You are on page 1of 10

Santa-Gonzlez y Camargo Actual Biol 38 (104): 71-80, 2016 | DOI: 10.17533/udea.acbi.

v38n104a07

Proteccin celular antioxidante y respuesta adaptativa


inducida por estmulos oxidativos crnicos
Antioxidant cellular protection and adaptive response induced by chronic
oxidative stimuli

Gloria A. Santa-Gonzlez1, 3, Mauricio Camargo1, 2, 4

Resumen
La adaptacin es un importante mecanismo por el cual las clulas y los organismos responden a retos
ambientales y a cambiantes necesidades funcionales. Para lograrlo, las clulas integran cambios en el
fenotipo, actividad metablica, expresin gnica y funcin celular, que deben coordinarse adecuadamente
para mantener la viabilidad ante estmulos nocivos, como es el caso del reto ante un exceso de especies
reactivas de oxgeno (ROS). En este estudio, se evalu la hiptesis que pulsos crnicos y repetitivos con
perxido de hidrgeno (H2O2), pueden activar respuestas celulares que resultan en adaptacin a estrs
oxidativo. Para probar esto, se estableci un modelo in vitro, donde las clulas de origen mioblastoide C2C12,
fueron expuestas a 5 mU/ml de la enzima glucosa oxidasa que durante breves pulsos de 1 hora/da genera una
concentracin constante de 50 M de H2O2 en el medio. Este rgimen de tratamiento se extendi durante
7 das, tras los cuales se evaluaron los efectos sobre la morfologa y viabilidad celular, el contenido de ADN
mitocondrial, la acumulacin de ROS mitocondrial y la expresin de genes de defensa antioxidante. Los
resultados obtenidos apoyan la idea de que los estmulos prolongados, repetitivos y a bajas concentraciones
de ROS, pueden actuar como molculas de sealizacin induciendo procesos celulares que convergen en
la adaptacin al estrs oxidativo crnico.
Palabras clave: adaptacin, defensa antioxidante, estrs oxidativo crnico, homeostasis

Abstract
Adaptation is an important mechanism in cells and organisms that allow them to respond to environmental
challenges and changing functional demands. To accomplish these requirements, cells integrate modifications
at different levels such as gene expression, metabolic activity, cellular functionality and phenotype. The
orderly coordination of these changes is fundamental for cells to maintain viability despite a variety of
harmful stimuli, such as the case of exceedingly concentrations of reactive oxygen species (ROS). In this
study, we tested the hypothesis that chronic and repetitive stimuli with a mild concentration of hydrogen
peroxide (H2O2) would activate cellular responses, resulting in adaptation. This was done confronting cell
cultures to prolonged exposures of H2O2 obtained with glucose oxydase (GlucOx) added to the medium to
generate a constant concentration of the oxidant ( 50 M); this treatment protocol (1h/d) was extended
during seven continuous consecutive days after which the following parameters were evaluated: cell
morphology and viability, mitochondrial DNA content, mitochondrial ROS accumulation and antioxidant
defense gene expression. These data further support the idea that exposure to continuous and low
concentrations of ROS, could act as signaling molecules inducing cellular processes that converged toward
adaptation to chronic oxidative stress.
Key words: adaptation, antioxidant defense, chronic oxidative stress, homeostasis

Recibido: marzo 2015; aceptado: noviembre 2015.


1 Grupo Gentica, Regeneracin y Cncer, SIU-UdeA, Lab. # 432. Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medelln (Antioquia), Colombia.
2 Docente, Instituto de Biologa, Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medelln (Antioquia), Colombia.

Correos electrnicos: 3 <gloria.santa@udea.edu.co>; 4 <mauricio.camargo@udea.edu.co>.

