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CÓDIGO: P-SA-85

FECHA DE
14/10/2015
GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN:
DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01

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GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ
REFERENTE DE LABORATORIO SECRETARIO DE SALUD REPRESENTANTE DE LA
REPRESENTANTE DE CALIDAD DIRECCIÓN
DIRECTOR (S) TECNICO (S)

CÓDIGO: P-SA-85

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1. OBJETIVO

Establecer una guía de las actividades para la validación de métodos de ensayo
normalizados y empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los
métodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede
aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.
Regular o sistematizar los métodos para la validación de las instrucciones de ensayo y de
calibración.

El objetivo de la validación es probar la aptitud de los métodos, así como la capacidad del
laboratorio. La validación se apoya en los parámetros estadísticos del procedimiento.

Los procedimientos y el alcance de la validación no son siempre los mismos y deben ser
establecidos individualmente.

2. ALCANCE

Esta guía se debe aplicar a todos los métodos de ensayo establecidos en el Laboratorio de
Salud Pública del Meta.

3. DEFINICIONES

• Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se
han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación especifica prevista.
• Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se
han cumplido los requisitos especificados.
• Valor Verdadero Convencional (De una Magnitud): Valor atribuido a una
magnitud particular, y aceptado a veces por convención, porque la representa, con
una incertidumbre apropiada, para un fin dado.
• Mesurando: Magnitud particular sometida a medición.
• Incertidumbre de Medida: Parámetro asociado al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonables atribuidos al
mesurando.
• Exactitud de una Medición: Proximidad entre el resultado de una medición y el
valor verdadero del mesurando.
• Repetibilidad (De los Resultados de las Mediciones): Proximidad entre los
resultados de mediciones sucesivas del mismo mesurando, realizadas bajo las
mismas condiciones de medición. (Aplicación de un mismo procedimiento, a un
mismo objeto, por le mismo operador, en intervalos cortos de tiempo, con el mismo
equipamiento instrumental, en el mismo lugar).
• Reproducibilidad: Proximidad entre los resultados de mediciones de un mismo
mesurando, realizadas bajo distintas condiciones de medición.

se plantea la duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real del analito. para un dado nivel de confianza. tales como tiempo. La señal del fondo es producida por el blanco y exhibe ruido. Para el análisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que sólo se emplean valores atribuibles al analito. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 3 DE 26 • Precisión Intermedia: Magnitud que relaciona la variación en los resultados observados cuando uno o más factores. . Típicamente el valor de k es igual a 3 (LD = 3σF) Los valores por encima del LD pueden ser atribuidos a la presencia del analito y los valores por debajo del LD son indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables. • Límites de Cuantificación: Es la menor cantidad que puede ser determinada cuantitativamente con una incertidumbre asociada. El límite de cuantificación es entre 3 y 10 veces el LD (LD = 3σF). operador. El límite de detección (LD) corresponde a una señal k veces la desviación estándar del ruido del fondo. 4. equipamiento. RESPONSABLE La aplicación de este documento es responsabilidad del personal del Laboratorio de las áreas de Vigilancia del ambiente y atención a las personas en la realización de los ensayos. según cada caso. varían dentro de un mismo laboratorio. • Límite de Detección: Es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con cierto nivel de confianza especificado. Para un resultado analítico que es muy cercano al valor del blanco.

Cualquier variación en el método normalizado implica la repetición de dicha confirmación. en el futuro. Disminuye el número de fallas y repeticiones. GENERALIDADES 5. 5. La validación es un proceso experimental por el cual se establece mediante estudios de Laboratorio que las características de diseño del método analítico cumplan los requerimientos (metodológico y estadístico) para la aplicación analítica propuesta. previo a su uso en ensayos. la validación garantiza que el procedimiento escrito es lo suficientemente detallado como para que distintos analistas o laboratorios obtengan resultados comparables cuando lo utilicen. confianza. Tipos de Validación • PROSPECTIVA: Proceso de validación para metodologías nuevas que se diseña y comienza a realizarse en el presente.1. . reducir costos. limitaciones. que incluye la estimación de las medidas de precisión y exactitud aplicables a cualquier método analítico.1. es necesario demostrar que sus resultados son aceptables. seguridad en el método analítico y en la calidad de los resultados obtenidos en el laboratorio de trabajo. Se valida para asegurar la calidad.1. El laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados. La validación consiste en valorar si la precisión y la exactitud que se obtienen siguiendo el procedimiento son adecuadas para el problema.1. • RETROSPECTIVA: Proceso de validación para metodologías que actualmente se están aplicando. aumentar la productividad cumplir con la normas establecidas. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 4 DE 26 5. el análisis se realiza en el presente. pero con datos del pasado obtenidos en un momento puntual.1. DESARROLLO 5. CONDICIONES GENERALES Antes de que un procedimiento pueda proporcionar información analítica útil.1. Involucra el desarrollo de un protocolo. pero los datos se analizan transcurrido un determinado tiempo. ventajas. Además. Los equipos también deben ser calibrados y/o validados antes de su uso. y la validación determina las características de operación.

