You are on page 1of 9

Pemurnian dan karakterisasi tirosinase dari daun kenari(Juglansregia

)
Abstrak
Polifenol oksidase (PPO) adalah enzim tembaga tipe-3 mengkatalisis oksidasi senyawa
fenolik untuk turunan kuinon mereka, yang selanjutnya dikonversi ke melanin, pigmen
mana-mana dalam organisme hidup. Dalam penelitian ini tanaman berasal tirosinase
diisolasi dari daun kenari (Juglans regia) dan biokimia ditandai. Itu mungkin untuk
mengisolasi dan memurnikan enzim dengan cara metode ekstraksi dua-fasa air diikuti
dengan pemurnian kromatografi dan identifikasi. Menariknya, enzim menunjukkan
aktivitas monophenolase agak tinggi mengingat bagian utama dari PPO tanaman
dengan beberapa pengecualian hanya memiliki aktivitas diphenolase. Massa molekul
rata-rata 39.047 Da (Asp101 Arg445)ditentukan dengan sangat akurat dengan
spektrometri massa resolusi tinggi. Spesies tirosinase proteolitik diaktifkan ini
diidentifikasi sebagai oksidase polifenol yang sesuai dengandikenal jrPPO1
urutandengan peptida sequencing menerapkan nanoUHPLC-ESI-MS / MS. Polipeptida
backbone dengan urutan cakupan 96% ditentukan mulai dari Asp 101 dan tidak
melebihi Arg445.

Pendahuluan
Polyphenol oksidase (PPO) adalah metalloenzymes yang berisi pusat tembaga tipe-3
terjadi di banyak organisme termasuk tanaman, jamur dan bakteri(Mayer,2006;.
Selinheimo et al,2007). Perwakilan dari kelas ini adalah oksidase katekol, tyrosinases
dan lakase. Tyrosinases, kelas PPO bifunctional, menggunakan molekul oksigen untuk
mengkatalisis oksidasi berbagai monophenols ke o-diphenols (cresolase / kegiatan
monophenolase; EC 1.14.18.1), dan oksidasi berikutnya o-diphenols untuk yang sesuai
o-kuinon (catecholase kegiatan / diphenolase; EC 1.10.3.1). Katekol oksidase
mengkatalisis eksklusif oksidasi o-diphenols untuk o-kuinon, kurang reaksi
hidroksilasi(Mayer,2006; Mayer dan Harel,1979).Laccasa (EC 1.10.3.2) dapat
mengoksidasi lebar berbagai senyawa termasuk Aminophenol, monophenols, o- dan p-
diphenols dengan menghapus elektron tunggal dari mengurangi kelompok substrat dan
menghasilkan radikal bebas(Mayerdan Harel, 1979; Sanchez-Amat dan Solano,1997).

Melanines dihasilkan oleh polimerisasi kuinon yang sekarat-senyawa yang bertanggung
jawab atas kerusakan yang disebabkan browning banyak buah-buahan dan
sayuran(Martinezdan Whitaker, 1995; Yoruk dan Marshall,2003).Sementara fungsi
fisiologis dari PPO dalam banyak tanaman masih belum jelas, ada bukti kuat yang PPO
memainkan peran kunci dalam parasit dan patogen resistance di beberapa spesies.
Efek protektif PPO umumnya dikaitkan untuk generasi kuinon reaktif(Steffenset al.,
1994; Van Gelder et al., 1997; Vaughn et al.,1988).