71
Actual Biol Volumen 38 / Nmero 104, 2016 Santa-Gonzlez y Camargo

INTRODUCCIN mitgenos (MAPKs); los reguladores transcripcionales NF-B


(factor nuclear B) y activador transcripcional 1 (AP-1) (Hirota
Las especies reactivas de oxgeno (ROS) se producen et al. 1997, Ji et al. 2007, Zhang 2004); y el factor redox Ref-
continuamente como productos secundarios de ciertas vas 1 (Evans et al. 2000, Fritz et al. 2003). Estas vas operan
metablicas y por algunos sistemas especficos que estn en forma coordinada y son crticas para que las clulas de
bajo fino control celular como procesos patolgicos de mamfero afronten al estrs oxidativo.
inflamacin (Mittal et al. 2014, Pluskota-Karwatka 2008)
citoquinas, peroxisomas, xantina-oxidasa (XO), NADPH De otro lado, se sabe que los estmulos continuos a bajas
oxidasa (Holmstrom y Finkel 2014, Lemon et al. 2008) concentraciones de ROS, pueden inducir de manera directa
acetil-coA oxidasa y citocromos (DAutraux y Toledano la activacin/desactivacin enzimtica y cambios en los
2007, Ji et al. 2004); y simultneamente, las ROS son niveles de expresin gnica (Gomez-Cabrera et al. 2008,
degradadas a travs de varios mecanismos. Los procesos Luna-Lpez et al. 2013, Pickering et al. 2013, Radak et al.
de generacin y degradacin de ROS generalmente se 2005, Wiese et al. 1995). Este fenmeno est relacionado
encuentran bajo un control celular riguroso manteniendo con el concepto de hrmesis, caracterizado como una
las concentraciones en bajo nivel (< 10-8 M) (Boveris y particular relacin respuesta-a-dosis, la cual describe
Cadenas 2000, Chance et al. 1979, Lushchak 2011). que un fenmeno biolgico adverso puede llegar a ser
benfico cuando es aplicado en bajos niveles (Calabrese
La regulacin de los procesos celulares de produccin 2015, Yu 2004). En este contexto, los radicales libres de
y degradacin de ROS es crtica para la supervivencia, oxgeno pueden ser considerados como benficos a bajas
incluyendo sensores de especies reactivas, transduccin dosis (Calabrese y Baldwin 2003, Ji et al. 2006, Radak et
de seales y modulacin de la maquinaria de transcripcin al. 2008, 2005).
y traduccin. Varias evidencias indican que las ROS
son mensajeros importantes en vas de sealizacin que El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de
conducen a la adaptacin celular (Powers et al. 2010) y las clulas musculares para responder al estrs oxidativo
desempean un papel importante en la homeostasis redox inducido por la exposicin crnica y repetitiva a bajas
de diferentes procesos celulares como el crecimiento, la concentraciones de H2O2. Para ello, se estableci un
diferenciacin, la proliferacin y la apoptosis (Crawford y modelo in vitro, donde las clulas de origen mioblastoide
Davies 1994, Evans et al. 2003, Kefaloyianni et al. 2006, C2C12, fueron expuestas a 5 mU/ml de la enzima glucosa
Marinho et al. 2014) Sin embargo, la exposicin excesiva oxidasa (GlucOx) que durante breves pulsos de 1 hora/da
a ROS puede surgir como consecuencia de cambios en genera una concentracin de 50 M de H2O2 en el medio;
el ambiente celular, la exposicin a medicamentos o este rgimen de tratamiento se extendi durante siete das,
compuestos oxidantes, o la insuficiencia en los sistemas despus de los cuales se caracteriz la adaptacin celular.
de defensa antioxidante y conducir a un estado conocido
como estrs oxidativo, en el cual se produce dao a Los resultados del presente trabajo, evidencian que estmulos
macromolculas tales como ADN, ARN, protenas y lpidos crnicos repetitivos con H2O2 actan como molculas de
(Barzilai y Yamamoto 2004, Evans et al. 2003, Kumar et sealizacin en clulas de mamfero, induciendo procesos
al. 2005). celulares que incluyen: i) cambios morfolgicos; ii) aumento
del mtADN; y iii) modulacin en los patrones de expresin
Los sistemas de respuesta a estrs oxidativo se activan gnica. Esto resulta en un fenotipo de adaptacin al estrs
gradualmente y son dependientes del tipo celular, del que hace a la clula significativamente ms resistente a un
carcter espacio-temporal del estmulo, y del tipo y eventual reto oxidativo mayor.
concentracin de ROS (Bar-Shai et al. 2008, Crawford
y Davies 1994, Evans et al. 2003, Kefaloyianni et al.
2006, Lushchak 2011). Entre los principales mecanismos MATERIALES Y MTODOS
moleculares activados por las ROS estn los de defensa
antioxidante como las glutatin peroxidasas (GPx), las Cultivos celulares. Se emple la lnea celular de origen
peroxirredoxinas (TPX), las superxido dismutasas mioblastoide C2C12 (CRL-1772, ATCC), mantenida en
(SODs) y la catalasa (CAT); adems, se encuentran las medio DMEM suplementado con suero bovino fetal (SBF)
vas de sealizacin mediadas por Keap1/Nrf2 (Osburn al 5%, penicilina 100 g/ml y estreptomicina 100 g/ml,
y Kensler 2008) y las protenas quinasas activadas por e incubadas a 37 C en atmsfera hmeda y CO2 al 5%.

72
Santa-Gonzlez y Camargo Actual Biol 38 (104): 71-80, 2016 | DOI: 10.17533/udea.acbi.v38n104a07

Esquema de tratamientos. Para inducir la respuesta de (QIAcube System); el contenido relativo de mtADN se
adaptacin, se realizaron tratamientos pro-oxidantes de evalu por RT-PCR como se describe en Furda et al. (2012)
manera intermitente y repetitiva; para ello, cada 24 h se y Rooney et al. (2015).
adicion glucosa oxidasa (GlucOx, G6641, Sigma) 5 mU/
ml para generar una concentracin continua de 50 M de Deteccin de ROS mitocondrial. Para cuantificar
H2O2 en el medio. Este rgimen se mantuvo durante siete las ROS mitocondriales se emple el fluorocromo
das como se ilustra en la figura 1. MitoSOX Red (M36008T, Life Technologies). Despus
del tratamiento, se tomaron ~ 5 x 10 5 clulas y se
resuspendieron en PBS; luego se les adicion MitoSOX a
una concentracin final de 3 M por 30 min, seguido de 2
lavados con PBS para eliminar el exceso de fluorocromo.
Finalmente, se realizaron lecturas en citmetro de flujo
Coulter Epics XL.