5. por lo menos.2. para el caso de la validación de un método analítico general.2. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 5 DE 26 • REVALIDACIÓN: Repetición total o parcial de una validación. • TRANSFERENCIA DE VALIDACIÓN: Confrontación de resultados de pruebas de adecuación y análisis en paralelo. Declaración del método frente a su aptitud frente a las especificaciones y uso previsto 5. 2.1.2.2.1. Determinación de los parámetros estadísticos del procedimiento. Definición de los atributos del método a validar (Por ejemplo: Límite de detección 1mg/l. métodos similares y/o guías de validación. de dos muestras homogéneas obtenidas por el equipo que realizará la validación y el equipo que aplicará la técnica validada 5.1.1. Establecimiento de las condiciones Las condiciones de la validación se encuentran definidas por el método en su documento normativo. Valoración de los resultados de la validación por comparación de los parámetros estadísticos obtenidos con las condiciones y decisión sobre la validez del procedimiento para el propósito establecido mediante la ejecución del protocolo. incertidumbre de los resultados < 20% en todo intervalo de trabajo.1. Elaboración del informe de validación F-SA-141 6. 5. De no ser así se deben establecer apoyados en soportes científicos. Establecimiento del Alcance de la Validación . Elaboración del protocolo de validación F-SA-140 3. por la introducción de algún cambio que se espera afecte la bondad de un método validado.2.1. intervalo lineal mayor a 2 órdenes de magnitud.1.1. Establecimiento de las Condiciones y Alcance de la validación 5. 4. PRINCIPIOS DE LA VALIDACIÓN Cada validación de un procedimiento consiste en tres pasos: 1.

validado por otro organismo. Método de Ensayo Objetivos de la Validación Caso 1. que ha sido publicado. Tabla 1: Objetivos de la validación según el tipo de procedimiento de ensayo. otra matriz. Tabla 2: Alcance de la validación según el tipo de procedimiento de prueba. . del cual dependerá los atributos y especificidad del protocolo de validación: 1. exactitud del método original no depende de la modificación introducida. Método No Normalizado: Se trata de una modificación a un método de ensayo normalizado. Método Normalizado: Se trata de un método de ensayo estandarizado. generalmente comunidades científicas y que se aplica exactamente como está descrito en la norma. Comprobación de que el laboratorio ha Método normalizado estandarizado el ensayo y lo utiliza correctamente. 2. robustez del ensayo y que el laboratorio ha estandarizado el ensayo y lo utiliza correctamente. La validación en los casos descritos tiene objetivos distintos y por lo tanto diferentes puntos esenciales como muestra la tabla 1. Comprobación de que la repetibilidad. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 6 DE 26 Para definir el alcance de la validación se tendrá en cuenta el tipo de ensayo. Caso 2. se hicieron modificaciones a los métodos descritos en la norma que pueden tener una repercusión sobre la calidad de los resultados. la Modificación de un reproducibilidad. la precisión intermedia y la método normalizado. por ejemplo. Ejemplos: Un método de extracción diferente.

límite de detección (Siempre y cuando se indiquen en la norma). El alcance de la validación deberá establecerse en el protocolo de validación F-SA-140 y. repetibilidad. Modificación de 4.) Comprobación del cumplimiento de los Método normalizado parámetros estadísticos. Parámetros DETERMINADOS Las guías internacionales sugieren que de acuerdo al método se validen y/o verifiquen los siguientes atributos: . 1. exactitud.) Además de lo indicado para el caso 1 de esta un método normalizado.1. 3.3. probar parámetros estadísticos determinados. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 7 DE 26 Método de Ensayo Objetivos de la Validación Caso 1. Tabla. los principios aplicados deben registrarse en el informe de validación F- SA-141.1. 2.) Elaboración de cartas de control analizando un material de referencia. 5. Caso 2. en caso necesario.) Participación en ensayos interlaboratorios.2. Ejemplo: incertidumbre de los resultados.

así: − SA = kCA . el volumen y la absorbancia. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 8 DE 26 Linealidad El análisis de una muestra genera una señal química o física de una magnitud proporcional a la cantidad de analito existente en la muestra. ejemplos habituales son la masa. podrá expresarse como: − SA = knA . Si una técnica revela la cantidad absoluta del analito existente en la muestra. la señal proporcionada por el análisis. Para nuestros fines. En muchos casos es interesante comparar los resultados de la recta de regresión obtenida con el analito puro con los correspondientes al analito en . conjuntamente se determina el rango lineal. SA. Además. según que la señal sea proporcional a una cantidad absoluta del analito o que lo sea a una cantidad relativa. es decir el intervalo comprendido entre la concentración mínima y máxima del analito para cual el método ha sido probado. es conveniente dividir las técnicas analíticas en dos clases generales. − Una segunda clase de técnicas analíticas son las que responden a la cantidad relativa del analito. − Donde nA son los moles o gramos del analito de la muestra y k es una constante de proporcionalidad. − La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad que existe entre la concentración del analítico y su repuesta o señal. − Donde CA es la concentración del analito en la muestra. La señal puede ser cualquier cosa que podamos medir.

