Pengembangan dan Validasi Metode HPLC untuk

Penentuan Serentak Lima Makanan Aditif dan Kafein dalam Minuman Ringan

1. Perkenalan

Aditif makanan banyak digunakan dalam bahan makanan untuk mencegah pembusukan
dan memperbaiki warna, rasa, dan tekstur makanan. Namun, zat aditif ini dalam
makanan dapat mempengaruhi individu yang sensitif dengan beberapa jenis alergi,
asma, dan demam. Akibatnya, pihak berwenang menetapkan nilai ambang batas untuk
asupan harian yang dapat diterima, bervariasi dari satu negara ke negara lain. Misalnya,
daftar aditif makanan resmi dan tingkat maksimum yang diijinkan di Uni Eropa
tercantum dalam lampiran direktif dewan [1, 2].
Untuk memastikan keamanan pangan dari pertanian ke garpu, juga penting untuk
mengembangkan metode analisis yang andal dan andal untuk memantau tingkat aditif
dalam makanan [3]. Oleh karena itu, berbagai metode analisis telah dilaporkan untuk
penambahan aditif makanan sintetis simultan, seperti kromatografi lapis tipis [4],
spektrofotometri UV-terlihat [5,
6], voltametri [7, 8], polarografi pulsa diferensial [9], elektroforesis kapiler [10], HPLC-
DAD [11-14], HPLC- MS [15], dan HPLC-MS-MS [16, 17] . Sampai sekarang, meskipun

Banyak teknik analisis telah dikembangkan untuk penentuan berbagai makanan

tambahan pada makanan, tidak ada laporan tentang penentuan kombinasi kombinasi ini
secara simultan dalam sampel makanan. Di antara metode analisis ini, HPLC ditambah
dengan detektor sinar UV / Vis atau dioda (DADs) adalah metode yang paling umum
digunakan karena sensitivitas, selektivitas, dan resolusi tinggi. Jadi, pengembangan
metode pemisahan kromatografi efektif melibatkan seleksi yang bijaksana terhadap
kondisi eksperimental yang sesuai untuk pemisahan komponen yang berminat pada
resolusi yang memadai dengan jangka waktu yang wajar. Dalam hal ini, desain
eksperimental adalah alat yang berguna untuk menyederhanakan kerja keras [18]. Ini
bukan hanya metode timesaving tetapi juga memiliki kemampuan untuk
mengungkapkan kemungkinan interaksi antara variabel [19, 20]. Oleh karena itu, desain
eksperimental telah semakin digunakan untuk menentukan kondisi optimum pemisahan
kromatografi beberapa analit dalam sampel cairan makanan, obat-obatan, dan biologis
dengan jumlah eksperimen minimum selama lebih dari satu dekade terakhir [21-28].

Dalam makalah ini, metode RP-HPLC baru dikembangkan, dengan menggunakan

rancangan eksperimental, untuk penentuan lima makanan aditif sintetis secara simultan
dalam minuman ringan, termasuk tiga pewarna sintetis (carmoisine, allura red, dan pon
ce ce 4R), dua bahan pengawet (potassium sorbat dan natrium benzoat), dan kafein.
Untuk prosedur optimasi, desain Box Behnken (BBD) digunakan untuk membangun
model matematis yang memprediksi bagaimana perubahan masukan atau pengendalian
variabel (pH, laju alir, dan rasio fasa gerak) mempengaruhi resolusi di wilayah
eksperimen yang ditetapkan. Selanjutnya, metode validasi telah dilakukan sesuai dengan
pedoman International Conference on Harmonization. Metode yang dioptimalkan dan
divalidasi berhasil diterapkan pada beberapa minuman ringan komersial yang
mengandung kalium sorbat, sodium benzoat, carmoisine, allura red, ponceau 4R, dan
kafein.

2. Percobaan
2.1. Aparat. Analisis kromatografi dilakukan dengan menggunakan sistem HPLC
Shimadzu (Kyoto, Jepang) yang terdiri dari unit pompa LC20 AT, detektor SPD-20A UV-
Vis, injeksi sampel 7725 20 L, komputer, dan Inertsil OctaDecylSilane- (ODS-) 3V kolom
(5 m, 250 mm 4,6 mm; Ilmu Pengetahuan GL, Tokyo, Jepang). Analisis statistik untuk
data tanggapan analitis dan validasi dievaluasi dengan perangkat lunak Microsoft Excel
2000. Perangkat lunak statistik Statgraphics Centurion XV (StatPoint Inc., VA, USA)
digunakan untuk merencanakan grafik dan untuk memperkirakan tanggapan variabel
eksperimen.

