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Tema 10.

Catlisis Enzimtica

1
Enzimas
Las enzimas se caracterizan por actuar
con gran velocidad y precisin y dejan
muy poco margen para el error

2
Primeros estudios sobre enzimas
Buchner: (1897) las levaduras fermentan el azcar a
alcohol. Estas molculas funcionan separadas de las
clulas

Summer: (1926) aisl cristales de ureasa. Comprob su


composicin nicamente proteica.

Haldane: habla por primera vez de interacciones dbiles


entre enzima y sustrato para catalizar la reaccin.

3
Enzimas
Las enzimas son protenas globulares muy numerosas:
hay ms de 2.000 enzimas diferentes.

Caractersticas de las enzimas:


1. Son catalizadores de reacciones biolgicas, es decir,
aumentan su velocidad.
2. Poseen una elevada especificidad: las enzimas se unen
de forma especfica a un sustrato o ligando
3. El ligando se une al centro activo del enzima
4. Algunas enzimas necesitan cofactores para realizar su
funcin
5. Factores como el pH y la temperatura afectan a la
velocidad de la reaccin
4
ENZIMAS
Difieren de los catalizadores qumicos en:

1. Mayor velocidad de reaccin.


V catlisis enzimtica 106 a 1014 veces ms alta que las no catalizadas
y al menos varios rdenes de magnitud mayor que la de las
reacciones con catalizadores qumicos

Poder cataltico de algunas enzimas

5
ENZIMAS
Difieren de los catalizadores qumicos en:

2. Condiciones de reaccin moderadas


Catlisis enzimtica: T<100C; P atmosfrica; pH neutro
Catlisis qumica: T y P elevadas, pH extremos

3. Mayor especificidad de reaccin

4. Capacidad de regulacin
Control alostrico
Modificacin covalente de las enzimas
Variacin de las cantidades de enzimas sintetizadas
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Cofactores
Algunas enzimas solo necesitan las cadenas laterales de
sus aas para ser funcionales
Otras necesitan cofactores para ser funcionales
Estabilizan la conformacin de la protena activa
Se unen en el centro activo
Unen enzima y sustrato

Dos tipos:

Iones metlicos: Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, ....


Molculas orgnicas complejas llamadas Coenzimas

7
Iones que actan como cofactores

8
HOLOENZIMA

enzima + cofactor
complejo activo catalticamente

APOENZIMA

es una enzima sin cofactor


complejo inactivo catalticamente

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Coenzimas
Hay dos tipos:

Molculas Orgnicas
Complejas
Slo se unen a la enzima en el
momento de la catlisis

Grupos Prostticos
Coenzima unidos ntimamente a
la enzima.
Una vitamina forma parte de la
estructura En rojo, coenzima
Transportadores intermediarios de FAD
grupos funcionales, tomos o
electrones

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Algunas coenzimas que actan como portadores transitorios de
tomos o grupos funcionales

11
Las coenzimas ms
importantes son:

-NAD (Nicotinamida
Adenina Dinucletido)

-FAD (Flavina Adenina


Dinucletido

Participan en
reacciones redox

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13
(B5)

Coenzima A

Riboflavina (B2)
14
NADH, NADPH (nicotinamida adenina dinucletido, -vit B3-)

Participan en reacciones redox

15
Las enzimas se clasifican segn las
reacciones que catalizan
Sufijo -asa tras el nombre de sustrato o actividad que realiza

Ureasas, ADN polimerasas


Clasificacin internacional: 6 clases de enzimas segn tipo
de reaccin catalizada:

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Cmo funcionan las enzimas?
Las molculas biolgicas son muy
estables a pH neutro, temperatura
suave y el ambiente acuoso que hay
dentro de las clulas

Muchas reacciones bioqumicas son


poco probables en el entorno celular

Un enzima proporciona un ambiente especfico (centro activo)


en el que una reaccin puede transcurrir a mayor velocidad

El centro activo se une al sustrato ( E-S ), gracias a los R de


sus aas 17
Las enzimas son catalizadores

Las enzimas alteran velocidades de reaccin


Las enzimas no alteran equilibrios de reaccin

Reaccin enzimtica sencilla:

E+S ES EP E+P

(Complejos transitorios)