Perfil de expresin gnica. Para evaluar los efectos a nivel


Figura 1. Esquema de tratamientos y mtodos para transcriptmico de la exposicin a largo plazo a H2O2, se
recoleccin de datos realiz un anlisis de microarreglos basados en RT-PCR.
Brevemente, se extrajo ARN total usando Qiagen RNeasy
Morfologa celular. Despus de los tratamientos, las Mini kit (74104, QIAGEN), el cADN se sintetiz mediante
clulas fueron sembradas en laminillas de vidrio estriles. transcripcin reversa con 250 ng de ARN total y oligo-dTs
Al da siguiente, fueron fijadas con paraformaldehdo con el RT2 first strand kit (330401, QIAGEN) siguiendo
en buffer sucrosa (PFA-CBS) al 4% por 5 minutos, las instrucciones del fabricante. Se emple el RT2 Profiler
posteriormente, se lavaron tres veces con PBS y se PCR Array Mouse Oxidative Stress and Antioxidant
montaron en portaobjetos con medio de montaje acuoso. Defense (PAMM-065Z, QIAGEN) para evaluar 84 genes
Las clulas fueron observadas y fotografiadas con aumento relacionados con defensa antioxidante, metabolismo de
de 128 X en estreo microscopio Olympus SZX16. ROS y transporte de oxgeno. El microarreglo se proces
de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se corri
Determinacin de tamao y granularidad medidos por en el termociclador BioRad C1000 con el sistema de
citometra de flujo. Terminados los siete das de tratamiento deteccin CFX96. Los cambios relativos en la expresin
pro-oxidante crnico, las clulas fueron fijadas con etanol gnica se calcularon por el mtodo Ct normalizado para
fro al 70%, y posteriormente, incubadas con 100 g/ml de los genes constitutivos incluidos en el microarreglo. Los
RNasa (Sigma, R5000), marcadas con 100 g/ml de yoduro datos se analizaron con el software SABiosciences PCR
de propidio (Sigma, P4170) y analizadas por citometra array data analysis.
de flujo (Coulter Epics XL). Empleando los parmetros
forward scatter (FSC) y side scatter (SSC) se determin Anlisis estadstico. Todos los datos obtenidos
el tamao y granularidad relativos de las clulas. representan los resultados de dos o tres experimentos
independientes por grupo de tratamiento. Las pruebas
Determinacin de viabilidad celular por citometra t-Student y los anlisis de varianza (ANOVA) se
de flujo. Para determinar el efecto del tratamiento realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los
crnico con H2O2 sobre la viabilidad celular se emple valores p < 0,05 se consideraron como estadsticamente
anexina V:PE Apoptosis Detection Kit I (559763, BD significativos. Las barras de error representan el error
Pharmingen) siguiendo las indicaciones del fabricante. estndar de la media (SEM).
Brevemente, 1 x 106 clulas se resuspendieron en buffer
de unin, y posteriormente, se adicionaron 5 l de
anexina V y 5 l de 7-aminoactinomicina D (7-AAD). RESULTADOS
Tras incubacin durante 30 minutos a temperatura
ambiente, las clulas se analizaron por citometra de Tratamiento pro-oxidante crnico induce cambios en
flujo (Coulter Epics XL). la morfologa celular. La figura 2 muestra la morfologa
comparativa de las clulas control y las clulas expuestas
Contenido de ADN mitocondrial. El ADN genmico se a estmulos crnicos continuos con 50 M de H2O2. En la
extrajo y cuantific usando un procedimiento automatizado figura 2A se muestra una fotografa representativa del anlisis

73
Actual Biol Volumen 38 / Nmero 104, 2016 Santa-Gonzlez y Camargo

realizado por estereomicroscopa, donde se observa que los Aumento del contenido relativo de ADN mitocondrial
mioblastos no tratados estn alargados, con forma fusiforme y disminucin de la acumulacin de ROS mitocondrial
y ampliamente extendidos sobre la superficie de crecimiento; despus del estmulo pro-oxidante. La mitocondria es
las clulas redondas y ligeramente adheridas al sustrato son una de las organelas ms sensibles a agentes oxidantes;
mitticas. La figura 2A tambin evidencia que despus de por ello se evalu si el tratamiento crnico poda alterar
la exposicin crnica a H2O2 se observan varios cambios su capacidad de replicacin del ADN y los sistemas de
morfolgicos: un importante porcentaje de la poblacin detoxificacin de ROS. La figura 4 muestra que 50 M
celular tiene forma redondeada pero conserva la adherencia de H2O2 durante siete das contribuye significativamente
a la superficie de crecimiento, no se pierde el contacto entre al aumento de copias de mtADN (p < 0,0001), mientras
las clulas y hay crecimiento en monocapa; aparentemente que la concentracin de ROS se ve reducida respecto a las
no hay lesiones en la membrana celular ni formacin de clulas no tratadas (p = 0,1704).
vacuolas. Esto mismo pudo determinarse a travs de anlisis
por citometra de flujo, donde se observa que el tamao de Expresin diferencial de genes asociados con la respuesta
las clulas con tratamiento oxidativo es significativamente a estrs oxidativo. Para determinar si el tratamiento
mayor comparado con las clulas no tratadas (p = 0,009, figura pro-oxidante empleado, induce cambios en el patrn de
2B); adicionalmente, tambin hay una importante tendencia expresin de genes de respuesta a estrs, se evaluaron 84
hacia el aumento de la complejidad celular en clulas con genes antioxidantes y relacionados con el metabolismo y
tratamiento pro-oxidante repetitivo (p = 0,0713, figura 2C). transporte del oxgeno, a travs de microarreglos basados en
RT-PCR. Se calcularon los valores Ct para todos los genes,
Estmulos continuos con H2O2 afectan la viabilidad y posteriormente, se determin el nivel de expresin relativo
celular. Para cuantificar la exposicin de fosfatidilserina al de las clulas no tratadas.
y el dao de la membrana citoplasmtica como indicativo
de apoptosis, las clulas se analizaron mediante el uso Los resultados obtenidos para RT2 Profiler PCR Array Mouse
de anexina V y 7-AAD. La figura 3A muestra que el Oxidative Stress and Antioxidant Defense muestran que al
tratamiento crnico con 50 M de H2O2 aumenta el final del protocolo de tratamiento pro-oxidante crnico hay
porcentaje de clulas positivas para anexina V (Q2 y Q3), expresin diferencial de diez genes; ocho fueron regulados
lo que podra representar un aumento de clulas apoptticas positivamente (nivel de expresin > 1,5) y dos fueron regulados
respecto al control (p = 0,0103; figura 3B). negativamente (nivel de expresin < 0,5) (figura 5, tabla 1).

