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Revista Colombiana de Química

ISSN: 0120-2804
orodriguez@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia
Colombia

Espinel, Esperanza; López, Elizabeth
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE a-AMILASA DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA
MEDIANTE FERMENTACIÓN EN FASE SÓLIDA
Revista Colombiana de Química, vol. 38, núm. 2, 2009, pp. 191-208
Universidad Nacional de Colombia
Bogotá, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=309026681001

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La vamente la actividad de la enzima. SED. Colombia. sede Bogotá.82 U/mg. VOLUMEN 38. y estabilidad en un in- Este estudio reporta la purificación y ca.48 mg/mL hasta la homogeneidad fue confirmada y Vmáx = 5. Bogotá. Elizabeth López1. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. cro- activador. Universidad Nacional de Colombia. yeron 25% y 40% respectivamente. Los iones pleando yuca blanca colombiana (Ma. El peso molecular esti. Entre por SDS-PAGE. almidón de yuca se encuentran la maltosa 1 Departamento de Química. Facultad de Ciencias.0. tervalo de temperatura 0-50 °C y su tem- diante fermentación en fase sólida. valores de Km y Vmáx fueron calculados un grado de purificación del orden de 62 y usando la linealización de Lineweaver- un rendimiento de 9%. Colombia.edu. peratura óptima fue 70 °C.3 Recibido: 17/12/08 – Aceptado: 21/08/09 xima actividad de hidrólisis de almidón soluble con pH 6.0-7. Los tividad específica final de 314. siendo enzima fue purificada por precipitación el ión Ca2+ el que tuvo el más alto poder fraccionada con sulfato de amonio. No. cromatografía de filtración por gel (Sephadex G-75) y que Li+ y Fe3+ la disminuyeron ligera- cromatografía de intercambio catiónico mente (13%). 2 Dirección actual Colegio Marruecos y Molinos IED. em. La estabilidad racterización parcial de una a-amilasa térmica de la enzima se presentó en el in- producida por Penicillium commune me.co 3 melopezr@unal.0. mientras (DEAE-Sephadex A-50). los principales productos de hidrólisis del mado fue 35 kDa.85 mmol glucosa/min. neespinelb@unal. Ca2+. La enzima mostró má. Bogotá.edu. Cu2+ no alteró significativa- matografía de intercambio aniónico mente la actividad de la enzima. La purificación Burk. y Co2+ y Hg2+ la disminu- (CM-Sephadex C-50) obteniendo una ac. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE a-AMILASA DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE FERMENTACIÓN EN FASE SÓLIDA PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF a-AMYLASE FROM PENICILLIUM COMMUNE PRODUCED BY SOLID STATE FERMENTATION PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA a-AMILASA DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUZIDA MEDIANTE FERMENTAÇÃO EM FASE SÓLIDA Esperanza Espinel1. Ba2+ y Ag+ aumentaron significati- nihot esculenta Crantz) como soporte.2. con el resultado Km = 0. tervalo de pH de 5.co 191 .

