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5. TEXTOS GERAIS

5. Textos gerais
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5. TEXTOS GERAIS
5.1. Textos gerais sobre esterilidade 647 5.8. Harmonizao das Farmacopeias 773
5.2. Textos gerais sobre produtos biolgicos 671 5.9. Polimorfismo 777
5.3. Anlise estatstica de resultados de ensaios 5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso
e testes biolgicos 701 farmacutico 781
5.4. Solventes residuais 737 5.11. Caractersticas nas monografias 787
5.5. Tabelas alcoomtricas 747 5.12. Padres de referncia 793
5.6. Aferio dos interferes 759 5.14. Medicamentos de terapia gentica
5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos para uso humano 801
citados na Farmacopeia Portuguesa 765

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 645

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5.1. TEXTOS GERAIS

SOBRE ESTERILIDADE
5.1. Textos gerais sobre esterilidade 649 5.1.5. Aplicao do conceito F0 esterilizao
5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis 649 pelo vapor das preparaes aquosas 656
5.1.2. Indicadores biolgicos de esterilizao 651 5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo
5.1.3. Eficcia dos conservantes antimicrobianos 652 da qualidade microbiolgica 656
5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes 5.1.7. Segurana vrica 669
farmacuticas 653

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 647

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5.1. TEXTOS GERAIS
SOBRE ESTERILIDADE
5.1.1. MTODOS DE PREPARAO
DE PRODUTOS ESTREIS
Esterilidade a ausncia de microrganismos vivos. A
realizao de ensaios no suficiente para garantir a
esterilidade de um produto e a garantia da esterilidade
passa igualmente pela aplicao de processos de produo
convenientemente validados. essencial estudar o efeito do
mtodo de esterilizao escolhido sobre o produto (incluindo
o recipiente ou a embalagem final) do ponto de vista da
eficcia e da manuteno da sua integridade e validar esse
mtodo antes de o pr em prtica. Recomenda-se a escolha
de um recipiente que seja compatvel com o mtodo de
esterilizao aconselhado. A utilizao escrupulosa de um
processo validado condio a respeitar, sob pena de obter
um produto no estril ou deteriorado. De cada vez que se
fazem mudanas de vulto no processo de esterilizao faz-se
nova validao incluindo no que diz respeito a contaminao
microbiana (carga). bvio que as normas de boa prtica de
fabrico (descritas, por exemplo, no guia CEE relativo s boas
prticas de fabrico) tero que ser observadas, nomeadamente
no que diz respeito a:
emprego de pessoal qualificado e convenientemente treinado,
utilizao de locais adequados,
utilizao de equipamento de produo adequado,
concebido para poder ser facilmente limpo e esterilizado,
respeito pelas precaues necessrias para reduzir o
risco de contaminao microbiana (biocarga) antes da
esterilizao,
utilizao de mtodos validados em todas as etapas crticas
da produo,
vigilncia do ambiente e controlos durante a produo.
As precaues a tomar para limitar a carga microbiana antes
da esterilizao incluem a utilizao de compostos que
apresentem um nvel suficientemente baixo de contaminao
microbiana. Pode ser desejvel executar controlo
microbiolgico e estabelecer limites apropriados para
compostos cuja origem, natureza ou modo de preparao
comportem riscos de contaminao.
Os mtodos descritos neste texto aplicam-se principalmente
inactivao ou eliminao de bactrias, leveduras e fungos.
Entretanto, para os produtos biolgicos de origem animal ou
humana, ou quando material de origem animal ou humana
utilizado na produo, necessrio demonstrar, aquando
da validao, que o processo utilizado permite eliminar ou
inactivar os contaminantes vricos potenciais. Indicaes
a este respeito so fornecidas, por exemplo, nas Notas
Explicativas CEE.
Sempre que possvel, conveniente escolher um processo
que permita a esterilizao do produto na embalagem
definitiva (esterilizao final). Quando se utiliza um processo
final (pelo vapor, pelo calor seco ou por radiaes) totalmente
validado, pode admitir-se, sob reserva de aprovao pela
Autoridade Nacional, que se recorra libertao paramtrica,
isto , fundamentar a libertao de um lote de unidades
esterilizadas mais nos dados de produo do que nos
resultados de um ensaio de esterilidade efectuado sobre uma
amostra desse lote.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis
Se a esterilizao final no for possvel, convm recorrer
filtrao usando um filtro que retenha bactrias, ou tcnica
assptica; sempre que possvel, aplica-se um tratamento
complementar apropriado (por exemplo, aquecimento) ao
produto no seu recipiente definitivo. Em todos os casos, o
recipiente e o sistema de fecho mantm a esterilidade do
produto durante todo o tempo de validade.
Nvel de segurana de esterilidade (NSE)
Nos casos apropriados, nos mtodos descritos mais adiante
faz-se referncia ao conceito de nvel de segurana de
esterilidade ou NSE. Com efeito, no pode garantir-se nem
verificar em absoluto a esterilidade de todas as unidades
contidas numa populao que tenha sido objecto de
esterilizao. A inactivao de microrganismos por processos
fsicos ou qumicos um fenmeno que se rege por uma
lei exponencial e, por consequncia, existe sempre uma
5. Textos gerais
certa probabilidade estatstica de um microrganismo
sobreviver esterilizao. Para um determinado processo,
esta probabilidade de sobrevivncia funo do nmero,
do tipo e da resistncia dos microrganismos presentes,
bem como do ambiente em que se desenrola a operao. O
nvel de segurana de esterilidade (NSE) de um processo
de esterilizao indica o grau de segurana com o qual
um conjunto de unidades tornado estril pelo processo
utilizado. O NSE para determinada tcnica expresso como
a probabilidade da existncia de uma unidade no estril
nessa populao. Um NSE de 106, por exemplo, corresponde
a uma probabilidade de existir, no mximo, 1 microrganismo
vivel em 106 unidades esterilizadas do produto final. O NSE
associado a um processo, para um determinado produto,
estabelecido com base em estudos de validao apropriados.
MTODOS E CONDIES DE ESTERILIZAO
A esterilizao pode ser efectuada por um dos mtodos descritos
a seguir. possvel utilizar variantes ou combinaes destes
mtodos, desde que o processo escolhido seja validado quer
no aspecto de eficcia, quer na manuteno da integridade do
produto, incluindo o recipiente ou a embalagem.
Qualquer que seja o mtodo de esterilizao utilizado, os
parmetros crticos so objecto de controlo para confirmar
que o conjunto do lote sujeito, durante todo o processo
de tratamento, s condies de esterilizao previamente
definidas. Esta exigncia vlida em todos os casos, mesmo
quando so utilizadas condies padro.
Esterilizao final
Para a esterilizao final, essencial ter em conta a no
uniformidade das condies fsicas ou qumicas durante o
ciclo de esterilizao. O local menos acessvel ao agente de
esterilizao determinado para cada processo de carga e
para cada tipo e forma de recipiente ou de embalagem (por
exemplo, o ponto mais frio de uma autoclave). Convm
igualmente determinar a dose mnima letal resultante
do ciclo de esterilizao e a reprodutibilidade deste, para
assegurar que todas as cargas submetidas esterilizao
recebem o tratamento recomendado.
Depois de se estabelecer um processo de esterilizao final,
avalia-se a sua eficcia na rotina, sempre que possvel, por
verificao e registo apropriados das condies fsicas ou
qumicas atingidas pela carga, durante toda a durao do
ciclo de esterilizao.
649
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis
Esterilizao pelo vapor (em autoclave). Quando aplicvel,
a esterilizao pelo vapor saturado sob presso o mtodo
recomendado, nomeadamente para as solues aquosas.
Para este mtodo de esterilizao final, as condies padro
aplicveis s preparaes aquosas so de 121C, durante,
pelo menos, 15 min. Podem utilizar-se outras combinaes
de temperatura e tempo desde que se demonstre que o
processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada
e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos
limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues
utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106. As
informaes relativas validao por meio do conceito F0 so
dadas mais adiante (5.1.5).
Os parmetros fsicos (temperatura e presso) existentes
dentro da autoclave durante o processo de esterilizao so
conhecidos. A temperatura geralmente determinada por
meio de sondas instaladas no interior de vrios recipientes
5. Textos gerais
representativos bem como em pontos da autoclave
previamente identificados como os mais frios do conjunto
da carga. Os parmetros fsicos so registados durante todo
o decorrer do ciclo, por exemplo na forma de diagrama
temperatura/tempo ou qualquer outra apropriada.
Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao,
conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2).
Esterilizao pelo calor seco. Para este mtodo de
esterilizao final as condies padro so de 160C durante, o tempo de esterilizao. As determinaes so efectuadas
pelo menos, 2 h. Podem utilizar-se outras combinaes
de temperatura e tempo desde que se demonstre que o
processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada
e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos
limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues
utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106.
A esterilizao pelo calor seco realiza-se em estufas de
ventilao forada ou noutros dispositivos especialmente
preparados para o efeito. A carga colocada de tal modo que
a temperatura seja uniforme em todo o conjunto. Obtm-se
dados relativos temperatura no interior do esterilizador
durante o processo de esterilizao, recorrendo geralmente
a sondas instaladas no interior de vrios recipientes
representativos bem como em pontos do esterilizador
previamente identificados como os mais frios do conjunto da
carga. A temperatura registada durante todo o decorrer do
ciclo, de forma apropriada.
Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao,
conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2).
O calor seco a mais de 220C frequentemente utilizado
para esterilizar e despirogenar material de vidro. Neste caso,
em lugar de utilizar indicadores biolgicos de esterilizao
(5.1.2), possvel demonstrar a existncia de uma reduo de
3 log das endotoxinas resistentes ao calor.
Esterilizao por radiaes ionizantes. Este mtodo de
esterilizao efectua-se por exposio do produto a uma
radiao ionizante que pode ser uma radiao gama
proveniente de um radioistopo apropriado (cobalto 60, por
exemplo) ou um feixe de electres acelerados por meio de um
acelerador apropriado.
Em certos pases existem regulamentaes especiais para a
utilizao das radiaes ionizantes para fins de esterilizao
(ver, por exemplo, as Notas Explicativas CEE).
Para este mtodo de esterilizao final, a dose padro (dose
absorvida) de 25 kGy. Podem utilizar-se outros valores
desde que se demonstre que a dose escolhida assegura uma
650
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
taxa de letalidade adequada e reprodutvel quando aplicado
como rotina dentro dos limites de tolerncia estabelecidos.
Os mtodos e precaues utilizados permitem obter um NSE
de, pelo menos, 106.