Tabla 1. Genes expresados diferencialmente en clulas C2C12 despus de exposicin crnica a H2O2. En esta se
presenta los genes que mostraron expresin diferencial significativa (p < 0,05) entre clulas control y clulas tratadas
crnicamente con 50 M de H2O2. Nivel de expresin (N ex) de los genes en negrilla la expresin relativa mayor a 1,5;
y en cursiva los que mostraron expresin menor a 0,5.Los valores p fueron calculados a travs de ANOVA de una va
(Ref seq = referencia de secuencias)

Smbolo Ref seq N ex Definicin


Apoe NM_009696 1,9 Apolipoprotena E
Atr NM_019864 4,0 Ataxia telangiectasia y rad3 relacionados
Ccl5 NM_013653 0,2 Quimiocina (motivo CC) ligando 5
Gpx3 NM_008161 0,2 Glutatin peroxidasa 3
Nos2 NM_010927 1,7 xido ntrico sintetasa 2, inducible
Psmb5 NM_011186 2,0 Subunidad beta 5 del proteasoma
Slc38a1 NM_134086 1,6 Familia de transportadores de solutos 38, miembro 1
Sod2 NM_013671 1,7 Superxido dismutasa 2, mitocondrial
Txn1 NM_011660 2,7 Tiorredoxina 1
Vim NM_011701 1,7 Vimentina

74
Santa-Gonzlez y Camargo Actual Biol 38 (104): 71-80, 2016 | DOI: 10.17533/udea.acbi.v38n104a07

Figura 2. Caracterizacin morfolgica de los mioblastos C2C12 despus del tratamiento pro-oxidante crnico. A.
observacin directa por estereomicroscopa; B. Medicin del tamao celular representado en histograma y con la media
de la intensidad de la seal detectada por el parmetro forward scatter (FSC) del citmetro de flujo; C. Medicin de la
granularidad celular representado en histograma y con la media de la intensidad de la seal detectada por el parmetro
side scatter (SSC) del citmetro de flujo (los datos se presentan como media SEM de tres repeticiones biolgicas
independientes; ** = diferencia significativa con p < 0,01; ns = diferencia estadstica no significativa)

75
Actual Biol Volumen 38 / Nmero 104, 2016 Santa-Gonzlez y Camargo

Figura 4. Tratamiento con H2O2 altera la dinmica


mitocondrial. A. Cantidad relativa de mtADN; B.
Cuantificacin de especies reactivas de oxgeno (ROS)
mitocondrial [* = indica diferencia significativa (p <
0,05) entre tratamientos; los valores se expresan como
media SEM]

Figura 3. Tratamiento con H2O2 afecta la viabilidad de


las clulas C2C12. A. Dot-plot comparativo de clulas Figura 5. Niveles de expresin de los genes inducidos en
no tratadas versus tratadas; B. Cuantificacin de las clulas C2C12 despus del proceso de adaptacin (los
clulas apoptticas [* = indica diferencia significativa datos son expresados como niveles de expresin relativa
(p < 0,05) entre tratamientos; los valores se expresan al control SEM. La lnea punteada muestra el nivel de
como media SEM] expresin basal)