The molecular weight was esti. o que teve o Co2+ and Hg2+ decrease it 25% and 40% mais alto poder indutor. Íons Ca2+. a-amylase. de purificação na ordem de 62 e um rendi- mated to be 35 kDa. sua temperatura óptima de reacção foi de vator. A purificação até à homo- maximal activity in the soluble starch geneidade foi confirmada por SDS- hydrolysis at pH 6.0. e enzyme. fermentación en fase só.85 µmol glucose/min were calcula.0 to 7. Cu2+ does not alter significantly 70°C. sendo o ião Ca2+. e Co2+ e Hg2+ a 192 . whereas Li+ ram significativamente a actividade da and Fe3+ decrease it slightly (13%) and enzima. and its optimal tempera.4 de una a-amilasa. yuca blanca colombiana. pH 6. Among hydrolysis products of evidencia de que la enzima es capaz de tapioca starch are maltose and glucose. Purification Sephadex C-50) obtendo una actividade to homogeneity was confirmed by SDS específica final de 314.0. glucosidic linkages.0. cionada com sulfato de amónio.0-7. This study reports the purification and partial characterization of an a-amylase Este estudo reporta a purificação e carac- from Penicillium commune produced by terização parcial de uma a-amilasa pro- solid state fermentation using colombian duzida por Penicillium commune median- white tapioca (Manihot esculenta Crantz) te fermentação em fase sólida usando as support. cromato- graphy (Sephadex G-75) and cation ex. A enzima foi estável num significantly increase the activity of the intervalo de temperatura de 0-50 °C.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. solid state fermentation. The enzyme was purified by mandioca branca colombiana (Manihot ammonium sulphate precipitation. A enzi- exchange chromatography (DEAE-Sep. ma foi purificada por precipitação frac- hadex A-50). gel filtration chromato. Penici- llium commune.0. A purification factor of 62 with a tração por gel (Sephadex G-75) e croma- 9% yield and final specific activity of tografia de intercambio catiónico (CM- 314. with ion Ca2+ as the highest acti.82 U/mg were recorded. este resultado proporciona ver-Burk.48 mg/mL and Vmax significativamente a actividade da enzi- = 5. O peso molecular estimado foi de range of pH from 5. e estabilidade num intervalo de ture was 70 °C. co- lombian white tapioca. a-amilasa. ma. and is stable in a PAGE.82 U/mg. a characteristic behavior of an a-amylase. Cu2+ não alterou respectively. The enzyme shows mento de 9%. Thermal sta. comportamiento característico yme ability to hydrolyze the starch a-1. Ba2+ e Ag+ aumenta- the activity of the enzyme. romper los enlaces glicosídicos a-1. Ions Ca2+. No. um grau PAGE. VOLUMEN 38. 2 DE 2009 y la glucosa. Ba2+ and Ag+ pH de 5. enquanto que Li+ e Fe3+ a diminuí- ted using the linearization of Linewea. 35 kDa. Penicillium lida. A enzima mostrou máxima acti- bility was in the range of temperature vidade de hidrólises de amido solúvel a from 0 to 50 °C. anion esculenta Crantz) como suporte. cromatografia de fil- C-50). Km = 0. commune. grafia de intercambio aniónico (DEAE- change chromatography (CM-Sephadex Sephadex A-50).4 del this result provides evidence of the enz- almidón. ram ligeiramente (13%).

Recientemente se ha reportado la pro- ducción de a-amilasa por hongos del gé- nero Penicillium (7. natural de hongos filamentosos como Pe- Os valores de Km e Vmáx foram calculados nicillium commune. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica diminuíram 25% e 40% respectivamente. fermentação em fase só- lida. Los medios empleados en Ciacomeq Ltda. tecnológicas. 4). Entre os acción de proteasas (5). en estos trabajos no se lleva a cabo la purifi- Las a-amilasas son enzimas que catalizan cación y posterior caracterización de la al azar la hidrólisis de enlaces glicosídi. VOLUMEN 38. mandioca branca colombiana. Tradicional- mente la producción de a-amilasas se ha llevado a cabo mediante procesos de fer- mentación líquida sumergida (FLS) debi. mayores rendimientos en la producción ver-Burk. Una cepa de Penicillium sp. partamento de farmacia de la Universidad la fermentación en fase sólida (FFS) Nacional de Colombia. por el laboratorio de microbiología del de- les como temperatura y pH. para producir malto.4 de polisacáridos como el almi.85 mmol glucosa/min. son las enzimas microbianas las que encuentran mayor demanda en apli- caciones industriales (2). bilidad. La FFS son semejantes en textura al hábitat yuca (Manihot esculenta Crantz) fue com- 193 . Son de gran nética de una a-amilasa obtenida a partir importancia en la industria alimenticia. blecer su potencial en aplicaciones bio- dón y el glicógeno. Bogotá.48 mg/mL e de enzimas y la mínima degradación por Vmáx = 5. rés en investigación. principais produtos de hidrólises do ami- do de mandioca encontram-se a maltosa e Cada una de las aplicaciones industria- glucosa. les de las a-amilasas requiere propieda- dencia de que a enzima é capaz de romper des únicas respecto a especificidad. nismos. esta- os enlaces glucosídicos a-1. de una cepa nativa de Penicillium commu- textil. senten propiedades diferentes a las cono- cidas se mantiene como un tema de inte- a-amilasa. papelera y farmacológica. temperatura y dependencia del comportamento característico de uma pH (6). medio Saboraud agar-maltosa 4%. animales y microorga. obtendo Km = 0. El al- y los procesos de purificación son menos midón de yuca empleado fue adquirido en costosos (3. y la búsqueda de enzimas que pre- a-amilasa. 8). purificación y caracterización ci- madas dextrinas límite (1). enzima. sin embargo. este resultado proporciona evi. fue donada do al mayor control de factores ambienta. ne mediante fermentación en fase sólida. Penici. llium commune. y aun. No. nihot esculenta crantz) como soporte.4 do amido. El microorganis- constituye una alternativa interesante mo se mantuvo a temperatura ambiente en puesto que los metabolitos se concentran.. sa. Colombia. que las fuentes productoras de a-amilasas empleando yuca blanca colombiana (Ma- incluyen plantas. sin embargo. etapas fundamentales para esta- cos a-1. oligosacáridos de diferentes tamaños En esta publicación se describe la pro- y cadenas más o menos ramificadas lla. lo que genera usando a linearização de Linewea. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. ducción.