18
Las enzimas son catalizadores

SP

Eje X: Cambios qumicos durante la reaccin a medida que S se convierte en P


Eje Y: Energa libre: la energa de los sistemas biolgicos se describe en funcin de su
energa libre de Gibbs, G.
La energa libre del sustrato se llama estado basal
Go: variacin de Energa libre estndar: es la variacin de E libre en un sistema en
condiciones estndar (temp=298K [25C], Pparcial gases=1 atm, concentracin de todos
los solutos= 1M).
G o : variacin de Energa libre estndar bioqumica: variacin de energa libre estndar
en las clulas, a pH 7, lejos de concentraciones 1M.
19
SP

G o : variacin de Energa libre estndar bioqumica

Es negativa: el equilibrio favorece a P (exergnica)


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SP

Estado de transicin:

- no es una especie qumica con estabilidad significativa


- no es un intermediario de la reaccin
- es un momento molecular fugaz en el cual que la reaccin transcurra hacia
el sustrato o hacia el producto es igualmente probable.

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Energa de activacin:
diferencia entre la E del
estado basal y la E del
estado de transicin

S P

Durante el proceso de conversin de un sustrato en un producto se genera un


intermediario de alta energa: se dice que el sustrato ha alcanzado el estado de
transicin, es decir, se encuentra activado y la probabilidad de rotura o
formacin de un enlace qumico aumenta (con respecto al sustrato) para dar
lugar al Producto.

Se llama Energa libre de activacin a la cantidad de energa necesaria para


hacer que 1 mol de una sustancia (a una temperatura determinada) alcance el
estado de transicin.
22
Las enzimas son catalizadores

En ausencia de
catalizador slo una
pequea parte de las
molculas contar con E
suficiente para alcanzar el
estado de transicin: la
reaccin ser muy lenta

La velocidad de una reaccin se puede acelerar :

- Calentando aumenta el movimiento trmico y la E


- Aadiendo un catalizador disminuyendo la energa de
activacin 23
- E de activacin: barrera energtica para una reaccin qumica.

- Sin E de activacin muchas reacciones celulares revertiran:


- macromolculas no se mantendran
24
- no rutas metablicas
- no estructuras celulares altamente ordenadas y complejas
- Las enzimas son catalizadores de las reacciones qumicas: disminuyen
la cantidad de E libre de activacin, la reaccin ser ms rpida.
- Las reacciones sin catalizador transcurren lentamente. 25
Comparacin de energa catalizada por un
enzima y sin catalizar

E+S ES EP E+P
ES y EP son intermediarios de reaccin.
Cuando en una reaccin existen varios pasos, la velocidad
global viene determinada por el paso cuya energa es ms
elevada: paso limitante de velocidad. 26
Ejemplo

C12H22O11 + 12 O2 12 CO2 + 11 H2O

La sacarosa es un compuesto estable

La energa libre de activacin es muy alta

En un recipiente de vidrio esta reaccin no sucedera

En una clula es una reaccin normal: hay catalizadores

27
Velocidad de reaccin / equilibrio
El equilibrio de una reaccin est asociado a variaciones de
E libre estndar de la reaccin
S P
Constante de equilibrio (K eq)

K eq = [P] / [S]
Aplicando
termodinmica

G 0 = - RT ln K eq

R = constante de los gases (8,315 J / mol x K)


T = temp absoluta 298 K (25C)
G 0 negativo Equilibrio de reaccin favorable. No
asociado a velocidad elevada 28
Velocidad de reaccin / equilibrio
Ecuacin de la velocidad de una reaccin:

V = k [S] k = constante de velocidad


Ej: k = 0.03 s -1: el 3% de S ser convertido
en P en 1 segundo.

Las enzimas catalizan,


aumentan la velocidad de
una reaccin

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Poder cataltico y especificidad de los enzimas

Cmo una enzima proporciona un descenso espectacular


de las energas de activacin de reacciones especficas?

-Formacin de enlaces covalentes transitorios entre sustrato


y grupos R de centro activo que son reactivos. Se produce
una reaccin qumica determinada previa a la reaccin final.

-El mantenimiento del complejo ES se debe sobre todo a


interacciones no covalentes. El establecimiento de esas
interacciones liberan pequeas cantidades de E libre: da
estabilidad al complejo ES. Energa de fijacin.