76
Santa-Gonzlez y Camargo Actual Biol 38 (104): 71-80, 2016 | DOI: 10.17533/udea.acbi.v38n104a07

DISCUSIN de respuesta inicial benfica para minimizar el estrs, pero


que al persistir en el tiempo puede desencadenar en muerte
Las adaptaciones celulares son respuestas funcionales celular por apoptosis (Jain et al. 2015, Sabri et al. 2003).
y estructurales reversibles ante situaciones de estrs
fisiolgico y algunos estmulos patolgicos. Estas Para determinar el efecto del estmulo oxidativo sobre la
respuestas, permiten alcanzar nuevos estados de equilibrio viabilidad, se emple la doble marcacin con anexina V y
que permiten a las clulas sobrevivir y seguir funcionando 7-AAD; la figura 3 muestra que con relacin a las clulas
(Kumar et al. 2005). Uno de los desafos que afronta la control, el tratamiento pro-oxidante crnico indujo un
clula constantemente es la acumulacin de ROS como aumento de la poblacin positiva para anexina V (7,8
consecuencia de exposicin a sustancias qumicas, versus 14,08%, p = 0,0103). La muerte celular inducida
radiacin, metabolismo y envejecimiento celular. De hecho, por ROS se ha asociado principalmente a necrosis, pero
cuando aumenta la produccin de ROS o los sistemas se ha evidenciado que tambin pueden iniciar apoptosis a
antioxidantes son ineficientes, se pueden inducir lesiones travs de una compleja red de mecanismos que involucran
celulares relacionadas con mltiples procesos patolgicos, dao mitocondrial, alteracin en la homeostasis del calcio
incluidos el cncer, el envejecimiento y algunos procesos y dao en el ADN (Kupsco y Schlenk 2015). Aunque los
degenerativos como el Alzheimer (Marteijn et al. 2014, datos obtenidos indican que la viabilidad de las clulas
Matsumura et al. 2015, Muoz-Espn y Serrano 2014). fue afectada durante el perodo de pre-condicionamiento,
resultados recientes muestran que despus de la exposicin
La clula solo puede disponer de un rango limitado de crnica a 50 M de H2O2, el tratamiento agudo con
funciones y estructuras para hacer frente a una situacin 1 mM de H2O2 no causa efectos deletreos como los
de estrs oxidativo; sin embargo, si el estmulo nocivo inducidos en clulas sin adaptar, lo que implica que si las
es crnico y repetitivo, la clula se puede adaptar a las clulas no entran en apoptosis al final del proceso de pre-
necesidades fisiolgicas para mantener el equilibrio redox condicionamiento, adquieren ventajas para contrarrestar
(Kumar et al. 2005). Este estudio muestra evidencia sobre subsiguientes dosis agudas (Orozco et al. 2010).
las exposiciones crnicas con bajas concentraciones de
ROS que pueden inducir respuestas celulares, alterando Como las mitocondrias son un blanco importante de
la estructura celular y la expresin de genes nucleares las ROS y su funcionamiento normal es crucial para el
especficos, para mantener la homeostasis y rescatar a las mantenimiento de la homeostasis celular, se investig si
clulas del estrs. durante el proceso de adaptacin, estas organelas sufren
algn tipo de alteracin en relacin a su proliferacin
Para establecer el modelo de adaptacin a estrs y acumulacin de ROS. La figura 4 muestra que el
oxidativo se emplearon las clulas C2C12, precursoras tratamiento crnico con bajas concentraciones de H2O2
de fibras de miocardio, capaces de adaptarse a fuertes induce un aumento en el nmero de copias del mtADN, lo
desequilibrios en el estado redox, y que representan un cual se ha comunicado como un evento molecular temprano
sistema experimental ideal para estudiar mecanismos ligado al estrs oxidativo, y asociado a la protena Parkin
activados durante la respuesta a estrs. Las clulas C2C12 que interacta con el mtADN y preserva la integridad del
poseen morfologa mioblastoide caracterstica de clulas genoma en respuesta al aumento de los niveles de ROS;
musculares, crecimiento en monocapa (figura 2A) y tienen adems, promueve la biognesis mitocondrial a travs de
una duracin de ciclo celular normal para clulas de su asociacin con el factor de transcripcin mitocondrial
mamfero; sin embargo, despus del tratamiento crnico A (TFAM) potenciando su actividad (Lee y Wei 2005,
con H2O2, se evidencia un cambio en el tamao, forma Palikaras y Tavernarakis 2014).
y granularidad de las clulas (figuras 2B y 2C). Uno de
los mecanismos propuestos como reguladores en esta En un modelo de adaptacin a estrs oxidativo, las clulas
respuesta, involucra la estimulacin de H2O2 a factores cambian su actividad metablica y activan vas requeridas
de crecimiento como VEGF y la subsecuente activacin para combatir las ROS; por tanto, se espera que para lograr
de las vas MAPK/ERK y PI3K que regulan la funcin un nuevo estado de equilibrio se alteren los perfiles de
y expresin de genes relacionados con el crecimiento y expresin gnica. Esta idea se evidenci con los resultados
supervivencia celular (Cai 2005, Gough y Cotter 2011). obtenidos en los microarreglos basados en RT-PCR, en
Las observaciones de este estudio, muestran aumento los que se obtuvo cambio en el perfil de expresin de diez
en el tamao celular, posiblemente relacionado con una genes implicados en diferentes mecanismos celulares de
hipertrofia compensatoria que se origina como mecanismo respuesta a estrs oxidativo (tabla 1) y correlacionados con