Durante o processo de esterilizao, a radiao absorvida
pelo produto objecto de verificaes regulares, efectuadas
por processos dosimtricos que so independentes da taxa de
radiao. Os aparelhos so calibrados em relao a uma fonte
padro numa instalao de referncia quando da recepo
e depois com intervalos de tempo apropriados que no
ultrapassam 1 ano.
Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao,
conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2).
Esterilizao por gases. Este mtodo s utilizado quando no
possvel aplicar qualquer um dos outros processos. essencial
assegurar a penetrao do gs e da humidade no produto a
esterilizar e utilizar depois um processo de eliminao do gs
em condies que se verificou previamente permitirem que no
produto esterilizado os resduos ou produtos de transformao
do gs se reduzem a uma concentrao inferior que pode
provocar efeitos txicos quando da utilizao. A este respeito,
as notas explicativas da CEE fornecem indicaes quanto ao
emprego do xido de etileno.
Convm, sempre que possvel, determinar e registar a
concentrao do gs, a humidade relativa, a temperatura e
nos locais mais desfavorveis do ponto de vista da realizao
das condies de esterilizao, locais estes que foram
determinados quando da validao.
A eficcia do processo verificada, para cada carga
esterilizada, com indicadores biolgicos apropriados (5.1.2).
Um amostra apropriada de cada lote submetida a um ensaio
de esterilidade (2.6.1) antes da sua libertao.
Filtrao
Certas substncias activas ou produtos no susceptveis
de serem submetidos a uma esterilizao final podem
ser esterilizados por filtrao usando um tipo de filtro
que satisfaa a uma prova microbiana realizada com um
microrganismo de ensaio apropriado. Pode servir uma
suspenso de Pseudomonas diminuta (ATCC 19146 NCIMB
11091 ou CIP 103020). Recomenda-se aplicar uma carga
de prova de, pelo menos, 107 UFC por cm2 de rea activa
de filtrao e preparar a suspenso num meio de cultura
de triptona-soja que, aps passagem atravs do filtro,
recolhido em condies asspticas e incubado em aerobiose
a 32C. Estes produtos necessitam de precaues especiais.
O processo e o ambiente de produo so escolhidos de
modo a limitar os riscos de contaminao microbiana e so
objecto de verificao regular por mtodos apropriados.
O equipamento, os recipientes e fechos e, se possvel, os
componentes do produto so submetidos a um processo de
esterilizao conveniente. Efectua-se a filtrao esterilizante
to prximo quanto possvel do ponto de enchimento.
As operaes que se seguem filtrao so realizadas em
condies asspticas.
As solues so filtradas por uma membrana antibacteriana
de porosidade nominal inferior ou igual a 0,22 m ou por
outro tipo de filtro que possua propriedades equivalentes de
reteno de bactrias. So tomadas precaues para evitar
as perdas de soluto por adsoro no filtro e a libertao de
contaminantes pelo filtro. Tem-se em conta a contaminao
microbiana antes da filtrao, a capacidade do filtro, o
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
tamanho dos lotes e o tempo de filtrao. Um mesmo filtro
no utilizado durante um espao de tempo superior quele
que foi definido como adequado quando da validao do
conjunto filtro-produto.
A integridade dos filtros esterilizantes verificada antes e
depois do seu uso por meio de ensaios adaptados ao tipo de
filtro e etapa em que efectuada a verificao (por exemplo,
ponto de bolha, resistncia presso ou taxa de difuso).
Dados os riscos suplementares que comporta a filtrao,
em relao aos outros mtodos de esterilizao, pode
ser desejvel proceder a uma pr-filtrao com um filtro
antibacteriano quando impossvel limitar a contaminao
microbiana por outros meios.
Preparao assptica
O objectivo da preparao assptica manter a esterilidade
de um produto obtido a partir de componentes previamente
esterilizados por um dos mtodos antes descritos. O
processo de atingir este objectivo operar em condies
e em instalaes concebidas para impedir a contaminao
microbiana. A preparao assptica pode compreender
o enchimento e o fecho assptico dos recipientes, a
mistura assptica dos componentes da frmula seguida do
enchimento e do acondicionamento asspticos.
Para manter a esterilidade dos componentes e do produto
durante a preparao conveniente dispensar ateno
especial aos seguintes aspectos:
meio ambiente,
pessoal laborante,
reas crticas,
esterilizao dos recipientes/fechos e operaes de
transferncia de produtos,
durao mxima da armazenagem antes da embalagem final.
A validao do processo de preparao compreende
verificaes adequadas sobre o conjunto dos parmetros
referidos e o prprio processo objecto de verificaes
regulares por simulao com meios de crescimento
microbiano que so postos a incubar e examinados com vista
deteco de uma eventual contaminao microbiana. Alm
disso, dos produtos esterilizados por filtrao ou preparados
em condies asspticas submetida ao ensaio de esterilidade
(2.6.1) uma amostra apropriada antes da libertao do lote.
5.1.2. INDICADORES BIOLGICOS
DE ESTERILIZAO
Os indicadores biolgicos so preparaes aferidas de
microrganismos seleccionados, utilizados para avaliar a
eficcia de um procedimento de esterilizao. So geralmente
constitudos por uma populao de esporos bacterianos
depositados num suporte inerte, por exemplo uma tira
de papel de filtro, uma lmina de vidro ou um tubo de
material plstico. O suporte semeado embalado de modo
a que o conjunto fique protegido de qualquer alterao
ou contaminao, permitindo no entanto que o agente
esterilizante entre em contacto com os microrganismos. As
suspenses bacterianas podem apresentar-se em ampolas
seladas. Os indicadores biolgicos so preparados de modo a
poderem ser conservados em condies definidas.
Determina-se um prazo de validade.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
5.1.2. Indicadores biolgicos de esterilizao
Microrganismos da mesma espcie bacteriana que as bactrias
utilizadas para fabricar os indicadores biolgicos podem ser
inoculados directamente num produto lquido a esterilizar,
ou num produto lquido similar ao produto a esterilizar. Neste
caso, demonstra-se que o lquido utilizado no tem efeito
inibidor para os esporos utilizados, em particular quanto
sua germinao.
Os indicadores biolgicos so caracterizados pelo nome da
espcie bacteriana do microrganismo indicador, nmero
da estirpe na coleco de origem, nmero de esporos
viveis por suporte e pelo valor D. O valor D o valor de
um parmetro de esterilizao (durao ou dose absorvida)
necessrio para reduzir em 10 por cento do valor inicial, o
nmero de microrganismos viveis. S tem significado em
condies experimentais bem definidas. Esto presentes
apenas os microrganismos indicados. Podem ser utilizados
como indicadores biolgicos suportes com mais do que uma
espcie bacteriana. So fornecidas informaes sobre o meio
5. Textos gerais
de cultura e condies de incubao.
Recomenda-se que os indicadores biolgicos sejam
colocados em locais considerados menos acessveis ao
agente esterilizante, ou identificados como tais por prvias
determinaes fsicas. Aps exposio ao agente esterilizante,
utiliza-se uma tcnica assptica para transferir o suporte
carregado de esporos para o meio de cultura, afim de evitar
qualquer risco de contaminao na altura do exame. Podem
ser utilizados indicadores biolgicos que incluam uma
ampola com meio de cultura directamente colocada na
embalagem de proteco do suporte semeado.
A escolha dos microrganismos indicadores efectuada com
base nos seguintes critrios:
a) a resistncia da estirpe indicadora ao mtodo de
esterilizao considerado , quando comparada, superior
de todos os microrganismos patognicos e dos
microrganismos potencialmente presentes no produto,
b) a estirpe indicadora no patognica,
c) a estirpe indicadora desenvolve-se facilmente,
O desenvolvimento aps incubao dos microrganismos
indicadores submetidos ao processo de esterilizao
demonstra que o processo foi insuficiente.
1. Esterilizao pelo vapor. Recomenda-se a utilizao de
indicadores biolgicos na esterilizao pelo vapor para
a validao dos ciclos de esterilizao. Recomenda-se a
utilizao de esporos de Bacillus stearothermophilus
(por exemplo ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157
ou CIP 52.81). O nmero de esporos viveis por suporte
superior a 5 105 e o valor D a 121C superior a
1,5 min. Verifica-se se a exposio dos indicadores
biolgicos ao vapor durante 6 min a 121 1C mantm
os esporos revivificveis, e que no h desenvolvimento
dos microrganismos indicadores aps exposio ao vapor
durante 15 min a 121 1C.
2. Esterilizao pelo calor seco. Recomenda-se a utilizao de
Bacillus subtilis (por exemplo a var. niger ATCC 9372,
NCIMB 8058 ou CIP 77.18) na preparao de indicadores
biolgicos. O nmero de esporos viveis por suporte
superior a 1 105 e o valor D a 160C da ordem
de 1 a 3 min. O calor seco a temperaturas superiores
a 220C utilizado frequentemente na esterilizao e
eliminao de pirognios no material de vidro. Neste caso,
a demonstrao da existncia de uma reduo de 3 log de
endotoxinas bacterianas resistentes ao calor substitui a
utilizao de indicadores biolgicos.
651
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.3. Eficcia dos conservantes antimicrobianos
3. Esterilizao por radiaes. Podem ser utilizados
indicadores biolgicos para monitorizar as operaes de
rotina, como meio suplementar para avaliar a eficcia
da dose de radiao escolhida, especialmente no caso de
esterilizao com electres acelerados. Recomenda-se a
utilizao de esporos de Bacilius pumilus (por exemplo,
ATCC 27.142, NCTC 10327, NCIMB 10692 ou CIP 77.25). O
nmero de esporos viveis por suporte superior a 1 107.
O valor D superior a 1,9 kGy. Verifica-se que no existe
desenvolvimento de microrganismos indicadores aps
exposio a 25 kGy (dose mnima absorvida)
4. Esterilizao por gases. A utilizao de indicadores
biolgicos necessria para todos os procedimentos
de esterilizao por gases, tanto na validao dos ciclos
como nas operaes de rotina. A esterilizao por gases
correctamente utilizada para os dispositivos mdicos,
5. Textos gerais
os isoladores, os locais, etc. A utilizao dos gases neste
contexto no faz parte das actividades da Farmacopeia.
A utilizao de esporos de Bacillus subtilis (por exemplo
a variedade niger ATCC 9372, NCIMB 8058 ou CIP
77.18) recomendado para o xido de etileno. O nmero
de esporos viveis por suporte superior a 5 105.
Os parmetros de resistncia so conhecidos para o
procedimento utilizado: por exemplo, para o xido de
etileno, o valor D superior a 2,5 min para um ciclo
de ensaio envolvendo 600 mg/l de xido de etileno a
54C com 60 por cento de humidade relativa. Verifica-se
a ausncia de desenvolvimento dos microrganismos
indicadores aps exposio durante 60 min no ciclo do
ensaio atrs descrito, e que a sua exposio durante
15 min num ciclo com temperatura reduzida (600 mg/l,
30C e 60 por cento de humidade relativa) deixa os
esporos revivificveis. A exposio dos indicadores a
600 mg/l de xido de etileno, durante 60 min, a 54C e
sem humidificao deve deixar esporos revivificveis para
assegurar que o indicador biolgico capaz de revelar a
existncia de uma humidificao insuficiente.
