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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FCCNM - EAP

BIOLOGA BIOQUMICA I - 2017 PRCTICA

Reporte N: 1. BIOQUMICA II-2017 PRCTICA

Fecha de Entrega: 29/08/2017.

Cdigo, Apellidos y Nombres:

2014025589, Arvalo Velsquez, Peter.

2015003819, Campos Lpez, Armando.

2015003864, Campos Segura, Anthony.

2015003409, Delgado Olivares, Leslie.

INFORMACION DE LA PRCTICA

CROMATOGRAFIA
MUESTRAS UTILIZADAS
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA:
Silica gel
Laminas de vidrio, laminas porta objetos.
Envase con tapa (cmara cromatografa)
Flores y frutos de colores
HCL metanlico al 1%

Eluyentes
n-butanol: cido actico glacial: agua
(60:15:25)
HCl 1 N
cido actico glacial: HCl : Agua
(60:6:20)

Cromatografa en columna
Sephadex G-25
Tubo de vidrio (1 x 08 cm)
Buffer Fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2
Reservorio de Buffer con mangueras
Muestra: Azul de dextrano 10mg/mL y rojo de fenol 0.5%
METODOLOGA UTILIZADO PARA CROMATOGRAFA DE CAPA FINA
I) Utilizando el mortero se aplastaron los ptalos y se aadimos 5ml de
HCL y luego 2ml ms.

Figura n1: ptalos de rosa molidos en un mortero con 7ml de HCL. Fuente:
https://es.123rf.com/photo_12420252_petalos-de-rosa-de-flores-en-un-mortero-de-porcelana-
con-su-correspondiente-mano-y-dispersas-aislada.html

II) Con una pipeta se absorbi la parte liquida y se verti en un tubo de


ensayo.
III) Luego con la ayuda de un alfiler se introduce una tiza de color blanco
dentro del tubo.

Figura n2: tiza introducida en el tubo de ensayo con la ayuda de un alfiler. Fuente: propia
IV) Luego se espera por 10 minutos y se observa la distancia recorrida
por el lquido fuertemente coloreado.

Figura n3: tiza ms el lquido fuertemente coloreado. Fuente propia.

METODOLOGA UTILIZADO PARA CROMATOGRAFA EN COLUMNA


I) Se preparo una suspensin de Sephadex G-25 en buffer fosfato de
potasio 50 mM, PH 7.2; luego se virtio, una vez equilibrada en el tubo
(1 x 08 cm) dejando una capa de buffer de elucin.

Figura n4: Sephadex G-5 con buffer fosfato de potasio 50Mm a pH 7,2. Fuente propia.

II) Se conect el reservorio que tiene el mismo buffer (de elucin) y se


dej equilibrar la columna.
III) Se destapo el tubo y se aplicsephasex la muestra en la parte
superior del Sephadex G-25, lavanda con el buffer para eliminar las
trazas de muestra que an queden en las paredes de la columna.
IV) Se agreg un exceso de buffer y se conect al reservorio.

Figura n5: sephadex G-5, lavanda con el buffer. Fuente propia.

V) Se colectaron fracciones de 0,5 mL por tubo. El tubo con mayor


intensidad de color representa el volumen de exclusin de la columna
(Vo o volumen muerto). Se determin con ms exactitud leyendo las
fracciones en espectrofotmetro a 620 o 260 nm.

OBJETIVOS
Conocer las diferentes tcnicas de cromatografas y determinar su uso
prctica dentro del campo de la biologa.

Realizar el experimento con la tcnica de cromatografa en capa fina


para separar e identificar muestras biolgicas.

Experimentar con la tcnica de cromatografa en columna como otra


opcin para identificar y separar compuestos de inters biolgico de una
mezcla.

Calcular el rate factor (Rf) del experimento de cromatografa en capa fina


como tambin el volumen relativo de elucin en cromatografa en
columna.
RESULTADOS

Cromatografia en Capa Fina

Ds

Dm

***Rf =Dm / Ds

MUESTRAS Dm Ds Rf
A (nuestro) 4.6 cm 5,9 cm 0,78 cm
B (otros) 0,4 cm 6,6 cm 0.06 cm

Cromatografia en columna
Volumen Volumen de Volumen
MUESTRAS Tiempo
muerto elucion total
A (nuestro) 20 ml 21 ml 41 ml 29.17 min
B (otros) 10 ml 20 ml 30 ml 17.18 min