0.5.0 g de yuca rallada. rallada manualmente luego de retirar la Una suspensión de 1x107 esporas/mL se cáscara empleando un rallador de plástico utilizó para inocular los medios de fer- doméstico convencional. guimiento cada 24 horas de la produc- identidad 100%) permiten identificar el mi. y se realizaron dos ti- partir de la biomasa generada se realizó pos de fermentaciones. MgSO4. gov).01. En el caso de la FFS se adicionaron 50 mL de buf- El micelio de P. min a 8 000 rpm. mL de suspensión de esporas de P. K2HPO4.0 g de al- dores universales ITS4 e ITS5 (11). commune fue suspendido fer fosfato 0.0.50. 1. mentación. según la fuente de carbono. VOLUMEN 38.8S-ITS2 decidos con 10 mL de solución de sales. Los medios se esterilizaron a 121 °C nlm. de la subunidad ribosomal. almidón de dextrosa y extracto de levadura) (9). KCl.15. El Penicillium sp. el sobrenadante constituyó el extracto crudo. Posteriormente. método de extracción por fenol-cloro. con agitación constante nicamente durante 30 min en un agitador durante 10 min. de almidón ó 10 g de yuca rallada. se filtró micelio sobrenadante. commune.1 M pH 7. Los medios de fermentación se prepara- torio de micología y fitopatología ron tomando como referencia el medio (LAMFU) de la Universidad de los Czapcek-Dox (9). La identificación se realizó mediante téc- nicas de biología molecular en el labora. crecido en medio líquido SDY (sucrosa.ncbi. 0. los análisis bioinformáticos y 15 psi por 15 min. NCBI (National Center for Biotech- nology Information: http://www. hume- có por PCR la región ITS1. 0. se amplifi. Corea). A yuca o yuca rallada.00.nih.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. se filtró sobre gasa estéril de placa MLW modelo Thys 2 a 80 osci- en condiciones asépticas para retirar el laciones completas por minuto. 2 DE 2009 prada en un supermercado en Bogotá y fue teo de esporas con un hemacitómetro. se agitó mecá- en agua estéril. La solución de sales con- identificación molecular se realizó com. se inocularon con 1 se hicieron utilizando el algoritmo Blastn. FeSO4. en una extracción de ADN total a través del condiciones estáticas. FFS y FLS. y se realizó el con. Para la FLS se separó croorganismo como perteneciente a la es. (NH4)2SO4. tenía (g/100 mL de agua destilada): parando la secuencia obtenida contra to. región amplificada fue secuenciada por suspendidos en 100 mL de solución de sa- la compañía Macrogen (Seúl. la solución sobre algodón y se centrifugó 194 . La les diluída 1:10.50. ción de la enzima. mune y se incubaron a 22 °C.00. 0. fue con CaCl2. Se formularon dos medios. gos reportadas en la base de datos del CaCl2. Se hizo se- xima identidad obtenidos (E value = 0. La midón de yuca ó 3. Para las FFS el medio se preparó con 10 g formo (10). el hongo mediante centrifugación por 30 pecie P. das las secuencias nucleotídicas de hon. 3. en una centrífuga MLW modelo T52. y se suplementaron Andes de Bogotá. El medio para la FLS contenía 3. com- Los alineamientos con mayor puntaje y má. con los ceba. No.

