reaccin se tom un volumen de 200 l de clulas lisadas y no


lisadas, las cuales se adicionaron a 800 l de una solucin de 0.4 g/l de tirosina
disueltas en el amortiguador de fosfatos antes mencionado. Como blanco se utiliz la
solucin de tirosina en amortiguador de fosfatos, sin extracto celular. Se incubaron a
30C y se tomaron las lecturas de absorbencia a 475 nm, contra la solucin blanco,
cada minuto durante 15 min. La actividad se expresa como Unidades por ml de
clulas. Donde una Unidad es 1mol de dopacromo formado por min. Se us un
coeficiente de extincin de 3600 M-1 cm-1 para el dopacromo (Kong et al. 2000).
21

6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Preparacin de un banco de clulas
La aparicin de variantes celulares con morfologa diferente y con un nivel reducido
de expresin de protenas heterlogas, o con inestabilidad segregacional y/o
estructural de plsmidos, es un fenmeno observado frecuentemente con
microorganismos recombinantes. Con el propsito de reducir stas variaciones se
recurre a la obtencin de cepas con informacin gentica integrada en cromosoma
o, como en el presente trabajo, al uso de vectores que se disearon para reducir la
inestabilidad de los mismos. pTrc99A es un vector de mediano nmero de copias
(30), en el cual la expresin de los genes est controlada por el promotor artificial trc
(Amann et al., 1988). trc es un promotor fuerte e hbrido, ya que combina la regin
35 del promotor de trp y la regin 10 del promotor de lacUV5, el cual es regulado
por el operador lacO. Adems, pTrc99A contiene: un sitio de clonacin mltiple
(secuencias de ADN que son reconocidas por varias enzimas de restriccin, las
cuales permiten que se puedan insertar genes, mediante cortes y ligaciones de
genes con relativa facilidad); el gen que codifica para la protena represora lacq (que
lo hace inducible por Lactosa o IPTG); el gen que le confiere resistencia a ampicilina
como marcador de seleccin; los terminadores de la trascripcin rrnB T1 y T2; y el
origen de replicacin de pbr322. En total el tamao del plsmido ptrc99A es de 4,176
pares de bases.

Varios de los elementos citados hacen que pTrc99A sea un vector estructural y
segregacionalmente estable, no obstante con el objetivo de evitar fuentes de
variacin gentica en el presente trabajo se decidi preparar un banco de viales con
la cepa que se emple para llevar el estudio paramtrico. De esta manera, a partir de
una cepa de E. coli W3110 (cepa no patognica que se utiliza ampliamente en la
industria biotecnolgica para la produccin de protenas recombinantes), recin
transformada por electroporacin con el plsmido pTrc99A conteniendo el gen que
codifica para la tirosinasa de R. etli (pTrcMutmelA), se evalu la produccin de
melanina en cajas conteniendo medio Luria. De estas cajas se seleccion una
colonia, designada W3110/pTrcMutmelA, cuyo fenotipo es caracterstico de
22

produccin de melanina: color negro intenso en presencia de sulfato de Cu y tirosina.


Esta colonia fue cultivada, por separado, en medio rico (Luria) y medio mineral-2 g/l
de glucosa (M9: ver composicin en la seccin de materiales y mtodos), en
presencia de ampicilina (200 g/ml), hasta alcanzar una DO600 de 5 y 1.5
respectivamente, las cuales corresponden a la fase de crecimiento exponencial de E.
coli en estos medios. 1 ml de estos cultivos se adicionaron a crioviales conteniendo
glicerol (crioprotector) al 80% (previamente esterilizado), se mezclaron perfectamente
y se congelaron inmediatamente sobre hielo seco y se almacenaron en un ultra
congelador a 70. Estos viales fueron utilizados como semilla para desarrollar los
inculos en matraz. Durante 10 meses de almacenamiento, tiempo durante el cual
este banco fue utilizado para los cultivos reportados en este trabajo, la cepa se
mantuvo estable en cuanto a la velocidad de crecimiento, fenotipo y su capacidad
para producir melanina a partir de tirosina.

6.2 Proceso de recuperacin y cuantificacin de melanina.


Las melaninas pueden recuperarse mediante un proceso sencillo que consta de:
precipitacin a pH cido (2); lavado con agua; disolver a pH alcalino (10); precipitar
de nuevo con cido; lavar con agua o dializar; centrifugar y secar. Este proceso de
recuperacin tambin puede ser empleado para cuantificar la cantidad de melanina
producida. No obstante, para propsitos prcticos de cuantificacin de melanina
producida durante cultivos de la cepa W3110/pTrcMutmelA, dicho procedimiento es
demasiado tedioso y consume mucho tiempo. Con el fin de llevar a cabo una
cuantificacin sencilla de la eumelanina producida, mediante una simple lectura de
absorbencia, como primera parte de este trabajo se procedi a purificar y caracterizar
el producto obtenido de cultivos con medio mnimo-glucosa suplementados con
ampicilina, sulfato de Cu y L-tirosina, implementndose el proceso descrito en los
materiales y mtodos, el cual se muestra a manera de resumen en la (Figura 6.1).
Este proceso se adapt a partir de lo descrito en la Patente de los EUA No.
5,837,505 (della-Cioppa et al., 1998), obtenindose un producto de color negro
intenso.
23

Posteriormente, la melanina fue caracterizada espectrofotomtricamente utilizando


una concentracin (pesada y aforada con la mayor precisin posible) de 0.01 g/l en
agua destilada y comparada con respecto a la melanina grado analtico, la cual es
obtenida mediante sntesis qumica, que distribuye la compaa Sigma. Las
eumelaninas se pesaron cuidadosamente en balanza analtica, su disolucin se llevo
a cabo a pH alcalino (pH = 10), y una vez disuelta el pH se ajusto entre 7 y 7.5, para
finalmente aforarse con agua destilada a la concentracin indicada.

Cultivo de E. coli/ptrcmelA

Centrifugacin (6000 xg por 5 min a 25 C)

Ajuste pH 2 (HCl 0.5 mM) por 1h


Masa celular Sobrenadante Centrifugacin (12000 xg
Centrifugaci
(desecho) por 12 min a 25 C)

Precipitado Sobrenadante
(desecho)
Lavado con agua
destilada sobre filtro de
0.45 micras en vac o

Secado de la melanina
(100 C por 72 h)
Melanina
Figura 6.1. Proceso implementado para la recuperacin de melanina

En la figura 6.2 se muestra el espectro de absorcin obtenido para ambas


eumelaninas en un intervalo de longitudes de onda de 190 a 800 nm. Como puede
observarse, el espectro de absorcin de ambas es prcticamente idntico, con
excepcin de una menor absorcin de la melanina obtenida en este trabajo en
longitudes de onda comprendidas entre los 205 y 320 nm. Esta diferencia puede
deberse a que los grupos carboxilo, que son los principales encargados de absorber
la energa de la regin ultravioleta, se ven disminuidos, al reaccionar con el HCl
utilizado en el mtodo de recuperacin, liberando CO2 en presencia de calor (Ito,
24

1986). Adems de que la melanina elaborada a partir de sntesis enzimtica es


diferente a la producida por sntesis qumica, en cuanto al promedio de unidades
monomricas presentes en la eumelanina (Chedekel, 1992). Para determinar estas
diferencias es necesario llevar estudios de caracterizacin adicionales de(l) (los)
producto(s) purificados, con tcnicas analticas tales como resonancia magntica
nuclear, difraccin de rayos X y HPLC acoplada a espectrometra de masa.

