ENZIMAS II

Dr. Felipe Arenas Salinas

felipe.arenass@usach.cl

Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa
Laboratorio Microbiologa Molecular
The enzyme-substrate complex

Adrian Brown
Brown and Henri investigated the
substrate-dependence of an enzyme-
catalyzed reaction and found that the
reaction reached a maximum velocity at
high substrate concentrations (Vmax)
 Brown and Henris conclusion:

The enzyme works by forming a complex (like a lock and a key)

with the susbtrate and acting on it for a finite period of time.
binding reaction dissociation
E + S E-S E-P E + P
enzyme enzyme-substrate enzyme-product enzyme
+ complex complex +
substrate product

Schematic representation of an enzyme-catalyzed reaction

 Cintica Enzimtica

Leonor Michaelis (January 16, 1875 Maud Leonora Menten (March 20, 1879
October 8, 1949), German-born July 26, 1960), Canadian medical
American biochemist, physical chemist, scientist
and physician
 Cintica enzimtica
Enzimas michaelianas: producen curvas hiperblicas
cuando se grafica velocidad de reaccin versus
concentracin de sustrato.

Ejemplo: chimotripsina

Enzimas alostricas: producen curvas sigmoidales

cuando se grafica velocidad de reaccin versus
concentracin de sustrato. Muestran fenmenos de
cooperatividad.

Ejemplo: aspartato transcarmaboilasa

 Cintica enzimtica

Enzima micheliana Enzima alostrica

Hiprbola Sigmoide
Cintica Enzimtica
Ecuacin de Michaelis-Menten
 Ecuacin de Michaelis-Menten

Curva de progreso de una reaccin

catalizada por una enzima
Vo2 [S2]

[P]

Vo1
d P - dS
[S1]

v
dt dt

Tiempo
 Ecuacin de Michaelis-Menten

Es un proceso cclico en que se recupera la enzima.

Efecto de la concentracin del sustrato:

- da una cintica hiperblica
- es un proceso saturante
 Ecuacin de Michaelis-Menten

Hay un nmero limitado de sitios en la enzima para fijar sustrato

Al estar ocupados todos los sitios, por mucho que se aumente la

concentracin de sustrato, la velocidad permanecer constante
teniendo un valor asinttico.

k2

k-1 k-2

Etapa lenta Etapa rpida

Ecuacin de Michaelis-Menten

k2

k-1 k-2
Ecuacin de Michaelis-Menten

VMAX = Velocidad mxima de

la reaccin.
Ecuacin de Michaelis-Menten

k1 k2
E+S ES E+P
k -1

Km = constante de michaelis

Concentracin de sustrato
a la cual la velocidad de la
reaccin es de Vmax.
Km grandes: complejo ES dbil
Km pequea: complejo ES ms estable
 Significado de Km

1. Constante de equilibrio de disociacin del complejo ES (en condiciones

de equilibrio rpido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato (en

condiciones de equilibrio rpido)

3. Mide la funcin de fijacin (en cond. de eq rpido)

4. Concentracin de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la

mitad de la mxima.

5. Se define para una pareja E-S

6. Se mide en unidades de concentracin.

Km = constante de michaelis
 Significado of Km

Km da cuenta de la afinidad de la enzima por el

sustrato
Km baja significa una alta afinidad por el sustrato;
Km alta significa una baja afinidad por el sustrato

Si se compara una enzima con dos sustratos

Hexokinasa : D-fructosa Km = 1.5 mM
D-glucosa Km = 0.15 mM

Si se compara dos enzimas con el mismo sustrato

Hexokinasa: D-glucosa Km = 0.15 mM
Glucokinasa: D-glucosa Km = 20 mM
Ecuacin de Michaelis-Menten
Ecuacin de Michaelis-Menten
Ecuacin de Michaelis-Menten
Ecuacin de Michaelis-Menten
Ecuacin de los Dobles Recprocos