37 °C. De este sobrenadante se cipitó entre 50 y 80% de saturación. La actividad enzimática. se agitó mecánicamente durante una hora La concentración de proteínas fue de- a temperatura ambiente en un agitador de terminada por el método colorimétrico de placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscila. el precipitado se descartó y tación fraccionada con sulfato de amonio. el sobrenadante constituyó el extracto crudo. Para La actividad específica se define como las obtener el extracto crudo se añadieron unidades de actividad por miligramo de 150 mL de buffer fosfato 0. por ser el medio muestra que contiene la enzima. en una centrifuga MLW El extracto crudo fue sometido a precipi- modelo T52. La fracción con la proteína de interés pre- men de 2085 mL. se dializó 24 h con sulfato de amonio.50 cm X 2. solución sobre algodón para retirar los sólidos gruesos. Las bandejas con el medio Una unidad de actividad enzimática se se esterilizaron a 121 ºC y 15 psi durante define como la cantidad de enzima que li- 15 min y se inocularon con 3 mL de la bera 1 mg de glucosa por minuto bajo las suspensión de esporas. VOLUMEN 38. El trabajo se continuó empleando la 200 mL de una dilución apropiada de la FFS con yuca rallada.50 cm X 16.50 cm). pH 6. Se tomaron 10 mL de cada extracto crudo y se diali- zaron contra agua destilada para realizar Para medir la actividad a-amilasa se utili- medidas de concentración de proteína y zó el método de Nelson-Somogyi (12). Luego de 20 min de de enzima. 195 . Bradford (13). Pasados 10 min. en men a 10 mL con agua destilada y se reali- cada una se puso una capa de 1 cm de es. za la determinación colorimétrica a 500 pesor aproximadamente de la mezcla de nm (espectrofotómetro Genesys 5). No. proteína. La incubación se condiciones del ensayo. y se filtró la ca bovina como proteína patrón. y 800 en el cual se obtuvo la mayor producción mL de CaCl2 5mM.1 M pH 7. se adicionan 500 mL del reactivo de Somogyi y se lleva la mez- cla a un baño María a temperatura de ebu- llición. Precipitación con sulfato de amonio tos. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica por 30 min a 8 000 rpm. El filtrado total se centrifugó a 8 000 rpm por 30 min. se retira la mez- cla del baño y se adicionan 500 mL del Se emplearon bandejas de aluminio reactivo de Nelson. se completa el volu- (22.0. Al residuo se le realizó una segunda extracción bajo las mismas condiciones y se juntaron los dos extrac. 100 g de yuca rallada y 100 mL de solu- ción de sales. reacción a 37 °C. Este tomaron 100 mL para realizar ensayos precipitado se disolvió en el mínimo volu- preliminares de precipitación fraccionada men de agua destilada. contra agua destilada y se liofilizó. mezcla de reacción contiene 1 mL de so- lución de almidón soluble al 1% (p/v). se obtuvo un sobrenadante con un volu. realizó a 22 ºC durante siete días. empleando albúmina séri- ciones completas por minuto.0. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA.

0 y fue sometido a residual fue determinada bajo las condi- cromatografía de intercambio catiónico ciones normales del ensayo. La elusión de (49 kDa). Se usaron sobre CM Sephadex C-50 (2. gradiente discontinuo de fuerza iónica (NaCl 0. desnaturalizantes que se dializó contra agua destilada y se liofilizó. dares: fosforilasa B (104 kDa).5 x 30.5 M). acetato-acético.5 x rés. 2 DE 2009 Cromatografía de intercambio aniónico ca (NaCl 0. A cada fracción El liofilizado de la etapa anterior se di. anhidrasa carbónica (37 kDa). se mezcla- y la estabilidad de la enzima ron en un pool (pool G-75-pico II) que se dializó contra agua destilada y se con- El pH óptimo de la enzima fue determina- centró por liofilización.5 M).05 M. cada fracción (4.0 a 37 °C.5 X 30. fos- cm).0. No.5 mL) se le midió la absorbancia a 280 solvió en el mínimo volumen de buffer nm y la actividad enzimática.0 cm) equilibrada con el mismo buff. los cuales se tiñeron con azul de Coomas- Cromatografía de filtración por gel sie. por electroforesis en condiciones claron en un pool (pool DEAE-pico II). tración 100 mM.0 y 12. Cromatografía de intercambio Para establecer el efecto del pH sobre la catiónico estabilidad.1 a 0. Los marcadores de peso molecular empleados fueron de la marca Bio-Rad. La elusión se realizó por medio de un destilada y se liofilizó. pH 6.0 buffers glicina-HCl. las proteínas se realizó con NaCl al 1%.0 y la actividad fosfato 0. VOLUMEN 38. El pool DEAE-pico II se disolvió en con las siguientes proteínas como están- NaCl al 1% y fue sometido a cromato. A lisozima (20 kDa). Se corrieron electroforesis SDS-PAGE (14). con geles de poliacrilamida al 12%. La velocidad de flu- jo fue de 30 mL/h. Las fracciones que Determinación del peso molecular contenían la proteína de interés. La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. pH 7.0 cm). y se aplicó a una ciones que contenían la proteína de inte- columna de DEAE Sephadex A-50 (2. la enzima fue incubada a 37 °C por 1 h en diferentes buffers en un ran- El pool G-75-pico II se disolvió en buffer go de pH entre 2. (4. Las fracciones que mostraron Efecto del pH sobre la actividad mayor actividad enzimática. CM-pico I) que se dializó contra agua er. Las frac- fosfato 50 mM. ovoalbúmina dex G-75 (2.1 a 0. se mez. albúmina grafía de filtración por gel sobre Sepha. A cada fracción (5 ml) se le midió la absorbancia a 280 nm y la actividad enzimática. La elusión se realizó por medio de fato y glicina-NaOH. se mezclaron en un pool (pool 30. de suero bovino (83 kDa).0 y 12. do realizando medidas de actividad en un rango de pH entre 2. inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa) y La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. todos con concen- un gradiente discontinuo de fuerza ióni.5 mL) se le midió la ab- sorbancia a 280 nm y la actividad enzi- mática. 196 .REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA.

