ELABORACIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN

PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES.

MTODO DE MILLER
Ana Gaviria*, Andrea Zuluaga*, Marla Berrio *, Alejandra Daz*.
* Estudiantes de Microbiologa Industrial y Ambiental, Escuela de
Microbiologa,
Universidad de Antioquia.

RESUMEN:
El mtodo del DNS se basa en una reaccin entre los azcares reductores y el cido 3,5-
dinitrosaliclico, donde se produce la reduccin del mismo en cido 3-amino-5-
nitrosaliclico, resultando en un complejo de color naranja cuantificable
colorimtricamente. Se utiliz este mtodo para cuantificar la concentracin de azucares
reductores en dos muestras problema, mediante la construccin de dos curvas de
calibracin, las absorbancias de las muestras se midieron a una longitud de onda de
540nm en el espectrofotmetro. El jarabe de almidn presento mayores concentraciones
de azucares reductores en comparacin con la melaza. El mtodo presenta una gran
ventaja por su alta sensibilidad. Sin embargo se debe tener en cuenta que este presenta
dispersiones en sus resultados segn la naturaleza de la muestra
Palabras claves: Azcares reductores, monosacridos, DNS, curvas de calibracin.

INTRODUCCIN
Un azcar reductor es un trmino qumico para un azcar que acta como un agente
reductor y puede donar electrones a otra molcula. Especficamente, un azcar reductor es
un tipo de carbohidrato o azcar natural que contiene un grupo aldehdo o cetona libre que
forma un grupo hemiacetal el cual le confiere la caracterstica de poder reaccionar con otros
compuestos o molculas como: cidos nucleicos, aminocidos, etc. (1)
Todos los monosacridos, aldosas o cetosas y la mayora de los disacridos son azcares
reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anomricos no est
formando enlace glucosdico, adems de que a la sacarosa la componen dos azcares
reductores, glucosa y fructosa, y no contiene grupos carbonilo libres. (2)
La determinacin de los azcares reductores se bas en el mtodo de Miller o DNS (utiliza
cido dinitrosalicilico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra), como
reactivo que tiene la capacidad de oxidar los azcares reductores mostrando un
comportamiento diferencial hacia mono y disacridos, presentando resultados que se
pueden medir a una longitud de onda de 540nm. (3)
Esta tcnica sirve para cuantificar los azcares reductores producidos durante una
fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica.
Por lo tanto, el objetivo de la prctica es aplicar esta tcnica para la construccin de una
curva de calibracin de glucosa e identificar los azcares reductores en una muestra
problema.
METODOLOGA

Preparacin de la solucin stock y diluciones

Para la realizacin de la curva de calibracin, se parti de glucosa monohidratada

(CH2OH(CHOH)4CHO H2O). Mediante la siguiente relacin estequiomtrica se obtiene los
gramos de glucosa a utilizar

()
, ,
()

= , ()

Se prepar la solucin estndar de glucosa a partir de 0,044 gramos de glucosa y aforando

en un baln volumtrico para obtener un volumen final de 100ml cuya concentracin fue de
0.4 g/L
posteriormente, a partir de la solucin preparada, se prepararon 10 diluciones y un blanco
utilizando el siguiente modelo de calculo

Dnde:

1 = concentracion de solucion madre (0.4 )

1 = Volumen de la solucin de glucosa al 0,4
2 = Volumen de agua destilada (5)
2 = incognita

1 1 1104 0,4
Ejemplo: 2 =
2 2 = 5104
2 = 0,08

En las tablas 1 y 2 se muestran las concentraciones de las soluciones de glucosa despus

de aplicar la formula empleadas por los grupos 1 y 2 para la construccin de la curva de
calibracin

Preparacin de las muestras problemas

Tomando como referencia muestras problemas con una concentracin estimada de 500g/L,
se realizaron 3 diluciones por triplicado de cada una para obtener concentraciones finales
cuya absorbancia pueda ser analizado a partir de la curva de calibracin. Las 1, 2 y 3
soluciones de jarabe de almidn Se prepararon a partir de una solucin de () g/L de almidon
y las 3 soluciones de muestra de melaza a partir de una solucin de () g/L de melaza, para
la preparacin de estas diluciones se emple el modelo de clculo anteriormente
mencionado.