Volumen relativo de elucin


*** Vr= Ve / Vo

Volumen relativo
MUESTRAS
de elucion
A (nuestro) 1.05 ml
B (otros) 2 ml
DISCUSIN
-Comparando la efectividad y rapidez entre las tcnicas de cromatografa
empleadas la cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente
a otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya
que lo que se emplea es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir
las separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor en
donde la fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La
fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general
menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se
desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los
compuestos orgnicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < flor <
cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos
< amidas. (4)
Mientras que en la cromatografa en columna se utiliza una columna de vidrio
vertical que se llena con un soporte slido adsorbente (fase estacionaria: los
ms utilizados son gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3). La muestra que se
quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la
columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase mvil) que,
por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna. Se
establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el
disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los
componentes de una mezcla establecer interacciones diferentes con la fase
estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes velocidades y se
conseguir su separacin. No obstante, a menudo los compuestos que deben
ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente
pequeas fracciones de eluatos (Cada una de las sustancias que migran a
travs del lecho de la fase estacionaria (impulsadas por la fase mvil) dentro de
un sistema de separacin cromatogrfico) en tubos rotulados y la composicin
de cada fraccin se analiza por cromatografa en capa fina. Una vez
identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se
renen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes
por mtodos espectroscpicos. (5).
Se puede inferir entonces que la cromatografa en capa fina es la ms fcil y
rpida ya que se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un
adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte
CONCLUSIONES
Efectivamente, se pudo conocer tericamente las diferentes tcnicas de
cromatografas expuesta en clase como la importancia biolgica que
representa esta tcnica para separar compuestos biolgicos que se
encuentran en una mezcla.
Se pudo realizar la tcnica de cromatografa en capa fina con xito como
tambin se pudo observar, separar e identificar el pigmento del material
biolgico utilizado que en este caso fue el de flores de varios colores.

Gracias al experimento de la cromatografa en columna se pudo conocer


que tambin puede ser una tcnica para separar compuestos biolgicos
purificados que se encuentran en una mezcla.

Se calcul con efectividad el rate factor de cromatografa en capa fina


gracias a los valores obtenidos en la medicin de la distancia recorrida
de la muestra como tambin la distancia recorrida por el solvente.
Tambin se pudo calcular el volumen relativo de elucin de
cromatografa en columna.

CUESTIONARIO
Cromatografa de capa fina
1. Qu criterios permiten elegir el solvente adecuado para separar
solutos?
La eleccin del solvente est directamente relacionada con el tipo de
reaccin y requiere tener en cuenta ciertas consideraciones. A la hora de
escoger el solvente se debe tener perfectamente estudiada la solubilidad
de los reactivos a la temperatura a la cual se tiene que realizar el
experimento. Cuando se deben realizar experimentos a temperatura
elevada se tienen que seleccionar disolventes de puntos de ebullicin
altos, como por ejemplo DMF, DMSO, N-metilpirrolidona, tolueno, xileno,
etc. (Grupo GIDOLQUIM; 2016).

2. Si de un fluido biolgico deseas separar los lpidos, cul sera el


tratamiento de la muestra, que soporte y que tipo de solvente
utilizara?

Se utilizaran actual mente 2 diferentes tipos de mtodos:


Para separar los lpidos de una muestra se utilizan habitualmente
tcnicas cromatogrficas, como la TLC o cromatografa en capa
delgada. La misma puede realizarse en forma monodimensional o
bidimensional, dependiendo de la naturaleza del compuesto a separar.
Se usara un solvente orgnico alcalino y como soporte una mezcla de
PH acido. (Shalom, F. 2017)
3. Cul sera el soporte y el solvente adecuado para separar
terpenos de esteroles?
Como solventes se pueden utilizar potasa etanlica y como soporte ter
etlico. (Cert, A. E tal. 1997)
Bibliografa
Grupo GIDOLQUIM. (2016). Tcnicas y Operaciones avanzadas en el
laboratorio qumico (TALQ). Universidad de Barcelona.
Shalom, F. (2017). Separacin de lipidos individuales y lpidos neutros.
Cert, A. ETAL. (1997). Determinacin de esterles y dialcoholes triterpnicos
en aceite de oliva mediante separacin de la fraccin por cromatografa lquida
de alta eficacia y anlisis por cromatografa de gases. Estandarizacin del
mtodo analtico. Instituto de la Grasa (C.S.I.C). Avda. Padre Garca Tejero 4.
Sevilla. E-41012. Espaa.

Cuestionario
Cromatografa en columna
1. Cul es la relacin entre el Peso Molecular de los solutos separados
por cromatografa en columna y el Volumen relativo de Elucin?
Es indirectamente proporcional ya que este es independiente del tamao
de la columna del gel(De esta respuesta no estoy seguro, no encontr
info solo estoy suponiendo por la info que nos dan en la gua)

2. Indique 03 soportes utilizados para la cromatografa de exclusin,


mencionando sus caractersticas.
Agarosa Sepharosa: Versatilidad qumica, Estabilidad fsica y Baja
absorcin no especfica.
Agarosa Biogel A: Este soporte es compatible con todos los tampones
de uso comn y se puede utilizar con tampones de alta sal sin cambiar
significativamente el volumen del lecho. Bio-Gel Se puede utilizar un gel
de 1,5 m a pH 4-13 ya 2-30 C.
Poliacrilamida Biogel P: son qumicamente inertes, transparentes y
estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza inica.
(biomodel)

3. Si tenemos una protena de 700 KDa y tiene como soporte para


cromatografa de exclusin sephadex G-25, sephadex G-75, sephadex
G-200, Cul de ellos utilizara? Justifique su respuesta.

En esa es la g-200 porque es la que permite pasar mayor peso


(Bioquimicaexperimental)

Bibliografa

http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm.
https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/cromatografc3
adas.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos
_6700.pdf
http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tip
us.html