5.1.3. EFICCIA DOS CONSERVANTES
ANTIMICROBIANOS
Quando as preparaes farmacuticas no possuam elas
prprias propriedades conservantes adequadas, podem
adicionar-se-lhes agentes de conservao antimicrobianos,
particularmente em preparaes aquosas, com o fim de evitar
ou limitar a proliferao microbiana que pode ocorrer nas
condies normais de conservao e de emprego e assim
apresentar um risco de infeco para o doente e deteriorao
da preparao, nomeadamente nos recipientes multidose. Os
agentes de conservao antimicrobianos no so utilizados
para substituir o cumprimento das boas prticas de fabrico.
A eficcia de um agente de conservao antimicrobiano
pode ser aumentada ou diminuda pelo composto activo
da preparao, pela composio da preparao na qual
incorporado ou pelo recipiente e modo de fecho adoptado.
A actividade antimicrobiana da preparao no recipiente
definitivo avaliada para o seu perodo de validade com
o objectivo de assegurar que aquela actividade no sofre
alterao durante o perodo de conservao. Estes exames
so efectuados em amostras colhidas do recipiente definitivo
imediatamente antes do ensaio.
652
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
Durante a fase de desenvolvimento de uma preparao
farmacutica, verifica-se a actividade antimicrobiana prpria
da preparao ou, se necessrio, demonstra-se que, quando
adicionada de 1 ou mais conservantes apropriados, assegura
uma proteco adequada contra os efeitos nocivos que podem
resultar da contaminao ou da proliferao microbiana
durante o perodo de conservao e emprego da preparao.
A eficcia da actividade antimicrobiana demonstra-se atravs
do ensaio abaixo descrito, que no se destina ao controlo de
rotina.
ENSAIO DE EFICCIA DOS CONSERVANTES
ANTIMICROBIANOS
O ensaio consiste na contaminao artificial da preparao,
se possvel no recipiente definitivo, atravs da inoculao
de microrganismos apropriados, conservando a preparao
semeada a uma temperatura adequada, colhendo amostras do
recipiente em determinados intervalos de tempo e efectuando
nelas uma contagem dos microrganismos.
Consideram-se adequadas as propriedades conservantes
da preparao quando, nas condies do ensaio e aps
intervalos de tempo e temperaturas prescritos, se produzir,
conforme os casos, uma diminuio importante ou uma
ausncia de aumento do nmero de microrganismos na
preparao inoculada. Os critrios de aceitao, em termos
de diminuio do nmero de microrganismos em funo do
tempo, variam para as diversas categorias de preparaes de
acordo com o grau de proteco pretendido (ver quadros)
Microrganismos de ensaio
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82.118.
Staphylococcus aureus ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518;
CIP 4.83.
Candida albicans ATCC 10231; NCPF 3 179; IP 48.72.
Aspergillus niger ATCC 16404; IMI 149007; IP 1431.83.
Os ensaios efectuam-se com 1 estirpe de cada vez.
Complementam-se os microrganismos especificados com
estirpes ou espcies que constituem contaminantes potenciais
da preparao. Por exemplo, a Escherichia coli (ATCC 8739;
NCIMB 8545; CIP 53.126) utiliza-se em todas as preparaes
orais e a Zygosaccharomyces rouxii (NCY 381; IP 2021.92) nas
preparaes orais com elevada concentrao de acar.
Preparao do inculo
Antes do ensaio, semeie superfcie de um meio gelosado
B (2.6.12) para bactrias ou um meio gelosado C sem
antibiticos (2.6.12) para fungos uma cultura-me recente
obtida de cada um dos microrganismos especificados. Incube
as culturas bacterianas a uma temperatura entre 30-35C,
durante 18-24 h, a cultura de C. albicans entre 20-25C,
durante 48 h, e a cultura de A. niger entre 20-25C, durante
1 semana ou at obteno de uma esporulao satisfatria.
Podem ser necessrias subculturas depois de revitalizao dos
microrganismos, at que estes atinjam um desenvolvimento
ptimo, sendo recomendvel que se mantenha um nmero
mnimo de repicagens.
Para a colheita das culturas bacterianas e de C. albicans
utilize um lquido de suspenso estril contendo 9 g/l de
cloreto de sdio R. Disperse e transfira a cultura desenvolvida
em superfcie para um recipiente apropriado. Junte uma
quantidade adequada de lquido de suspenso para reduzir o
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
nmero de microrganismos para cerca de 108 por mililitro.
Para recolher a cultura de A. niger utilize um lquido de
suspenso estril contendo 9 g/l de cloreto de sdio R e
0,5 g/l de polissorbato 80 R e ajuste o nmero de esporos
para cerca de 108 por mililitro com a mesma soluo. Colha
imediatamente uma amostra apropriada de cada suspenso
e determine o nmero de unidades formadoras de colnias
por mililitro em cada suspenso, atravs da sementeira em
placas ou filtrao por membrana (2.6.12). Este valor serve
para determinar o inculo e a linha de base a ser utilizada no
ensaio. As suspenses so usadas imediatamente.
MTODO
Para se efectuar a contagem de microrganismos viveis
nas preparaes inoculadas, use o mesmo meio gelosado
que foi empregue na cultura inicial do microrganismo
correspondente.
Semeie vrios recipientes da amostra com uma suspenso de
um dos microrganismos de ensaio de modo a que se obtenha
um inculo com 105 a 106 microrganismos por mililitro ou
por grama da preparao. O volume da suspenso do inculo
no ultrapassa 1 por cento do volume do produto. Misture
cuidadosamente para assegurar uma distribuio homognea.
Mantenha o produto semeado a uma temperatura entre
20C e 25C, ao abrigo da luz. Colha amostras apropriadas
de cada recipiente, por exemplo 1 ml ou 1 g, no tempo 0 e
nos intervalos de tempo apropriados, consoante o tipo de
preparao, e calcule o nmero de microrganismos viveis
atravs da sementeira em placas ou filtrao por membrana
(2.6.12), assegurando que toda a actividade antimicrobiana
residual da preparao tenha sido eliminada pela diluio,
por filtrao ou atravs da utilizao de um desactivador
especfico. No caso de se utilizar o mtodo das diluies,
leva-se em linha de conta a reduo da sensibilidade na
deteco de pequeno nmero de microrganismos viveis. No
caso de se utilizar um desactivador especfico, confirma-se,
atravs de controlos apropriados, a capacidade do sistema de
permitir o crescimento dos microrganismos de ensaio.
O mtodo validado com o objectivo de se verificar a
capacidade para pr em evidncia a reduo na contagem do
nmero de microrganismos viveis.
CRITRIOS DE ACEITAO
Os critrios para avaliao da actividade antimicrobiana
apresentam-se na tabela em termos de reduo logartmica
do nmero de microrganismos viveis relativamente ao valor
obtido no inculo.
Preparaes parentricas e oftlmicas
Reduo logartmica
6h 24 h 7 dias 14 dias
Bactrias A 2 3
B 1 3 SA
Fungos A 2
B 1
SA: sem aumento
NE: no encontrado
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas
Os critrios A representam a eficcia que se recomenda seja
atingida. Quando justificados, se os critrios A no puderem
ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem
reaces indesejveis, aplicam-se os critrios B.
Preparaes tpicas e locais
Reduo logartmica
2 dias 7 dias 14 dias 28 dias
Bactrias A 2 3 SA
B 3 SA
Fungos A 2 SA
B 1 SA
Os critrios A representam a eficcia que se recomenda seja
atingida. Quando justificados, se os critrios A no puderem
ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem
reaces indesejveis, aplicam-se os critrios B.
5. Textos gerais
Preparaes orais
Reduo logartmica
14 dias 28 dias
Bactrias 3 SA
Fungos 1 SA
Estes critrios representam a eficcia que se recomenda seja
atingida.
5.1.4. QUALIDADE MICROBIOLGICA
DAS PREPARAES FARMACUTICAS
O presente captulo publicado a ttulo de informao.
Este captulo geral tem 2 conjuntos de critrios de aceitao
recomendados em matria de qualidade microbiolgica. O 1.
representa os critrios de aceitao associados aos primeiros
conjuntos de ensaios dos captulos 2.6.12 e 2.6.13. Do mesmo
modo que nestes conjuntos de ensaios, os critrios de aceitao
correspondentes destinam-se a serem posteriormente
substitudos pelo 2. conjunto de critrios. Adimite-se, sob
reserva de autorizao, a utilizao do 2. conjunto de critrios
em vez do 1. conjunto antes de se proceder sua substituio.
Este 2. conjunto de critrios foi desenvolvido em conjunto com
a Farmacopeia do Japo e a Farmacopeia dos Estados Unidos
no mbito do processo de harmonizao internacional.
A. MTODO DA FARMACOPEIA EUROPEIA
O fabrico, o acondicionamento, a conservao e a distribuio
das preparaes farmacuticas so conduzidas de modo a
assegurar uma qualidade microbiolgica satisfatria. As
preparaes farmacuticas satisfazem s seguintes exigncias:
Categoria 1
Preparaes obrigatoriamente estreis de acordo com a
monografia da forma farmacutica correspondente e outras
28 dias preparaes rotuladas de estreis.
NE
Ensaio de esterilidade (2.6.1)
SA
Categoria 2
SA
Preparaes para aplicao local ou para administrao
nas vias respiratrias, com excepo das preparaes
obrigatoriamente estreis, e sistemas transdrmicos.
653
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas

Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). No
mximo, 102 bactrias, fungos e leveduras por grama, por
mililitro ou por sistema transdrmico (compreendendo a
pelcula protectora e a camada de suporte).
Enterobactrias e outras bactrias Gram-negativas (2.6.13).
Dispositivos transdrmicos: ausncia de bactrias,
verificada em 1 sistema (comprendendo a pelcula
protectora e a camada de suporte). Outras preparaes: no
mximo, 10 bactrias por grama ou por mililitro.
Ausncia de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1,0 g,
1 ml ou 1 sistema (comprendendo a pelcula protectora e a
camada de suporte) (2.6.13).
Ausncia de Staphylococcus aureus verificada em 1,0 g,
1 ml ou 1 sistema (comprendendo a pelcula protectora e a
camada de suporte) (2.6.13).