Medida de absorbancia para las soluciones

Finalizada la preparacin de las diluciones (para la curva patrn y muestra problema), se
agreg a cada tubo 0,5 ml del reactivo DNS, despus de depositado el reactivo se procedi
a tapar cada tubo con un trozo de papel aluminio con el fin de evitar prdidas del reactivo
por evaporacin. Todas las diluciones se incorporaron en un bao mara con una
temperatura ente 80C y 90C durante 5 minutos. Posteriormente, se depositaron en un
balo de hielo durante 5 minutos. Se realiz la lectura de absorbancia de todas las soluciones
de muestra problema y curva de calibracin a una longitud de onda de 540 nm.

Curva de calibracin

Con los datos que se obtuvieron de absorbancia para las diluciones preparadas a partir de
la solucin stock de glucosa se hall el promedio de las absorbancias para cada una de las
concentraciones y se construy una grfica entre la concentracin de glucosa (g/L) vs
Absorbancia en el programa Excel en donde se determin la ecuacin y el R de cada grafica
realizada.

Determinacin de la concentracin de azucares reductores en las muestras

de jarabe de almidn y melaza

Se utiliz la ecuacin de la lnea recta obtenida de las grficas de las curvas de calibracin.
Se despejo el valor de x de dichas ecuaciones, el cual equivale a la concentracin de
azucares reductores en cada una de las muestras, igualmente se reemplaz y por el
promedio de las absorbancias de las muestras problema. Se aplic la ecuacin de la
siguiente manera:

Ecuacin curva DNS 1:

= 0,2199 0,1534 (. 2)
. 1
+ 0,1534
=
0,2199
0,22 + 0,1534
= = 0,22 ( 1. )
0,2199

= 1,69

Este valor corresponde a la concentracin de azcares reductores en la dilucin realizada,

por lo tanto, para determinar la concentracin real de azcares reductores presentes en la
melaza, es necesario multiplicar dicho valor por el factor de dilucin.
=
=

=
= =

Otra forma de obtener la concentracin real de azucares reductores en una muestra
es utilizando la ecuacin 1, donde:

1 = 0,3 / ()
2 =
1 = [ ] De azucares en la dilucin.
2 = [ ]
Resultados

Curvas de calibracin de glucosa.

Muestra Volumen de Volume Concentraci Abs 1 Abs 2 Promedio Desviaci

la solucin n de n (g/L) Abs n estndar
de glucosa agua
al 0,4 g/L destilad
(ml) a (ml)
Blanco - 0,5 - - - -
1 0,1 0,4 0,04 0,066 0,076 0,071 0,0070710
7
2 0,2 0,3 0,08 0,274 0,288 0,281 0,0098994
9
3 0,3 0,2 0,12 0,496 0,514 0,505 0,0127279
2
4 0,4 0,1 0,16 0,701 0,753 0,727 0,0367695
5
5 0,5 - 0,2 0,955 0,94 0,9475 0,0106066
Tabla 1. Datos reportados por el grupo n 1 para la construccin de la curva de
calibracin.

