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Manual de procedimientos microbiológicos

Procedimientos de muestreo para alimentos, leches y productos lácteos
El objetivo de un muestreo es obtener una muestra representativa del alimento a
examinar, por lo tanto las unidades muestreadas deberán remitirse al laboratorio,
tomando las precauciones necesarias a fin de que las condiciones bacteriológicas
no se alteren.
Se recomienda tomar las medidas necesarias para prevenir cualquier
contaminación de las muestras durante el transporte al laboratorio, el
almacenamiento y las manipulaciones subsiguientes.
1. Materiales:
1.1. Recipientes de muestreo: utilizar recipientes limpio, secos y esteriles;
de boca ancha y con tapa. Debeen ser de acero inoxidable u otro
material adecuado, con capacidad para una unidad de muestra (min.
225g).pueden utilizarse tapones de jebe, plástico o corcho , pero
deben estar cubiertos con un materialinerte, como por ejemplo papel
de aluminio anes de ser colocados en el recipiente.
1.2. Instrumentos de muestreo:
pipetas,espátulas,cucharas,tijeras,cuchillos,bisturís,sondas u otros
dispositivos necesarios, previamente esterilizados.
1.3. Marcadores, plumones, papel engomado, etiquetas suficientemene
grandes para anotar datos.
1.4. Equipo estrilizante: autoclave,horno bactereologico capaz de
alcanzar una temperatura de 180C.
1.5. Refrigerador, capaz de enfriar las muestras da 0-5 C en pocas horas
como aditamento indispensable el congelador para el
almeacenamiento de muestras congeladas.
1.6. Agente esterilizante : Alcohol etílico (Merck, Art. N 983 ) o alcohol
isopropilico (Merck, Art N 9634 ).
1.7. Termometro, de 20 a 100 C con sub-divisiones de 0.1 C.
2. Preparación y dilución de la muestra
Metodo recomendado por el ¨Estándar methods for the examination for
dairy products¨ (hausler, 1972) y por el AOAC(1975), con escepcion de que
este ultimo utiliza como diluyente la solución de tampón fosfato.
2.1. Aparatos y Materiales
2.1.1. Licuadora de 2 velocidades o de velocidad simple controlada por
reóstato.
2.1.2. Vasos de licuadora de vidrio o meal de un litro de capacidad, con
tapas, resistentes a temperaturas de autoclavado. Se debe
utilizar un vaso esteril.
2.1.3. Balanza con pesas (capacidad 2500g) sensibilidad 0.1g.

dependiendo del propósito de la prueba.2.4. Agua peptonada salina Formula (g por litro) Peptona 1 NaCl 8. Isntrumentos para la preparación de muestras cuchilllos. Tapar el vaso de licuadora esteril.1g de muestra representativa (ICMSF.2.1. 2. 1972 para cada unidad de muestra 450ml en frascos o botellas 90 o 99 ml en botellas de dilución o recipientes similares para leche. Refrigerar la muestra 1-5 C cuando el análisis no se pueda efectuar inmediatamente. cucharas espátulas. Pipetas de 1. 2. b. etc. Esterilizados previamente por autoclave o aire caliente. tenedores. . 2.1 Seguir el procedimiento descrito anteriormente para el llenado de frascosy tubos de dilución. Diluyentes: a.0 +/-0.1. Empezar tan pronto como sea posible después que la muestra ha sido tomada.1. 1974) si el contenido del envase no es homogéneo (como por ejemplo una comida congelada). 2. Si la muestra esta congeladad. pinzas tijeras. 2. en su base original (o en el recipiente en el cual ha sido recibida en el laboratorio) por un máximo de 18 horas en refrigerador a 2-5 C si la muestra congelada puede ser fácilmente dividida (ejemplo:helados) proceder sin descongelar.1.5.  Según especificaciones de Hausler. 1957) Disolver 1 g de peptona en un litro de agua destialda. Luego pesar 50+/-0.7. Refrigerador a 2-5C. 2.1. si los recipientes son calibrados reajustar el volumen.5 Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y ajustar el Ph a 7. Procedimiento: 2. Agua protonada(Strake y Stokes. Llenar los frascos o tubos de dilución de volúmenes predeterminados de modo que después del autoclavado (121Cx15min) el volumen sea mas o menos 2% del deseado.2.6. 10 y 11 ml (especificaciones de dilución de leche. tomar una muestra de 50 g de un homogenizado de toda la muestra o analizar cada porción de alimento diferente por separado.2. hausler 1972).