5. Textos gerais
B. Preparaes para administrao por via oral contendo
matrias primas de origem natural (animal, vegetal
ou mineral), quando impossvel um pr-tratamento
antimicrobiano e autorizada para as matrias primas uma
contaminao microbiana superior a 103 microrganismos
por grama ou por mililitro. Excluem-se os medicamentos
com base em plantas descritos na categoria 4.
Contagem de germes aerbios viveis totais (2.6.12).
No mximo, 104 bactrias e 102 fungos e leveduras por
grama ou mililitro.
Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas. No
mximo, 102 bactrias por grama ou por mililitro (2.6.13).
Ausncia de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).
Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml) (2.6.13).

Categoria 3
Categoria 4
A. Preparaes para administrao por via oral ou rectal
Medicamentos com base em plantas, exclusivamente
Contagem de germes aerbios viveis totais (2.6.12). No compostos por uma ou vrias drogas vegetais (inteiras, em
mximo, 103 bactrias e 102 leveduras por grama ou por fragmentos ou em p).
mililitro.
A. Medicamentos com base em plantas que necessitam do
Ausncia de Escherichia coli (1,0 g ou 1,0 ml). uso de gua fervente.
QUADRO 1 Critrios de avaliao da qualidade microbiolgica das substncias para uso farmacutico no estreis

Via de administrao DNGA DNTF

Microrganismos especficos
(UFC/g ou UFC/ml) (UFC/g ou UFC/ml)
Via oral: preparaes no aquosas 103 102 Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
Via oral: preparaes aquosas 102 101 Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
Via rectal 103 102
Via bucal
Via gengival
Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Via cutnea 102 101
Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
Via nasal
Via auricular
Via vaginal 102 101 Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
Ausncia de Candida albicans (1 g ou 1 ml)
Via transdrmica (limites para um 102 101 Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
sistema transdrmico, incluindo Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
pelcula protectora e suporte)
Inalao (aplicam-se as exigncias 102 101 Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
especficas para as preparaes Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
lquidas dispensadas atravs de Ausncia de bactrias gram-negativas resistentes aos sais
nebulizadores) biliares (1 g ou 1 ml)
Disposio especial da Ph. Eur. para
as preparaes para administrao
oral contendo matrias-primas
naturais (animal, vegeta1 ou No mximo, 102 UFC de bactrias gram-negativas
mineral), quando for impossvel resistentes aos sais biliares (1 g ou 1 ml)
um pr-tratamento antimicrobiano
e quando a Autoridade competente 104 102 Ausncia de salmonelas (10 g ou 10 ml)
admite uma contaminao Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
microbiana das matrias-primas Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
superior a 103 microrganismos
viveis por grama ou por mililitro

Disposio especial da Ph. Eur. para

as preparaes base de plantas
exclusivamente compostas por uma
ou vrias drogas vegetais (inteiras,
em fragmentos ou em p):
medicamentos com base em 107 105 No mximo, 102 de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
plantas que necessitam de gua
fervente No mximo, 103 UFC de bactrias gram-negativas
medicamentos com base em resistentes aos sais biliares (1 g ou 1 ml)
105 104
plantas em que no intervm Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
gua fervente Ausncia de salmonelas (10 g ou 10 ml)

654 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12).
No mximo, 107 bactrias e 105 fungos e leveduras por
grama ou por mililitro.
No mximo, 102 Escherichia coli por grama ou por
mililitro (2.6.13), utilizando diluies apropriadas.
B. Outros medicamentos com base em plantas em que no
intervm a gua fervente.
Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12).
No mximo, 105 bactrias e 104 fungos e leveduras por
grama ou por mililitro.
Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas. No
mximo, 103 bactrias por grama ou por mililitro (2.6.13).
Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
Ausncia de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).
B. MTODO HARMONIZADO: QUALIDADE MICROBIOLGICA
DAS PREPARAES FARMACUTICAS E DAS
SUBSTNCIAS PARA USO FARMACUTICO NO ESTREIS
A presena de alguns microrganismos nas preparaes no
estreis pode reduzir ou at anular a actividade teraputica
do produto e constitui um perigo potencial para a sade
do paciente. Os fabricantes tm, pois, a responsabilidade
de assegurar uma fraca carga microbiana nas formas
farmacuticas finais atravs da implementao dos textos em
vigor sobre as Boas Prticas de Fabrico durante o fabrico,
conservao e distribuio das preparaes farmacuticas.
O controlo microbiolgico dos produtos no estreis realiza-
-se de acordo com os mtodos descritos na Parte B. Mtodo
harmonizado dos captulos gerais 2.6.12 e 2.6.13. O quadro 1
e o quadro 2 mencionam os critrios de aceitao aplicveis
aos produtos farmacuticos no estreis com base na
determinao do nmero total de germes aerbios (DNTGA)
e da determinao do nmero total de fungos/leveduras
(DNTFL). Os critrios de aceitao baseiam-se nos resultados
individuais, ou na mdia dos resultados quando se efectuam
vrias contagens, por exemplo, nas contagens em placas.
Quando se prescreve um critrio de aceitao no que respeita
qualidade microbiolgica, este interpretado do seguinte
modo:
101 UFC: nmero mximo aceitvel 20;
102 UFC: nmero mximo aceitvel 200;
103 UFC: nmero mximo aceitvel 2000 e assim
sucessivamente.
O quadro 1 compreende uma lista de microrganismos
especficos para os quais se estabeleceram critrios de
aceitao. Esta lista forosamente no exaustiva e a
pesquisa de outros microrganismos pode ser necessria
para uma determinada preparao, consoante a natureza da
matria-prima de origem e o mtodo de fabrico.
QUADRO 2 Critrios de aceitao da qualidade microbiolgica das
substncias para uso farmacutico no estreis
DN-GA DNTF
(UFC/g ou UFC/ml) (UFC/g ou UFC/ml)
Substncias para 103 102
uso farmacutico
Se se demonstrou que nenhuma das pesquisas prescritas
permite uma contagem vlida dos microrganismos no nvel
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas
prescrito, utiliza-se um mtodo validado com um limite de
deteco to prximo quanto possvel do critrio de aceitao.
Alm dos microrganismos citados no quadro 1, avalia-se a
importncia em aceitar a presena de outros microrganismos
tendo em vista os seguintes factores:
utilizao do produto: risco varivel consoante a via de
administrao (oftlmica, nasal, respiratria),
natureza do produto: aco sobre o crescimento
microbiano (substrato favorvel? Propriedades
antimicrobianas adequadas?),
modo de administrao,
categoria de pacientes alvo: risco potencialmente diferente
para os lactentes, crianas jovens, pessoas fragilizadas,
emprego de imunossupressores, de corticosterides,
5. Textos gerais
existncias de patologias, feridas, leses orgnicas.
Nos casos justificados, efectua-se uma avaliao dos factores
em causa, com respeito ao risco induzido, conduzida por
pessoal com formao especializada em anlise microbiolgica
e interpretao dos dados microbiolgicos. Nas matrias-
-primas, esta avaliao tem em conta o tratamento a que
o produto submetido, as tcnicas actuais de controlo e a
disponibilidade de produtos com a qualidade desejada.
Anexo: disposio especial da Farmacopeia Europeia para
os medicamentos com base em plantas exclusivamente
constitudas por um ou vrios frmacos vegetais (inteiros,
divididos ou em p):
Proceda com o protocolo seguinte:
Preparao das amostras e pr-incubao. Prepare uma
amostra como se descreve no captulo geral 2.6.12, Parte B.
Mtodo harmonizado, utilizando uma diluio a 1/10 de,
pelo menos, 1 g da amostra e semeie uma quantidade
apropriada (determnada como indicado em 3-4 no captulo
geral 2.6.12, Parte B. Mtodo harmonizado) de meio quido
de peptonas de casena e soja com as quantidades da amostra
correspondentes, respectivamente, a 0,1 g, 0,01 g e 0,001 g
(ou 0,1 ml, 0,01 ml, 0,001 ml) do produto. Misture e incube a
30-35C durante 18-24h.
Seleco e subcultura. Agite o recipiente, transfira 1 ml de
meio lquido de peptonas de casena e soja para 100 ml de
meio lquido de MacConkey e incube a 42-44C durante
24-48h. Repique para meio gelosado de MacConkey e incube
a 30-35C durante 18-72h.
Interpretao. O crescimento de clinas indica a provvel
presena de E. Coli, a confirmar por ensaios de identificao.
Anote a menor quantidade de produto que d resultado
positivo e a maior quantidade de produto que d resultado
negativo.
Determine o nmero provvel de bactrias usando o quadro
seguinte.
Resultados obtidos com uma quantidade de produto de Nmero provvel de
bactrias por grama ou
0,1 g ou 0,1 ml 0,01 g ou 0,01 ml 0,001 g ou 0,001 ml mililitro de produto
103
103 e 102
102 e 10
10
655
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
5.1.5. APLICAO DO CONCEITO F0
ESTERILIZAO PELO VAPOR DAS
PREPARAES AQUOSAS
Esta seco publicada a ttulo de informao.
O valor F0 associado a um processo de esterilizao pelo
vapor saturado exprime a sua letalidade, em termos de tempo
(em minutos) de exposio temperatura de 121C que seria
necessrio para obter o mesmo resultado que com o processo
utilizado, aplicado ao produto na sua embalagem final, em
relao aos microrganismos que possuem um valor de Z de 10.
O valor F0 total de um processo tem em conta as fases de
aquecimento e de arrefecimento do ciclo e pode ser calculado
por integrao relativamente aos tempos das taxas de
letalidade associados a intervalos de temperatura pouco
5. Textos gerais
pronunciados.
Quando um ciclo de esterilizao pelo vapor escolhido na
base do conceito F0, confirmado que ele permite obter, de
modo constante, uma adequada segurana de esterilidade.
Para validar o processo, pode igualmente ser necessrio
efectuar um acompanhamento microbiolgico contnuo e
rigoroso durante a produo de rotina para demonstrar que
os parmetros microbiolgicos se mantm compreendidos
dentro das tolerncias estabelecidas para obter um NSE de,
pelo menos, 10 6.
Na esterilizao pelo vapor, Z caracteriza a resistncia de um
microrganismo s variaes de temperatura. Define-se como
a variao de temperatura necessria para modificar o valor
D de um factor de 10.
D o valor de um parmetro de esterilizao (durao ou
dose absorvida) necessrio para reduzir at 10 por cento do
valor inicial o nmero de micorganismos viveis. D s tem
significado em condies experimentais bem definidas.
Entre estes diferentes parmetros existem as seguintes
relaes matemticas:
5.1.6. MTODOS ALTERNATIVOS
PARA O CONTROLO DA QUALIDADE
MICROBIOLGICA
O captulo seguinte publicado a ttulo informativo.