Como se distribuyen aleatoriamente alrededor del valor central. por ejemplo. expresados como CV%. siempre que el número de mediciones sea lo suficientemente grande. utilizando las mismas soluciones y el mismo instrumental. La precisión es una medida del grado de precisión intermedia y repetibilidad del método analítico bajo las condiciones normales de operación y está relacionada con el coeficiente de variación. En estas circunstancias. Como la precisión intermedia abarca un número mayor de fuentes de variabilidad. podrán calcularse aplicando la ecuación de Horwitz. Los errores que afectan a la distribución de las mediciones alrededor del valor central se llaman aleatorios y se caracterizan por variaciones tanto de magnitud como de sentido. los valores teóricos de repetibilidad (RSDr) y precisión intermedia (RSDR). nunca puede ser mejor que la repetibilidad. Ecuación de Horwitz Si no se dispone de un método con el cual comparar los parámetros de precisión. la precisión del análisis solo afecta a la media o a la mediana. Repetibilidad Es la precisión obtenida cuando todas las mediciones son hechas por el mismo analista durante un solo período de trabajo analítico.1505 . La falta de correspondencia de las rectas nos indica que hay interferencia por matriz Precisión La precisión es la medida de la dispersión de los datos en torno a un valor central y puede expresarse como rango. Por lo general la precisión se divide en dos categorías: Repetibilidad y precisión intermedia. los errores positivos y negativos tienden a compensarse. PRSDR% = 2C -0. por distintos analistas o en distintos días de trabajo de laboratorio por un mismo analista. Los errores aleatorios no afectan necesariamente a la exactitud de un análisis. desviación estándar o varianza. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 9 DE 26 la matriz. Precisión intermedia Es la precisión obtenida en cualquier otro conjunto de condiciones.

se considera aceptable cuando su coeficiente de variación CV% experimental (RSDR) es inferior al valor calculado con la ecuación teórica. expresada como tanto por uno. c. Variación de la precisión intermedia estándar relativa (RSDR) en función de la concentración. El cálculo del criterio de aceptabilidad para la imprecisión se realizará acorde a las especificaciones de la AOAC “Official Methods of Analysis” . los valores tomados de esta curva son indicativos de la precisión alcanzable y aceptable del método analítico por diferentes laboratorios. En general. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 10 DE 26 Donde c es la concentración del elemento analizado expresada en ppm ó mg/L y RSDR % representa la desviación típica relativa calculada a partir de los resultados obtenidos en condiciones de precisión intermedia [(SR / x) x 100] Según Horwitz. Su aplicación proporciona un medio satisfactorio sencillo de evaluar la aceptabilidad de la precisión del método. Los valores calculados con la ecuación de Horwitz se consideran límites razonables de variabilidad que permiten comparar y calificar la precisión de cualquier método analítico en función de la concentración del analito determinado en una muestra. la precisión del método analítico bajo condiciones de precisión intermedia.

La más utilizada es la recuperación. la menor diferencia en la cantidad de analito que puede detectarse será para cada caso: Delta nA = Delta SA / k Delta CA = Delta SA / k La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. todas las medidas individuales son demasiado grandes o demasiado pequeñas. etc. El límite de detección es la menor cantidad de analito que puede detectarse con seguridad. Sensibilidad La capacidad para demostrar que dos muestras tienen distintas cantidades de analito es una parte esencial de muchos análisis. Se debe diferenciar claramente entre dos tipos de sensibilidad: Sensibilidad de calibración: la que corresponde a la pendiente de la curva de calibración Sensibilidad analítica: la correspondiente al cociente entre la sensibilidad de calibración y la desviación estándar de la medida. Dos técnicas o la misma técnica . Si Delta SA es el menor incremento de señal que puede medirse. Por tanto. Si bien el valor verdadero de la concentración no se conoce sino que solo puede estimarse. es posible preparar una muestra por un procedimiento más exacto que el evaluado (pesada. es decir. La sensibilidad de un método es una medida de su capacidad para establecer que estas diferencias son significativas. con un efecto acumulativo que conduce a un error sistemático positivo o negativo neto. Los errores que afectan a la exactitud de un análisis se llaman sistemáticos y se caracterizan por una desviación sistemática en relación con el valor verdadero. dilución. Tanto los errores sistemáticos positivos como los negativos pueden afectar el resultado del análisis.) y utilizarla como referencia. Un error sistemático positivo produce un valor central mayor que el valor verdadero y un error sistemático negativo da lugar a un valor central menor que el valor verdadero. La sensibilidad es el cambio de la señal por unidad de cambio de la cantidad de analito y equivale a la constante de proporcionalidad de las ecuaciones: SA = knA . el límite de detección es un parámetro estadístico. A menudo se confunde la sensibilidad con el límite de detección del método. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 11 DE 26 Exactitud La exactitud es una medida de la proximidad existente entre la medida de la tendencia central y la verdad o el valor esperado. y SA = kCA .