Muestra Volumen de Volume Concentraci Abs 1 Abs 2 Promedio Desviaci

la solucin en n Agua n (g/L) Abs n
ml (0,4 g/L (ml) estndar
Glucosa)
Blanco 0 0,5 ------ ------- ------- -------
1 0,1 0,4 0,08 0,117 0,124 0,1205 0,004949
7
2 0,2 0,3 0,16 0,359 0,344 0,3515 0,010606
6
3 0,3 0,2 0,24 0,572 0,576 0,574 0,002828
4
4 0,4 0,1 0,32 0,829 0,814 0,8215 0,010606
6
5 0,5 0 0,4 1,033 0,999 1,016 0,024041
6
Tabla 2. Datos reportados por el grupo n 2 para la construccin de la curva de
calibracin.
 Curva DNS 1 y = 0,2199x - 0,1534 Curva DNS 2 y = 2,8263x - 0,1016
R = 0,9999 1.2 R = 0,9989
Absorbancia a 540 nm 1

Absorbancia 540 nm
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Concentracin de glucosa (g/L)
Concentracion de Glucosa (g/L)

Grafico 1. Curva de calibracin obtenida Grafico 2. Curva de calibracin obtenida

con los datos de la tabla 1. con los datos de la tabla 2.

Muestras problemas

1. Determinacin cuantitativa de azucares reductores en una muestra problema.

Muestra problema 1: Jarabe de almidn

Concentracin ABS 1 ABS 2 ABS3 promedio Desviacin Volumen Volumen de

estimada (g/L) ABS estndar de jarabe agua
de almidn destilada
al 0,3 g/L (ml)
(ml)
125 0,22 0,21 0,22 0,22 0,0057735 0,06 24,94
250 0,488 0,499 0,473 0,49 0,01305118 0,06 49,94
500 0,176 0,173 0,176 0,175 0,00173205 0,015 24,98

Tabla 3. Datos obtenidos para la determinacin cuantitativa de azucares reductores en

una muestra problema de jarabe de almidn.

Muestra problema 2: Melaza

Concentracin ABS 1 ABS 2 ABS3 promedio Desviacin Volumen Volumen de

estimada (g/L) ABS estndar de al 0,3 agua
g/L (ml) destilada
(ml)
125 1,054 1,062 1,072 1,062 0,0090185 0,04 49,96
250 0,336 0,338 0,346 0,334 0,0052915 0,08 49,92
500 0,126 0,138 0,129 0,131 0,006245 0,16 49,84

Tabla 4. Datos obtenidos para la determinacin cuantitativa de azucares reductores en

una muestra problema de melaza.
 Muestra problema 1: Jarabe de almidn Muestra problema 2:

[] [ ] De [ ] real [ ] De [ ] real [] [ ] De [ ] real [ ] De [ ] real

estimad azucares azucares. estimad azucares. azucares.
a . (Curva a (Curva DNS (Curva
(g/L) (Curva DNS 2) (g/L) 1) DNS 2)
DNS 1)

125 1,76 733,3 0,1137 45,83 125 5,57 1740, 0,412 128,1
6
250 3,03 2524, 0,20 166,6 250 2,216 1,380,154 96,25
9
500 1,52 2533, 0,096 149,9 500 1,293 404.0 0,082 25,62
2 6
Tabla 5. Determinacin de las concentraciones de azucares reductores en las muestra
problema a partir de la ecuacin de la lnea recta obtenida en las curvas de calibracin
observada en las grficas 1 y 2 y los valores de las absorbancias que se encuentran en
las tablas 3 y 4.