En cuanto ensayo. fue determinada bajo las condiciones nor- males del ensayo. ras luego de adicionar el revelador y ca- lentar a 120 °C por 3 min. la fase móvil fue clorofor- de CaCl2 5 mM. La estimación de Km y Vmáx se (5:95.2H2O. HgCl2. dad enzimática fue de 8. y 1 mL de solución de revelado se hizo con H2SO4/metanol almidón. previamente dia. Las mediciones de actividad se mediante comparación con patrones de realizaron bajo las condiciones normales glucosa y maltosa en una cromatografía del ensayo. La concentración la estabilidad fue establecido incubando final en la mezcla de reacción para ambos por 1 h la enzima en buffer fosfato 100 compuestos fue 10 mM. Capacidad para hidrolizar el almidón de yuca y productos de hidrólisis Efecto de la concentración de sustrato Los productos finales de hidrólisis luego Se utilizaron siete concentraciones dife. de capa delgada (silica gel 60 F254 nía 100 mL de enzima purificada. CoCl2. AgNO3.0 en un rango de temperatura ausencia de EDTA y SDS fue considera- entre 40 y 92 °C. la acti- 197 . 100 mL Merck). EDTA y SDS sobre la actividad enzimática Se utilizaron las siguientes sales: La cinética de producción de a-amilasa CuSO4. BaCl2 y senta en la Figura 1. CaCl2. se incubó partir de 48 horas.6H2O. Para medir los efectos de EDTA y SDS.4 ron evaluados según Hmidet et al. No. Los productos de hidrólisis realizó a partir de la linealización de Li. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Efecto de la temperatura sobre la nes metálicos fue definida como de actividad y la estabilidad de la enzima 100%.5H2O. El efecto de la temperatura sobre normales del ensayo. de 10.0.21 U/mL para la sidual bajo las condiciones normales del FFS y 6. (15). en las que la activi- 37 °C. Efecto de algunos iones metálicos. con un máximo a las con la solución de la sal durante 30 min a 168 horas (siete días). REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. La actividad residual da como de 100%.2-1. La mezcla de reacción conte. determinada en un rango de temperatura luego se realizó la medición de actividad entre 0 y 92 °C en buffer fosfato 100 mM. enzimática residual bajo las condiciones pH 6. la enzima fue incubada con el com- La temperatura óptima de la enzima fue ponente respectivo por 30 min a 37 ºC. mg/mL). La actividad en mM. incremento de la actividad a-amilasa a lizada contra agua destilada. 20. fueron observados como manchas oscu- neweaver-Burk. LiCl. en los diferentes medios de cultivo se pre- FeCl3. luego se determinó la actividad re. La enzima. 800 mL de buffer fosfato mo/acético/agua (70:60:10. 30 y 60 min de incubación fue- rentes de almidón soluble (0. v/v/v) y el 100 mM. pH 6.15 U/mL para la FLS. v/v).0 mM. La concentración final de sal en la mezcla de reacción para todos los casos En los medios con yuca rallada hay un fue 1. pH 6. a los medios con almidón de yuca. La actividad sin adición de los io. VOLUMEN 38.0.

