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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

EFECTO DEL pH Y LA CONCENTRACIN EN LA INTENSIDAD


DE FLUORESCENCIA DE RIBOFLAVINA
EFECTO DEL pH Y LA CONCENTRACIN EN LA INTENSIDAD
DE FLUORESCENCIA DE RIBOFLAVINA

RESULTADOS

Tabla 1. Resultados de la curva de calibracin de Riboflavina en diferentes solventes.

Intensidad de Intensidad de Intensidad de Intensidad de


Riboflavina
fluorescencia en fluorescencia en HCl fluorescencia en fluorescencia en
(ppm)
H2O 0.1 M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M
0.0 4.98 4.97 4.96 4.96
1.0 6.10 5.13 5.52 15.27*
2.0 6.82 5.30 6.01 4.98
3.0 8.02 5.46 6.50 4.99
4.0 8.96 5.59 6.93 5.01
5.0 9.79 5.47 7.63 5.01
10.0 13.30 6.23 9.54 5.05
50.0 17.92 7.08 15.92 5.10
pH 5 1 4 13

Tabla 2. Resultados de la curva de calibracin de Riboflavina en diferentes solventes,


expresados como la diferencia de la intensidad de fluorescencia de cada una de las
concentraciones de riboflavina menos el valor del blanco de reactivos.

Intensidad de Intensidad de Intensidad de Intensidad de


Riboflavina
fluorescencia en fluorescencia en HCl fluorescencia en fluorescencia en
(ppm)
H2O 0.1 M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M
0.0 4.98 4.97 4.96 4.96
1.0 1.12 0.16 0.56 10.31*
2.0 1.84 0.33 1.05 0.020
3.0 3.04 0.49 1.54 0.03
4.0 3.98 0.62 1.97 0.05
5.0 4.81 0.50 2.67 0.05
10.0 8.32 1.26 4.58 0.09
50.0 12.94 2.11 10.96 0.14
pH 5 1 4 13

GRAFICOS
5
U n id a d e s d e flu o r e s c e n c ia

0
0 1 2 3 4 5
R iv o f la v in a (p p m )

A g u a D e s io n iz a d a H C l 0 .1 M

c . A c tic o 0 .9 M N a O H 0 .1 M

F ig u r a 1 . D e te r m in a c i n d e l e fe c to d e d ife r e n te s d is o lv e n te s s o b r e la
in te n s id a d d e flu o re s c e n c ia e n R iv o fla v in a .

2
14

12
U n id a d e s d e flu o r e s c e n c ia

10

0
0 10 20 30 40 50
(p p m )
A g u a D e s io n iz a d a H C l 0 .1 M

c . A c tic o 0 .9 M N a O H 0 .1 M

F ig u r a 2 . D e te rm in a c i n d e l e fe c to d e la c o n c e n tr a c i n d e la R ib o fla v in a e n la
in te n s id a d d e s u flu o r e s c e n c ia .

DISCUSIN

El fluormetro de filtros que utilizamos maneja dos monocromadores que son filtros que son
utilizados para aislar la luz incidente y la luz fluorescente, seleccionar dos diferentes tipos de
longitudes de onda. Los filtros utilizados fueron para la excitacin fue de 425 nm y para la emisin
540 nm, como se conoce el de emisin es ms grande que el de excitacin, esto es debido a
procesos de relajacin no radiante.

En general, la riboflavina presenta un estado electrnico basal (un estado de baja energa) de inters,
y un estado electrnico excitado de mayor energa. Dentro de cada uno de estos estados electrnicos
hay diferentes estados vibracionales. En el fluormetro, primero se excito la muestra mediante la
absorcin de fotnes de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados
vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas causan que la
molcula excitada pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado vibracional ms bajo del
estado electrnico excitado. La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de
vibracin del estado electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas
pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones
emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias que se pueden medir como una
intensidad de emisin (fluorescencia). Segn las fuentes bibliogrficas la riboflavina presenta una
intensidad de fluorescencia a 540 nm y una existacion 445 nm. Por ello se utiliz una lmpara de luz
ultravioleta con una emisin de onda de 540 nm y un filtro que capta la radiacin emitida a 420nm
en el fluormetro.

Se puede decir que la riboflavina es muy inestable a diferente pH debido a que cuando se tiene en
agua su fluorescencia es la esperada y sin en cambio con los otros disolventes un cido y un lcali,
a pesar de tener la misma concentracin en todas las soluciones las lecturas fueron distintas. En el
lcali pierde completamente su fluorescencia porque las lecturas son muy similares al blanco, y con
el cido se va incrementando la fluorescencia conforme aumenta la concentracin pero como se
observa en la grfica es mucho menor que cuando est en presencia de agua destilada. En agua
destilada se observa una curva tipo caracterstica donde aumenta la concentracin de riboflavina,
aumenta la intensidad de fluorescencia.

3
En la lnea de H2O se muestra un claro aumento proporcional de la concentracin con el efecto de
la fluorescencia. En la lnea de HCl se muestra que la concentracin y el efecto de la fluorescencia
casi no se notan debido a que los protones y los iones hidroxilo impiden la fluorescencia. En la lnea
del CH3COOH se muestra un comportamiento parecido al del agua pero con un poco de variacin
en la concentracin respecto a la cantidad emitida de fluorescencia. El pH ms idneo para el efecto
de fluorescencia es el neutro ya que al estar neutra la solucin la deslocalizacin del compuesto se
lleva acabo de manera total entre ms nos acercamos a este pH se mostrara un mayor ndice la
proporcionalidad de la concentracin respecto a la fluorescencia.

CONCLUSIONES

La riboflavina es inestable a pH cido y lcali, mantiene su fluorescencia a pH neutro agua


destilada.
El comportamiento de la riboflavina respecto la concentracin sigue le ley de Bouger y Beer.
El pH ptimo de la riboflavina en cuanto a la emisin de fluorescencia es a pH de entre 4 y
5.5
El pH ms idneo para la fluorescencia es el neutro (pH=7).
Los protones y iones hidroxilo impiden la fluorescencia.
La concentracin es directamente proporcional a la fluorescencia.

PREGUNTAS EXTRA

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrofluorimetria.pdf
http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/67111
1d-archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF
http://nutricionalas6.blogspot.mx/2014/03/riboflavina-o-vitamina-b2-la-
vitamina.html
http://www.ubiobio.cl/miweb/webfile/media/194/v/v18-2/06.pdf