Thompson y col.2. en frascos de dilución de 99 ml o 10 ml en frascos de 90 ml. Licuar el alimento y diluirlo rápidamente.10^-5 o un numero de dilución que la experiencia indica como deseables para el alimento en examen. Agitar esta dilución y las subsiguientes vigorosamente por lo menos 25 veces en un arco de 30 cm. aereacion. Esperar 2-3 minutos para dispersar la espuma.3. para averiguar la calidad bactereologica de la leche refrigerada que proviene de los establos y /o la efectividad y duración de su refrigeración se aconseja realizar .mesofilos 30-35 C y termófilos 55 C.10^-3.1969(ii)Recuento por extensio en superficie o método del Spread drop.2. repetir este procedimiento utilizando las diluciones 10^-2.1971).2. Adicionar al vaso de licuadora 450 ml del diluyente recomendado una dilución de 10^-1. Sin embargo una vez que el diluyente ha sido adicionado a la muestra no se debe permitir demorar innecesarias. Muchas de las células pueden no desarrollar debido a condiciones desfavorables de nutrición. 2.3. 2. temperatura o duración de la incubación. Ninguno de los procedimientos señalados es capaz de enumerar todos los tipos de microorganismospresentes en la muestra. Comenzar a velocidad baja luego pasar a mas alta velocidad entre algunos segundos o gradualmente en pocos segundos incrementando a máximo voltaje. (iii) En los mtodos de recuento de microrganismo en placa se debe especificar la temperatura de incubación en atención a que los distintos grupos de microorganismos tienen diferentes rangos de temperaturas de crecimientopara los psicrotrofos de 0-7 C. (iii) Metodo de recuento por gotas en superficie (miles y Misra. Angelotti.10^-4. Medir un ml de dilución 10^-1 del material licuado.4.Sharpe y Kilsby. La temperatura será seleccionada de acuerdo con el propósito de la prueba :por ejemplo.1961. Un tiempo prudencialde licuado permitido es de dos minutos a velocidad (para ciertos alimentos espumosos tales como pasteles de crema un minutos de licuado es suficiente). 1960). 2. 2. 1938. (ii) El etodo Plate Loop es también ahora ampliamente utiliado para leches (D. evitando la espuma. Determinación del número de microorganismos aerobios Se utilizan comúnmente tres métodos para la numeración de microorganismos aerobios mesofilos: (i) Recuerdo Standard en placa el cual es también llamado recuento de aerobios en placa o Pour Plate revisao por Hartman y Hutsberger.5.I.

 Agar Plate Count ( Agar peptona de caseína-glucosa-extracto de levaduras) (Merck.10^-2. pero 55 C será la temperatura de incubación preferida para la determinación termofilica en el equipo de blanqueado o de bombas de calentamiento en un sistema conductor del alimento.10^-3.1 ml de la dilución 10^-5 para obtener 10^-1 a 10^-6 g de muestra de alimento por placa Petri.4. alícuotas de 1 ml a partir de la dilución 10^-1.10^-5 y una alícuota de 0.  Baño de agua o incubador de aire a una temperatura de 44 – 46 C para mantener el agar.2. Método del recuento Standard en placa 2.  Pipetear.  Incubador a 29-39 C. Procedimiento  Preparar la muestra por el procedimiento recomendado en el capitulo de preparación y dilución de la muestra.10^-4. N5463).  Contador de Colonias ( modelo de campo oscuro). 2.4. . por duplicado a placas Petri esteriles. un recuetno de microorganismo psicrotrofos a 7 C durante 10 dias.  Contometro. Aparatos y materiales  Placas de Petri.5 y 10 ml ( especificaciones para dilución de leche. un recuento a 25 -30 C dara una mejor información aceca de la sanitación de la planta.4. un recuento a 35-37 C reflejara el grado de contaminación por mesofilos. El método que se describe a continuación es el mas difundido y esta recomendado para productos lacteos por el ¨Estándar Methods for the Examnation of Dairy Products¨.1.Art. el recuento de microorganismos termoduricosmide el numero de microorganismos que sobreviven al procedimiento de pasteuriazacion a 63C durante 3 minutos. de vidrio (100x15mm) o de plástico (90x15mm).  Pipetas bactereologicas de 1. Por otra parte. 2. Hausler 1972).

Mezclar bien por rotación. Computo del recuento Standar  .  Una vez solidificado el agar.5. Agregar rápidamente a las placas Etri 10-15 ml de agar licuado y temperado.  Computar el recuento Estándar em placa o el estimado del recuento en placa.3 horas. Eltiempo trnascurrido desde la preparación de la dilución del agar no se debe exceder los 26 minutos. se recomienda de preferencia que sean menos de 10 minutos. invertirías placas e incubarias a 29-31 C durante4+/.  Licuar el Agar Plate count en un baño de vapor o baño de agua hirviente sin exponerlo a demasiado calor o de periodos prolongados de calentamiento. 2. Temperar el agar a 44 -46C y controlar su temperatura cuidadosamente para evitar la muerte de las bacterias en la muestra diluida.

Determinación del Número de Microorganismo 50g o ml 450ml 10ml 10ml 10ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 ml 1ml .

2.extraxto de levaduras.IDF (Merck. Agar recuento libre de azucares Fil. Merck. . Agar plate count (Agar peptona de caseína-glucosa. Gelatina nutritiva especial para el recuento electrónico de microcolonias(Merck. Agar cuenta gérmenes Estándar (Merck. N 5463). Art N 4067). Art. Art N1621) 3. homogenizar a 15000-20000rpm por un tiempo no mayor a 2.1. Art N 10878) 4.5 minutos. En el caso de alimentos solidos. 5.