1.4
1.2 Eumelanina Sigma
Absorbencia

1.0
Eumelanina obtenida
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
200 300 400 500 600 700 800
Longitud de onda (nm)

Figura 6.2. Espectro de absorcin de eumelanina Sigma (grado analtico) y


eumelanina obtenida en el presente trabajo a partir de tirosina en medio mineral-
glucosa.

Como puede observarse el espectro de absorcin para ambas eumelaninas es


idntico en el intervalo de 320 a 420 nm. Particularmente, con la concentracin de
eumelanina empleada (0.01 g/l), a 400 nm se obtiene un valor de absorbancia el cual
es confiable de leer en la mayora de los espectrofotmetros (0.163). Por estas
razones se escogi 400 nm como la longitud de onda a la cual se podra desarrollar
una curva de calibracin para cuantificar la melanina en los sobrenadantes de los
cultivos. Mediante una curva de calibracin a diferentes concentraciones de melanina
(0.01 a 0.05 g/l) contra absorbencia a 400 nm, se determin experimentalmente el
coeficiente de extincin. En la Figura 6.3 se muestran los resultados obtenidos
usando celdas con un paso de 1 cm, las pendientes, que corresponden a los valores
25

de los coeficientes de extincin, fueron de 13.8 y 14.8 cm-1 (g/l)-1 para las
eumelaninas de SIGMA y la producida en este trabajo, respectivamente, con
coeficientes de correlacin (r2) mayores a 0.999 en ambos casos. Los valores
numricos de coeficientes de extincin obtenidos concuerdan con valores reportados
en la literatura para eumelanina, p. ej. Sarna y Swartz (1988) reportan un valor de
14.7 a 400 nm.

1.00
Eumelanina Sigma
Absorbencia 400nm

y= 13.8x+ 0.008
0.75
Eumelanina obtenida
y= 14.8x+ 0.01
0.50

0.25

0.00
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Melanina (g/l)

Figura 6.3 Curva de calibracin de absorbencia a 400 nm en funcin de la


concentracin de eumelanina.

De tal manera que para cuantificar la eumelanina, se midi la DO400, en el


sobrenadante de cultivos libres de clulas y fue convertida a peso seco utilizando la
siguiente relacin 1 DO400 = 0.0676 g/l eumelanina. Este ltimo valor es el inverso del
coeficiente de extincin de la eumelanina procesada. Como se observa en la Figura
6.3, el mtodo es sensible a concentraciones tan bajas como 0.01 g/l y la curva es
lineal hasta una lectura de absorbencia de 0.8 y concentraciones de 0.05 gEuMel/l a
400 nm. De tal forma que a concentraciones mayores a 0.05 gEuMel/l se realizaban
diluciones con agua destilada, este procedimiento tambin ayudaba a resolver el
problema de precipitacin cuando se alcanzaron concentraciones mayores a los 0.4
gEuMel/l.
26

6.3 Efecto del marcador de seleccin (ampicilina) y del cofactor (Cu).


Se realizaron cultivos con la cepa W3110/pTrcMutmelA para 2 concentraciones
combinadas del marcador de seleccin ampicilina y cofactor sulfato de cobre. Las
cinticas de crecimiento y de formacin de eumelanina se muestran en la figura 6.4.
Para evaluar el efecto combinado de dos niveles del marcador de resistencia y del
cofactor se probaron dos niveles de ambos: a) 200 g/ml de ampicilina con 40 g/ml
CUSO4; y b) 100 g/ml de ampicilina con 20 g/ml CUSO4. La figura 6.4 muestra la
cintica de este cultivo y en la tabla 6.2 se presenta un resumen de los parmetros
cinticos y de conversin de glucosa en biomasa. En las concentraciones probadas,
la comparacin de resultados permite establecer que la velocidad de crecimiento ()
y el rendimiento biomasa/glucosa (YX/Glc) fue menor con las concentracin elevadas
de ampicilina y de Cu, en un 19 y 11%, respectivamente. Esto de debi
probablemente a que el uso de concentraciones relativamente altas de estos
compuestos resultan ser txicos a que se canaliza una mayor cantidad de energa
para el mantenimiento de la clula. No obstante en trminos especficos la velocidad
de consumo de glucosa (qGlc) prcticamente no vari, debido a que la y YX/Glc
disminuyeron en aproximadamente la misma proporcin.

Como se observa en la figura 6.4, una vez que la glucosa se agota y que el
microorganismo entra a la fase estacionaria, inicia la formacin de melanina, esto
indica que la produccin de la misma no esta asociada a crecimiento. Dicho
comportamiento se present en todos los experimentos llevados a cabo en la
presente tesis y se discutir a ms detalle en otras secciones. No obstante, se sabe
que la trascripcin de los insertos que estn bajo el control de trc en el vector
pTrc99A se da durante la fase de crecimiento (Amann et al., 1988) y, como se
mostrar adelante, que la actividad de tirosinasa y por ende la formacin de la misma
es durante la fase de crecimiento. En el caso de productos no asociados a
dP
crecimiento la formacin del mismo esta dada por la ecuacin = x (Ver anexo
dt
11.4 y 11.5), donde la constante EuMel representa la velocidad especfica de
produccin de eumelanina (mgEuMel/gDCWh). En la figura 6.4 se observa que la
27

cantidad de clulas permanece constante durante la fase estacionaria y en la cintica


de formacin de eumelanina que su produccin se da a dos velocidades diferentes.

1 2.0

Eumelanina x 4 (g/l)
Biomasa (gDWC/l) 1.6

Glucosa (g/l)
1.2
0.1
0.8

0.4

0.01 0.0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h)

Figura 6.4 Efecto de niveles de ampicilina y Cu sobre las cinticas de crecimiento y


de formacin de melanina.
Condiciones del cultivo: pH 7.0, 30C y 0.1mM IPTG.
Smbolos vacos: 200 g/ml de ampicilina y 40 g/ml CuSO4.
Smbolos llenos: 100 g/ml de ampicilina y 20 g/ml CuSO4.