Anlisis de resultados
Los azcares reductores tienen la capacidad de reducir el cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)
bajo condiciones determinadas. En presencia de calor, los azcares interactan con el
cido 3,5 dinitrosalicilico lo que genera un viraje amarillo en la muestra. El cambio de
coloracin es determinado por el mtodo de densidad ptica a una longitud de 540 nm ledo
en el espectrofotmetro, de esta manera se puede cuantificar la concentracin de estos en
una muestra.
Inicialmente, se construy dos curvas de calibracin de glucosa (grafica 1 y 2) en un rango
de concentraciones especfico (004g/l-0,4g/l) para determinar la concentracin real
de azcares reductores en las muestras problema, dichas curvas mostraron que la
regresin se ajust a un modelo lineal descrito por las ecuaciones de primer grado Y=
0,2199x - 0,1534 y Y= 2,8263x - 0,1016 cuyos coeficientes de correlacin arrojaron valores
muy cercanos a 1, mostrando una buena relacin entre las variables e indicando un buen
ajuste entre las diferentes concentraciones de glucosa y su absorbancia. Esta correlacin
fuerte entre las dos variables se atribuye a que la tcnica espectrofotomtrica para la
determinacin de azcares reductores cumpli con la Ley de Lambert-Beer para el rango
de concentraciones establecido, que mide la proporcionalidad que existe entre la luz
absorbida por una sustancia dada y su concentracin. (4)
Sin embargo, en la construccin de las curvas patrn, los grupos de trabajo obtuvieron
concentraciones diferentes de glucosa, lo que ocasion a su vez diferencias en las
absorbancias que deberan ser similares puesto que ambos grupos utilizaron la misma
muestra. Adems se registraron diferencias en las desviaciones estndares de cada curva,
lo cual verifica el error que hubo en las diluciones por parte de los practicantes afectando
tambin la reproducibilidad y fiabilidad del experimento.
Cabe destacar que en general, la realizacin de las curvas de calibracin cont con una
buena repetitividad en las mediciones de absorbancia por duplicado tanto en la curva
construida por el grupo 1 como en la curva del grupo 2, lo cual es respaldado por un valor
poco significativo de desviacin estndar.
Las dos muestras problemas manifestaron diferencias significativas en la concentracin de
azcares reductores, esto se debe a que el jarabe de almidn (muestra problema 1) es la
mezcla de dos polisacridos; amilosa y amilopectina; ambos estn formados por unidades
de glucosa. Aunque tambin posee compuestos a nivel traza como grasas y minerales, la
gran cantidad de carbohidrato presente en su estructura podra explicar las altas
concentraciones de azcares reductores en el jarabe (Tabla 5) (9). En comparacin con la
melaza que est constituida por un alto porcentaje de azcares no reductores como la
sacarosa (60%- 63% en peso), y una proporcin muy baja de azcares reductores como la
glucosa o dextrosa (6%- 9% en peso) y fructosa o levulosa (5%-10% en peso) dando como
resultado concentraciones menores, lo que se evidencia en la tabla 5. (1)
En la muestra problema de melaza (Tabla 4) se puede observar valores de absorbancia
mayores a 1. Dicho resultado se debe a que la melaza es una sustancia de consistencia
viscosa y a travs de ella el paso de luz es limitado dando como resultado una gran
absorbancia, otro factor que contribuy con las absorbancias mayores a 1 es el mal
apareamiento de las cubetas o el mal estado de estas, conduciendo a errores en las lecturas
(7). Adems ensayos anteriores muestran la dificultad que presenta esta tcnica con este
tipo de sustancias como los estudios de Otero y colaboradores en los cuales se concluye
que la utilizacin del mtodo de Miller para la determinacin de azcares reductores
presenta dispersin en mieles, muestras intensamente coloreadas y caldos de
fermentacin, lo cual altera el resultado de las absorbancias.(8)
Al calcular la desviacin estndar de las muestras, se puede observar que las medidas de
absorbancia de jarabe de almidn cuentan con una menor dispersin en las muestras 1 y
3, en la muestra 2 se ve un pequeo incremento en la desviacin, como se mencion
anteriormente, este error se debi a las diferencias en las diluciones que obtuvo cada grupo.
Por su parte en la melaza se obtuvieron valores de desviacin muy bajos que no
influenciaron realmente la lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro.
La cuantificacin de azcares reductores tiene una gran diversidad de aplicaciones que van
desde saber cmo influyen en el sabor dulce de las variedades de mesa hasta en la
industria para los procesos fermentativos(5), estudios como los publicados por Madero
Torres y colaboradores utilizan la determinacin de azcares reductores para el control de
la calidad en mezclas de oligogalacturnidos, los cuales son compuestos que estimulan el
crecimiento vegetal, siendo los azcares reductores indispensables para el control de la
calidad de dicha mezcla. (6)