SREACT. Esta ecuación no podrá resolverse si no se dispone de una determinación independiente de SREACT. KA. Selectividad Un método analítico es selectivo cuando su señal sólo depende de la cantidad de analito presente en la muestra. Pueden ampliarse para incluir un término que corresponda a la contribución de esta interferencia a la señal SI de tal modo que la señal de la muestra en los dos casos quedará convertida en: SMUESTRA = SA + SI = kA nA + kInI y SMUESTRA = SA + SI = kA CA + kICI Donde SMUESTRA es la señal total debida a los componentes de la muestra y kA y kI son las sensibilidades para el analito y la interferencia y nI y CI son los moles y la concentración de la interferencia en la muestra. . la totalidad de la señal medida durante el análisis.I y viene dado por la relación : KA. Un coeficiente de selectividad superior a (+1) o inferior a (-1) indica que el método es más sensible para la interferencia que para el analito.I = kI / kA Que puede ser positivo o negativo. Las interferencias potenciales pueden encontrarse en la muestra propiamente dicha. o en los reactivos que se utilizan durante el análisis. las ecuaciones SA = knA. que es lo que se denomina el blanco del método. = KCA + SREACT. La ecuación para la señal SMEDIDA = SA + SREACT. dependiendo de si el efecto de la interferencia sobre la señal es similar o. En presencia de una interferencia. es la suma de la señal producida por el analito más la de los reactivos. Si no hay interferencia alguna. pero diferente sensibilidad analítica debido a factores propios como: necesidad de extracción. La contribución de SREACT se determina midiendo la señal de un reactivo en un análisis en el que no entra la muestra. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 12 DE 26 empleada para diferentes matrices. La exactitud de un método depende de su selectividad para el analito Sin embargo. etc. y SA = kCA. concentración. siendo CA la concentración del analito. incluso el mejor método puede no estar libre de interferencias que contribuyan a la señal registrada. opuesto al del analito. pueden tener la misma sensibilidad de calibración. La selectividad del método para la interferencia en relación al analito se define como el coeficiente de selectividad. SMEDIDA.

En la realidad. puede aplicarse a la determinación de analitos en muestras con una amplia variedad de matrices. de la temperatura. Se considera sólido aquel método que no es sensible a los cambios de las condiciones experimentales. de la acidez o del tiempo de reacción. Lo habitual es dar a z un valor de 3 que corresponde a un nivel de significación de alfa = 0. Por lo tanto.00135 (tabla de distribución normal de una cola). Estos métodos se consideran robustos. Robustez y solidez Para que un método sea útil debe proporcionar resultados fiables. Si la sensibilidad de un método depende en gran medida de las condiciones experimentales. Límite de detección El límite de detección de un método es la menor cantidad o concentración de analito que puede detectar con seguridad estadística. Se considera robusto aquel método que puede aplicarse a los analitos en una amplia variedad de matrices. Cuando . (SigmaREACT es la desviación estándar conocida para la señal del reactivo del blanco y z es un factor correspondiente al nivel de confianza deseado. La International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) define el límite de detección como la menor concentración o cantidad absoluta de un analito que produce una señal significativamente mayor que la que se obtiene con el blanco de reactivo. Cuando un método está relativamente libre de interferencias químicas.135 % de las medidas efectuadas en el blanco darán señales situadas fuera de este rango. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 13 DE 26 Blanco del método Muestra que contiene todos los componentes de la matriz excepto el analito. la señal del analito en el límite de detección (SA)LD . Las variaciones aleatorias en las condiciones experimentales también introducen incertidumbre. las pequeñas variaciones de estas condiciones pueden dar lugar a resultados significativamente distintos. es (SA)LD = S REACT + z(Sigma)REACT Donde SREACT es la señal del reactivo del blanco. Matemáticamente. por ejemplo. sólo el 0. Un método sólido es relativamente insensible a los cambios en condiciones experimentales. La concentración correspondiente al límite de detección (CA)L D está dada por la siguiente relación: (CA)LD = (SA)L D / k El valor de z depende del nivel de significación deseado con el que se va a informar el límite de detección. los métodos están sometidos a distintas interferencias químicas y físicas que contribuyen a la incertidumbre del análisis.

o. se dice que se retiene. deberá aceptarse la hipótesis alternativa. H0 implica que error aleatorio es suficiente para explicar cualquier diferencia entre los valores que se comparan. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 14 DE 26 se desconoce (Sigma) REACT. la probabilidad de que el rechazo de la hipótesis nula sea incorrecto. Si la hipótesis nula se rechaza. se rechazará la hipótesis nula y se admitirá que hay pruebas de existencia de analito en la muestra. se compara la señal de la muestra con la del blanco. tras la prueba. Si se selecciona z como 3. La hipótesis nula. ej. en otras palabras. La hipótesis nula es que la muestra no contiene analito..135 %. se retiene o se rechaza. HA. Cuando la hipótesis nula no se rechaza. se elige un nivel de significación para el análisis. donde t es el valor adecuado de la tabla t de un análisis de una cola. El Committee on Enviromental Analytical Chemistry of the American Chemical Society recomienda la siguiente expresión para el límite de cuantificación: (SA)LDC = SREACT + 10(Sigma)REACT Test de significación Un test de significación se crea para determinar si la diferencia entre dos o mas valores es demasiado grande como para que pueda explicarse por un error aleatorio. el término z(Sigma)REACT pude sustituirse por t (SREACT ) . Una hipótesis nula y una hipótesis alternativa proporcionan respuestas a la pregunta. la probabilidad de un error de tipo 1 se reducirá a 0. Una vez establecidas la hipótesis nula y alternativa. en lugar de decirse que se acepta. Al analizar una muestra para determinar la presencia de un analito. El nivel de significación es el nivel de confianza para la retención de la hipótesis nula. es decir. de un error tipo 1. es que la diferencia entre los valores es demasiado grande como para que pueda ser explicada por un error aleatorio y por tanto. definiendo alfa como: . La prueba de significación se lleva a cabo sobre la hipótesis nula que. La hipótesis alternativa es que si existe analito y que (SA) LD es > SREACT. si (SA )LD supera a SREACT por un valor de z Sigma ó (ts). 95 %) y en el segundo se expresa como alfa. el nivel de significación se expresa como porcentaje (p. el primer paso consiste en definir el problema experimental como una cuestión de si o no. Límite de cuantificación Es la concentración o cantidad absoluta más pequeña de un analito que puede determinarse con seguridad y se denomina (LDC). Al crear una prueba de significación. es la misma que el nivel de significación. debe ser real. en cuyo caso (SA) LD y SREACT serán idénticos. En el primer caso. La probabilidad de que se rechace falsamente una hipótesis nula. La hipótesis alternativa.