Tabla 6.1 Efecto de los niveles de ampicilina y Cu sobre parmetros cinticos de


crecimiento y de formacin de melanina.

Amp:CuSO4 YX/Glc qGlc 1 2 YEuMel/TYR


(mg/ml:g/ml) (h-1) (gDCW/gGlc) (gGlc/gDWC h) (mgEuMel/ (mgEuMel/ (%)

gDWCh) gDWCh)
200 : 40 0.21 0.24 0.91 23.5 11.1 81.6
100 : 20 0.26 0.27 0.96 18.5 6.0 61.5

Para los dos casos evaluados disminuy ms del 50% a las 22 h del cultivo (2 en
la tabla 6.2). Esta disminucin puede deberse a que la estabilidad de la tirosinasa
disminuye despus de las 22 h. Adems, tanto 1 y 2 fueron mayores en el
experimento con la mayor concentracin de ampicilina y Cu en un 27 y 85%,
28

respectivamente, lo cual provoc que el rendimiento de produccin de melanina con


respecto a tirosina sea del 82 % del terico mximo a las 50 h de cultivo, 25% mayor
que el obtenido con el nivel bajo de ampicilina y Cu. Estos datos sugieren que el nivel
alto de ampicilina (200 g/ml) probablemente provoca una mayor estabilidad del
plsmido y en consecuencia que estas clulas tengan una mayor cantidad de
tirosinasa.

6.4 Efecto de la temperatura


En las figuras 6.5 a 6.9 se presentan las cinticas y el resumen de resultados de los
experimentos donde se estudi el efecto de la temperatura sobre el crecimiento y la
produccin de melanina, incluyendo las condiciones experimentales en la figura 6.5.
Como se observa la produccin de melanina ocurre nicamente durante las fases
estacionarias de los cultivos y los parmetros cinticos cambian en funcin de la
temperatura. En la figura 6.6 se observa que, para el intervalo de temperaturas
estudiado, la velocidad especfica de crecimiento presenta una dependencia lineal
con la temperatura. As mismo, la velocidad especfica de consumo de glucosa
tambin presenta una relacin lineal con la velocidad especfica de crecimiento
(Figura 6.7). Esta ltima relacin es representada por el modelo de consumo global
de sustrato, considerando que no hay producto,

qS = +m
Yx / s
en el cual la ordenada al origen es la energa de mantenimiento (m) y el recproco de
la pendiente es el rendimiento verdadero (YX/S). Los valores obtenidos son m =
0.095gGlc/gDCWh y YX/S = 0.37 gDWC/gGlu para ambos parmetros, respectivamente. Da
Silva y Bailey (1986) estimaron, para E. coli recombinante, que los rendimientos
tericos mximos eran de 0.42 gDWC/gGlu, mientras que para el mismo hospedero
utilizado en el presente trabajo con un plsmido diferente, Sandoval (2003) obtuvo
YX/S = 0.4 gDWC/gGlu, siendo nicamente 10 % y 5% mayores al valor encontrado para
W3110/pTrcmutmelA. Los valores de energa de mantenimiento para E. coli silvestre
son de 0.047 gGlc/gDWC h (Neijssel, et al. 1996) y de 0.054 gGlc/gDWC h (Blanch y ClarK
1997). Estos valores son aproximadamente el 50 % menores, que el obtenido para E.
29

coli W3110/pTrcMutmelA, debido a que esta es una cepa que contiene el plsmido
pTrcMutmelA el cual aumenta la carga metablica en la clula.

Para expresar la dependencia de la velocidad especfica de crecimiento con respecto


a la temperatura se utiliz la ecuacin de Arrhenius

= e RT
,
donde Ea es la energa de activacin (cal/mol) y representa la cantidad energa
necesaria para obtener crecimiento exponencial microbiano en cierto intervalo de
temperatura; A es una constante que representa un factor de frecuencia; R es la
constante de los gases ideales (en cal/mol.K) y T la temperatura (en K). Graficando
el log contra T-1, se obtiene una lnea recta, cuya pendiente es Ea/R (Figura 6.8).

Multiplicando el valor de la pendiente por la constante de la ley general de los gases


(1.9872 cal/mol oK), se obtiene el valor de energa de activacin: 14,778.8 cal/mol y
el valor de la constante A de 1.146x1010 (h-1). El valor de energa de activacin
encontrado en nuestro trabajo para E. coli W3110/pTrcMutmelA fue nicamente 10 %
mayor que el reportado para E. coli B/r en medio mnimo (Ingraham y Marr, 1996).
No obstante que la temperatura ptima para el crecimiento de E. coli es de 37C
(Ingraham y Marr, 1996), la produccin de eumelanina no se ve favorecida a
temperaturas cercanas a este ptimo (Figura 6.5).

En esta ocasin tambin la produccin de melanina se dio a dos diferentes


velocidades con reducciones del 50 al 75% para las temperaturas de 25-30oC y 32.5-
35oC, respectivamente, despus de las 25 h de cultivo (Figura 6.5 y 6.9). No obstante
que el cultivo que se desarroll a 35C, por crecer a una mayor velocidad, lleg ms
rpido a la fase estacionaria, no produjo melanina antes que los otros cultivos.
Probablemente esto se debe a que la temperatura de 35C se aleja de la
temperatura ptima de actividad de tirosinasa, ya que es bien sabido que a 37oC el
30

Biomasa (gDWC/l)
0.1

0.01
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)

2.0

1.6
Glucosa (g/l)

1.2

0.8

0.4

0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)

0.5
Eumelanina (g/l)

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)

Figura 6.5 Efecto de la temperatura sobre las cinticas de crecimiento, consumo de


glucosa y produccin de eumelanina.
Condiciones del cultivo pH 7.0, 0.1mM IPTG, 200 g/ml de ampicilina y 40 g/ml
CuSO4. Temperaturas (oC): Cuadrado 25.0, Tringulo 27.5, Tringulo hacia abajo
30.0, Rombo 32.5 y Circulo 35.0.
31

0.40

0.35

0.30

(h-1)
0.25

0.20

0.15

0.10
25.0 27.5 30.0 32.5 35.0

Temperatura (oC)

Figura 6.6 Relacin entre la temperatura y la velocidad especfica de crecimiento.