Ketik-3 protein tembaga mengandung dua ion tembaga, masing-masing
dikoordinasikan oleh tiga residu histidin. Selama reaksi katalitik, jenis-3 pusat tembaga
tirosinase ada dalam tiga yang berbeda negara. Mengurangi deoksi negara [Cu (I) -Cu
(I)] mengikat molekul oksigen dan hasil di negara oxy [Cu (II) O2 2_-Cu (II)]. Dalam

UV / Vis spektroskopi dan analisis urutan (nanoUHPLC-ESI-MS / MS). Metode pemurnian dijelaskan dalam makalah ini memungkinkan isolasi yang sangat efisien dari dua bentuk dari kenari tirosinase. beberapa di antaranya mungkin penting dalam perlawanan patogen(Colaricet al. regia) diekstraksi dan dimurnikan dengan cara kromatografi cair protein cepat (FPLC) dan ditandai dengan molekul penentuan massa (SDS-PAGE. Ini juga diamati oleh Tremolieres dan Bieth (1984). jaringan herba kenari..2014). Target PPO dielusi akhir natrium klorida gradien bersama-sama dengan satu dari total tiga heme-protein co-dielusi. jrPPO1. Surya et al. Rompel et al. protein non-target dan lainnya senyawa hidrofobik. Menyiratkan beberapa percobaan karakterisasi (data tidak ditampilkan) dapat diasumsikan bahwa protein mengganggu adalah peroksidase a.. dielusi berturut-turut tapi efisien dipisahkan di . Escobar et al... peroksida terikat dalam al-g2: modus bridging g2(Kitajima et al. isoelectrical fokus (IEF). nanoESI-QTOF). di mana Cu (II) ion dijembatani oleh molekul air atau hidroksil ion(Solomonet al. Hal ini jelas ditunjukkan pada Gambar. polifenol diperoleh secara gratis dan solusi protein yang jelas sangat baik cocok untuk selanjutnya langkah pemurnian kromatografi. Oleh karena itu. (1999a.1996).. 2005. regia Metode ekstraksi yang diterapkan didasarkan pada teknik dijelaskan untuk tirosinase laten dari jamur (Agaricus bisporus) dan telah terbukti efektif(Mauracheret al. Dalam karya ini tirosinase dari daun kenari (J. yang dinamai urutan elusi kromatografi.Kenari (Juglans regia) PPO disebabkan memiliki resistensi patogen diduga sebagai awal 1911(Masaket al.1989). Hasil dan diskusi Ekstraksi dan pemurnian tirosinase dari J.. yang konstitutif dinyatakan dalam semua hijau. Piffaut dan Metche. Menggunakan kolom tukar kation (SP-Sepharose) sebagai pemurnian pertama Langkah terbukti menjadi sangat efektif dalam hal menghapus bagian utama dari protein non-target.Negara bertemu [Cu (II) -Cu (II)] diasumsikan sebagai keadaan istirahat dari situs tembaga..1991).Kenari daun memiliki kandungan tinggi berbagai polifenol.2012).1991).PPO dari daun kenari telah kurang dipelajari di masa lalu(Escobaret al.1911). membentuk 1 dan 2. (2008) menunjukkan bahwa PPO dari kenari dikodekan oleh gen tunggal.oxy negara. diidentifikasi dan ditandai dengan metodologi berdasarkan spektrometri massa memberikan informasi urutan dan massa sangat akurat. 2008.2006).Fraksi menunjukkan tirosinase tertinggi Kegiatan dikumpulkan dan dimuat ke tukar kation kedua Kolom (Monos) di mana dua bentuk utama dari tirosinase. 1A dengan mengikuti penyerapan di karakteristik nm 410 untuk heme prostetik kelompok. Beberapa pemisahan dua fasa air berturut-turut menggunakan triton X-114 dan PEG-4000 (polyethylene glycol) menghasilkan kuantitatif penghapusan pewarna hidrofobik. Pentingnya fungsional dari PPO-kegiatan dalam walnut hull pertama kali dijelaskan pada tahun 1991(Piffautdan Metche.