656
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
1. INTRODUO GERAL
O objectivo deste captulo facilitar a implementao
e utilizao de mtodos alternativos no controlo
microbiolgico quando estes conduzem a melhores
custos e aumentam a garantia da qualidade dos produtos
farmacuticos. Estes mtodos alternativos podem tambm
encontrar aplicaes na vigilncia do ambiente.
Os mtodos microbiolgicos descritos na Farmacopeia
Portuguesa vm sendo utilizados h quase um sculo e os
mtodos de contagem e identificao dos microrganismos
prestam ainda grandes servios aos microbiologistas. Durante
todos estes anos constituram um instrumento precioso
para controlar os produtos farmacuticos e para assegurar
a sua segurana microbiolgica. No entanto, os mtodos
microbiolgicos convencionais so lentos e os resultados s
esto disponveis aps um perodo de incubao que pode
ir at 14 dias. Os resultados dos controlos microbiolgicos
convencionais raramente permitem uma correco antecipada.
Durante os ltimos anos surgiram mtodos alternativos
para o controlo da qualidade microbiolgica e alguns
destes mtodos so capazes de disponibilizar resultados
em tempo real (ou quase real) com a possibilidade de uma
aco correctiva mais precoce. Estes novos mtodos trazem
igualmente uma melhoria significativa da qualidade dos
controlos.
Neste captulo informativo descrevem-se os mtodos
microbiolgicos que tm aplicaes farmacuticas. Para
cada mtodo descreve-se o princpio bsico, discutem-se
os benefcios e as desvantagens, depois apresentam-se as
potenciais utilizaes, quer dizer, as aplicaes efectivas que
podem ser encaradas tendo em vista o princpio em que o
mtodo se baseia. Finalmente, incluem-se as consideraes
gerais para a validao destes mtodos, ilustrada com
exemplos especficos para cada tipo de mtodo. A ttulo
informativo, descreve-se, no final do captulo, um protocolo
detalhado de validao.
Este captulo no tem objectivo de recomendar um ou
outro mtodo, nem de fornecer uma lista exclusiva ou
exaustiva de mtodos alternativos que podem ser utilizados
no controlo farmacutico. O seu contedo apenas
informativo mas pode servir de guia no s na escolha de
um mtodo microbiolgico alternativo, como complemento
ou substituio da abordagem dos mtodos microbiolgicos
convencionais, mas tambm para se proceder validao
do mtodo escolhido. Nesta rea em evoluo constante e
rpida, so sempre susceptveis de aparecerem novos mtodos
e as indicaes que se mencionam neste captulo podem ser
tambm aplicveis a estes mtodos.
Existem 3 grandes tipos de determinaes especficas em
matria de controlos microbiolgicos. Estes incluem:
ensaios qualitativos de presena/ausncia de
microrganismos,
ensaios quantitativos de contagem de microrganismos,
ensaios de identificao.
1-1. ENSAIOS QUALITATIVOS DE PRESENA/AUSNCIA DE
MICRORGANISMOS
Nas anlises microbiolgicas convencionais, os ensaios deste
tipo utilizam tipicamente a turvao ou outra alterao
relacionada no meio de cultura como evidncia da presena
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
de microrganismos viveis na amostra. O exemplo mais
comum o ensaio de esterilidade. Outros exemplos deste tipo
so os ensaios que visam determinar a presena/ausncia na
amostra de um tipo particular de microrganismos.
1-2. ENSAIOS QUANTITATIVOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
A filtrao por membrana e a contagem em placa so os
mtodos convencionais utilizados para estimar o nmero de
microrganismos viveis presentes numa amostra. O ensaio
denominado de nmero mais provvel (NMP) constitui
outro exemplo deste tipo de mtodos. Foi desenvolvido para
se estimar o nmero de microrganismos viveis presentes
na amostra quando esta no apropriada para a contagem
directa em placa.
1-3. ENSAIOS DE IDENTIFICAO
A caracterizao bioqumica e morfolgica de um
microrganismo desconhecido constitui o mtodo clssico
de identificao utilizado nos ensaios da Farmacopeia.
Os mtodos desenvolvidos recentemente permitiram
racionalizar e automatizar alguns aspectos desta
identificao, nomeadamente no que respeita ao tratamento,
anlise e armazenamento dos dados. Vrias novas
abordagens foram integradas neste mtodos, como algumas
reaces bioqumicas, utilizao de substratos de carbono,
caracterizao da composio em cidos gordos, perfil das
bandas com endonucleases de restrio e anlise da sequncia
16S do ADNr.
2. PRINCPIOS GERAIS DOS MTODOS ALTERNATIVOS
Os mtodos microbiolgicos alternativos recorrem a tcnicas
directas ou indirectas de deteco; em alguns casos, obtm-se
a amplificao do sinal por mtodos de enriquecimento. Para
ter em conta estas diferenas e por razes de comodidade
na apresentao deste captulo, dividem-se os mtodos
alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica em
3 categorias:
mtodos com base no crescimento, em que geralmente
se obtm um sinal detectvel no final de um perodo de
subcultura,
medio directa, com diferenciao e visualizao das
clulas individuais,
anlise dos componentes celulares, com medio
indirecta da presena microbiana atravs da expresso de
componentes celulares especficos.
Estas distines podem em algumas casos ser artificiais, mas
possibilitam que se crie uma classificao.
2-1. MTODOS COM BASE NO CRESCIMENTO
2-1-1. Deteco precoce do crescimento
2-1-1-1. Aspectos crticos gerais dos mtodos com base na
deteco precoce do crescimento
Estes mtodos esto criticamente dependentes do
crescimento bacteriano para se conseguir um nmero
detectvel de microrganismos. Nos casos tpicos de baixos
nveis de contaminao microbiana que caracterizam os
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
produtos farmacuticos, a deteco pode levar 24 h ou mais,
sobretudo no caso de fungos e leveduras. Pode conseguir-
-se um aumento da sensibilidade procedendo filtrao do
produto. Neste caso, a membrana filtrante incubada no
meio e os resultados so expressos em termos de presena/
/ausncia na quantidade de produto correspondente ao volume
filtrado. Estes sistemas, devido ao facto de utilizarem uma
etapa de incubao em meio lquido, no do informaes
quantitativas e permitem apenas estabelecer uma presena/
/ausncia na quantidade de produto analisado. A anlise
de diferentes quantidades da amostra podem permitir uma
determinao semi-quantitativa (ensaio limite). A principal
vantagem destes mtodos, comparando com os mtodos
clssicos, reside muitas vezes na sua capacidade de permitir
um tratamento simultneo de um grande nmero de
amostras e potencialmente a obteno de resultados num
intervalo de tempo mais curto.
5. Textos gerais
2-1-1-2. Mtodos electroqumicos
Princpio. A multiplicao e a actividade metablica dos
microrganismos num meio de cultura apropriado conduzem
produo de metabolitos inicos com cargas elevadas a
partir dos nutrientes orgnicos com cargas fracas, induzindo
assim uma modificao das propriedades elctricas do meio.
Estas modificaes da impedncia (medidas pela condutncia
e/ou capacitncia) so monitorizadas por meio de elctrodos
integrados nos recipientes de cultura e em contacto com o
meio. O ponto final da medio o tempo necessrio para
se detectar uma variao pr-determinada da impedncia. O
tempo de deteco inversamente proporcional ao tamanho
do inculo inicial. Para os fungos e leveduras que apenas
produzem pequenas variaes da impedncia, recorre-
-se geralmente a uma medio indirecta da condutncia
utilizando um reservatrio de hidrxido de potssio. A
medio directa da capacitncia pode tambm ser possvel.
Aspectos crticos. Deteco automatizada com dados gerados
electronicamente, grficos das variaes da impedncia
reflectindo a curva de crescimento dos microrganismos e
reduo at 48 h da durao do ensaio.
Potenciais utilizaes. Doseamento microbiolgico de
antibiticos, eficcia dos conservantes antimicrobianos,
presena/ausncia na quantidade da amostra analisada quando
efectuada a contagem do total de microrganismos viveis.
2-1-1-3. Medio do consumo ou da produo de um gs.
Princpio. Os microrganismos em fase de multiplicao e de
metabolismo activos, utilizam meios de cultura apropriados,
produzindo por seu lado metabolitos ou induzindo a
eliminao de nutrientes especficos. Uma das abordagens
possveis consiste em verificar as modificaes da composio
dos gases no espao superior dos recipientes de cultura
fechados, com transdutores de presso que reagem produo
de um gs (CO2, por exemplo) ou ao consumo de um gs
(O2, por exemplo). Podem tambm ser utilizados outros
indicadores, nomeadamente a deteco colorimtrica do CO2.
Aspectos crticos. Nos microrganismos de crescimento
lento, como as micobactrias, este mtodo permite uma
deteco mais rpida. No existe relao directa entre a
carga microbiolgica inicial e o ponto final de deteco. A
temperatura de incubao e o algoritmo de tratamento dos
dados influenciam muito os resultados.
Potenciais utilizaes. Produtos nos quais podem estar
presentes microrganismos de crescimento lento.
657
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
2-1-1-4. Bioluminiscncia
Princpio. O trifosfato de adenosina (ATP) um marcador
de viabilidade celular muito conhecido. O mtodo de
bioluminiscncia consiste em provocar a libertao de ATP
pelos microrganismos por meio de um agente de extraco
apropriado e depois efectuar um doseamento quantitativo
com um sistema enzimtico luciferina/luciferase que emite
uma luz de intensidade proporcional quantidade do ATP
presente. A luz emitida medida com um bioluminmetro
e expressa em unidades de luz relativa (ULR) no caso da
bioluminiscncia em meio lquido. O valor de ULR obtido
para uma amostra comparado com um valor limite de
ULR do meio de cultura ou da suspenso da amostra,
determinado 2 ou 3 vezes. O resultado positivo se a
ULR obtida na amostra for superior a este limite. Este
mtodo comporta uma variante que consiste em reter os
microrganismos numa membrana, depois cultiv-los atravs
5. Textos gerais
da incubao em gelose, sendo as microcolnias formadas
detectadas com uma cmara com um detector de carga
acoplado (CCD) e os resultados expressos em
micro-UFC. Este mtodo quantitativo, mas com um
intervalo de linearidade estreito.