No. crudo fue precipitado por adición de sul- dio sólido empleando yuca rallada. perfil de elusión (Figura 2) mostró un úni- 198 . no obstante. VOLUMEN 38. producción de la misma cantidad de quida sumergida que presenta un valor a-amilasa tomaría más tiempo. a partir de las 168 horas commune y que en caso de usar almidón (7 días) se aprecia un incremento en la ac. da. El extracto hongo filamentoso. la mayor actividad medio ofrecía una mayor área superficial a-amilasa se encontró en la fracción y presentaba una textura más rugosa. com- El crecimiento de P.76 U/mL a los 10 días de observación. la yuca rallada constituye un mejor sopor- zar los valores observados con yuca ralla. commune. 2 DE 2009 Actividad a-amilasa durante cultivos en FFS (-) y FLS (—) usando almidón de yuca (O) y yuca ralla- da (p) como sustrato.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. te para la producción de a-amilasa por P. cuyo usuales de este microorganismo. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. de yuca en fermentación en fase sólida. 50-80%. La purificación de a-amilasa de P. este fato de amonio. la tividad enzimática en la fermentación lí. se. se favoreció en el me. un mune se resume en la Tabla 1. máximo de 7. vidad enzimática comienza a aumentar a Los resultados obtenidos sugieren que partir de las 120 horas (5 días) sin alcan. esta fracción fue aplicada a una mejante a las condiciones de los hábitats columna de DEAE Sephadex A-50.

40 5.14 15.09 1.61 146.82 61. pH 7.34 28. Extracto crudo 1985 873.08 3414.05 76 de amonio fracción 50 – 80% DEAE-Sephadex 5 49.59 10.0. lada y liofilizado.2 M. alcanzan.65 2660.75 12 CM Sephadex C-50 0. VOLUMEN 38. el cual fue dializado contra agua desti- tra agua destilada y liofilizado. las fracciones del pico ac- con actividad fueron reunidas en el pool tivo fueron reunidas en el pool G-75 pico DEAE-pico II.85 9 co pico con actividad a-amilasa luego de con NaCl al 1%. el cual fue dializado con.53.00 100 Precipitado sulfato 10 220.66 535.28 402.40 4446. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Resumen de la purificación de a-amilasa de Penicillium commune.75. II. con este paso se alcan- do un grado de purificación de 10. pH (Figura 3) mostró un único pico de activi- 6. El perfil cromatográfico la adición de buffer fosfato 50 mM.55 53.53 59 A-50 Sephadex G-75 2 3. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA.51 3. Las fracciones del pico dad a-amilasa. (p) actividad enzimática. Este pool fue aplicado a una columna El pool G-75 pico II se disolvió en de Sephadex G-75. No. zó un grado de purificación de 28. y fue apli- Perfil de elusión sobre DEAE-Sephadex A-50. la elusión se realizó buffer fosfato 50 mM.7 1. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. (O) Absorbancia 280 nm. 199 .97 314.0 NaCl 0.

con actividad fueron reunidas en el pool CM. sas microbianas tienen su pH óptimo en el gura 6) permite establecer un peso mole.1 M.5 (8).0 (7) y el de la a-amilasa de Peni- La comparación de la movilidad electro.0 (2). Las fracciones P. el cual fue dializado contra agua destilada. la 5). pH 7. En otros estudios. Aunque el forética de la a-amilasa de P. No. commune. la mayoría de las a-amila- lar en una electroforesis SDS-PAGE (Fi. El perfil de elusión (Figura 4) mos. 2 DE 2009 Perfil de elusión sobre Sephadex G-75. mogeneidad de la enzima. cado a una columna de CM Sephadex 10 y 210 kDa (2). sin embargo. Este pool mostró una sola banda Cuando la actividad de la enzima fue en- en la electroforesis SDS-PAGE (Figura sayada con diferentes valores de pH. la mayo- C-50.0 NaCl 0.pico I. máxima actividad se obtuvo con pH 6. indicando la purificación hasta la ho.85. el pH óptimo de la a-amilasa de Penicillium chrysogenum fue de 5. rango ligeramente ácido a neutro. commune pH óptimo para las a-amilasas varía entre con la de los marcadores de peso molecu. ran- luego de la adición de buffer fosfato 50 go en el que se encuentra la a-amilasa de mM. (p) actividad enzimática. El rango de peso en el que se encuentra el pH óptimo de la molecular para las a-amilasas oscila entre a-amilasa de Penicillium commune.0.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. cilium griseofulvum de 5. VOLUMEN 38. alcanzan- do un grado de purificación final de 61. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.0. ría de las a-amilasas microbianas tienen tró un único pico con actividad a-amilasa su peso molecular entre 30 – 70 kDa. rango cular de 35 kDa. 200 . 2.0 y 12. (O) Absorbancia 280nm. liofilizado y disuelto en buffer fosfato 50 mM. pH 7.