Eicken et al. Identifikasi protein dan konfirmasi Urutandiisolasi dan dimurnikan dua bentuk tyrosinases jelas diidentifikasi sebagai PPO1 J. Wu et al.. Dalam bentuk non berkurang ini enzim menampilkan mobilitas elektroforesis yang lebih tinggi. yang mungkin karena konformasi lebih kompak.awal gradien (lihat Gambar.).25 (ProtParam. Ini cocok dengan pI secara teoritis dihitung dari 5. Di-gel aktivitas diukur berikut non mengurangi SDS-PAGE sebagai pengurangan merugikan aktivitas enzim. Empat isoform PPO dimurnikan dari mantel dan polong kacang hijau (Phaseolus vulgaris L.2010). Oleh karena itu. masing-masing (lihat Gambar.2.: COLU17) seperti yang dijelaskan di bawah ini. masing-masing(Guoet al. Dalam kondisi non- mengurangi jembatan disulfida utuh dan karena itu dapat menstabilkan konformasi enzim (lihat Gambar.35 untuk jrPPO1 (Asp101-Arg445) (UniProt . Saat ini enam urutan asam amino (PPO1 ke 6) dikenal untuk oksidase polifenol yang berasal dari Agaricus bisporus(Liet al. Escobar et al. Wichers dkk.. Weijn et al.org) sesuai dengan urutan asam amino yang diidentifikasi jrPPO1 (Asp101-Pro444) dan pI 5.. dan mereka berat molekul yang diperkirakan 57. 46 dan 39 kDa. 1C / D dan 2). IEF (kedua sampel diterapkan) mengakibatkan dua tempat pada pI 5. 2013.91 (jrPPO1 (Asp101? Pro444)) dan 71 (jrPPO1 (Asp101? Arg445)) peptida tryptic diidentifikasi dan tercantum dalam Tabel 1 (jrPPO1 (Asp101? Pro444)) dan Tabel 2 (jrPPO1 (Asp101? Arg445)).tetapi proteolitik dibelah pada yang berbeda posisi dimurnikan dan dikarakterisasi..2008). dua bentuk tirosinase terpisah dan dimurnikan membedakan diri mereka dalam memiliki atau kurang asam amino terminal Arg445. Sering isoform dari polifenol oksidase yang ditemukan selama isolasi dan pemurnian. masing-masing. 54. 2C). 2A).. Sedangkan.1 dan 5.: COLU17. 2014.2008)dengan cara nanoUHPLC-ESI- MS / MS menghasilkan cakupan urutan maksimum 96% (jrPPO1 (Asp101? Pro444)) dan 96% (jrPPO1 Asp101? Arg445)) kuning disorot dalam Gambar. 2003..5. baik bentuk menunjukkan sebuah band tunggal pada sekitar 39 kDa (lihat Gambar. Sedangkan tidak ada band yang berhubungan dengan protein non-target yang terlihat. (1998) terisolasi dua oksidase katekol dengan sekuens asam amino yang berbeda dari ubi jalar (Ipomoea batatas) yang memiliki massa molekul 39 dan 40 kDa. Hal ini dikonfirmasi juga oleh penentuan massa protein utuh oleh nanoESI-QTOF. 2011.3. ExPASy.2009). Pada kolom tukar kation (Monos) protein heme tersisa (peroksidase) bisa sangat efektif dipisahkan dari tirosinase (lihat Gambar. Selain itu.Dalam naskah ini telah dibuktikan bahwa dua bentuk kenari tirosinase. 1B). yang timbul dari yang sama gen (jrPPO1. Studi elektroforesis Kemurnian dari dua bentuk tirosinase ditentukan dengan sodium dodesil elektroforesis sulfat poliakrilamida gel (SDS-PAGE). Escobar et al. regia (UniProt .. 1B). 2B).. Mauracher et al. seorang cakupan peptida hampir lengkap dari wilayah inti utama . Untuk memoles alasan fraksi dari dua bentuk tirosinase secara terpisah diterapkan untuk kolom yang sama tukar kation (Monos) menghasilkan sangat tinggi kemurnian dua spesies tirosinase (lihat Gambar.