77
Actual Biol Volumen 38 / Nmero 104, 2016 Santa-Gonzlez y Camargo

otros resultados obtenidos en este estudio. De un lado, se de la exposicin crnica y repetitiva a H2O2 se vio aumento
observ aumento en los niveles de expresin del gen Vim, de dos veces en la expresin de Psmb5, el gen que codifica
que codifica para una protena integrante de los filamentos para la subunidad 5 del complejo proteosomal 20S; esto
intermedios, responsable del mantenimiento de la forma de demuestra un potenciamiento de la actividad del proteosoma
la clula, la integridad del citoplasma y la estabilidad de las en la respuesta adaptativa a estrs oxidativo.
conexiones del citoesqueleto. Esta alteracin en su perfil
de expresin concuerda con las observaciones del cambio La lesiones oxidativas en el ADN son otra de las consecuencias
morfolgico de las clulas despus del tratamiento pro- del aumento en las ROS; la protena ATR es una de las
oxidante crnico. Por otro lado, se observ aumento en la molculas censoras que participa en el reconocimiento del
expresin del gen Sod2 que codifica para la manganeso dao y transmite la seal a molculas efectoras que activan
superxido dismutasa mitocondrial, una de las principales los puntos de control del ciclo celular y las vas de reparacin
enzimas de defensa antioxidante de las clulas de del ADN; o en ciertos contextos, inducen muerte celular
mamfero, que cataliza la conversin del O2- mitocondrial por apoptosis (Barzilai y Yamamoto 2004, Nam y Cortez
a H2O2 para luego ser transformado en agua por la Gpx4 2011). Los resultados muestran que el tratamiento crnico
(Lee y Wei 2005). Los datos de RT-PCR obtenidos en este con H2O2 induce aumento de cuatro veces en la expresin
estudio tambin muestran incremento de 1,7 X en el nivel de Atr, lo que sugiere que esta protena contribuye de manera
de expresin de Sod2, y aumento de 1,5 X para Gpx4; estos significativa con la respuesta adaptativa funcional que
resultados se correlacionan con la disminucin de las ROS protege a las clulas de muerte celular por daos oxidativos
mitocondriales reportadas en la figura 3B. Adicionalmente, en el ADN. Asimismo, en el anlisis se identific la sobre-
el aumento en el nivel de expresin en Nos2 sugiere que expresin de Apoe y Slc38a1 que han sido relacionados con
la exposicin crnica a H2O2 est relacionada con la el metabolismo energtico y el mantenimiento del balance
sobrerregulacin de la xido ntrico sintetasa inducible entre oxidantes y antioxidantes.
(iNOS) y posiblemente a la subsecuente potenciacin de la
produccin de xido ntrico (NO), el cual ha sido registrado Finalmente, se encontraron genes con bajos niveles de
como un agente protector frente a la toxicidad del H2O2 expresin (< 0,5) como Ccl5 (Rantes) que codifica para
(Phoa y Epe 2002, Wink et al. 1995). una quimiocina importante en lesiones causados por
isquemia-reperfusion y es secretada por varios tipos
Uno de los genes que mostr mayor aumento en los niveles celulares, incluyendo clulas musculares. Un estudio
de expresin fue Txn1. La tiorredoxina codificada por reciente demostr que su inhibicin con molculas
este gen, desempea un papel crtico en la sealizacin antagonistas, ejerce efectos cardioprotectores durante
redox. Su funcin principal es actuar como antioxidante, la reperfusin temprana a travs de propiedades anti-
manteniendo el estado reducido de diversos factores de inflamatorias y antioxidantes (Braunersreuther et al.
transcripcin como NF-kB y NRF2, ambos involucrados en 2010). Aunque no hay evidencias experimentales sobre
la modulacin transcripcional de varios genes implicados la regulacin negativa de la expresin de este gen ante
en la detoxificacin de ROS (Marinho et al. 2014). De est situaciones de estrs oxidativo, los hallazgos registrados
manera, la regulacin positiva en la expresin de Txn1 en en este estudio, podran ser una evidencia importante sobre
respuesta al tratamiento pro-oxidante crnico, indica que los mecanismos de adaptacin en respuesta al estmulo
la protena es un importante mediador en las cascadas crnico, como reguladores negativos de la transcripcin
de sealizacin redox que permiten la activacin de los de Ccl5, lo que representara ventaja en la reduccin de
mecanismos celulares de adaptacin a ROS. las lesiones provocadas por reperfusin; as que el papel
fisiolgico de Rantes en el proceso de adaptacin, debe
Aunque las enzimas antioxidantes funcionan como scavengers ser examinado en futuros estudios. El otro gen que mostr
de ROS, si la concentracin intracelular de especies oxidantes disminucin en el nivel de expresin fue Gpx3, cuyo
es muy alta y se supera el balance redox, se pueden generar producto proteico es sintetizado principalmente en rin
daos a los componentes celulares, incluyendo protenas y secretado en plasma para neutralizar el H2O2 (Burk
y el ADN. Cuando esto ocurre, se activan diferentes vas at al. 2011, Takahashi y Cohen 1986). En este caso, la
de rescate, una de ellas es el aumento de la actividad del regulacin negativa despus del tratamiento pro-oxidativo
proteosoma, encargado de remover de manera selectiva las posiblemente est relacionada con su funcin sistmica
protenas oxidadas, evitando su agregacin y reticulacin, in vivo, sobre la cual no es factible discutir ampliamente
as como la toxicidad celular a la que daran lugar (Radak et dado el modelo in vitro de cultivos celulares empleado en
al. 2002). En el anlisis transcriptmico realizado despus esta investigacin.