Test de Significación de una cola. XMEDIA y usando un test de significación para compararla con (u). La exactitud del método se juzga determinando la cantidad media de analito presente en varias muestras.Aunque (Sigma)2 es un estimador sin sesgo de (s2). CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 15 DE 26 Alfa = 1 .t s / (n)1/2 . Test en la que se rechaza la hipótesis nula para los valores situados a ambos extremos de la distribución normal. Para resolver la incertidumbre al calcular (Sigma)2.05 Test de Significación de dos colas. alfa será igual a 0. la hipótesis alternativa es que la diferencia entre XMEDIA y (u) es demasiado grande para que pueda explicarse por un error aleatorio. que se define como (t >/= z ) en todos los niveles de confianza. se sustituye el valor de z por la variable t.2 definimos el intervalo de confianza como la forma de expresar el valor más probable de la media de una población (u). que es una función de (s2) y no se (Sigma)2 . Comparación entre xmedia y (u) Un enfoque para validar un nuevo método analítico consiste en analizar una muestra patrón que contiene una cantidad conocida de analito (u).(z (Sigma)) / (n)1/2 Los valores de z mostrados en las tablas estadísticas proceden de una curva de distribución normal. Test en la que la hipótesis nula queda rechazada para los valores situados sólo en un extremo de la distribución normal. estos dos valores pueden diferir significativamente en cualquier muestra seleccionada aleatoriamente.z (Sigma) Y Miu (u) = XMEDIA +/. La hipótesis nula es que XMEDIA y (u) serán iguales y que cualquier diferencia entre los dos valores puede explicarse por errores aleatorios que afectan a la determinación de XMEDIA. Nivel de confianza 100 Así para un nivel de confianza del 95%. Como (s2 ) es un estimador sin sesgo de (Sigma)2 debe ser posible obtener intervalos de confianza para muestras sustituyendo (s) por (Sigma) en las siguientes ecuaciones : Miu (u) = Xi +/. La segunda ecuación quedará convertida en : (u) = XMEDIA +/. cuando se conoce la desviación estándar Sigma. Intervalos de confianza de las muestras (limite superior y limite inferior) En el numeral 3.

el grado de libertad siempre es igual al número total de miembros o sea (n). CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 16 DE 26 Grados de Libertad Los denominadores de las siguientes ecuaciones (Sigma )2 = = SUMATORIA ( Xi . calibradores de concentraciones conocidas y se debe verificar las condiciones de almacenamiento.3. tiempo y embalajes.u )i=1 i = N n y (s2) = SUMATORIA ( Xi . la sustitución de (u) por (XMEDIA) elimina un grado de libertad del cálculo. porcentaje de recuperación Cambios en el pH Robustez Cambio de operador Repetibilidad – Límite de detección – exactitud (Sesgo) Detección Intervalo de trabajo / linealidad.1. garantizando la integridad y . temperatura. en la varianza de la muestra. eventualmente especificidad 5. Estos deben determinarse de acuerdo al método y modificaciones realizadas en el mismo los cuales son definidos en el protocolo de validación RAN-CD-FOR 024 Cuando los métodos son modificados es de esperarse un posible efecto debido a una modificación del método de ensayo de acuerdo a lo descrito en la tabla 3: Tabla 3: Efecto de modificaciones al método de ensayo sobre los parámetros a determinar Modificación Ejemplos de los Posibles Efectos Sobre: Método de extracción Porcentaje de recuperación Matriz de la muestra Especificidad.XMEDIA )i=1 i = N n–1 Se llaman habitualmente grados de libertad de la población y de la muestra respectivamente. VALIDACIÓN DE MÉTODOS CLÍNICOS Para realizar la validación se requiere material de control de calidad interno. Sin embargo. En el caso de la población. muestras de pacientes.