Ecuacin de Lineweaver-Burk

Y=mx+n
 Conclusiones de la ecuacin de Michaelis - Menten

cuando [S]= KM, la ecuacin queda:

cuando [S] >> KM, la ecuacin queda

cuando [S] << KM, la ecuacin queda

NUMERO DE RECAMBIO / CONSTANTE CATALITICA

PERFECCION CATALITICA
 Constantante Catalitica (kcat)
o Nmero de Recambio

K cat = Vmax / [ET]

NUMERO DE RECAMBIO

Nmero de molculas de sustrato convertidas en

producto en una unidad de tiempo, por una molcula
de enzima (cuando la enzima est saturada de
sustrato).
 Constantante Catalitica (kcat)
o Nmero de Recambio
Vmax = k 2 [E]T
En la cintica de Michaelis -Menton k2= kcat

Kcat es el nmero de moles de sustrato convertidos

a producto por segundo y por mol de enzima

Es una medida til para comparar las actividades de

diferentes enzimas
Constantante Catalitica (kcat)
o Nmero de Recambio
Constantante Catalitica (kcat)
o Nmero de Recambio
Eficiencia cataltica

Kcat/Km = eficiencia cataltica

Inhibicin Enzimtica
 Inhibicin enzimtica

Varias sustancias inhiben a las enzimas: drogas, anlogos a sustratos,

toxinas, complejos metlicos

El estudio con los inhibidores :

Da informacin de las rutas metablicas
Indica cmo actan las toxinas y drogas
Ayudan a entender los mecanismos de accin enzimtica

Existen 2 tipos de inhibidores segn el tipo de interaccin con la enzima:

Reversibles
Irreversibles
 Inhibidores

Reversible: Unin no covalente de un compuesto a una enzima. Forma enlaces no-

covalentes dbiles que se disocia fcilmente de la enzima. La enzima es inactiva
solamente cuando el inhibidor esta presente.

- Inhibidor competitivo
- Inhibidor no competitivo
- Inhibidor acompetitivo
Irreversible: Generalmente es un compuesto que se une covalentemente a la
enzima. Forma enlaces covalentes o enlaces no-covalentes fuertes. El sitio de unin
es un grupo aminoacdico que participa en la reaccin enzimtica normal

Modifican permanentemente a la enzima / Se unen covalentemente

inhibidores suicidas
 Inhibidor competitivo

Inhibidor competitivo:
Semejante al sustrato normal y compite por el mismo sitio de unin.
El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre

Ki = constante
de disociacin
para el inhibidor
 Inhibidor competitivo

El inhibidor aumenta la Km, pero la Vmax (a concentraciones altas de

sustrato) sigue siendo la misma.

V
Vmax Sin inhibidor
1/V Con inhibidor

Con inhibidor Sin inhibidor

1/[Vmax]

[S] -1/[Km]
1/[S]

La inhibicin se puede superar aumentando la [S]

 Inhibidor no-competitivo

Inhibidor no competitivo (Alosterica):

El inhibidor se une a la enzima independientemente de que lo haga o no el
substrato (la unin del inhibidor, es en un sitio diferente a la del sustrato).

Causa un cambio conformacional en la enzima por tanto, no impide la

fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin cataltica.
 Inhibidor no-competitivo

Interacta con una parte que es importante para la funcin de la enzima, pero
no impide la unin del sustrato al sitio activo.

Se une a la enzima o al complejo ES

V
Vmax Sin inhibidor
1/V Sin inhibidor

Con inhibidor Con inhibidor

1/[Vmax]

[S] -1/[Km] 1/[S]

El inhibidor reduce la Vmax, pero la Km sigue siendo la misma.
 Inhibidor acompetitivo

Inhibidor acompetitivo:
El inhibidor se une solamente al complejo ES una vez formado, impidiendo
la accin cataltica.
 Inhibidor acompetitivo

Solo se une al complejo ES

1/V Sin inhibidor

Con inhibidor

1/[Vmax]

-1/[Km] 1/[S]

El inhibidor reduce la Vmax y la Km.