78
Santa-Gonzlez y Camargo Actual Biol 38 (104): 71-80, 2016 | DOI: 10.17533/udea.acbi.v38n104a07

En resumen, los datos obtenidos indican que la exposicin Chance B, Sies H, Boveris A. 1979. Hydroperoxide metabolism in
crnica a H2O2 induce una respuesta altamente dinmica que mammalian organs. Physiological Reviews, 59: 527-605.
permite alcanzar un estado de adaptacin celular, que implica Crawford DR, Davies KJ. 1994. Adaptive response and oxidative stress.
cambios morfolgicos, funcionales y de expresin gnica, y Environmental Health Perspectives, 102 (Suppl 10): 25-28.
cuyo principal beneficio fisiolgico sera proteger las clulas DAutraux B, Toledano MB. 2007. ROS as signalling molecules:
mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature
frente a una subsiguiente dosis aguda o letal de ROS.
Reviews Molecular Cell Biology, 8: 813-824.
Evans AR, Limp-Foster M, Kelley MR. 2000. Going APE over ref-1.
Mutation Research, 461: 83-108.
AGRADECIMIENTOS
Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. 2003. Are oxidative
stress-activated signaling pathways mediators of insulin resistance
Este estudio fue financiado por la Estrategia para la and beta-cell dysfunction? Diabetes, 52: 1-8.
Sostenibilidad 2013-2014, Universidad de Antioquia, y Fritz G, Grsch S, Tomicic M, Kaina B. 2003. APE/Ref-1 and the
la Fundacin para la Promocin de la Investigacin y la mammalian response to genotoxic stress. Toxicology, 193: 67-78.
Tecnologa, Banco de la Repblica. Los autores quieren Furda AM, Bess AS, Meyer JN, Van Houten B. 2012. DNA Repair
agradecer al laboratorio de Joel Meyer de Duke University Protocols. Methods in Molecular Biology, 920: 111-132.
por el apoyo proporcionado en los experimentos de Gomez-Cabrera MC, Domenech E, Via J. 2008. Moderate exercise
cuantificacin de mtADN; al Grupo de Investigacin e is an antioxidant: upregulation of antioxidant genes by training.
Innovacin Biomdica del ITM y a Diego Fernando Uribe Free Radical Biology and Medicine, 44: 126-131.
y Andrea Gmez por la asistencia tcnica en RT-PCR; y a Gough DR, Cotter TG. 2011. Hydrogen peroxide: a Jekyll and Hyde
Melisa Hincapi y Antea Delgado por su colaboracin con el signalling molecule. Cell Death and Disease, 2, e213. Doi:
montaje de muestras, toma de imgenes para la descripcin 10.1038/cddis.2011.96
de la morfologa celular y los ensayos de viabilidad. Hirota K, Matsui M, Iwata S, Nishiyama A, Mori K, Yodoi J. 1997.
AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association
between thioredoxin and Ref-1. Proceedings of the National
REFERENCIAS Academy of Sciences of the United States of America, 94:
3633-3638.
Bar-Shai M, Carmeli E, Ljubuncic P, Reznick AZ. 2008. Exercise and Holmstrom KM, Finkel T. 2014. Cellular mechanisms and physiological
immobilization in aging animals: the involvement of oxidative consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews
stress and NF-kappaB activation. Free Radical Biology and Molecular Cell Biology, 15: 411-421.
Medicine, 44: 202-214. Jain A, Atale N, Kohli S, Bhattacharya S, Sharma M, Rani V. 2015. An
Barzilai A, Yamamoto KI. 2004. DNA damage responses to oxidative assessment of norepinephrine mediated hypertrophy to apoptosis
stress. DNA Repair, 3: 1109-1115. transition in cardiac cells: A signal for cell death. Chemico-
Boveris A, Cadenas E. 2000. Mitochondrial production of hydrogen Biological Interactions, 225: 54-62.
peroxide regulation by nitric oxide and the role of ubisemiquinone. Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Steinhafel N, Via J. 2004. Acute exercise
International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life, activates nuclear factor (NF)-kappaB signaling pathway in rat
50: 245-250. skeletal muscle. Journal of the Federation of American Societies
Braunersreuther V, Pellieux C, Pelli G, Burger F, Steffens S, Montessuit for Experimental Biology, 18: 1499-1506.
C, Weber C, Proudfoot A, Mach F, Arnaud C. 2010. Chemokine Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Via J. 2006. Exercise and hormesis:
CCL5/RANTES inhibition reduces myocardial reperfusion activation of cellular antioxidant signaling pathway. Annals of
injury in atherosclerotic mice. Journal of Molecular and Cellular the New York Academy of Sciences, 1067: 425-435.
Cardiology, 48: 789-798. Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Via J. 2007. Role of nuclear factor kappaB
Burk RF, Olson GE, Winfrey VP, Hill KE, Yin D. 2011. Glutathione and mitogen-activated protein kinase signaling in exercise-
peroxidase-3 produced by the kidney binds to a population of induced antioxidant enzyme adaptation. Applied Physiology,
basement membranes in the gastrointestinal tract and in other Nutrition, and Metabolism, 32: 930-935.
tissues. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Kefaloyianni E, Gaitanaki C, Beis I. 2006. ERK1/2 and p38-MAPK
Liver Physiology, 301 (1): G32-38. signalling pathways, through MSK1, are involved in NF-kappaB
Cai H. 2005. Hydrogen peroxide regulation of endothelial function: transactivation during oxidative stress in skeletal myoblasts.
Origins, mechanisms, and consequences. Cardiovascular Cellular Signalling, 18: 2238-2251.
Research, 68: 26-36. Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Aster JC. 2005. Respuestas celulares
Calabrese EJ. 2015. Hormesis: principles and applications. Homeopathy, ante el estrs y las agresiones por txicos: adaptacin, lesin y
104: 69-82. muerte. En: Mitchell RN, editor. Robbins y Cotran. Patologa
Calabre EJ, Baldwin LA. 2003. Hormesis: the dose-response revolution. estructural y funcional. 7a. ed. Espaa: Elsevier. p. 3-42.
Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 43: 175-197.