CLIA. Rhoads. reactivos para cada equipo. mismo evento de calibración.Procesamiento del material de control: Realizar 10 corridas de cada concentración del material de control el mismo día en orden diferente evaluando la prueba en cuestión. . durante 5 días o cada nivel por corrida analítica durante 10 días. . .Duración del estudio: 5 días. . mismo analizador y de medio ambiente por el mismo operador en un periodo corto de tiempo.Número de pruebas a realizar: Mínimo 10. Mantener las condiciones de conservación y estabilidad del material de control.1.Material requerido: Materiales de control de calidad de diferentes concentraciones.3. .2. reactivos para cada equipo.Duración del estudio: 1 día. por manufactura o algún otro. Recolectar .Material requerido: Materiales de control de calidad interno de diferentes niveles del método a evaluar. Evaluación de imprecisión bajo condiciones de repetibilidad Realización de varias medidas en las mismas condiciones de medición.1.25 del error total permitido por el estándar establecido. Anexar el printer del equipo. especificadas por el fabricante. Recopilar los datos obtenidos y realizar la estimación cuantitativa de media.Número de pruebas a realizar: 10 por cada nivel de control. .Procesamiento del material de control: Procesar 1 muestra de cada nivel del material de control al arranque y al final de la corrida o AM y PM.Criterio de aceptabilidad: Los coeficientes de variación obtenidos bajo condiciones de repetibilidad deben ser ≤ 0. mismo reactivo.3. printer del equipo. printer del equipo. . Evaluación de imprecisión bajo condiciones de precisión intermedia . Desviación Estándar (DS) y Coeficiente de variación (%CV). 5. Para los métodos cuantitativos se realizarán las siguientes estimaciones: 5.1. . sea variabilidad biológica. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 17 DE 26 estabilidad de los especímenes muestreados.

muestras de pruebas de evaluación externa ya reportadas Procesamiento de muestras: Seleccionar 10 muestras de material de control (5 por duplicado) que cubran el rango dinámico del método y que hayan sido recolectadas y conservadas en condiciones óptimas para su procesamiento. . Lo más cercano a 0.3. formatos de registro y printer del equipo.90 . Evaluación del error sistemático entre los Ecuación de la recta y= bx + a métodos . CLIA. .1.. reactivo de los equipos. Rhoads. por manufactura o algún otro. Desviación Estándar (DS) y Coeficiente de variación (%CV). R Coeficiente de Intensidad entre la asociación y la relación 0.95 .Número de pruebas a realizar: Mínimo 10.Criterio de aceptabilidad: Los coeficientes de variación obtenidos bajo condiciones de reproducibilidad deben ser ≤ 0. Si se trata de Intercepto (A) el limite de detección un mismo valor de la magnitud de medida.Material requerido: Muestras de pacientes cuyos resultados cubran el rango dinámico del método. .00 variación de las variables. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 18 DE 26 datos y realizar la estimación cuantitativa de media. Esta evaluación puede realizarse con material de referencia o muestras de pruebas de evaluación externa previamente analizadas.3. − Criterio de aceptabilidad: Recolectar y realizar la estimación cuantitativa de: − Herramienta estadística Criterio de Aceptabilidad Sensibilidad Error sistemático proporcional: si varían Pendiente 0.10 de forma proporcional al valor de la (Slope:B) magnitud medida.Duración del estudio: 5 días. sea variabilidad biológica.33 del error total permitido por el estándar establecido.1. 5. o dos veces Error sistemático constante. Evaluación de exactitud del método: Comparación de métodos .1.

3 .7 C4 0.6 C5 0.8 C3 0. Procedimiento: Obtener muestras cercanas al punto de corte. Verificación del punto de corte Se determina usando material de control provisto por la casa comercial (control de calidad dependiente) o un control independiente cercano al punto de corte con n de 30.4 0.2 0.5 0. a partir del control positivo de concentración conocida y realizar las diluciones hasta obtener el valor C50 +- 20% Tabla diluciones para evaluación del punto de corte MUESTRA VOLUMEN DE MR VOLUMEN DILUYENTE C1 0. diluciones del control positivo cercanas al punto de corte.3. control negativo.4 C7 0. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 19 DE 26 SESGO Menor del error total permitido (BIAS) (Yc-Xc)/Xc*100 Reemplazar en la ecuación de la Error sistemático en recta X por el nivel de decisión y Error sistemático en los niveles de los límites de estimar el valor de Y.3 0.1.7 0. printer del equipo Número de pruebas realizadas: 10 por cada dilución. luego decisión decisión clínico calcular e sesgo en %.1 0.5 C6 0. este debe ser menor que el error permitido Para las pruebas cualitativas no se realiza comparación de métodos se realiza verificación del cut off 5.9 C2 0. y reactivos para la ejecución del ensayo.4.6 0. siguiendo las especificaciones de la guía CLSI EP12 Duración: 1 día Materiales: control positivo.