1.1
qGlc (gGlc/gDCWh)

y= 2.723x + 0.095

0.9

0.7

0.5

0.1 0.2 0.3 0.4

(h-1)

Figura 6.7 Relacin entre la velocidad especfica de crecimiento y la velocidad


especfica de consumo de glucosa.

vector pTrc99A favorece la transcripcin de los insertos bajo el control de trc (Amann
et al., 1988). Los datos presentados en las Figura 6.5 y 6.9 sugieren que la
temperatura favorable para la actividad de la enzima est entre 30 y 32.5oC y que la
velocidad especfica de formacin de melanina se ve favorecida a 32.5 y 30C.
32

Adems, considerando que el rendimiento de produccin de melanina fue de 80 a


95% para las temperaturas de 25, 27 y 32.5oC, que se ve drsticamente reducida a
35oC (28%) y que a 30oC se obtiene el 100% de conversin de tirosina en melanina
(Figura 6.10), y aunado a que la mayor velocidad de sntesis se obtiene a esta ltima
temperatura, se escogi la temperatura de 30oC para continuar los estudios. Estos
resultados concuerdan con el origen del gen que codifica para la tirosinasa, es decir
el gen melA fue clonado a partir de R. etli, y los organismos del mismo genero
pertenecientes a bacterias del suelo han visto favorecida la produccin de melanina a
esa temperaturas de cultivo 30C (Mercado-Blanco et al. 1993).

1
y= -7.437x+23.162128
(h-1)

0.1
3.20 3.25 3.30 3.35 3.40
1/T x 1000 (o K-1)

Figura 6.8 Aplicacin del modelo tipo Arrhenius para representar la dependencia de
la velocidad especfica de crecimiento con el recproco de la temperatura para E. coli
W3110/pTrcMutmelA.
33

(mgEuMel/gDCWh)
25
EuMel1
20
EuMel2

EuMel
15

10

0
25 27.5 30 32.5 35
Temperatura (C)

Figura 6.9 Velocidad especfica de formacin de eumelanina como funcin de la


temperatura.

100
YEuMel/Tyr (%)

80

60

40

20

0
25 27.5 30 32.5 35
Temperatura (C)

Figura 6.10 Rendimiento de conversin de tirosina en eumelanina en funcin de la


temperatura.

6.5 Efecto del pH


Para determinar el efecto del pH sobre la produccin de melanina, se llev acabo un
cultivo con los parmetros antes seleccionados (ampicilina 200 g/ml, sulfato de
cobre 40 g/ml y 30C), con 0.4 g/l de tirosina y 0.1 mM de IPTG. El caldo de
fermentacin, al llegar a la fase estacionaria, fue dividi en porciones de 50 ml
(matraces de 250 ml con mamparas), se ajusto el pH a diferentes niveles
(reajustandolos al mismo valor cada vez que se muestrearon) y se incubaron a 30 C
y 250 rpm. De esta manera la concentracin de clulas fue constante para todos los
34

Biomasa (gDWC/l)
1

0.1

0.01
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)

0.5
Eumelanina (g/l)

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)

Figura 6.11 Efecto del pH sobre las cinticas de crecimiento y de produccin de


melanina.
Condiciones del cultivo: 0.1mM IPTG, 200 g/ml de ampicilina y 40 g/ml CUSO4.
Smbolos para pH: Cuadrado 5.5, Tringulo 6.0, Tringulo hacia abajo 6.5, Rombo
7.0, Circulo 7.5, Equis 8.0 y Cruz 8.5.

experimentos durante la etapa de produccin de melanina (Figura 6.11). La cantidad


de melanina obtenida, as como la velocidad con que se produjo fue drsticamente
afectada por el valor de pH (Figuras 6.11 y 6.12). Los valores de pH que no
35

favorecieron la sntesis de melanina fueron 5.5 a 6.5 y 8.5, siendo 7.5 y 8.0 los que
provocaron la mayor velocidad de produccin. Cabe resaltar que a estos ltimos
valores se presento una sola velocidad, ocasionando que desapareciera la etapa de
produccin a una velocidad baja (Figura 6.12). Adems a los valores de 7.5 y 8.5 el
valor de se increment en promedio al doble del obtenido con pH 7.0.

El rendimiento de conversin de tirosina en melanina fue del 100% para los pHs de
7.0, 7.5 y 8.0, y menor a 70% para los otros valores evaluados (Figura 6.13). En
virtud de que la velocidad de produccin y el rendimiento se reducen drsticamente a
pH de 8.5, se decidi seleccionar como el pH 7.5 en lugar de 8.0, durante la etapa de
produccin, como el valor para continuar el estudio y evitar correr el riesgo de errores
durante el control de los cultivos, que podran afectar radicalmente la formacin de
melanina. De nuevo, como en el caso del estudio de temperatura, estos datos
sugieren que el pH ptimo de actividad de la enzima est entre 7.5 y 8.0.

50
(mgEuMel /gDCWh)

40 1
2
30

20

10

0
5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
pH

Figura 6.12 Efecto del pH en la velocidad especfica de formacin de eumelanina.


36

100

YEuMel/Tyr (%)
80

60

40

20

0
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH

Figura 6.13 Efecto del pH sobre el rendimiento reconversin de tirosina en


eumelanina.

6.6 Efecto del IPTG


Una vez establecidos los valores de marcador de resistencia, cofactor, temperatura y
pH que favorecen la mayor velocidad de sntesis y el mayor rendimiento de
conversin de tirosina en melanina, y no obstante que se conoce que
concentraciones de 0.1 mM de IPTG conllevan a una buena transcripcin del vector
pTrc99A, decidimos revisar el efecto de la concentracin de inductor del plsmido.
Particularmente, para la construccin empleada, E. coli pTrcMutmelA, la
concentracin ms alta que se evalu (1 mM) ocasion reducciones en la velocidad
especfica de crecimiento y en la velocidad de consumo de glucosa, no obstante la
cantidad de clulas alcanzadas cuando se agot la glucosa fue la misma para las
tres concentraciones probadas (Figura 6.14 y Tabla 6.2). Al parecer, tambin como
ya ha sido reportado (Miao y Kompala, 1992), el aumento en las concentraciones de
IPTG afecta de manera negativa el crecimiento de algunas cepas de E.coli en
condiciones aerbicas. Los resultados de produccin de melanina indican: a) que la
produccin fue mnima cuando se utiliz 0.01 mM de IPTG, probablemente debido a
una baja induccin del plsmido; b) que la formacin de melanina inici 12 horas
despus de entrar a la fase estacionaria cuando se us 1 mM de IPTG, ocasionado
posiblemente por un efecto de acumulacin excesiva y conformacin inadecuada de
la tirosinasa; y c) que el rendimiento de conversin de tirosina en melanina fue el
37

mximo a concentraciones de 0.1 y 1 mM de IPTG, siendo prcticamente nulo


cuando se us 0.01 mM. Por los resultados presentados en esta seccin se
recomienda utilizar una concentracin de IPTG de 0.1 mM cuando se utiliza medio
mineral con 2 g/l de glucosa, aunque probablemente a concentraciones celulares
mayores sea necesario una concentracin mayor del inductor.