79
Actual Biol Volumen 38 / Nmero 104, 2016 Santa-Gonzlez y Camargo

Kupsco A, Schlenk D. 2015. Chapter One: Oxidative stress, unfolded Phoa N, Epe B. 2002. Influence of nitric oxide on the generation
protein response, and apoptosis in developmental toxicity. En: and repair of oxidative DNA damage in mammalian cells.
Jeon KW, editor. International review of cell and molecular Carcinogenesis, 23: 469-475.
biology. San Diego: Academic Press. p. 1-66. Pickering AM, Vojtovich L, Tower J, Davies KJ. 2013. Oxidative stress
Lee HC, Wei YH. 2005. Mitochondrial biogenesis and mitochondrial adaptation with acute, chronic, and repeated stress. Free Radical
DNA maintenance of mammalian cells under oxidative stress. The Biology and Medicine, 55: 109-118.
International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 37: 822-834. Pluskota-Karwatka D. 2008. Modifications of nucleosides by
Lemon JA, Rollo CD, Boreham DR. 2008. Elevated DNA damage in endogenous mutagens-DNA adducts arising from cellular
a mouse model of oxidative stress: impacts of ionizing radiation processes. Bioorganic Chemistry, 36: 198-213.
and a protective dietary supplement. Mutagenesis, 23: 473-482. Powers SK, Duarte J, Kavazis AN, Talbert EE. 2010. Reactive oxygen
Luna-Lpez A, Gonzlez-Puertos VY, Romero-Ontiveros J, Ventura- species are signalling molecules for skeletal muscle adaptation.
Gallegos JL, Zentella A, Gomez-Quiroz LE, Knigsberg M. Experimental Physiology, 95: 1-9.
2013. A noncanonical NF-B pathway through the p50 subunit Radak Z, Naito H, Kaneko T, Tahara S, Nakamoto H, Takahashi R,
regulates Bcl-2 overexpression during an oxidative-conditioning Cardozo-Pelaez F, Goto S. 2002. Exercise training decreases
hormesis response. Free Radical Biology and Medicine, 63: 41-50. DNA damage and increases DNA repair and resistance against
Lushchak VI. 2011. Adaptive response to oxidative stress: Bacteria, oxidative stress of proteins in aged rat skeletal muscle. Pflgers
fungi, plants and animals. Comparative biochemistry and Archiv European Journal of Physiology, 445, 273-278.
physiology. Toxicology and Pharmacology: CBP, 153: 175-190. Radak Z, Chung HY, Goto S. 2005. Exercise and hormesis: oxidative stress-
Marinho HS, Real C, Cyrne L, Soares H, Antunes F. 2014. Hydrogen related adaptation for successful aging. Biogerontology, 6: 71-75.
peroxide sensing, signaling and regulation of transcription factors. Radak Z, Chung HY, Goto S. 2008. Systemic adaptation to oxidative
Redox Biology, 2: 535-562. challenge induced by regular exercise. Free Radical Biology and
Marteijn JA, Lans H, Vermeulen W, Hoeijmakers JH. 2014. Medicine, 44: 153-159.
Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer Rooney JP, Ryde IT, Sanders LH, Howlett EH, Colton MD, Germ
and ageing. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 15: 465-481. KE, Mayer GD, Greenamyre JT, Meyer JN. 2015. PCR based
Matsumura A, Emoto MC, Suzuki S, Iwahara N, Hisahara S, Kawamata determination of mitochondrial DNA copy number in multiple
J, Suzuki H, Yamauchi A, Sato-Akaba H, Fujii HG, Shimohama species. Methods in Molecular Biology, 1241: 23-38.
S. 2015. Evaluation of oxidative stress in the brain of a transgenic Sabri A, Hughie HH, Lucchesi PA. 2003. Regulation of hypertrophic
mouse model of Alzheimers disease by in vivo electron and apoptotic signaling pathways by reactive oxygen species in
paramagnetic resonance imaging. Free Radical Biology and cardiac myocytes. Antioxidants and Redox Signaling, 5: 731-740.
Medicine, 85: 165-73. Doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.04.013 Takahashi K, Cohen HJ. 1986. Selenium-dependent glutathione
Mittal M, Siddiqui MR, Tran K, Reddy SP, Malik AB. 2014. Reactive peroxidase protein and activity: Immunological investigations
oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants on cellular and plasma enzymes. Blood, 68: 640-645.
and Redox Signaling, 20: 1126-1167. Wiese AG, Pacifici RE, Davies KJ. 1995. Transient adaptation of
Muoz-Espn D, Serrano M. 2014. Cellular senescence: from physiology oxidative stress in mammalian cells. Archives of Biochemistry
to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 15: 482-496. and Biophysics, 318: 231-240.
Nam E, Cortez D. 2011. ATR signalling: more than meeting at the fork. Wink DA, Cook JA, Pacelli R, Liebmann J, Mitchell JB, Murali C. 1995.
Biochemical Journal, 436, 527-36. Nitric oxide (NO) protects against cellular damage by reactive
Orozco E, Santa G, Camargo M. 2010. NAC and L-Carnitine antioxidant oxygen species. Toxicology Letters, 82/83: 221-226.
action in a chronic oxidative stress model in C2C12 myoblast cell Yu BP. 2004. Hormesis and intervention of aging. Geriatrics and
line. Revista de la Asocacin Colombiana de Ciencias Biologicas, Gerontology International, 4: S81-S83.
22: 31-54. Zhang Y. 2004. Reactive Oxygen Species (ROS), troublemakers between
Osburn WO, Kensler TW. 2008. Nrf2 signaling: an adaptive response Nuclear Factor-B (NF- B) and c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK).
pathway for protection against environmental toxic insults. Cancer Research, 64: 1902-1905.
Mutation Research, 659: 31-39.
Palikaras K, Tavernarakis N. 2014. Mitochondrial homeostasis: The
interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis.
Experimental Gerontology, 56: 182-188.

80

You might also like