• Observación de las características morfológicas y física de los microorganismos en los medios utilizados • Realización de pruebas bioquímicas complementarias que diferencia unos microorganismos de otros 5. VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS En el área de microbiología se utilizan dos características de medición: La investigación de Presencia /Ausencia en un peso determinado de muestra y el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC).1 Y 2. en orden diferente.1. Para la construcción de dichos protocolos se tendrán encuentra las normas ISO 16140 e ISO 11133. por ello el modelo de distribución Gaussiano no es aplicable y debe seguirse otro tipo de distribuciones como Poisson o Binomial Negativa (J.1 C10 1 0 Analizar 10 veces cada dilución. Procesar control positivo y control negativo al mismo tiempo que se procesan las diluciones Imprimir los resultados del equipo (printer del equipo) y realizar el análisis estadístico: Proporción (%) de resultados positivos y negativos en cada nivel de dilución 5.4. por que la distribución es discreta y no continua.8 0. Los procesos de medición en microbiología presentan características diferentes con respecto a otros. . Etapas definidas en el proceso de validación • Selección de medios de composición química específica y temperatura de incubación que permitan seleccionar en función de sus características unos microorganismos de otros.Laso) 5. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 20 DE 26 C8 0.1. el mismo día. Parámetros de validación Los parámetros dependerán del tipo de método utilizado y definirán aquellas características que sean útiles para el uso previsto. los recuento se realizan sobre placas que tienen un número pequeño de UFC.2.1.1. con la última versión vigente y la información publicada por el INVIMA.2 C9 0.4.9 0. esto plantea problemas importantes sobre todo cuando existe un número pequeño inferior a 15 ufc.4.

1.4. 5. 100 UFC. 5 UFC.4. Exactitud expresada como recuperación . 5.1. 1 UFC. .1.3. Tipos de muestras para la validación Para llevar a cabo los ejercicios de validación de métodos cuantitativos y cualitativos se utilizan matrices naturalmente contaminados. 10 UFC y 20 UFC para el límite de detección. Parámetros metodologías cuantitativas . Eficiencia 5. 10 UFC y 1 UFC para el límite de cuantificación. La selección de las categorías de alimentos utilizados depende del tipo y grupo de microorganismos y del alcance de la validación de acuerdo a la norma ISO 16140: 2008 Anexo B. 0 UFC. en el caso de muestras clínicas se tomaran las muestras empleadas en el ensayo para el uso previsto por la casa comercial. Número de muestras . Sensibilidad .6. en estos se incluyen los métodos de Números más probables (NMP) que son semicuantitativos.5.1. Especificidad . Limite de detección . Precisión expresada como coeficiente de variación . Los estudios de inclusividad y exclusividad no aplican para recuentos de mesófilos. Falsos positivos .4. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 21 DE 26 Se definen dos tipos de metodologías cualitativas (Cuyo objetivo es detectar ausencia o presencia) y métodos cuantitativos (El objeto es detectar un valor numérico expresados como UFC de microorganismo objetivo. 5.4.4. Limite de Detección . Parámetros de metodologías cualitativas . recuento de mohos y levaduras. Falsos negativos . previamente analizados en el laboratorio con nivel de contaminación no muy altos. Limite de Cuantificación Para los procedimientos de validación se incluyen mínimo tres niveles de contaminación o fortificación de matrices así: .

4. a partir de la dilución de cepa de interés Para obtener las concentraciones anteriores se debe aplicar la fórmula de C1.V1= C2. Los resultados obtenidos después de la lectura se registran las hojas de trabajo y posteriormente se transcriben a la matriz de Excel Una vez transcritos los datos se procede hacer el cálculo del límite de detección 5.7. 5 UFC. 5 ufc. Se prepararan las suspensiones bacterianas de la cepa de interés en las concentraciones 10 UFC. igualmente se deben incluir muestras negativas mínimo 6 5. 10 ufc. 1 ufc) V2: Volumen final de la suspensión con la concentración requerida El volumen a calcular corresponde a la cantidad de suspensión necesaria para las repeticiones requeridas.1. V1: Volumen de la dilución a determinar para preparar la concentración requerida. C2: Concentración en ufc a preparar (20 ufc. Material de referencia certificado De acuerdo a la metodología a validar se selecciona el detector de interés (medio o caldo de cultivo) siguiendo el procedimiento técnico oficial o la norma de referencia del método.8. Repetibilidad y precisión intermedia Fortificación de las matrices: Una vez pesadas la muestras se identifican y se fortifican con los inoculo previamente preparados agregando 1mL de la suspensión correspondiente a la . 1 UFC y 0 UFC. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 22 DE 26 Se establece un n mínimo de 20 muestras.1. Los inóculos se deben procesar el mismo día de su preparación.4. y el número de matrices dependerán del uso previsto. Por ejemplo para el recuento de Estafilococo coagulasa positivo la norma de referencia es “ICMSF Vol I segunda edición 2000 Método 1 páginas 231 a 236” la cual indica en el ítem de Materiales y métodos la referencia el detector Baird Parker.V2 Donde: C1: Concentración inicial (100 ufc).

luego se homogeniza cumpliendo el procedimiento técnico a validar. C. Muestras que son negativas (Sin Fortificar o con ausencia del microorganismo target) y que al aplicarles el test dan un resultado negativo. realizando minino dos repeticiones por matriz La repetibilidad será evaluada con los resultados de las repeticiones realizadas por el analista responsable del ensayo. Muestras que son positivas (Fortificadas con UFC conocidas de cepas deseadas) y que al aplicarles el test dan un resultado positivo. Muestras que son positivas (Fortificadas con UFC conocidas de cepas deseadas) y que al aplicarles el test dan un resultado negativo. Sensibilidad y especificidad Para realizar los cálculos de sensibilidad y especificidad la fortificación de las muestras se realiza igual que para la estimación de la repetibilidad y precisión intermedia hasta el procesamiento. Con los resultados obtenidos se aplica la tabla de contingencia de 2 x2. La precisión intermedia se evalúa entre los analistas. Muestras que son negativos (Sin Fortificar o con ausencia del microorganismo target) y que al aplicarles el test dan un resultado positivo.9. Los resultados obtenidos después de la lectura se registran en las hojas de trabajo y posteriormente se transcriben a la matriz de Excel Una vez transcritos los datos se procede hacer las estimaciones estadísticas 5.1. B.4. A = Verdaderos Positivos B = Falsos Positivos C = Falsos Negativos D = Verdaderos Negativos . D. Procesamiento de Muestras: Las matrices elegidas fortificadas se procesan de acuerdo al procedimiento técnico de la metodología a validar. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 23 DE 26 matriz pesada. Dichos resultados se ubican en la tabla asi: A.