Tabla 6.2. Resumen de resultados de cultivos con diferentes concentraciones de


IPTG.

IPTG qS 1 YEuMel/Tyr
(mM) (h-1) (gGlc/gDCWh) (mgEuMel/gDcWh) (%)
1 0.22 0.66 49.8 100
0.1 0.29 0.82 43.6 100
0.01 0.31 0.81 0.72 11.41
38

Biomasa (gDWC/l)
1

0.1

0.01
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

2.5
Glucosa (g/l)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

0.75
Eumelanina (g/l)

0.50

0.25

0.00
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Figura 6.14 Cinticas de crecimiento, consumo de glucosa y produccin de melanina


de cultivos lote a diferentes concentraciones de IPTG.
Condiciones de cultivo: 200 g/ml de ampicilina, 40 g/ml de sulfato de cobre, 0.4 g/l
de tirosina, pH 7.0 durante la fase de crecimiento y 7.5 durante la etapa de
produccin de melanina. IPTG (mM): Cuadrado 0.01, Tringulo 0.1, Tringulo hacia
abajo 1.
39

6.7 Efecto de la concentracin de cobre


Con los valores de los parmetros antes seleccionados y cambiando el pH de 7.0 a
8.0, al llegar a la fase estacionaria, se decidi evaluar de forma independiente el
efecto que tiene la concentracin de sulfato de cobre. Las concentraciones
evaluadas fueron: 20, 40, 80, y 400 g/ml. Las clulas se lisaron instantneamente
cuando se inculo el cultivo con 400 g/ml de sulfato de cobre, debido a que a tal
concentracin el cobre (6.3 mM) es sumamente txico para E. coli W3110, la
concentracin mnima de cobre reportada que inhibe su crecimiento es 3.5 mM
(Grass y Rensing 2001). En comparacin con las concentraciones de CuSO4 de 20 y
40 g/ml , las velocidades especficas de crecimiento de consumo de glucosa y el
rendimiento disminuyeron cuando se utilizaron 80 g/ml deCuSO4 (Figura 6.15 y
Tabla 6.3). Al parecer el efecto txico del cobre sobre el crecimiento se empieza a
manifestar a partir de 1.26 mM y el exceso de iones Cu+2 parece interferir con la
activacin del sustrato en el sitio activo de la enzima. La velocidad especfica de
formacin de melanina fue similar para las concentraciones de 20 y 40 g/ml de
sulfato de Cu, lo cual permite suponer que estas son concentraciones adecuadas
para donar los iones Cu+2 que conforman el sitio activo de la enzima sin que se
afecte su afinidad por el sustrato.

Tabla 6.3 Datos cinticos a diferentes concentraciones de sulfato de cobre.

CuSO4 qS YEuMel/Tyr
(g/ml) (h-1) (gGlc/gDCWh) (mgEuMel/gDCWh) (%)
80 0.24 0.74 38.7 73
40 0.27 0.83 46.6 100
20 0.27 0.82 41.7 100
40

Biomasa (gDWC/l)
1

0.1

0.01
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

2.0
Glucosa (g/l)

1.5

1.0

0.5

0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

0.75
Eumelanina (g/l)

0.50

0.25

0.00
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Figura 6.15 Cinticas de crecimiento, consumo de glucosa y produccin de melanina


a diferentes concentraciones de CuSO4.
Condiciones: 200 g/ml de ampicilina, 0.4 g/l de tirosina, 0.1 mM de IPTG, 30C, pH
inicial de 7.0 y 8 al iniciar la fase estacionaria.
Sulfato de cobre (g/ml): Cuadrado 20, Tringulo 40 y Tringulo hacia abajo 80.
41

6.8 Cultivo lote con adiciones de tirosina


Con el propsito de determinar: a) el consumo de tirosina durante la fase de
crecimiento y el inicio de la estacionaria; b) s era factible incrementar la
concentracin de melanina; y c) la actividad especfica de tirosinasa durante las
fases de crecimiento y estacionaria, se llev a cabo un cultivo con todos los
parmetros estudiados en sus valores seleccionados y con pulsos de tirosina durante
la fase estacionaria tal y como se muestra en la figura 6.16. Los valores de los
parmetros cinticos y estequiomtricos durante la fase de crecimiento (, qGlc y
YX/S), fueron prcticamente iguales a los obtenidos en la seccin anterior con 40
g/ml de sulfato de cobre. La tirosina no es consumida por las clulas durante la fase
de crecimiento exponencial, durante la fase previa a la entrada a estacionaria y
cuando la concentracin celular es mxima (aprox. 0.8 gDCW/l) se consume
aproximadamente el 20% de la tirosina inicial, es decir tan slo 0.08 g/l de los 0.4 g/l
iniciales de tirosina (Figura 6.16). Durante la fase estacionaria, de produccin de
eumelanina, se consume el 80% de la tirosina inicial. En el microorganismo
estudiado (E. coli W3110/pTrcMutmelA) la enzima es producida intracelularmente y,
aunque contradictorio, se sabe que los sistemas de trasporte, especficamente las
permeasas de tirosina aroP y tyrP en la membrana de E. coli, se reducen
drsticamente en presencia de tirosina (Whipp y Pittard, 1977; Sarsero et. al., 1991).
Esto constituye una barrera fsica, en la cual la tirosinasa formada no tiene acceso a
la tirosina para convertirla en L-dopa. El consumo de tirosina durante la etapa
preestacionaria parece servir para que las clulas utilicen este aminocido para
satisfacer requerimientos nutricionales o para formar los primeros precursores de la
melanina. Como es sabido durante la fase estacionaria ocurren muchos cambios en
la expresin de protenas, en la activacin de los sistemas de respuesta a estrs y en
la conformacin de la membrana de E. coli (Hewitt et al., 1999). Durante dicha fase
es probable que la combinacin de estos factores ocasione que la tirosina ingrese a
la clula, los precursores de la melanina sean formados intracelularmente, por accin
de la tirosinasa, excretados al medio y que la polimerizacin de la misma ocurra
extracelularmente, ya que el producto es obtenido en el sobrenadante.
42

La adicin de cuatro pulsos de tirosina en polvo, para obtener adiciones de 0.4 g/l
cada una, aparte de la inicial, permiti producir un poco ms de 1.3 g/l de melanina y
mostrar que la enzima se mantiene activa, convirtiendo tirosina en melanina, en las
condiciones de cultivo evaluadas, hasta por ms de 60 h (Figura 6.16). Adems, la
conversin de los 1.2 g/l de tirosina, agregados en la primera parte del cultivo, en
melanina fue del 100% hasta las 60 h del cultivo, y la conversin de los 0.8 g/l de
tirosina adicionados en la etapa final del cultivo fue marginal, probablemente debido
a la inactivacin de la enzima.

