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DETERMINACION ANALITICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

3.1 ASPECTOS GENERALES


En general, no se determina la concentracin de enzimas en tejidos y/o fluidos
orgnicos, sino su actividad. El motivo es que la concentracin de enzimas en suero es
baja; sin embargo, dada su elevada capacidad cataltica es posible determinar su
actividad con fiabilidad y se presupone que, por lo general, la actividad es proporcional
a la concentracin.
Por tanto, es sumamente importante el procesado adecuado de las muestras, para que se
garantice la conservacin de la estructura proteica, fcilmente alterable por variaciones
de:
temperatura, pH muy cidos o alcalinos, detergentes, metales pesados o la presencia de
microorganismos en el recipiente, lo cual degradara la protena.
La conservacin de los sueros a T ambiente genera la inactivacin de las enzimas;
aunque, en algunos casos, la reduccin de esta actividad es reversible (por ejemplo, la
actividad de la CK se recupera aadiendo glutation a la reaccin); pero, en la mayora
de los casos, el tratamiento inadecuado de la muestra supone la prdida de, al menos,
parte de la actividad enzimtica.

Una de las funciones ms importantes del tcnico de laboratorio es mantener las


condiciones ms adecuadas para las muestras a procesar.
Para determinar la actividad de las enzimas es necesario conocer:
- la estequiometra de la reaccin que cataliza
- si necesita o no cofactor y cul es
- la concentracin mnima de sustrato y cofactor para alcanzar la mxima velocidad
- las condiciones ptimas de medida: pH; tiempo de incubacin; procesado de la
muestra biolgica y los reactivos; T; posibles activadores o inhibidores endgenos o
exgenos de la muestra
- las caractersticas de la tcnica analtica para esa muestra biolgica
Se puede determinar la actividad enzimtica concreta analizando la reaccin desde
diversos puntos de vista:
- aparicin de algn producto
- desaparicin del sustrato
- variacin del cofactor o de algn componente en el transcurso de la reaccin
3.2 TECNICAS DE ANLISIS
La tcnica analtica especfica ms empleada es la espectrofotometra ultravioleta
visible (UV-V). En la fase de retardo, inmediatamente despus de mezclar los reactivos
con la muestra biolgica no se debe medir la absorbancia, ya que es una fase de
encuentro y acoplamiento de sustrato y enzima. Puede durar de unos segundos a varios
minutos. En los productos comerciales nos indican el tiempo que dura este perodo de
retardo.
Al finalizar esta fase, comienza la fase lineal, donde la velocidad de formacin del
producto permanece constante y es en esta etapa donde se determina la actividad
enzimtica.
A medida que va transcurriendo la reaccin, llega un momento en que la velocidad
comienza a disminuir, debido a factores como el agotamiento de sustrato, el equilibrio
entre sustrato y producto y / o variaciones de pH que no han podido ser amortiguadas
por el tampn, a efectos de inhibicin del enzima, etc.
La actividad enzimtica se mide en Unidades Internacionales por unidad de volumen
(UI / mL, U / L). Se define como la cantidad de enzima que transforma un micromol
de sustrato en un minuto en condiciones estndar previamente establecidas. En cada
tcnica analtica se define la unidad de actividad y sus unidades.

3.3 MTODOS ANALTICOS DE DETERMINACIN ENZIMTICA


En estos mtodos, no es importante un dato puntual de absorbancia sino la variacin de
la absorbancia por unidad de tiempo ocasionada por la actividad de la enzima que se
pretende analizar su actividad.
A grandes rasgos, hablamos de dos mtodos de anlisis:
- mtodos a punto final: se mide la absorbancia tras un tiempo determinado, en el cual
se estima ha tenido lugar la reaccin
- mtodo cintico: consisten en medir la absorbancia varias veces, con intervalos de
minutos; permiten comprobar que se encuentra en la zona lineal de la curva, ideal para
la determinacin; si se detectan desvos de la linealidad, de desprecian alguna de las
medidas finales de absorbancia.
En los productos comerciales, se indican los pasos a seguir en cada determinacin para
que el resultado sea fiable.
Muchos mtodos de determinacin se basan en la medida de absorbancia de cofactores,
que median en la reaccin: complejos NAD-NADH; o NADP-NADPH.