Inhibidores
Regulacin de la actividad enzimtica

1. Regulacin alostrica

2. Modificacin covalente reversible

3. Activacin proteoltica
Regulacin alostrica
Modificacin covalente

Quinasa

Fosfatasa
Activacin proteoltica
Activacin proteoltica
Serin-proteasas
Serin-proteasas
Quimiotripsina
Mecanismo cataltico de una serin
proteasa
Laboratorio
Fosfatasa
 Fosfatasa

Curva de Calibracin pNP

 Fosfatasa

Parmetros Cinticos
A partir de los siguientes resultados determine:
Cul es el valor de Km:
Cul es el valor de Vmax:

[s] (mM) Vo (M/s)

0,2 5,0
0,4 7,5
0,8 10,0
1,0 10,7
2,0 12,5
4,0 13,6
 16

14

12

10
Series1

Vmax= 14.97 8
Logartmica
Km= 0.398 6 (Series1)
4

0
0 1 2 3 4 5
1.-
A partir de los siguientes resultados determine:
Cul es el valor de Km:
Cul es el valor de Vmax:

[S] mM V (mmol/ml/min)
0,1 3,33
0,2 5,0
0,5 7,14
0,8 8,0
1,0 8,33
2,0 9,09
1.- Uno de los parmetros cinticos importantes es el valor de Km. Mientras mayor sea
el valor de Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato. Es correcta esta
aseveracin? Explique brevemente y fundamente su respuesta.

2.- Se mide la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima en funcin de la
concentracin del sustrato. Esta reaccin se realiza en presencia y ausencia de un
inhibidor especfico (I). Los datos obtenidos se indican en la siguiente tabla:

Velocidad (mol/min)
[S] (M) Sin inhibidor Con inhibidor
0.3 x 10-5 10.4 4.1
0.5 x 10-5 14.5 6.4
1.0 x 10-5 22.5 11.3
3.0 x 10-5 33.8 22.6
9.0 x 10-5 40.5 33.8

a) Cules son los valores de Vmax y KM en ausencia y presencia del inhibidor?

b) Qu tipo de inhibidor es I?
3.- Defina y explique qu es el nmero de recambio de una enzima

4.- Explique el mecanismo de accin general de una enzima (su funcionamiento),

respecto a la reaccin qumica que cataliza, en trminos de la Energa Libre de la
reaccin.

5.- Defina sitio activo y sitio de unin al sustrato de una enzima.

6.- Defina los siguientes conceptos:

a) Holoenzima
b) Apoenzima
c) Cofactor
d) Coenzima
e) Enzima alostrica
7.- La penicilina se inactiva por la enzima penicilinasa, que tambin se conoce
como B-lactamasa). Se determin la cantidad de penicilina hidrolizada por
minuto, en una solucin que contiene 10-9 g de penicilinasa, y los valores se
expresaron en funcin a la concentracin de penicilina:

Determine por regresin lineal los valores de Km y Vmax de la enzima:

Con los valores obtenidos por regresin lineal para Km y Vmax y la ecuacin de
Michaelis Mentel, determine la velocidad de la reaccin si la concentracin de
sustrato es 0,18 M.

[S] (M) Velocidad

(mol/min)
1,25 1,72
1,67 2,04
2,5 2,63
5,0 3,33
10,0 4,17
8.- Si la cintica del ejercicio anterior se determina en presencia de un
inhibidor diferente se tienen los siguientes datos:
Cul es el valor de Km y Vmax en ausencia de inhibidor:
Cul es el valor de Km y Vmax en presencia de inhibidor:
Que tipo de inhibidor es I:
Cual es la velocidad de la reaccin en presencia y ausencia de
inhibidor se la [S]= 0,13mM:
Explique el efecto que tienen el inhibidor sobre la velocidad de la
reaccin:
[S] Velocidad (mmol/ml/min)
(mM) Sin inhibidor Con
inhibidor
3 10,4 2,1
5 14,5 2,9
10 22,5 4,5
30 33,8 6,8
90 40,5 8,1