Aspectos crticos. Se o produto de onde provm a amostra
apresenta um elevado nvel de contaminao bacteriana (na
ordem de 500-1000 UFC por quantidade da amostra examinada),
a deteco rpida (1 h). Se o nvel de contaminao for baixo Aspectos crticos. Foram feitas tentativas para deduzir por
(menos de 100 UFC por quantidade da amostra examinada),
necessrio amplificar o nmero de microrganismos atravs da
incubao no meio de cultura (lquido ou gelosado) durante
12-48 h consoante o mtodo utilizado. Aps este perodo de
incubao, uma nica clula capaz de crescer, ser multiplicada
por 1000 e poder ser detectada. A produo de ATP varivel
de um microrganismo a outro contendo as bactrias 1-10 fg e os
germes fngicos cerca de 100 fg por clula, existindo numerosos
outros factores que podem afectar o teor em ATP na clula:
espcie, fase de crescimento, estado nutricional, stress ou idade
da clula. No , pois, possvel obter uma contagem directa a
partir do valor de ULR. Por outro lado a turvao e a colorao
da amostra podem afectar a reaco, quer amplificando (devido
ao aumento do sinal luminoso emitido), quer atenuando
(devido a uma diminuio do sinal de luz emitido). Por razes
devidas natureza enzimtica, a reaco tambm sensvel podem infectar clulas hospedeiras e provocar a sua lise ou a
interferncia de produtos susceptveis de inibir ou de reduzir
a actividade enzimtica. Na prtica, este tipo de interferncia
rara, devendo contudo ser objecto de um estudo aprofundado
na altura da validao. A reaco tambm sensvel presena como ponto final as consequncias da infeco. Os pontos
de outros nucleotidos fosfatados como o ADP ou o GTP,
que interferem produzindo o ATP na presena da adenilato
quinase. Esta enzima utilizada para melhorar a sensibilidade
de alguns mtodos de bioluminiscncia: adiciona-se neste
caso um terceiro reagente contendo o ADP e produzido ATP
suplementar em presena da adenilato quinase libertada pelos
microrganismos.
Potenciais utilizaes. Eficcia da conservao
antimicrobiana, presena/ausncia de microrganismos na
quantidade da amostra analisada quando da contagem do
total de germes aerbios viveis (bioluminiscncia em tubo
ou em microplaca), contagem do total de germes aerbios
viveis (bioluminiscncia em membrana), vigilncia do
ambiente e da qualidade da gua. O mtodo aplicvel aos
produtos filtrveis ou no filtrveis.
2-1-1-5. Microcalorimetria
Princpio. O catabolismo microbiano gera calor que pode ser
medido com exactido por microcalorimetria. Pode detectar-
658
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
-se a produo de calor introduzindo a amostra contaminada
numa ampola selada contendo meio de cultura que se coloca
num calormetro. A utilizao de aparelhos sensveis permite
traar curvas de crescimento. A calorimetria de fluxo permite
detectar importantes cargas microbiolgicas.
Aspectos crticos. Teoricamente este mtodo no requer
crescimento mas apenas actividade catablica. Contudo,
necessrio um nmero mnimo de microrganismos para
gerar medies trmicas superiores linha de base que
geralmente se obtm utilizando um meio de enriquecimento.
Potenciais utilizaes. Eficcia da conservao antimicrobiana.
2-1-1-6. Turbidimetria
Princpio. O crescimento microbiano conduz a modificaes
detectveis da opacidade dos meios que possvel quantificar
com exactido atravs da medio da densidade ptica a um
comprimento de onda especfico. Na sua forma mais simples,
estas medies so efectuadas com um espectrofotmetro
padro, geralmente numa gama de comprimentos de onda
de 420-615 nm. Existem tambm sistemas automatizados
com leitores de microplacas que continuamente emitem as
leituras e permitem uma deteco precoce das modificaes
de densidade ptica.
extrapolao a carga microbiolgica inicial a partir do tempo
de deteco, mas elas limitam-se aos microrganismos sos
que apresentam caractersticas de crescimento reprodutveis.
O mtodo no permite diferenciar microrganismos viveis e
no viveis.
Potenciais utilizaes. Determinao do tamanho dos
inculos de suspenses bacterianas a utilizar nos ensaios
farmacuticos a partir de curvas de calibrao. No
modo automatizado, determinao da sensibilidade aos
conservantes por parte dos microrganismos de referncia
isolados dos produtos formulados.
2-1-1-7. Mtodos com base em fagos
Princpio. Os vrus bacterianos (bacterifagos ou fagos)
incorporao do seu material gentico e expresso de novas
protenas. A sua elevada especificidade para o hospedeiro
pode ser aproveitada nos mtodos de deteco que utilizam
finais deste tipo de mtodos so, por exemplo, a formao
de uma placa num tapete slido de bactrias, a deteco dos
contedos intracelulares libertados pelas bactrias lisadas
(eventualmente por colorimetria) ou a observao dos efeitos
de origem fgica como a enucleao de cristais de gelo ou a
bioluminiscncia aps infeco por um fago geneticamente
modificado. Colifagos acoplados a um marcador fluorescente
podem ser utilizados para a deteco selectiva de E. Coli
vivel em combinao como mtodo DEFT (ver 2-2-3.).
Aspectos crticos. A deteco com fagos pode ser utilizada
tanto para culturas homogneas como para culturas mistas,
onde a especificidade para o hospedeiro permite a deteco
e a identificao. Para ser detectvel, o ponto final requer
muitas vezes a presena de um nmero mnimo de clulas
alvo que assegurem a obteno de sinal mensurvel o que
implica um enriquecimento em situaes de baixa carga
microbiolgica. O processo de infeco vrica pode ser
afectado pela composio da amostra. Na maior parte dos
casos, a elevada especificidade para o hospedeiro torna
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
difcil a deteco de um espectro largo de contaminantes
microbianos.
Potenciais utilizaes. Mtodos sobretudo utilizados no
domnio da investigao, com alguns desenvolvimentos
comerciais focando principalmente a microbiologia clnica
e alimentar. Estes mtodos so susceptveis de ser utilizados
para determinar a presena/ausncia de microrganismos
especficos.
2-1-2. Desenvolvimento de meios destinados a melhorar a
deteco
Princpio. H muitos anos que existem meios de cultura que
so objecto de constantes melhorias. Inovao recente neste
domnio so os substratos cromognicos que so cada vez mais
utilizados em microbiologia clnica e alimentar. A propriedade
de detectar enzimas especficas atravs de substratos
apropriados levou ao desenvolvimento de um grande nmero
de mtodos com o objectivo de identificar os microrganismos
por meio de tcnicas manuais ou automatizadas. A
incorporao destes substratos num meio de isolamento
primrio, selectivo ou no selectivo, evita ter de se proceder a
subculturas e testes bioqumicos posteriores para identificar
alguns microrganismos. Os meios de cultura cromognicos
lquidos ou slidos visam estimular actividades enzimticas
especficas que permitam a deteco e a diferenciao de
microrganismos. A formulao destes meios particulares
comporta substratos definidos que so hidrolisados por uma
enzima celular especfica produzida por uma determinada
bactria quando do seu crescimento. Estes substratos so
escolhidos em funo da actividade enzimtica de diagnstico
pesquisada e so associados a indicadores corados.
Aspectos crticos. A utilizao de meios inovadores traz vrias
vantagens: melhor diferenciao das colnias numa cultura
mista, facilidade de emprego e de interpretao, tempo de
resposta mais curto dada a simultaneidade do crescimento e
da identificao dos microrganismos. Exige, contudo, uma
rigorosa validao dos meios para assegurar que so no s
especficos, como selectivos e robustos. A qualidade do sinal
no se fundamenta apenas na escolha das enzimas utilizadas
para a deteco porque as enzimas podem estar presentes em
gneros diferentes, mas tambm em algumas caractersticas
fsico-qumicas do meio, como o pH.
Potenciais utilizaes. Deteco de microrganismos
especficos como o E. coli, coliformes, salmonelas,
estafilococos e estreptococos. Grande utilidade nos ensaios
de controlo da presena/ausncia. Deteco de leveduras
tambm possvel com meios de cultura cromognicos.
2-2. LEITURAS DIRECTAS
2-2-1. Citometria de fase slida
Princpio. Utiliza-se um filtro de membrana para reter os
contaminantes microbianos que so corados atravs da
marcao com um fluorforo (indicador de viabilidade)
antes ou aps filtrao. O fluorforo um substrato
conjugado inicialmente no fluorognico que necessita
uma actividade enzimtica intracelular para a sua clivagem
e libertao da entidade fluorescente. A membrana celular
deve estar intacta para assegurar a reteno do fluorforo
no seio do citoplasma. Opera-se depois a deteco atravs
de excitao laser e varrimento automtico que permite a
visualizao individual dos microrganismos fluorescentes
viveis. Aplicaes informticas apropriadas permitem a
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
diferenciao de microrganismos viveis e de partculas
auto-fluorescentes. A grande sensibilidade e a rapidez
do mtodo permitem a deteco dos contaminantes
microbianos em tempo quase real. Pode obter-se o nmero
total de clulas utilizando um corante com fluorescncia
permanente.
Aspectos crticos. O mtodo torna possvel a deteco
de microrganismos viveis, metabolicamente activos,
dificilmente cultivveis ou no cultivveis. Este facto pode
tornar necessrio um reajuste nos limites de contaminao
microbiana estabelecidos para as amostras em anlise.
A deteco de esporos exige que a germinao se tenha
iniciado.
possvel a deteco de clulas individuais, mas a sua
identificao no faz parte actualmente do protocolo do
ensaio de rotina. A utilizao de anticorpos fluorescentes
pode abrir caminho para a deteco selectiva. A presena de
5. Textos gerais
partculas auto-fluorescentes, por vezes difceis de distinguir
dos microrganismos, pode originar falsos positivos.
Potenciais utilizaes. Mtodo rpido e sensvel para
avaliao no especfica da carga microbiana. A citometria de
fase slida tem aplicaes na rea do controlo das guas de
grau farmacutico.
2-2-2. Citometria de fluxo
Princpio. Os microrganismos em suspenso marcados com
fluorforos, so detectados quando so passados por um
citmetro de fluxo. A utilizao de um substrato com um
fluorforo indicador de viabilidade permite diferenciar os
microrganismos viveis das partculas no viveis (ver 2-2-1.).
Aspectos crticos. A citometria de fluxo aplica-se anlise
microbiolgica dos produtos filtrveis e no filtrveis.
Permite a deteco em tempo quase real mas no to
sensvel como a citometria de fase slida. Para se obter a
sensibilidade necessria no campo farmacutico, muitas
vezes necessrio introduzir uma etapa de incubao em meio
de cultura, o que transforma este mtodo num mtodo com
base no crescimento. Podem ser necessrias diluies em
srie para optimizar o desempenho da anlise das amostras
no filtrveis e o tamanho das partculas pode ter uma
influncia significativa neste desempenho. Com excepo
da filtrabilidade, aplicam-se a este mtodo as mesmas
consideraes da citometria de fase slida. A aglomerao das
bactrias pode ser um problema (por exemplo o S. aureus).
Potenciais utilizaes. Ao contrrio da citometria de
fase slida, possibilidade de deteco e contagem dos
microrganismos nos produtos que contm quantidades
significativas de partculas. Se for necessria uma etapa de
incubao, o mtodo torna-se qualitativo.