.2010)dan jamur tyrosinases (Ismaya et al. 1997. Mauracher et al. dapat diasumsikan bahwa penghapusan proteolitik dari bagian C-terminal enzim terjadi in vivo atau disebabkan oleh non-serin protease kasih sayang.. Thr443. 5A (mulai dari sekitar 28 hingga hingga lebih dari 40 tuduhan) menunjukkan Kehadiran satu spesies protein D mayor..1998)ditemukan untuk semua PPO eukariotik dikenal dalam literatur tidak dapat dideteksi.793 Da (STD kurang dari 1 Da).3).1 Da) dan A = 38.Hal ini juga dikonfirmasi oleh massa peptida analisis yang . Untuk dekonvolusi dari negara biaya distribusi ditunjukkan dalam inset (a)(Gambar.. masing-masing. batatas katekol oksidase(Klabundeet al. molekul rata-rata massa untuk spesies D utama dapat dinilai sebagai 39. saat berpasangan dengan meningkatkan Mr dan satu spesies protein kecil C.4A (mulai dari sekitar 28 untuk sampai dengan lebih dari 40 tuduhan) mengindikasikan kehadiran satu spesies protein utama C saat berpasangan dengan meningkatkan Mr dan dua yang berlimpah minor A. Sistein-histidin tioeter jembatan dilaporkan untuk urutan I. Pengukuran nanoESI-QTOF-MS memberikan bukti untuk Kehadiran dua spesies C mayor (Asp101? Pro444). B (terjadi bersama-sama dengan C) yang yang cukup disimpulkan sebagai bentuk protein menjadi proteolitik dibelah pada posisi yang berbeda dari inti utama polipeptida- chainend sebagaimana ditentukan dalam Gambar. Distribusi muatan negara ditampilkan dalam inset (a) Gambar.4A). A zoomedin bagian dari spektrum ini ditunjukkan pada Gambar. 2014. 5 menunjukkan spektrum massa jrPPO1 (Asp101? Arg445).890 Da (STD kurang dari 1 Da). (b) menunjukkan jelas bahwa setiap puncak spesies memiliki bahu (Dm _ 16 Da atau 32 Da) mungkin karena kehadiran teroksidasi dan non teroksidasi spesies.692 Da. B = 38.Neurospora crassa tirosinase(Lerch. Perbedaan massa antara spesies proteolitik akurat sesuai dengan asam amino Pro442. Van Gelder et al. 15 puncak yang berbeda yang digunakan untuk spesies utama C. B. dan Arg445 (lihat Gambar. Penentuan massa molekul Spektrum massa pada Gambar.1998).. Peptida membawa jembatan tioeter umum(Gielenset al.000 dan akurasi massa yang lebih baik dari 5 ppm. Pro444.1997). hidroklorida Benzamidine.1982).1 Da) dan C = 38. dan setidaknya 10 puncak dengan cukup sinyal untuk rasio kebisingan untuk spesies A dan B. Klabunde et al.890 Da (STD kurang dari 0.. Gambar. D (Asp101? Arg445) dan dua spesies minor A. 4diperbesar inset B.ditemukan sebelumnya wilayah transit yang peptida (Met1-Ala100) serta bagian C- terminal (Lys446-Gly603) yang hilang(Flurkeydan Inlow.047 Da (STD kurang dari 0. 2011.Memberikan fakta bahwa agen protease penghambatan (PMSF. 4B dan 5B. 4 menunjukkan spesies pertama jrPPO1 (Asp101? Pro444) diperoleh dengan instrumen nanoESI-QTOF dengan resolusi (FWHM) dari 40. Dengan asumsi bahwa muatan positif (z) negara semata-mata disebabkan oleh perlekatan z proton massa molekul rata-rata untuk spesies utama C bisa dinilai sebagai 38. Itu biaya distribusi negara ditampilkan dalam inset (a) pada Gambar. baik inhibitor serineprotease) digunakan selama ekstraksi..2008).Vitis vinifera polifenol oksidase(Viradoret al.