201 . (p) actividad enzimática. (O) Absorbancia 280nm. Electroforesis SDS-PAGE de las fracciones de purificación de a-amilasa de Penicillium commune 1) Extracto crudo 2) Sulfato de amonio fracción 50-80% 3) DEAE-pico II 4) G-75 pico II 5) CM-pico I. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Perfil de elusión sobre CM Sephadex C-50. No. VOLUMEN 38.

2 DE 2009 Determinación del peso molecular de a-amilasa de Penicillium commune por electroforesis SDS-PAGE. se ob. sugiere que la incuba- Como se puede observar en la Figura ción por periodos prolongados de tiempo 7. La enzima retuvo 95% pués de ser calentada una hora a 92 ºC. Vale la pena destacar que la en- serva que la enzima fue estable en el ran.8% Una consecuencia de orden práctico deri- con un pH 7. 0-50 °C. 2) a-amilasa purificada de Penicillium commune. indicando que el rango llus sp.0. 1) Marcadores de peso molecular. es la necesidad de el pH similares han sido reportados para revisar cuál es el tiempo requerido para la las a-amilasas de Aspergillus awamori inactivación total de la enzima en las me- (16) y Thricoderma viride (17).0 en un rango de temperatura entre 40 y comportamiento similar fue reportado 92 ºC. la tivación térmica de la enzima. Rangos de estabilidad en vada de este hallazgo. nación de la temperatura óptima se xima actividad y. es 70 (Figura 8) para así poder analizar la inac- °C.0-7.0. para una a-amilasa de Baci- a partir de 50 °C. corresponde construyó una gráfica de Arrhenius a la temperatura óptima de reacción. No. Con los datos obtenidos en la determi- La temperatura a la cual se alcanza la má. zima conserva 35% de su actividad des- go de pH 5. 202 . VOLUMEN 38. (18). por tanto. cuando la enzima fue incubada durante a esta temperatura induce un cambio con- una hora en buffer fosfato 100 mM. la actividad decreció rápidamente por Uchino. serva en la gráfica. pH formacional de la enzima.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. Luego de la incubación de la enzima de estabilidad térmica de la enzima es por 1 h en buffer de diferente pH. El cambio actividad disminuye rápidamente porque de pendiente cerca a los 50 °C que se ob- la enzima se va desnaturalizando. Cuando se sobrepasa este valor. de su actividad con un pH 5.0 y 98. didas de actividad por el método de Nel- son-Somogyi. Un caso de 6.

Se observan dos líneas rectas con cambio de pendiente cerca de los 50 °C. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. No. VOLUMEN 38. Cada punto ex- perimental corresponde al promedio de dos determinaciones. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de a-amilasa de Penicillium commune. Gráfica de Arrhenius. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. 203 .

85 mmol glucosa/min.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. vidad de la enzima. Km=0. 20). es posible remover mg/mL) (18. siendo el ión Ca2+ el mática de la a-amilasa de Penicillium que tiene el más alto poder activador. Las efecto activador del calcio puede estar re- Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de a-amilasa de Penicillium commune.42 mg/mL) terior justifica que luego de la diálisis (21). Gupta. según Nielsen. pero no CaI o CaII. del Ag+ aumentan significativamente la acti- EDTA y del SDS sobre la actividad enzi.48 mg/mL y origen de la enzima. de variar de uno a diez dependiendo del Burk (Figura 9) fueron 0. del EDTA y del SDS. Ca2+. et al.48mg/ml. es CaIII sin observar cambios estructurales muy similar a la del hongo filamentoso significativos. No. 19. La cantidad de iones Ca2+ pue- usando la linelización de Lineweaver. (1.85 mmol glucosa/min. se pueda evaluar el efecto de los iones escogidos. Como se puede notar. se hace lis-Menten y posee una alta afinidad por necesario tratar la enzima con EDTA o el almidón soluble respecto a otras a-ami. CaII. VOLUMEN 38. Lo an- Aspergillus fumigatus (0. sin embargo. 204 . Ba2+ y El efecto de algunos iones metálicos. et al. De acuerdo con 5. de los tres iones calcio (CaI. (2). Además.64 mapalus contiene. Vmáx=5. La a-amilasa de Penicillium commune ta remoción de los iones Ca2+ no basta presenta una cinética típica de Michae. contra agua destilada no se genere pérdi- da total de la actividad enzimática y.88 mg/mL). Aureobasidium pu. fusca (0. CaIII) que la a-amilasa de Bacillus hal- llulans (5. por lo tanto. lasas microbianas como Thermofibida (22). con dializar contra agua destilada. respectivamen. El commune se muestra en la Figura 10.75 mg/mL) y Bacillus sp. para lograr una comple- te. 2 DE 2009 a-amilasas son proteínas pequeñas que contienen por lo menos un ión Ca2+ por Los valores de Km y Vmáx determinados molécula. EGTA.