30
Especificidad
La E de fijacin tambin provoca la especificidad del enzima
Especificidad: discriminar entre sustrato y molcula
competitiva
Especificidad debida a la formacin de muchos enlaces
Centro activo: aas con cadenas laterales que favorecern
tanto la unin del sustrato como su catlisis (interacciones
hidrofbicas, inicas, covalentes, etc.)

31
La complementariedad
geomtrica y electrnica
entre enzima y sustrato
depende de fuerzas no
covalentes

Grupos
hidrfobos

Puentes de H

32
Especificidad
Absoluta
Slo hay 1 sustrato que se
pueda unir a un enzima

De grupo
Varios sustratos con un
grupo funcional determinado
se unen a la misma enzima.

De reaccin
Ej: Hidrlisis de un grupo
fosfato: rompe un enlace
fosfato de cualquier sustrato

De estereoespecificidad:
La ms especfica, distingue
estereoismeros
33
Modelo llave-cerradura
Fisher (1894) enunci: "el sustrato se adapta al centro activo o
cataltico de una enzima como una llave a una cerradura

34
Modelo del Ajuste Inducido
Modelo de Koshland (1958): las enzimas son flexibles y sus sitios
activos pueden cambiar (expandirse) para acomodarse a sus sustratos

35
Enzima imaginario. Rotura de una vara metlica

36
Grupos catalticos que contribuyen a la catlisis

Una vez formado el complejo ES, grupos


funcionales catalticos situados
adecuadamente colaboran en la catlisis.
Responsables de enlaces covalentes.

Catlisis cido base general

Catlisis covalente

Catlisis por iones metlicos


37
Grupos catalticos que contribuyen a la
catlisis

Catlisis cido base general

En muchas reacciones se generan intermediaros


inestables cargados: se estabilizan al donar o aceptar
H+ y se transforman en producto ms fcilmente que
en reactivos.

Grupos R de aas del centro activo actan como


dadores o aceptores de protones

38
Grupos catalticos que contribuyen a la
catlisis
Catlisis cido base general

39
Ejemplo de catlisis cido base general

Hidrlisis de un enlace amida: quimiotripsina (proteasa)

Se forma un
intermediario
cargado muy
inestable

40
Catlisis cido base general

Hidrlisis de un enlace
amida: quimiotripsina
(proteasa)

El intermediario
inestable se estabiliza por
transferencia de H+ desde
o hacia las cadenas
laterales del centro activo

41

Catlisis cido base especfica transferencia de H+ con H2O


Grupos catalticos que contribuyen a la catlisis

Catlisis covalente

Se forma enlace covalente transitorio entre E y S.

El complejo covalente regenera el E libre, ya que


experimenta una reaccin adicional.

A-B A + B (hidrlisis de un enlace entre A y B sin


catalizador)

A-B + X A-X + B A + X + B (hidrlisis de un enlace


con catalizador X covalente)
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Grupos catalticos que contribuyen a la catlisis

Catlisis por iones metlicos

Interaccin inica entre un metal fijado al enzima y


sustrato

El metal facilita reacciones de oxidacin-reduccin:


cambios reversible en el estado de oxidacin del in
metlico: el sustrato reacciona mejor.

43
Cintica enzimtica
Explica el mecanismo de accin enzimtica
Determinacin de la velocidad de la reaccin y el modo
en que sta cambia en respuesta a cambios en los
parmetros experimentales

La velocidad de reaccin depende de [S]


[S] vara durante la reaccin, ya que S se convierte en
P
Para simplificar, se mide la velocidad inicial (Vo),
cuando [S] > [E]

44
Cintica enzimtica
Constante Vara

Condiciones ambientales [S]

[E]

[S] Meseta
Vmax

[S] Vo
aumenta ms
despacio

[S] Vo aumenta linealmente 45


Cintica enzimtica
Teora general de la accin enzimtica
Michaelis Menten (1913)

E+S ES E+P

Ms lenta
Limita la V de la
reaccin total
En cualquier momento de la reaccin, el enzima existe
en dos formas:
- la forma libre E
- la forma combinada ES

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Cintica enzimtica
E+S ES E+P

Si [S] es baja, E estar sin


combinar: v ser proporcional
a [S].