2-2-3. Tcnica de filtrao e epifluorescncia directa (DEFT)
Princpio. Este mtodo pode ser considerado como o
percursor da citometria de fase slida. Os microrganismos
concentrados atravs da filtrao da amostra so corados com
um reagente fluorescente (antes pelo laranja de acridina, mas
agora mais frequentemente pelo 4,6-diamidino-2-
-fenilindol ou DAPI), e podem ser detectados com iluminao
epifluorescente. As tcnicas de colorao vital com
fluorescncia utilizadas em citometria de fase slida (ver
2-2-1.) so transpostas para a DEFT e corantes fluorescentes
redox como o cloreto de 5-ciano-2,3-ditoliltetrazlio (CTC)
podem ser utilizados para pr em evidncia clulas com
actividade respiratria. Acoplada a um microscpio, a DEFT
659
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
permite a rpida deteco de microrganismos, dependendo
a sensibilidade absoluta do volume do produto filtrado e do
nmero de campos examinados. A utilizao de sistemas
autofocalizantes semiautomatizados acoplados anlise de
imagens melhorou a utilidade deste mtodo. Uma variante
deste mtodo utiliza uma tcnica de amostragem com uma
pelcula adesiva para colher clulas das superfcies sendo
a colorao efectuada depois na pelcula que examinada
directamente com microscpio com epifluorescncia.
Aspectos crticos. A distribuio dos microrganismos sobre
a membrana influencia a robustez do mtodo. A intensidade
da fluorescncia pode ser afectada pelo procedimento
de colorao e estado metablico dos microrganismos.
Uma curta fase de cultura superfcie do filtro antes da
colorao permite a formao de microcolnias. Estas coram
rapidamente, podem ser facilmente contadas e comprovam a
viabilidade. Novos desenvolvimentos utilizando a hibridao
5. Textos gerais
in situ com fluorescncia (FISH), que resultam da interaco
complementar de uma sonda oligonucleotdica acoplada a
um marcador de fluorescncia e de uma sequncia especfica
de ARNr, abrem caminho para uma deteco selectiva.
Potenciais utilizaes. Utilizao geralmente limitada a
fluidos com fraca viscosidade, embora uma pr-diluio ou
pr-filtrao seja por vezes efectuada em produtos viscosos
ou particulares. D bons resultados no controlo das cargas
microbiolgicas dos produtos farmacuticos aquosos.
2-3. ANLISE DE COMPONENTES CELULARES
2-3-1. Fentipo
2-3-1-1. Mtodos imunolgicos
Princpio. Reaces do tipo antignio-anticorpo podem ser
utilizadas para detectar determinantes celulares nicos
de microrganismos especficos. Para a evidncia destas
reaces podem intervir a hemaglutinao, a colorimetria
ou a fluorimetria, permitindo uma deteco tanto qualitativa
como quantitativa. A imunoadsoro com enzima conjugada
(ELISA) oferece metodologias simples de fase slida.
Aspectos crticos. A deteco por mtodos imunolgicos
depende da expresso unvoca de determinantes celulares
nicos. Estes mtodos no demonstram necessariamente a
presena de microrganismos viveis.
Potenciais utilizaes. Deteco e identificao de
microrganismos especficos.
2-3-1-2. Perfil da composio em cidos gordos
Princpio. A composio em cidos gordos dos
microrganismos estvel, bem conservada e apresenta um
grau de homogeneidade elevada no seio dos diferentes grupos
taxonmicos. Cultiva-se o isolado num meio padro que
depois colhido. Aps saponificao, metilao e extraco fisiolgicas
dos cidos gordos, efectua-se por cromatografia em fase
gasosa a identificao e a quantificao dos steres metlicos
resultantes. A composio em cidos gordos do isolado
desconhecido comparada ao perfil de isolados conhecidos
que constam de uma base de dados para pesquisa de
concordncia e de uma eventual identificao.
Aspectos crticos. A utilizao do perfil de composio em
cidos gordos na identificao de microrganismos requer um
elevado nvel de normalizao. Para a anlise da composio
em cidos gordos das clulas microbianas, crucial que
660
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
os isolados sejam cultivados em meios e em condies de
incubao normalizados. A cromatografia em fase gasosa
deve tambm ser efectuada em condies de trabalho
normalizadas, com anlise frequente de preparaes padro e
de isolados conhecidos.
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
flora no ambiente ou num produto, para marcao dos
contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.
2-3-1-3. Espectroscopia de infravermelho com transformada
de Fourier (FTIR)
Princpio. O espectro de infravermelho com transformada de
Fourier dos microrganismos inteiros, d um perfil estvel,
identificvel e caracterstico de cada grupo taxonmico.
Os aparelhos disponveis no mercado asseguram a anlise
do perfil FTIR. Cultiva-se o isolado num meio padro que
depois colhido. Aps transferncia da massa celular para
um suporte, o registo do espectro e clculo da transformada
de Fourier, o perfil obtido comparado ao perfil de isolados
conhecidos que constam de uma base de dados para pesquisa
de concordncia e de uma eventual identificao.
Aspectos crticos. A utilizao de perfis FTIR para a
identificao de microrganismos requer um elevado nvel
de normalizao. Para a anlise de um perfil FTIR, crucial
que os isolados sejam cultivados em meios e em condies
de incubao normalizadas. Todas as clulas devem estar na
mesma fase de crescimento na altura da anlise. Deve dar-se
uma ateno particular validao.
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
flora no ambiente ou num produto, para a traabilidade dos
contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.
2-3-1-4. Espectrometria de massa
Princpio. O aquecimento a presso reduzida dos isolados
bacterianos provoca a libertao de produtos de
decomposio gasosa que podem ser analisados por
espectrometria de massa e do espectros de massa
caractersticos. Do mesmo modo, as clulas microbianas
intactas, quando submetidas a uma ionizao intensa num
sistema de espectrometria de massa com ionizao por
dessoro laser com anlise de tempo de voo (MALDI-TOF),
apresentam um perfil distintivo da espcie carregada. Estes
espectros podem ser comparados aos dos perfis conhecidos
como forma rpida de identificao.
Aspectos crticos. A anlise dos isolados necessita uma prvia
fase de cultura.
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
flora no ambiente ou num produto, para a traabilidade dos
contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.
2-3-1-5. Doseamentos bioqumicos baseados nas reaces
Princpio. Geralmente o doseamento precedido por uma
colorao de Gram ou um outro teste de diferenciao
precoce que permita escolher o protocolo de ensaio
apropriado. As suspenses de clulas microbianas so
examinadas com equipamentos de identificao que utilizam
uma propriedade bioqumica particular do microrganismo,
como a utilizao de fontes de carbono especficas. Efectua-
-se a identificao da cultura comparando o perfil da reaco
bioqumica com uma base de dados. Estes mtodos so postos
em prtica manualmente ou com aparelhos automatizados.
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
Aspectos crticos. necessrio dispor de uma colnia pura que
no tenha mais de 3 dias. A implementao do sistema no
tem dificuldade, mas a interpretao dos resultados pode ser
subjectiva. Consoante o sistema utilizado e os microrganismos
estudados, a obteno dos resultados pode ser rpida.
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
flora no ambiente ou num produto, para a traabilidade dos
contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.
2-3-2. Gentipo
2-3-2-1. Tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
Princpio geral. As tcnicas de amplificao baseiam-se na
repetio da reaco de polimerizao do ADN segundo
processo chamado de polimerizao em cadeia (PCR), que
conduz a um aumento exponencial do teor de um fragmento
especfico do cido nucleico considerado. Este processo cclico,
termfilo, consiste em amplificar um fragmento especfico
de ADN utilizando iniciadores oligonucleotdicos (ver 2.6.21).
O ARN pode tambm ser amplificado atravs da PCR aps
transcrio em ADNc com uma transcriptase inversa, mtodo
chamado de PCR com transcriptase inversa (RTPCR). Outros
mtodos especficos para o ARN, como as tcnicas com base
na amplificao de sequncias de cido nucleico (NASBA)
ou amplificao mediada por transcrio (TMA), permitem
amplificar cpias mltiplas anti-sentido do ARN alvo. Os
fragmentos de cido nucleico amplificados podem ser analisados
por vrios mtodos: anlise do tamanho dos fragmentos,
anlise de uma sequncia especfica, repetio da amplificao permite detectar em tempo real o produto de amplificao
com um segundo par de iniciadores, ou deteco especfica
por hibridao com uma sonda associada a um marcador
fluorescente. Consoante o mtodo de anlise escolhido, a tcnica
de amplificao pode ser qualitativa, semi-quantitativa ou
quantitativa. Para as aplicaes de identificao/caracterizao,
pode recorrer-se a uma sequenciao de regies especficas do
genoma (16S ou 23S dos ARNr alvo).
Aspectos crticos gerais. As tcnicas de amplificao dos
cidos nucleicos tm numerosas vantagens em relao aos
mtodos clssicos de deteco dos microrganismos:
so altamente especficas, na condio de os iniciadores
escolhidos serem especficos de um microrganismo ou
grupo particular de microrganismos,
os procedimentos so rpidos e permitem ultrapassar o
problema que se levanta com uma incubao prolongada,
a sua grande sensibilidade permite teoricamente a deteco
e amplificao de um fragmento nico do cido nucleico na
mistura reagente.
Contudo, existem numerosas restries prticas sua
utilizao:
a sensibilidade e a eficcia atingidas so influenciadas pela
concentrao dos fragmentos alvo na amostra,
a presena de inibidores do processo enzimtico conduzem
a reaces falsamente negativas,
o pequeno volume inicial da amostra analisada,
devido contaminao cruzada com fragmentos
anteriormente amplificados, a sensibilidade dos
procedimentos conduz a reaces falsamente positivas.
Consoante os objectivos da anlise, necessrio optar pela
amplificao do ARN ou ADN alvos. A escolha do alvo
afecta a correlao com a viabilidade. A utilizao do ADN
como marcador tem um inconveniente pelo facto de os
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
microrganismos mortos tambm conterem ADN. O ARNm
rapidamente degradado aps a morte das bactrias
considerado o melhor marcador de viabilidade.
Aspectos crticos da RT-PCR. A RT-PCR baseia-se na sntese
de ADNc a partir de uma matriz de ARN, efectuada com uma
transcriptase inversa. Uma parte especfica do ADNc depois
amplificada pela PCR. A eficcia da sntese do ADNc varia de
acordo com a qualidade do procedimento de isolamento do
ARN. A RT-PCR pode ser utilizada para a deteco especfica de
ARN se a contaminao de amostras de ARN por ADN for fraca.