(22).4 del almidón de cio. la enzima. la de EDTA y SDS 10 mM. La inhibición que ocasiona el comportamiento característico de una EDTA apoya la sugerencia de que la a-amilasa. cuya cantidad fue aumen- a-amilasas. ya que es capaz de romper los a-amilasa de P. mientras que Li+ y Fe3+ la disminuyen ligeramente y Co2+ y Hg2+ la disminuyen considerablemente. y que su actividad es dependiente de yuca. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Efecto de algunos iones metálicos. a-amilasa de Penicillium commune se que residuos aminoacídicos con grupos muestra en la Figura 11. (20). trazas de glucosa fue determinada desde siduos de histidina (His210. VOLUMEN 38. tal como lo indican Li. del EDTA y del SDS sobre la actividad enzimática. His122. En cuanto al SDS. No. enlaces glicosídicos a-1. tos de hidrólisis del almidón de yuca por giere. de reacción. nu. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. Cu2+ no altera significativamente la actividad de la enzima. los 10 min de reacción. commune contiene cal. EDTA o SDS. se corrobora en la producción de biocombustibles. 205 . Esta afirmación tran maltosa y glucosa. lo cual es de interés por su potencial este ión. Este resultado proporciona ción inhibitoria sobre la actividad de la evidencia de que la enzima presenta el enzima. La activi- dad fue determinada luego de la incubación de la enzima por 30 min a 37 °C con diferentes sales. La producción de concuerda con el hecho de que varios re. sin que se presente completa zación de las cargas negativas en la de los desnaturalización con la concentración dominios estructurales A y B de la enzima ensayada. así como la for- meración para Taka amilasa) están impli. Entre los princi- sulfihidrilo o imidazol son importantes en pales productos de hidrólisis se encuen- la función de la enzima. Al control no se le adicionaron sales. El agente quelante EDTA y tando a medida que aumentaba el tiempo el surfactante SDS también mostraron ac. El análisis cromatográfico de los produc- La inhibición por iones mercurio su. et al. mación de pequeñas cantidades de malto- cados en el mecanismo catalítico de las sa y dextrinas. EDTA y SDS. lacionado con interacciones adicionales su efecto sobre la estructura terciaria de favorables que contribuyen a la neutrali. La concentración final de los iones metálicos fue 1 mM.

0 y 7. activador y el EDTA causa una fuerte in- permite establecer que la fermentación en hibición. VOLUMEN 38. además tiene una tem. formacional que le permite conservar 35% de su actividad después de ser calen- tada a 92 ºC durante una hora. lo cual se evidencia en la peratura óptima de 70 °C y presenta má.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. ratura induce un cambio conformacional vestigación. crantz) empleados como soporte. como sustrato. el microorganismo sólo de la enzima. Tanto el almidón de yuca como la yuca La gráfica de Arrhenius presenta un blanca colombiana (Manihot esculenta cambio de pendiente cerca a los 50 °C. La comparación de las cinéticas de producción de la enzi. sugiriendo que la incubación por perio- ten el crecimiento de Penicillium commu. y los mejores resultados en cuanto a activi. permi.0 a 37 °C. Las muestras fueron removidas con intervalos determinados de tiempo. No. En las condiciones usadas en esta in. que su actividad es dependiente de este dad a-amilasa. La enzima presenta un pH óptimo de La a-amilasa de Penicillium commune 6. dos prolongados de tiempo a esta tempe- ne.0 y fue estable en un rango de pH entre es activa sobre almidón de yuca usado 5. ión. 8). producción de maltosa y glucosa en la 206 . 2 DE 2009 Cromatografía de capa delgada de los productos de hidrólisis de almidón de yuca por a-amilasa de Penicillium commune. Dado que Ca2+ tiene el más alto poder ma en cultivos en FFS y FLS estático. se confirma que la a-amilasa de fase sólida con yuca blanca rallada arroja Penicillium commune contiene calcio. Resultados similares en la hidrólisis de xima estabilidad en el rango 0-50 °C. almidón han sido reportados para las Con temperaturas superiores probable- a-amilasas de Penicillium griseofulvum y mente la enzima adquiere un estado con- Penicillium chrysogenum (7. produce una a-amilasa.

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