V mx se alcanza cuando
apenas quede E libre, todo en
ES.
El enzima est saturado

La cantidad de Sustrato que la Enzima procesa por unidad


de tiempo es limitada. 47
Cintica enzimtica
Ecuacin de Michaelis-Menten
El paso limitante de la velocidad en las reacciones enzimticas
es la descomposicin del complejo ES para formar producto y
enzima libre

V mx [S]
Vo = ---------------
Km + [S]

k1 k2 k1 cte de velocidad de formacin de ES


E+S ES E + P
k-1 y k2 cte de velocidad de descomposicin de ES
k-1
(k2 + k -1)
Km = Constante de Michaelis-Menten Km =
k1 48
Cuando Vo es de la V mx
V mx . [S] V mx . [S]
Vo = V mx =
Km + [S] Km + [S]

[S]
=
Si divido por V mx
Km + [S]

Despejo Km Km + [S] = 2 [S]

Km = [S], cuando Vo = V mx

49
En todas la enzimas que siguen una cintica de Michaelis-
Menten:
Hay una dependencia hiperblica de Vo frente a [S].

Se cumple la Cte. de Michaelis-Menten: KM = [S] en la que V


de la reaccin es Vmx

Se mide en mol/l

Vara con pH, S, t,...

Si KM se necesita
poco S para alcanzar
Vmx: la afinidad entre S y
E es alta.

50
Los valores de KM varan de una enzima a otra e
incluso varan de un sustrato a otro, dentro del
mismo enzima.

51
Grfica de dobles recprocos de
Lineweaver-Burk
1 Km 1
= +
Pendiente =
Vo Vmx[S] Vmx

Se representan los
recprocos de la grfica de
Michaelis-Menten 1/Vo
frente a 1/[S].

Al hacer el doble recproco,


se obtiene una lnea recta
con una pendiente igual a
Km/Vmx
Determinacin mucho ms precisa de V mx 52
Constante Kcat o nmero de recambio

Es comn reacciones que ocurren a travs de mltiples


pasos despus de la formacin del complejo ES

k1 k2 k3
por ejemplo: E+S ES EP E+P
k-1 k-2
(paso limitante)

La mayor parte de la enzima se encontrar en forma EP en


condiciones de saturacin Vmx = k3[Et]

Se define K cat (cte de V ms general): velocidad limitante de


cualquier reaccin enzimtica en condiciones de saturacin

53
Constante Kcat o nmero de recambio

En la ecuacin de Michaelis-Menten

Vmx
kcat = V max =K cat [Et]
[Et]

Con lo que la ecuacin se transforma en


kcat [Et][S]
Vo =
Km + [S]

siendo [Et] concentracin total de enzima (libre + unida a S)


54
Nmero de recambio (Kcat): es equivalente al
nmero de molculas de sustrato convertidas en
producto por unidad de tiempo en 1 sola molcula
de E cuando el E est saturado con el sustrato.

55
REACCIONES MULTISUSTRATO
En muchas reacciones enzimticas se fijan al E
dos o ms molculas de S diferentes

Suelen transferir grupos funcionales de un


sustrato a otro

Siguen el mtodo de Michaelis-Menten

ejemplo: hexoquinasa

ATP + Glucosa ADP + glucosa 6-fosfato

Hexoquinasa: Km de ATP = 0,4 mM


Km de Glucosa = 0,05 mM 56
REACCIONES MULTISUSTRATO
Reaccin enzimtica con formacin de un complejo
ternario

Unin estadstica
o al azar

Unin ordenada

Reaccin enzimtica en la que no se forma un


complejo ternario mecanismo ping-pong o de doble
desplazamiento

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E modificada covalentemente
INHIBICIN ENZIMTICA

Los inhibidores enzimticos son agentes


moleculares que interfieren en la catlisis,
haciendo ms lentas o deteniendo las reacciones

Inhibicin reversible
Se unen mediante interacciones reversibles
Inhibicin irreversible
Se unen tan fuertemente a la enzima que bloquean su
actividad de forma permanente

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INHIBICIN REVERSIBLE
Inhibicin Competitiva: compite con el sustrato por el
centro activo del enzima

Inhibicin Acompetitiva: se une a un sitio diferente al


que se une al sustrato. Solo se une al complejo ES

Inhibicin Mixta: se une a un sitio diferente al que se


une al sustrato. Se une tanto a E como al complejo ES

60
INHIBICIN COMPETITIVA
El I compite con el S por el centro activo

61
INHIBICIN COMPETITIVA
En presencia de un I competitivo la ec. de Michaelis-Menten:

Vmx [S] [I] [E] [I]