1 s_1 (L-dopa)(Goldfederet al. bagaimanapun..4 s_1 (L-dopa)(Espinet al. Klabunde et al. UV / Vis spektroskopi studi UV / Vis spektrum asli jrPPO1 (Asp101? Pro444) adalah disajikan pada Gambar.8 s_1 menuju L-tirosin dan nilai kcat dari 199.1999b). dapat diasumsikan bahwa baik penghapusan proteolitik dari bagian C-terminal enzim tidak memiliki tempat pembelahan preferensial yang berbeda namun daerah (Pro442-Arg445)... Dengan demikian.3). C-terminal fringing disebabkan oleh exo-peptidases C-terminal in vivo atau selama ekstraksi. 16 tyrosines. sedangkan tyrosinases dari jamur. Rompel et al. 1998.Kejenuhan jrPPO1 tercapai dengan penambahan dua Setara H2O2. 1980.Memberikan nilai kcat 20.. karena biaya transfer (CT) transisi O22_ (p/r)? Cu (II) (dx2 _ y2). Selain H2O2 menyebabkan peningkatan pita serapan di 345 nm (e345 = 12.namun proteolitik dicerna pada posisi yang berbeda. 1992..6.= 761 M_1 cm_1 per protein). Himmelwright et al.Khususnya.).1998. bakteri dan mamalia ditandai kinetis dengan baik. 2008).. 18 phenylalanines. parameter kinetik Parameteryang diperoleh pengukuran Michaelis-Menten kinetik dilaporkan dalam Tabel3.Penyerapan maksimum terjadi pada 280 nm dan bahu signifikan pada 292 nm menunjukkan adanya beberapa residu triptofan dalam urutan asam amino.9 s_1 (L-tirosin) dan 107.Untuk semua jenis-3 tembaga enzim penyerapan maksimal lemah di 345 nm diamati.Dengan demikian.2014)dua bentuk kenari tirosinase dari gen yang sama (jrPPO1. 1979. atau situs berbeda adalah Arg445. Penyerapan band di 580 berkorespondensi nm ke O22_ kedua (p/v)? Cu (II) (dx2 _ y2) CT transisi sebagai ditemukan di oxy hemocyanin dan oxy tirosinase(Eickmanet al.984 M_1 cm_1 per protein) dan 580 nm (e580 . yang efisien diisolasi dan dimurnikan dengan identitas. Rompel et al. Penutup Dengan menerapkan metode dimodifikasi dan disesuaikan pemurnian diterbitkan sebelumnya dari kelompok kami(Mauracheret al.3 s_1 terhadap L-dopa enzim memiliki aktivitas monophenolase.2013). hanya catechol oksidase dari tanaman mendapat perhatian sebanding dalam literatur(Eickenet al.. batatas(. 1998... The akurat molekul massa ditentukan dengan cara spektrometri massa resolusi tinggi memungkinkan pengurangan tulang punggung enzim polipeptida. yang juga ditemukan di sama sebesar di katekol oksidase urutan asam amino dari I.0 s_1 (Ltyrosine) dan 44.2000) dan Bacillus megaterium tirosinase dengan nilai kcat dari 4. 1998.menemukan semua jenis yang mungkin utama inti end peptida (lihat Gambar.Relatif nilai kcat tinggi dari dimurnikan jrPPO1 menghasilkan klasifikasi sebagai tirosinase a. 1974. batatas mana penambahan dua ekivalen H2O2 menyebabkan kejenuhan (Eickenet al. Solomon et al. 8 tryptophans dan 9 histidine hadir di matang jrPPO1 (Asp101? Pro444).Eicken et al.. di silico massa tulang punggung Asp101? Pro444 dan Asp101? Arg445 cocok dengan . Jolley et al.1994)..2012).dan diphenolase lebih tinggi sebagai enzim dalam literatur bisporus tirosinase misalnya Agaricus dengan nilai kcat 7.. Hasil ini sangat mirip dengan oksidase katekol dari Melissa officinalis dan oksidase 40 kDa katekol dari I. Escobar et al.