CONCLUSIONES
* El reactivo (DNS) reacciona satisfactoriamente bajo condiciones especficas de
temperatura con los azcares reductores, el resultado de esta reaccin es cuantificable de
manera satisfactoria, al interpolar las absorbancias en una curva patrn de azcares
reductores
* Las grficas muestran resultados satisfactorios debido a que el valor de R, obtenidos para
las dos curvas patrones de glucosa estn dentro de los rangos establecidos mtodo de
Miller presenta una gran ventaja que es su alta sensibilidad y productividad debido a que
es un mtodo espectrofotomtrico, sin embargo, se debe tener en cuenta que este presenta
dispersiones en sus resultados cuando las muestras a analizar son altamente viscosas y
coloreadas.
Preguntas:
Qu ventajas y desventajas considera que tiene el mtodo de Miller para la
determinacin de azucares?
Ventaja: El mtodo de Miller proporciona la facilidad de ser una tcnica de xido-reduccin
que se basa en la capacidad de la glucosa para reducir el cido 3,5-dinitrosalicilic bajo
determinadas condiciones; esta reduccin produce una coloracin que se hace ms intensa
a medida que aumenta la concentracin de azcares reductores, la cual se evidencia por
medio de la lectura de la absorbancia de espectrofotmetro, lo que conlleva a la aplicacin
de la ley de Beer-Lambert (Miller, 1959)
Desventaja: Esta tcnica consiste en la oxidacin de la glucosa, sin embargo, en solucin
acuosa se encuentra en su forma cclica que es muy estable y por lo tanto, no reacciona.
Por esta razn, es necesario calentar la muestra para que el anillo se abra dejando expuesto
el aldehdo dando lugar a una reaccin de oxidacin, teniendo en cuenta estas condiciones
tambin se frena la reaccin con hielo haciendo que la molcula de glucosa se cierre y
adquiera de nuevo su configuracin piranosa (Routh et al., 1190) (1)
Segn la diferencia existente entre los azcares reductores y los no reductores
(dar ejemplos) ser importante esto en una fermentacin, por qu?
La sacarosa no presenta poder reductor porque la unin glucosdica se establece entre el
carbono 1 de la glucosa y el carbono 2 de la fructosa, con lo cual se estabilizan las
estructuras cclicas, debido a que se constituye un acetal y no queda ningn hemiacetal
capaz de dar una cadena abierta por hidrlisis.
Los azcares no reductores debido a su estructura qumica afectan de cierta manera el
proceso de fermentacin debido a que la formacin de estos productos va acompaada de
desprendimiento de anhdrido carbnico y adems est en relacin inversa con la magnitud
de la temperatura de almacenamiento (Honig, 1974) debido a esto es necesario la limpieza
peridica de los tanques de almacenamiento, ya que los slidos sedimentables de estos
azcares se adhieren y se compactan con facilidad principalmente en el fondo, siendo
necesario removerlos con elementos cortantes (Honig, 1974)
Un jarabe de azucarado que contiene una mezcla de sacarosa y glucosa se desea
determinar el contenido correspondiente de cada azcar. Empleando el mtodo de
Miller como podra establecerse esto? Proponga una estrategia metodolgica que
pudiese ser empleada.
El jarabe azucarado est compuesto de un azcar reductor (glucosa) y un azcar no
reductor (sacarosa) por esto, una metodologa apropiada para la cuantificacin del
contenido de azucares reductores es tomar la muestra y hacer diluciones seriadas 1:10,
1:100, 1:500, luego se toma un volumen de muestra y de reactivo de DNS en iguales
proporciones (1 ml de muestra y 1 ml de DNS). Posteriormente se calienta a una
temperatura y tiempo determinado en la ficha tcnica. Se hacen lecturas de absorbancia en
el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540nm y de esta manera las absorbancias
obtenidas se interpolan en una curva de calibracin de azucares reductores con valores ya
establecidos.
BIBLIOGRAFA

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