V0 = = 1+ KI =
Km + [S] K I [EI]
KI= cte de equilibrio de fijacin de I a E

[S] >>[I] Se minimiza el efecto del I


Vmx normal
Km aumenta en presencia del I en un factor

62
INHIBICIN COMPETITIVA

V mxima no vara.
Km aumenta

Es decir, independien-
temente de la [I]
competitivo, hay
siempre una [S]
suficientemente
elevada para desplazar
al I del sitio activo de
E

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Inhibicin competitiva como terapia mdica

Intoxicacin por metanol


Orina

Metanol Formaldehdo Tejidos lesionados


(ceguera)

Alcohol deshidrogenasa (hgado)

Etanol (I) Acetaldehdo

El efecto del etanol es muy parecido al de un I competitivo, con la diferencia de que


el etanol es un S y su concentracin disminuir con el tiempo a medida que la E lo
convierta en acetaldehdo
INHIBICIN ACOMPETITIVA
El I se une a un sitio distinto que el S
Slo se une a ES

Presumiblemente distorsiona el
sitio activo y hace que la E sea
catalticamente inactiva 65
INHIBICIN ACOMPETITIVA
En presencia de I acompetitivo la ec. de Michaelis-Menten:

Vmx [S]
V0 = [I] [ES] [I]
= 1 + KI =
Km + [S]
K [ESI]
I
Disminuye la Vmx
Disminuye la Km [S] necesaria para alcanzar Vmx
Aumentar la [S] no revierte el efecto de un I acompetitivo

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INHIBICIN ACOMPETITIVA
La pendiente no vara,
Km /Vmx

Al aumentar [I], Km y
V mx disminuyen

El I afecta la funcin
cataltica de la E pero
no su unin al S

La I acompetitiva es
significativa solo para
las enzimas
multisustrato.

67
INHIBICIN MIXTA
El I se une a un sitio distinto que el S
Se une tanto a E como a ES

68
INHIBICIN MIXTA
Ecuacin de velocidad

Vmx [S] [I] [I]


Vo = = 1+ = 1 +
Km + [S] K I K I

Afecta tanto a Km como a Vmx

Caso especial poco frecuente: cuando = (El I se une con


igual afinidad al E y al ES) Inhibicin No Competitiva
Afectara a la Vmx pero no a la Km

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INHIBICIN MIXTA
Pendiente Km / Vmx

La [I] afecta tanto a Km como a


Vmax

La unin del S no revierte los


efectos del I mixto

Slo se observa en E con dos o


ms S

I no competitivo la lnea corta


el eje 1/[S] en -1/Km

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INHIBICIN REVERSIBLE
La ecuacin siguiente se utiliza como una
expresin general de los efectos de los
inhibidores reversibles
Vmx [S] Competitiva
=1
Vo =
Km + [S] =1 Acompetitiva

Efectos de inhibidores reversibles sobre los valores


aparentes de Vmx y Km

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INHIBICIN IRREVERSIBLE
El I se combina con o destruye un grupo esencial para
la actividad de la E
Asociacin no covalente muy estable
Enlace covalente

La reaccin de la
quimotripsina con el
diisopropilfluorofosfato
(DIFP) inhibe el enzima
irreversiblemente
(modifica una serina)
72
INHIBICIN IRREVERSIBLE
Inactivadores suicidas o Inactivadores basados en el
mecanismo
Poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de un E
especfico
El inactivador suicida comienza y pasa por los primeros pasos de
una reaccin enzimtica normal. Despus se convierte en un
compuesto muy reactivo, se combina irreversiblemente con E,
no se transforma en P
Diseo racional de frmacos
Muy efectivos
Pocos efectos secundario

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Factores que afectan a la actividad
enzimtica
pH

Las enzimas actan dentro de


lmites estrechos de pH

Existen un pH ptimo
Actividad mxima
Reflejo del ambiente celular en el
que normalmente se encuentra

Cambios en el pH afectan a la
estructura terciaria
Distribucin de cargas
Unin E S

74
Factores que afectan a la
actividad enzimtica
TEMPERATURA

temp V reaccin

Velocidad de la reaccin se
duplica cada 10C

T ptima
Velocidad mxima

Si aumenta mucho la
temperatura:
desnaturalizacin, se pierde la
estructura terciaria, el centro
activo pierde su estructura
75

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