1) memiliki aktivitas katalitik yang sebanding terhadap L-tyrosine juga lainnya tyrosinases ditandai. 4 _C. UV / Vis spektroskopi Hasil diverifikasi bahwa tirosinase dari J.10.massa molekul ditentukan dari 38.500 rpm pada 15 _C selama 15 menit) yang diulang dua kali. Ekstraksi tirosinase dari J. pH 4.5% (b / v) natrium askorbat.500 rpm) selama 30 menit pada 4 _C dan pelet dibuang. Berikut sentrifugasi sebuah (14. regia berisi jenis-3 pusat tembaga. Supernatan yang mengandung larut tirosinase dibawa ke 30% (176 g / L) saturasi dengan amonium sulfat dengan pengadukan kontinyu pada 4 _C.500 rpm. (2014) dengan beberapa modifikasi. 4% (v / v) triton X-114. Percobaan kinetika diklasifikasikan enzim sebagai tirosinase (EC. Supernatan disaring melalui filter kasar (kain tipis) dan diperlakukan dengan amonium sulfat (15 g / L) untuk mendapatkan pemisahan fase. 1. 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). regia tirosinase diekstraksi seperti yang dijelaskan oleh Mauracher et al. Setelah 30 menit pengadukan larutan disentrifugasi (14. percobaan Bahan tanaman daun Walnut dipanen dari beberapa pohon di sekitarnya Wina (Juni-September 2012) dan disimpan pada _80 _C dalam freezer sampai digunakan. Suspensi disentrifugasi pada 14. Untuk pemurnian lebih lanjut. Protein terikat dielusi dengan gradien linier natrium klorida (0-1 M) pada laju alir dari .18. GE Healthcare. Pelet protein yang diperoleh kemudian disaring melalui botol filter atas dan diresuspensi dalam 20 mM natrium buffer asetat. Hal ini juga dikonfirmasi analisis oleh spektrometri massa peptida.5.500 rpm (Beckmann XP26.500 rpm pada 15 _C selama 15 menit) dan penghapusan diperbolehkan dari deterjen yang fase kaya (fase yang lebih rendah). 1. The dimurnikan dan jelas supernatan yang mengandung tirosinase larut dibawa ke 80% (351 g / L) saturasi dengan amonium sulfat dan disimpan semalam di 4 _C. diameter = 2. 2 mM Benzamidine hidroklorida. Setelah penambahan dua setara H2O2 oxy penuh bentuk tirosinase dikembangkan.5 sampai konduktivitas yang di bawah 9 mS / cm.3. Proses ini didukung oleh sentrifugasi (14. Langkah ini adalah diikuti dengan penambahan berikutnya dari 3.500 rpm (4 _C) selama 30 menit dan supernatan diencerkan dengan 20 mM natrium buffer asetat.047 Da. Pemurnian tirosinase oleh Cepat Protein Liquid Chromatography Supernatan dimuat ke kolom tukar kation (SP-Sepharose FF. pH 4. pH 4. 40 mM L-prolin. 0. PEG-4000 dilarutkan dengan konsentrasi 4% (w / v) dalam supernatan pada 4 _C.6 cm) dan diseimbangkan dengan 20 mM natrium asetat. Larutankemudian disentrifugasi pada 14.890 dan 39.5% (b / v) PEG-4000 dan sentrifugasi (14. panjang = 10 cm.1 dan EC.14. rotor: JLA 16.250) selama 15 menit pada 4 _C. 10 menit) yang dihasilkan fase PEG (fase atas) dibuang. Sekitar 1 kg daun beku yang dicampur dan tergantung di 2 L penyangga ekstraksi (125 mM natrium sitrat. masing-masing.5.