1.5
Biomasa (gDWC/l)

Eumelanina (g/l)
z L-Tirosina (g/l)
1

1.0

0.1
0.5

0.01 0.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo (h)

Figura 6.16 Cintica de crecimiento, consumo de tirosina y produccin de melanina


en medio M9 suplementado con tirosina, con alimentaciones graduales de tirosina en
la fase estacionaria.
Las flechas indican el momento en el cual se alimentan 0,4 g/l de tirosina.
Condiciones del cultivo: 40 g/ml de CuSO4, 0.1 mM de IPTG, ampicilina 200 g/ml,
30 C, pH 7.0 durante la etapa de crecimiento exponencial y cambio a 7.5 a partir de
que se termin la glucosa.

La actividad de la enzima durante la fase de crecimiento fue de 1.55 UI/gDWC y de


1.43 UI/gDWC a las 13 h (Figura 6. 17) de haber iniciado la fase estacionaria. Los
valores especficos de actividad son similares y muestran claramente que la enzima
se forma durante la fase de crecimiento, se mantiene estable durante al menos las
primeras 12 h de la fase estacionaria, y que no es necesario agregar ms cofactor
43

durante el ensayo de actividad, ya que al parecer la totalidad de la enzima es


funcional y no requiere de cantidades adicionales del mismo. Estos datos, en
conjuncin con los resultados presentados antes en esta seccin, confirman que la
melanina no se forma durante la fase exponencial por que la enzima no est en
contacto directo con el sustrato.

2.0
Act. Enzimtica

1.5
(U/gDWC)

1.0

0.5

0.0
10 25
Tiempo (h)

Figura. 6.17 Valores de actividad a distintos tiempos del cultivo.

6.9 Cultivo lote con alta concentracin de tirosina


Con el fin de evaluar si el microorganismo era capaz de producir mas de 3 g/l de
melanina (valor de produccin mximo reportado a la fecha con microorganismos
recombinantes; della-Cioppa et al., 1998) se llev a cabo un experimento en el cual
se increment la concentracin inicial de glucosa para incrementar la cantidad de
clulas y tener una mayor cantidad de tirosinasa en el mismo volumen y poder
convertir 5 g/l de tirosina en melanina. Los resultados de este experimento se
muestran el la Figura 6.17. En resumen, los parmetros cinticos de crecimiento
fueron similares a los obtenidos previamente ( de 0.25 h-1, qGlc 0.83 gGlc/gDWCh),
alcanzando una biomasa mxima de1.54 gDWC/l, un poco ms del doble de los
experimentos anteriores con 2 g/l de glucosa. La produccin de melanina se llev a
cabo desde el inicio de la fase estacionaria hasta las 80 h del cultivo, llegando a un
44

total de 5.7 g/l, que corresponde al 100% de conversin del mximo terico de la
tirosina adicionada. La velocidad especfica de formacin de melanina fue de = 70.3
(mgMEL/gDWC h), la cual es 50% mayor que en los experimentos anteriores y en
trminos de productividad volumtrica se alcanz una velocidad de 95 mgMEL/l h, 5
veces mayor que la encontrada anteriormente cuando E. coli W3110/pTrcmelA fue
crecida utilizando 2 g/l de glucosa.

8
Biomasa (gDWC/l)

z Eumelanina (g/l)
7

Glucosa (g/l)
1
6
5
4
0.1
4 (g/l) tyr 3
2
1
0.01 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)

Figura 6.17 Cintica de crecimiento, consumo de glucosa y produccin de melanina


a altas concentraciones de tirosina
Para poder producir altas concentraciones de melanina se realizo un cultivo con 8.5
g/l de glucosa para alcanzar mayor concentracin celular, en medio M9
suplementado con 1 g/l de tirosina inicial, CuSO4 40 g/ml, 200 g/ml de Ampicilina,
0.1 mM de IPTG, temperatura de 30 C, 1 vvm (para evitar las limitaciones de
oxgeno a altas concentraciones de celulares), a pH 7 de crecimiento, cambio de pH
a 7.5 en la fase estacionaria y alimentacin de 4 g/l de tirosina a las 32 del cultivo.

6.10 Produccin de melanina en medio Luria


Para descartar que la produccin de melanina, y por ende la entrada de tirosina no
est reprimida por la presencia de glucosa, sino por las condiciones de la membrana
durante la fase estacionaria de los cultivos, se analiz la cintica de crecimiento y de
produccin de melanina de E. coli W3110/pTrcMutmelA en medio rico (medio Luria)
sin glucosa, con las condiciones mostradas en la Figura 6.18. Adems se incluy
45

como control negativo a la cepa progenitora (W3110). Como era esperado, las
velocidades especficas de crecimiento fueron mayores que con medio mineral (0.63
h-1. para ambas cepas), la velocidad especfica de formacin de melanina fue de
28.27 mgEuMel/gDCW h, y la mxima concentracin de producto fue de 1.13 gEuMel/l, el
cual es mucho mayor al que se obtendra a partir de los 0.4 g/l de tirosina. Un
balance sobre los aminocidos aromticos (incluyendo la tirosina) presentes en el
medio Luria, permiti concluir que dicha cantidad de melanina se form por la
copolimerizacin de las especies activas formadas de la tirosina por la tirosinasa con
otros aminocidos presentes en el medio Luria.

Por cuestiones prcticas, para llevar a cabo la cuantificacin de melanina se us el


coeficiente de extincin correspondiente a la eumelanina, aunque esta consideracin
no es del todo correcta ya que el medio Luria contiene otros aminocidos, incluyendo
tirosina (Manual: Difco Laboratories, 1998), que pueden copolimerizar con las
especies reactivas que forma la tirosinasa a partir de la tirosina y por tanto producir
un heteropolmero diferente al que se produce en medios mnimos con tirosina como
nico sustrato. Lo ms correcto sera caracterizar la melanina producida a partir del
medio Luria, pero dicho estudio no se contempl como parte integral de esta tesis,
adems de que para esta parte del presente estudio lo ms importante no era
cuantificar de manera precisa la melanina, sino determinar si la glucosa tena un
efecto represor en la formacin de sta, adems de que la produccin de melanina a
partir de medios complejos genera costos de produccin mayores, una melanina
bastante heterognea y ms difcil de eliminar impurezas durante la purificacin.