2.2. Bahan Kimia dan Reagen Semua bahan kimia dan pelarut memiliki nilai pereaksi
analitis dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Air Milli-Q digunakan untuk
mempersiapkan solusi dan fase gerak (Millipore, Milford, MA, USA). Sodium acetate
trihydrate, asam asetat glasial, dan asetonitril HPLC diperoleh dari Merck (Darmstadt,
Jerman). Kalium sorbat ( 99,0% kemurnian), sodium benzoat (99,0%, kemurnian),
carmoisine (98,0% kemurnian), allura merah (kemurnian 98,0%), ponceau 4R ( 99,0%
kemurnian), dan kafein ( Kemurnian 100,0%) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis,
Missouri, AS).

2.3. Persiapan Solusi Standar. Larutan stok standar kalium sorbat, natrium benzoat, dan
kafein disiapkan pada konsentrasi 250 g / mL. Larutan stok standar carmoisine, allura
red, dan ponceau 4R disiapkan pada konsentrasi 100 g / mL. Solusi kerja segar pada
kisaran konsentrasi 2-10 g / mL untuk carmoisine, allura red, dan ponceau 4R dan 5-25
g / mL untuk kafein, kalium sorbat, dan natrium benzoat disiapkan dengan dilusi stok
standar. solusi di air Milli-Q.

2.4. Persiapan sampel. Sampel minuman ringan dibeli dari supermarket lokal di Istanbul,
Turki, dan dihancurkan dalam bak mandi ultrasonik selama 5 menit. Kemudian, 1 mL
sampel dipindahkan ke labu volumetrik 10 mL dan diencerkan dengan volume dengan
air Milli-Q. Sebelum melakukan analisis, kedua sampel minuman ringan dan larutan
standar disaring melalui filter Millipore 0,45 m dan kemudian disuntikkan ke dalam
sistem HPLC.
2.5. Prosedur Kromatografi. Pemisahan optimum semua analit dicapai dengan buffer
asam asetat 0,025 M / asetat, pH 6.0, gradien asetonitril yang mengikuti 0-5 menit,
95: 75 (v / v); 5-10 menit, 70: 30 (v / v). Kecepatan aliran fasa gerak adalah 1,0 mL /
menit dan volume injeksi 20 L dalam semua kromatografi berjalan. Deteksi dilakukan
dengan detektor sinar ultraviolet yang bervariasi yang dipasang pada 230 nm.

2.6. Prosedur Pengoptimalan. Desain Box-Behnken (BBD) menggunakan tiga variabel

pada tiga tingkat (tingkat kode: -1, 0, dan +1) digunakan untuk optimasi penentuan
serapan kalium serap, natrium benzoat, caroisoisine, allura merah, ponceau secara
simultan. 4R, dan kafein dengan HPLC. Desain ini dipilih karena banyaknya eksperimen
yang dibutuhkan. Variabel dan tingkat yang dipilih untuk prosedur optimasi adalah pH
(; 6.0, 6.5, dan 7.0), laju alir (; 1,0, 1,2, dan 1,4), dan rasio fasa gerak (dalam hal buffer
asetat) (; 85, 90, dan 95) (Tabel 1). Metode HPLC yang diusulkan menganalisis senyawa
tersebut dalam dua tahap seperti yang disebutkan di atas. Sementara langkah pertama
memiliki efek pada pemisahan kromatografi, langkah kedua memiliki efek pada jangka
waktu metode. Oleh karena itu, variabel eksperimen langkah pertama metode HPLC
diperhitungkan. 15 percobaan berjalan dilakukan secara acak dan resolusi keseluruhan
() dipilih sebagai respon untuk pemisahan senyawa [19]. Matriks desain eksperimental
yang digunakan dan hasil yang diperoleh BBD tercantum pada Tabel 2.