SDS-PAGE dilakukan menurut metode Laemmli (1970) menggunakan Presisi Ditambah Protein Standar Warna Dual (Bio-Rad) sebagai penanda berat molekul. masing-masing. 0. Itu larutan protein kemudian diterapkan pada kolom Monos HR 5/50 Gl (kation kolom pertukaran. 1C / D). (membran eksklusi ukuran dari 10 kDa) disaring Ultra dan disentrifugasi (4000 rpm.033 mM L-tirosin sebagai substrat dan 10 lL dari larutan enzim. Proteinkonsentrasi konsentrasiprotein ditentukan dengan metode Bradford (1976) menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. 1. Data diplot sebagai 1 / V dan 1 / [S] konsentrasi sesuai dengan metode Lineweaver Burk dan (1934). panjang = 50 mm. GE Healthcare. Aktivitas enzim assay selama pemurnian Aktivitas enzim selama pemurnian itu dipantau oleh pengukuran spektrofotometri (Shimadzu UV-1800).5 mM SDS. 0. 4 _C) untuk menghapus natrium klorida.49 dan 0. Fraksi yang mengandung bentuk protein dielusi kedua pertama dan secara terpisah dikumpulkan dan lagi dimuat di Monos HR 5/50 Gl kolom di bawah kondisi yang sama untuk menghapus non-target lanjut protein dalam langkah pemolesan akhir (lihat Gambar. Monophenolase Kegiatan ditentukan dengan mengukur tingkat kenaikan absorbansi di 305 nm dan 25 _C.5 mengandung 2. semua dikumpulkan fraksi diuji photometrically untuk monophenolase dan aktivitas diphenolase. pH 6. diameter = 5 mm) dan dielusi dengan gradien linier natrium klorida (0-0.98. Enzim analisis kinetik The Michaelis-Menten konstan (Km) dan reaksi maksimum kecepatan (Vmax) ditentukan dengan menggunakan dua substrat (L-Dopa dan L-tirosin) di lima konsentrasi yang berbeda (1. 1B).7 M) pada laju alir 1 mL / menit. Kegiatan Diphenolase ditentukan melalui absorbansi pada 400 nm dan 25 _C. Satu unit (U) aktivitas enzim didefinisikan sebagai perubahan dalam 1 absorbansi Unit / min / ml.96. Dua tes enzim yang berbeda dilakukan. Reaksi dilakukan dalam 1 cm cuvette kuarsa menggunakan 1 mL dari 10 mM penyangga natrium fosfat. 5 mM 4-tert-butylcatechol sebagai substrat dan 1 lL larutan enzim.5 mL / menit (lihat Gambar. Substrat dilarutkan dalam 50 mM natrium penyangga fosfat pH 6. 0. Campuran reaksi (1 mL) terdiri dari 125 mM natrium sitrat penyangga. Dua bentuk dielusi pada konduktivitas dari 13 dan 16 mS / cm (lihat Gambar. Penentuan massa molekul Massa molekul enzim murni ditentukan oleh denaturating SDS-PAGE. pH 5.4. sampel yang .5.30. 1A). Isoelectrical fokus Isoelectrical berfokus dilakukan dengan menggunakan sel IEF Protean (Bio-Rad) dan IPG-garis dengan kisaran pH 4-7 sebagai penanda. Fraksi yang mengandung aktivitas yang dikumpulkan.29 mM).