INFORME DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO Cada validación debe ir acompañada de un informe: El mismo debe ser preparado por el profesional de laboratorio / operador / técnico y revisado por la Dirección Técnica. REGSTROS . El contenido del informe se establece en el formato informe de validación F-SA-141 6.5. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 24 DE 26 Valor de la Característica Resultado de la Prueba con el Método a Validar PRESENTE AUSENTE Total Positivo A B A +B Negativo C D C+D Total A +C B+D A +B + C+ D Una vez diligenciada la tabla de 2x2 se aplican las siguientes formulas: Sensibilidad: A / A+C x 100 Especificidad: D/ B+D x 100 La tabla de contingencia también permite hacer el cálculo de valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) así como la eficiencia de la prueba: VPP: A/ A+B x 100 VPN: D/C+D x 100 Eficiencia: A+D/N x 100 Donde N = A+B+C+D 5.1.

CLSI document EP7-A2 (ISBN 1-56238- 584-4). Pennsylvania 19087. 2005. documentos F-MC- Protocolo de MC-04. documentos F-MC- validación MC-04. Sanidad del Ambiente. documentos F-MC. 2003. EURACHEM / CITAC. Wayne. THIRD EDITION 2012 ASTM (American Society for Testing and Materials 1992): D3868-79. Wayne. Clinical and Laboratory Standards Institute. 940 West Valley Road. 04. Según F. Approved Guideline—Second Edition. GUIDE CG 4. Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach. 940 West Valley Road. 2004.1 Referencias Guía para la validación de métodos de ensayo. 940 West Valley Road. 04. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods. Wayne. Según F-MC-03 . Approved Guideline. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Suite 1400. Según F-MC-03 /Profesional de Medio físico y/o Laboratorio MC-03 -Listado Listado maestro de -Listado maestro de electrónico maestro de registros y/o tabla de registros y/o tabla registros y/o tabla retención documental de retención de retención documental documental 7. NCCLS. Según F. Pennsylvania 19087-1898 USA. Según F-MC-03 . Interference Testing in Clinical Chemistry. INS. Curso sobre Validación de Metodologías Analíticas. ANEXOS Anexo No. Approved Guideline—Second Edition. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 25 DE 26 Registro Responsable Como Donde Tiempo de Disposición conservarlo conservarlo conservación final Según Listado Según Listado Según Listado F-SA-140 Maestro de Maestro de Maestro de Director Técnico documentos F. Situación de la Validación de los ensayos microbiológicos en los laboratorios. NTC-ISO/IEC 17025:2005 Requisitos Generales de Competencia de Laboratorios de Calibración y Ensayo. NCCLS. 04.Laso Sanchez 2005. Suite 1400. documentos F-MC. . NCCLS document EP6-A (ISBN 1-56238-498-8). Pennsylvania 19087-1898 USA. Suite 1400. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).1898 USA. Organismo Argentino para la Acreditación (OAA). D1179-93. J. 04. Según F-MC-03 /Profesional de Medio físico y/o Validación Laboratorio MC-03 -Listado Listado maestro de -Listado maestro de electrónico maestro de registros y/o tabla de registros y/o tabla registros y/o tabla retención documental de retención de retención documental documental F-SA-141 Según Listado Según Listado Según Listado Informe de Maestro de Maestro de Maestro de Director Técnico documentos F. NCCLS. NCCLS document EP5-A2 (ISBN 1-56238-542-9). NCCLS.

Wayne. Suite 1400. Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation. 2002. Suite 1400. verificación o evaluación de métodos? Lo realmente importante es ser una herramienta de seguridad para el paciente. CÓDIGO: P-SA-85 FECHA DE 14/10/2015 GUIA PARA LA VALIDACIÓN EMISIÓN: DE MÉTODOS DE ENSAYO VERSIÓN: 01 PÁGINA: 26 DE 26 NCCLS. Approved Guideline—Second Edition. 2004. 940 WestValley Road. NCCLS. HISTORIAL VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS CAMBIOS 1 14/10/2015 Versión inicial . Agosto de 2013 8. NCCLS. Approved Guideline. NCCLS document EP9-A2 (ISBN 1-56238-472-4). 940 West Valley Road. Garzón González Alba Cecilia. Pennsylvania 19087-1898 USA. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples. Pennsylvania 19087-1898 USA. Validación. NCCLS document EP17-A (ISBN 1-56238-551-8). NCCLS. Wayne.