2.7. Prosedur Validasi. Validasi in-house metode ini dilakukan sesuai dengan pedoman
International Conference on Harmonization (ICH Q2R1) [29]. Parameter yang dievaluasi
adalah linearitas kurva kalibrasi, limit of detec- tion (LOD), limit of kuantification (LOQ),
dan presisi, akurasi, dan stabilitas. Linearitas metode HPLC untuk penentuan lima
makanan tambahan dan kafein dievaluasi dalam kisaran konsentrasi 2-10 g / mL untuk
carmoisine, allura red, dan ponceau 4R dan 5-25 g / mL untuk kalium sorbat, natrium
benzoat , dan kafein yang mencakup rentang konsentrasi normal yang didapat saat
menganalisis minuman ringan. Persamaan kalibrasi dihitung dengan perlakuan kuadrat
terkecil dari area puncak aditif makanan dan kafein. Batas deteksi (LOD) dan batas
kuantisasi (LOQ) dihitung sebagai LOD 3 / dan LOQ 10 / , di mana adalah
standar deviasi intercept dan adalah kemiringannya. Untuk menguji prediksi kinerja
metode yang diusulkan, intraday (tiga kali dalam operasi sehari dalam kondisi yang
sama) dan hari interday (empat hari berbeda) dilakukan pada tiga konsentrasi yang
berbeda (Level 1: 10 g / mL; Level 2: 15 g / mL; Level 3: 20 g / mL untuk kalium
sorbat, natrium benzoat, dan kafein; Level 1: 4 g / mL; Tingkat 2: 6 g / mL; Level 3: 8
g / mL untuk carmoisine, allura red, dan ponceau 4R). Akurasi metode ini dipastikan
dilakukan oleh sebuah studi pemulihan dengan menambahkan sejumlah standar
referensi yang diketahui ke sampel minuman ringan. Pertama, 0,5 mL sampel minuman
sof ditransfer ke labu volumetrik 10 mL dan standar referensi ditambahkan di atasnya
pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda. Kemudian, sampel ditambahkan diencerkan
dengan volume dengan air Milli-Q, disaring, dan dianalisis.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Optimalisasi Metode HPLC. Pengoptimalan kromatografi memerlukan pemilihan

kriteria yang sesuai untuk evaluasi kromatogram yang dihasilkan agar dapat memilih
kondisi optimum. BBD adalah desain orde dua yang independen, dapat diputar, atau
hampir dapat diputar berdasarkan desain faktorial yang tidak lengkap. Ini lebih efisien
dibandingkan dengan desain permukaan respons lainnya, seperti desain komposit pusat.
Ini juga dapat memberikan informasi yang cukup untuk menguji kekurangan fit, dan oleh
karena itu merupakan salah satu model kuadrat terbaik untuk metode permukaan
respon dan telah banyak digunakan di bidang analisis. Karena nonlinearitas model,
fungsi polinomial yang mengandung model orde dua didalilkan untuk menggambarkan
fenomena evolusi:

Dimana adalah jumlah variabel, 0 adalah istilah konstan, , , dan mewakili koefisien
istilah orde pertama, syarat kuadrat, dan syarat interaksi, masing-masing, dan adalah
istilah yang mewakili sumber variabilitas lainnya. tidak memperhitungkan perkiraan,
seperti kebisingan latar belakang [30].

Hasil percobaan ditunjukkan pada Tabel 2. Model regresi untuk respon diuji
melalui analisis varians (ANOVA). Dari hasil ANOVA (Tabel 3), dapat
disimpulkan bahwa kontribusi linier rasio fasa gerak () dan kontribusi kuadrat
dari rasio fasa gerak () mempengaruhi resolusi secara signifikan. Interaksi
variabel individual dalam penelitian ini tidak signifikan terhadap resolusi pada
rentang yang dipilih. Dilengkapi persamaan model kuadratik juga disajikan pada
(2). Gambar 1 menunjukkan analisis variabel individual dari desain eksperimen.
Dari Gambar 1, dapat dilihat bagaimana nilai resolusi dapat meningkat jika kita
mengambil rasio fasa gerak yang lebih tinggi (). Selain itu, kita dapat
menyimpulkan bahwa meskipun pH () dan laju alir () tidak sangat
mempengaruhi resolusi, resolusi yang lebih baik diperoleh untuk nilai pH dan
aliran laju yang rendah.

Model regresi yang diperoleh digunakan untuk menghitung permukaan respon untuk
masing-masing variabel secara terpisah. Gambar 2 menggambarkan plot permukaan
respons untuk resolusi. Secara khusus, efek pH () dan rasio fasa gerak () pada resolusi
ditunjukkan pada Gambar 2 (b). Plot ini menunjukkan bahwa resolusi tertinggi diperoleh
pada nilai rasio gerak fase yang lebih tinggi. Hubungan antara efek dari variabel lain
pada resolusi juga diplot pada Gambar 2 (a) - (c)