. Identifikasi protein dan urutan konfirmasi 2 lg dari kedua bentuk protein yang dimurnikan lebih lanjut untuk LC-MS / MS analisis dengan 1D SDS-PAGE.0 l / min. 2% asetonitril. Setelah itu asetonitril (ACN) dan asam format ditambahkan ke konsentrasi akhir 25% (v / v) ACN dan 0. Protein divisualisasikan dengan Coomassie pewarnaan dan band yang sesuai dengan bentuk dipotong. Sebelum pengukuran MS.05% (v / v) asam format. tetapi tanpa smercaptoethanol di loading dye. Untuk di-gel aktivitas tirosinase pewarnaan sebagian denaturating 10% SDS-PAGE dilakukan seperti yang dijelaskan di atas.00 eq. Sampel yang diuji dalam kuvet kuarsa dengan ketebalan lapisan 1 cm panjang jalur.339 dengan mencari melawan J. Kompleks perokso dibuat dengan menambahkan 0.3. Thermo Scientific). Gel diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue. Electrospray ionisasi Mass Spectrometry (ESI-MS) adalah dilakukan pada spektrometer massa nanoESI-QTOF (Maxis 4G UHR-TOF. tingkat penemuan palsu (FDR) dari pertandingan spektrum peptida (PSM) ditetapkan untuk <0. gas kering: 6. Gel direndam dengan 10 mM natrium penyangga fosfat pH 6.033 mM L-tyrosine untuk kegiatan pewarnaan. regia fasta file dari Database UniProt (COLU17). dalam rangka untuk mengurangi konsentrasi garam untuk minimum.0.000 rpm) dan buffer Sistem diubah menjadi 5 mM amonium asetat pH 5. H2O2 ke tirosinase dalam buffer 50 mM HEPES. Advion Biosiences.0.4 kV. Analisis sampel dilakukan dengan nano UHPLC-ESI-MS / MS menerapkan spektrometer massa Orbitrap resolusi tinggi (Dionex Ultimate 3000 RSLCnano. Q Exactive Orbitrap. Analisis data dilakukan dengan Proteome Penemu 1. Pencernaan dilakukan dengan tripsin serta kimotripsin dan peptida dielusi dari irisan gel oleh ultrasonication. UV / Vis studi spektroskopi spektrum Terlihat dan ultraviolet dipantau oleh 2-beam cuvette fotometer (Shimadzu UV-1800) dengan 10 mM natrium buffer asetat pH 5. Bruker.5 yang mengandung 0.50-6. Nanomate. Untuk keyakinan tinggi dari data MS.diterapkan untuk 10% poliakrilamida gel dicampur dengan mengurangi beban pewarna. pencitraan dari gel dilakukan dengan Gel Doc ™ XR dari BIO-RAD. Sampel peptida benar-benar dikeringkan dengan sentrifugasi vakum dan disimpan pada _20 _C untuk LC-MS / Analisis MS. pH 7.0. Toleransi massa peptida adalah 5 ppm dengan jumlah maksimum 2 terjawab perpecahan.1% asam format). digabungkan dengan perangkat robot nanospray. solusi enzim dimurnikan itu yang ultra disaring dengan sentrifugasi (14. carbamidomethylation dari sistein ditetapkan sebagai modifikasi statis sedangkan oksidasi metionin adalah satu-satunya modifikasi dinamis. Sasaran pita protein dipotong dan digunakan untuk identifikasi protein. 0.01 (Proteome Penemu). untuk melestarikan aktivitas enzim. tegangan: 1. pemanas kering 150 _C). Irisan gel destained dengan 30% asetonitril / 100 mM NH4-HCO3 diikuti oleh sistein carbamidomethylation menerapkan dithiothreitol dan Iodoacetamide.9% H2O.0 sebagai acuan (220-800 nm). Sampel dilarutkan dalam 5 lL 30% asam format dan diencerkan dengan 40 lL eluen A (97.

Dukungan keuangan oleh '' Fonds zur Forderung der wissenschaftlichen Forschung '' (FWF) di bawah P25217-N28 adalah rasa syukur diakui.Ucapan Terima Kasih Penulis berterima kasih kepada Universitas Wina untuk keuangan dukungan dari program pelatihan pascasarjana berjudul '' Fungsional Molekul '' (memberikan no. . IK I041-N).