En la Figura10.18 se muestra claramente que la formacin de melanina se llev a


cabo nicamente durante la fase estacionaria del cultivo, lo cual demuestra que no
hay represin por glucosa en los cultivos anteriores en presencia de glucosa y que la
tirosina extracelular entre en contacto con la tirosinasa intracelular depende
exclusivamente de las condiciones de la membrana. Otros estudio llevados a cabo
recientemente, por otro tesista en el laboratorio de IVM-DICB-IBt-UNAM, han
mostrado que se puede producir melanina en presencia de glucosa si las clulas son
46

permeabilizadas por diferentes mtodos durante la fase de crecimiento exponencial


(Zarate y Martnez; comunicacin personal). No obstante se ha reportado que
algunas veces la presencia de monosacridos en el medio pueden actuar como
represores de la produccin de melanina, caso concreto el de Streptomyces lividans,
que al no adicionar glucosa al medio, el cual est elaborado con casena peptona y/o
casena hidrolizada, la produccin de melanina es mejorada (della-Ciopa, et al.
1998).

10 1.5
Biomasa (gDWC/l)

Melanina (g/l)
1 1.0

0.1 0.5
W3110
W3110/ptrcmutmelA
0.01 0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Figura 6.18 Cintica de crecimiento y de produccin de melanina con medio Luria.


Condiciones: 200 g/ml de Ampicilina, 0.4 g/l de tirosina, 0.1 mM de IPTG para E.
coli W3110/pTrcMutmelA y sin los suplementos antes mencionados para la cepa
silvestre E.coli W3110. Temperatura 30C, con un pH inicial de 7.0 y 7.5 cuando los
cultivos llegaron a fase estacionaria.

10.11 Produccin de feomelanina


Se llevaron a cabo pruebas preliminares a nivel matraz para evaluar la produccin de
otro tipo de melaninas, utilizando L- tirosina en mezclas con cada uno de los
siguientes sustratos: fenilalanina, acido ascrbico y cistena. Est reportado que
estos compuestos pueden copolimerizar con las especies reactivas derivadas de la
tirosina (della- Cioppa et al., 1998). De estos experimentos se observ que no haba
variaciones en cuanto a color, excepto para la mezcla tirosina-cistena en soluciones
47

diluidas. Es por eso que se decidi realizar el estudio en fermentador nicamente


para esta mezcla.

Es sabido que otro tipo de melaninas, con diferente color pueden formarse si las
especies reactivas formadas a partir de la tirosina copolimerizan con otros
aminocidos, en el caso especfico de la cistena se forma un polmero color rojizo-
caf que da lugar a la feomelanina (Ozeki et al., 1997). Como parte final del presente
trabajo se decidi evaluar el potencial de W3110/pTrcMutmelA para producir
feomelanina. Cabe aclarar que la cistena es altamente txica para las bacterias
entricas como E. coli (Mcfall y Newman, 1996), por esta razn se llev a cabo
preliminarmente una prueba de inhibicin al crecimiento de W3110/pTrcMutmelA por
cistena. Se realiz un barrido usando concentraciones de cistena por debajo de
1.116x10-3 M. Se encontr que la concentracin mxima de cistena que no afecta el
crecimiento de E. coli W3110/pTrcMutmelA es de 2.85 x10-4 M. Por lo tanto la
evaluacin se realiz con las condiciones indicadas en la figura 6.19, adicionando
desde el inicio del cultivo 2.85 x10-4 M de cistena. Adems, durante la fase
estacionaria se hicieron dos adiciones de cisterna de 5.7x10-4 y 2.85 x10-4 M, a las 12
y 24 h del cultivo, para completar de esta manera 0.335 g/l de la mezcla 1:1 molar de
tirosina y cisterna (Figura 6.19). Se decidi probar esta relacin considerando que en
la sntesis de feomelanina se incorpora una molcula de cistena por cada molcula
de tirosina reactiva.
48

1 0.5

z Feomelanina (g/l)
Biomasa (gDWC/l)
0.4
cistena
2.85x10-4 M 0.3
0.1 cistena
5.7x10-4M 0.2

0.1

0.01 0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Figura 6.19. Cintica de crecimiento y produccin de feomelanina.


Condiciones: 2 g/l de glucosa, CuSO4 40 g/ml, 200 g/ml de Ampicilina, 0.1 mM de
IPTG, con 0.335 g/l de la mezcla 1:1 Molar de tirosina y cistena, temperatura de 30
C, pH 7 de crecimiento y cambio a 7:5 en la fase estacionaria.

Para cuantificar la feomelanina, sta se recuper y caracteriz de la misma manera


que se utiliz para la feomelanina (Ver seccin 6.2). La curva de calibracin del
producto se muestra en la Figura 6.20, encontrndose un coeficiente de extincin de
9.5 cm-1 (g/l)-1 (r2 = 0.989), o en trminos de absorbencia: 1 DO400 = 0.1056 g/l
feomelanina.

El anlisis de la Figura 6.19 permite concluir que la concentracin inicial utilizada, no


afecto el crecimiento de W3110/pTrcmelA, ya que las velocidades especficas de
crecimiento y de consumo de glucosa fueron 0.24 h-1 y 0.84 gGlc/gDWCh,
respectivamente, los cuales son bastante parecidos a los obtenidos en condiciones
similares y en ausencia de cistena. En este caso tambin la formacin de
feomelanina se llev a cabo en la fase estacionaria y la cantidad feomelanina
mxima producida, a partir de la mezcla cistena-tirosina, fue de 0.29 g/l, que
corresponde aproximadamente al 93 % del rendimiento terico mximo de la mezcla
1:1 M de tirosina-cistena. El promedio de velocidad especfica de formacin de
melanina fue 23.4 mgFeoMEL/gDCWh, valor que corresponde a aproximadamente la
49

mitad de la velocidad de formacin de eumelanina bajo condiciones de cultivo


similares.

0.75

y= 9.47x + 0.0045
DO (400 nm) 0.50

0.25

0.00
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Feomelanina (g/l)

Figura 6.20 Curva de calibracin de feomelanina producida a 400nm.


50

7. RESUMEN DE RESULTADOS
Las condiciones favorables para la produccin de melanina en cultivos lote con
medio mineral (M9) glucosa en E.coli W3110/pTrcmelA son:

Sulfato de cobre (CuSO4): 20-40 g/ml; Ampicilina: 200 mg/ml; IPTG: 0.1 mM;
Temperatura: 30 C; y pH 7durante el crecimiento exponencial y cambio a pH 7.5-8
en la fase estacionaria.
51

8. CONCLUSIONES

Como primera parte de este trabajo se concluye que si es posible obtener melanina,
con E. coli W3110/pTrcMutmelA, en medio mineral-glucosa-tirosina.

La melanina producida a partir de tirosina en E. coli W3110/pTrcMutmelA es una


eumelanina.

El mtodo de extraccin de melanina utilizado permite obtener el 85 % de la


melanina producida.

La produccin de melanina en cultivos lote, en E. coli W3110/pTrcMutmelA no esta


asociada a crecimiento.

La conversin de L-tirosina a eumelanina es del 100 % respecto al terico mximo.

La enzima tirosinasa se encuentra de manera intracelular en la fase de crecimiento


exponencial y con una actividad similar durante la fase estacionaria del cultivo.

La melanina producida a partir de la mezcla tirosina y cistena en E. coli


W3110/pTrcMutmelA es una feomelanina.

No existe represin por glucosa en la actividad de tirosinasa, si no ms bien parece


ser un problema de contacto entre el sustrato y la enzima, probablemente provocado
por la incapacidad de E. coli para introducir tirosina durante la fase de crecimiento
exponencial.

Bajo las condiciones seleccionadas en este trabajo, se logr obtener una


productividad volumtrica de 95 mgEuMel/l h, la cual es mayor a otros valores
reportados en la literatura.
52

Se obtuvieron concentraciones de eumelanina de 5.8 g/l, aproximadamente el doble


del mximo reportado en la literatura con microorganismos silvestres o
recombinantes.

En su conjunto, los resultados aqu mostrados permiten proponer como una


alternativa biotecnolgica el uso de E. coli W3110/pTrcMutmelA para la posible
formacin de melanina a escala de produccin.
53

9. PERSPECTIVAS

Evaluar si E. coli W3110/pTrcMutmelA puede producir melanina en la fase de


crecimiento exponencial utilizando otras fuentes de carbono diferentes a la glucosa.

Caracterizar la afinidad por otros sustratos derivados de la tirosina, y mezcla de cada


uno de ellos con la tirosina, para producir diferentes tipos de biopolmeros
(melaninas).

Purificar la enzima tirosinasa para: caracterizar sus propiedades catalticas; producir


melania in vitro; inmovilizarla y producir melanina u otros compuestos derivados en
procesos continuos.

Producir melanina a partir de glucosa alterando las rutas del metabolismo central y
de sntesis de compuestos aromticos en E. coli.

Inmovilizar la enzima tirosinasa para producir L-DOPA, que es un producto de inters


medico para tratar el mal de Parkinson.

Disear cultivos de alta densidad celular, primero crecer las clulas a alta densidad
sin inducir, antes de entrar a fase estacionara, inducir (adiciona IPTG) por al menos
2 o 3 duplicaciones, agregar tirosina y tratar de alcanzar concentraciones de
melanina mayores a 20 g/l de manera que el proceso pueda ser factible para llevarlo
a la escala industrial.

Construir cepas que no requieran de la adicin de inductor, por ejemplo, bajo un


promotor que se exprese constitutivamente.

Construir cepas que excreten la tirosinasa para llevar a cabo la produccin de


melanina desde el inicio de los cultivos y adems para favorecer la purificacin de la
misma. Para excretar colocar un pptido seal a la tirosinasa y secuencias de
54

aminocidos que permitan su adherencia a ciertas matrices para facilitar su


purificacin.

Elaborar una patente para la produccin de melanina a nivel fermentador, ante el


Instituto Mexicano de Proteccin Industrial (IMPI).
55

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60

11. ANEXO: ESTIMACION DE LOS PARAMTROS CINTICOS Y


ESTEQUEOMTRICOS.
11.1 Velocidad especfica de crecimiento
La Figura 11.1 muestra la cintica de crecimiento, de consumo de glucosa y de
formacin de producto tpica para procesos de fermentacin en procesos por lote. En
este caso se asume que los microorganismos han sido previamente adaptados en un
proceso de desarrollo de inculos, en condiciones similares a las empleadas en el
cultivo a nivel de fermentador de las mismas y que por consecuencia no se presente
la fase de crecimiento retardado o de adaptacin. Cuando las clulas no estn
limitadas por sustrato crecen de forma exponencial y se observa una lnea recta
cuando la masa celular es graficada en escala logartmica en funcin del tiempo del
cultivo (Quintero, 1981). De est manera se tiene que:

dx
=xt (1)
dt

donde:
X es la biomasa (gDCW/l); t es el tiempo (h); y es una constante de proporcionalidad
que representa la velocidad especfica de crecimiento (h-1)

Arreglando la ec. (1) e integrndola se obtiene:

X = Xo e( t ) (2)

donde:
Xo es la biomasa al inicio de la fase de crecimiento exponencial (gDCW/l)

De esta manera la velocidad de crecimiento se calcul aplicando el modelo de la ec.


(2), utilizando el mtodo de los mnimos cuadrados.
61

11.2 Rendimiento biomasa sustrato (YX/S)


Este trmino representa la biomasa generada por unidad de sustrato consumido:

10 10

P (A) 8
X
1
Glu
6

Producto
Biomasa

P (PA)
P (NA)

4
0.1

0.01 0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)

Figura 11.1 Cinticas de crecimiento, de consumo de glucosa y diferentes modelos


para la formacin de producto: a) Modelo asociado a crecimiento P (A); b) Modelo
parcialmente asociado a crecimiento P (PA); c) Modelo no asociado a crecimiento P
(NA).

YX/S =
(X 2 X1 ) (gDCW/gGlc) (3)
(S1 S 2 )

Donde:
S2 y S1 son la concentracin de glucosa en la parte inicial y final, respectivamente
(gGlc/l); y X1 y X2 son la biomasa en la parte final e inicial de la fase de crecimiento
exponencial, respectivamente (gDCW/l).

11.3 Velocidad especfica de consumo de glucosa (qS)


Este parmetro representa la velocidad de consumo de azcar por unidad de masa
celular (Quintero, 1981) y se calcul, durante la fase de crecimiento exponencial, de
acuerdo a:
62


qS = (gGlc/gDCW h) (4)
Yx / s

11.4 Modelos para la formacin de productos


Las cinticas que representan cada uno de los modelos de formacin de producto se
muestran en la Figura 11.1 (Quintero, 1981). Cuando un sustrato se convierte en
producto (P), la tasa de formacin esta en relacin con la velocidad de crecimiento.

dP dx
= (5)
dt dt

donde = constante estequiomtrica. Este es el modelo asociado con crecimiento

Para los casos en que la formacin del producto es independiente de la velocidad de


crecimiento:

dP
= X (6)
dt

Donde X es la concentracin de clulas, promedio, en la fase estacionaria y es una


constante de proporcionalidad que representa la velocidad de formacin de producto
no asociada a crecimiento, que se calcula mediante la siguiente ecuacin:

1 dP
(gProducto/gDCW h) = = (8)
x dt

El modelo combinado, para metabolitos parcialmente asociados a crecimiento,


propone expresar la produccin como la suma de ambas ecuaciones:

dP dx
= + x (7)
dt dt