Aspectos crticos das tcnicas de amplificao do ARN. Estas
tcnicas provaram ser muito teis na deteco especfica
(quantitativa) de ARN. No entanto, podem ser difceis de
implementar como rotina.
Aspectos crticos da deteco (semi)quantitativa (PCR em
tempo real). Os mtodos clssicos da PCR fundamentam-
5. Textos gerais
-se numa deteco no ponto final. A anlise dos fragmentos
geralmente efectuada com geles de agarose e com
marcadores de tamanho especficos. Contudo, no existe
correlao entre a quantidade do produto de amplificao
obtido no final da reaco e a quantidade inicial da
molcula alvo. Em contrapartida, a quantidade do produto
de amplificao detectado no incio da fase exponencial da
reaco apresenta uma boa correlao com a quantidade
inicial do cido nucleico a amplificar. Desenvolveram-se
tcnicas modernas da PCR em tempo real, para medir esta
fase exponencial da reaco. Uma sonda marcada especfica
formado e obter-se assim uma visualizao directa da
fase exponencial da reaco da PCR. Uma quantificao
da molcula ento possvel por comparao com os
grficos de amplificao obtidos com uma srie de diluies
de referncia. Esto disponveis no mercado sistemas
automatizados da PCR em tempo real. Uma outra vantagem
desta tcnica a de reduzir o risco de contaminao cruzada,
pois os produtos de amplificao so detectados atravs de
leitura laser em tubos fechados. Contudo, criar preparaes
de referncia uma operao difcil.
Aspectos crticos da amplificao dos genes que codificam
as regies 16S ou 23S do ARNr. Uma das mais poderosas
aplicaes da PCR a amplificao e posterior sequenciao
das regies especficas do ADN que codificam as regies
16S ou 23S do ARNr. A anlise destas sequncias especficas
permite na maior parte dos casos a identificao de um
microrganismo at ao nvel da espcie. A seleco de
iniciadores universais apropriados ou mesmo de pares
de iniciadores especficos da espcie a partir de bases de
dados internacionais permite uma elevada especificidade
na amplificao dos fragmentos. A sistemtica moderna
fundamenta-se na anlise comparativa das sequncias.
Potenciais utilizaes. Devido sua elevada especificidade, as
tcnicas de amplificao adaptam-se bem s identificaes.
Permitem a deteco de microrganismos especficos ou de
alguns grupos de microrganismos como os micoplasmas.
Para a contagem, necessrio recorrer PCR quantitativa
(em tempo real).
2-3-2-2. Impresso gentica
Princpio. Este mtodo permite caracterizar e identificar
os microrganismos utilizando fragmentos de restrio dos
cidos nucleicos a partir de genomas bacterianos ou fngicos.
Aps lise das clulas de uma colnia pura extrai-se o ADN
do lisado e fragmenta-se com uma enzima de restrio.
661
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
Separam-se os fragmentos de ADN, em funo do tamanho,
por electroforese, que se visualizam e comparam aos
perfis de isolados microbianos conhecidos. A impresso
gentica constitui um marcador estvel que permite uma
diferenciao absoluta das espcies ou at mesmo uma
caracterizao abaixo do nvel da espcie. A ribotipagem
um exemplo tpico desta tcnica. H tambm mtodos de
impresso com base na PCR, com iniciadores que se ligam
a vrios locais do genoma bacteriano que criam produtos
amplificados que apresentam uma distribuio de tamanho
caracterstica.
Aspectos crticos. necessrio dispor de uma colnia pura,
mas sem se proceder a uma etapa de cultura preliminar.
As condies de crescimento (temperatura, tipo de meio)
no afectam os resultados da anlise. Existem no mercado
sistemas semiautomatizados para a identificao de bactrias.
Potenciais utilizaes. Mais do que para a identificao das
5. Textos gerais
espcies, para a discriminao de estirpes (caracterizao
abaixo do nvel da espcie).
3. REQUISITOS GERAIS PARA A VALIDAO
O objectivo desta seco fornecer indicaes para a
validao dos mtodos alternativos que podem substituir
os mtodos microbiolgicos clssicos da Farmacopeia.
Por razes diversas que podem estar relacionadas com o
custo, comodidade ou rapidez das anlises, os laboratrios
de anlises microbiolgicas recorrem preferencialmente
a outros mtodos alternativos aos descritos nos captulos
gerais, no isolamento e na identificao dos microrganismos.
Exige-se a validao destes mtodos e o captulo 1.1.
Prescries gerais d indicaes com este objectivo.
A validao dos mtodos microbiolgicos alternativos deve
levar em linha de conta a inerente variabilidade associada
aos mtodos convencionais. Por exemplo, numa anlise
convencional de contagem em placa, a gama de resultados
observados muitas vezes maior do que os que normalmente
se obtm nos ensaios qumicos.
Quando se utiliza um equipamento especfico, crucial
para a aplicao do mtodo alternativo que o equipamento
(materiais, incluindo as aplicaes informticas) seja objecto
de uma qualificao completa nos seguintes aspectos:
qualificao da concepo, fornecida pelo fabricante, com
provas documentadas de que a concepo do equipamento
compatvel com a aplicao completa do mtodo,
qualificao das instalaes, com prova documentada de
que o equipamento foi fornecido e instalado de acordo com
as suas especificaes,
qualificao de trabalho, com prova documentada de que o
equipamento instalado funciona nos limites estabelecidos
quando se utiliza de acordo com os procedimentos de
trabalho,
qualificao do desempenho, com prova documentada de
que o equipamento, instalado e utilizado de acordo com
os procedimentos de trabalho, d desempenhos constantes
e conformes com os critrios pr-estabelecidos e deste
modo resultados correctos para o mtodo. Esta qualificao
efectua-se tipicamente com um sistema modelo (utilizando
microrganismos de referncia) que permite assegurar
que as condies de trabalho aplicadas pelo operador
do laboratrio satisfazem no laboratrio aos critrios
estabelecidos por quem forneceu o mtodo.
662
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
Alguns mtodos alternativos fundamentam-se na utilizao
de bases de dados. Para a validao, necessrio ter em
conta o carcter mais ou menos completo da base de dados
relativamente gama de microrganismos considerada.
A validade de qualquer mtodo novo ou modificado deve
ser demonstrada atravs de um ensaio comparativo entre o
mtodo oficial e o mtodo alternativo. Esta comparao deve
ser efectuada com base em parmetros definidos na presente
seco.
3-1. DIVERSOS TIPOS DE ENSAIOS MICROBIOLGICOS
Na validao, crucial identificar a parte do ensaio
respeitante ao mtodo alternativo. Existem, por exemplo,
diversos mtodos que permitem detectar a presena de
clulas viveis. Estes mtodos podem ter aplicao em
variados ensaios (carga microbiolgica, esterilidade, etc.),
mas no se substituem forosamente totalidade do ensaio
em todos os seus aspectos mais crticos. Por exemplo, o
ensaio de esterilidade por filtrao por membrana pode
ser efectuado pelo procedimento da Farmacopeia at ao
momento da reunio do filtro tratado com o meio de cultura.
A presena de clulas viveis pode ento ser demonstrada
por um ou outro dos mtodos disponveis. A validao
desta aplicao incidir mais sobre o sistema de isolamento
utilizado do que sobre o ensaio no seu todo.
Critrios gerais. A validao de um mtodo microbiolgico
um processo que visa estabelecer experimentalmente que
os parmetros do desempenho do mtodo esto conforme
as exigncias da aplicao em causa. Dado que os ensaios
microbiolgicos tm 3 aplicaes bsicas, so necessrios
3 conjuntos de critrios que se descrevem a seguir.
3-2. VALIDAO DE ENSAIOS ALTERNATIVOS
QUALITATIVOS (PRESENA/AUSNCIA DE
MICRORGANISMOS)
3-2-1. Exactido e preciso
Para demonstrar a equivalncia de 2 mtodos qualitativos,
um mtodo directo consiste em efectu-los paralelamente e
determinar o grau de equivalncia entre o mtodo a avaliar
e o mtodo da Farmacopeia. Pode dar-se como exemplo o
ensaio de esterilidade, onde esta abordagem se traduz pela
comparao entre as taxas de resultados positivos e negativos
com amostras idnticas, respectivamente, obtidos com o
mtodo alternativo e com o mtodo da Farmacopeia. Contudo,
pelo facto de haver poucas falhas, num caso como o do ensaio
de esterilidade, o problema que so necessrios milhares de
ensaios comparativos para estabelecer a equivalncia.
Um mtodo mais realista para avaliar a preciso de um
mtodo alternativo qualitativo por comparao com um
mtodo da Farmacopeia pode ser o de considerar o grau de
concordncia entre os 2 mtodos quando os procedimentos
so aplicados de forma repetida a diferentes lotes do mesmo
produto. A exactido e a preciso do mtodo alternativo pode
ser expressa em termos de propores relativas de falsos
negativos e de falsos positivos obtidas com o novo mtodo
relativamente ao da Farmacopeia, quando se utiliza um
inculo normalizado de fraca concentrao.
A taxa de ocorrncia de falsos negativos obtida em
presena da amostra com os 2 mtodos pode ser calculada
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
com microrganismos de referncia presentes em baixa
concentrao. Este modelo de ensaio similar ao utilizado
no ensaio padro de bacteriostase/fungistase, mas o nmero
de microrganismos inoculados deve ser muito baixo, por
exemplo na ordem de 5 UFC por unidade, para assegurar uma
frequncia de falhas suficientemente elevada para permitir
a comparao dos 2 mtodos. O mtodo alternativo deve
assegurar uma frequncia de isolamentos pelo menos to
elevada como o mtodo da farmacopeia.
3-2-2. Especificidade
A especificidade de um mtodo alternativo mede a
sua capacidade em detectar uma gama pretendida de
microrganismos potencialmente presentes na amostra.
Este aspecto convenientemente coberto pelo ensaio de
fertilidade dos meios, nos mtodos qualitativos que utilizam
o crescimento para demonstrar a presena/ausncia de
microrganismos. Nos mtodos que no se baseiam no
crescimento como indicador de presena microbiana, a
especificidade assegura a ausncia de interferncia no ensaio
de elementos estranhos presentes no sistema. Se o objectivo
do ensaio justificar, utilizam-se misturas de microrganismos
na validao.
3-2-3. Limite de deteco
O limite de deteco de um mtodo alternativo o mais
pequeno nmero de microrganismos que podem ser
detectados numa amostra nas condies experimentais
descritas. Em microbiologia, um ensaio limite serve para
determinar a presena/ausncia de microrganismos e o
limite de deteco refere-se ao nmero de microrganismos
presentes na amostra inicial antes de qualquer diluio ou
incubao e no ao nmero de microrganismos presentes no
momento do ensaio.
Os 2 mtodos (alternativo e da Farmacopeia) devem ser
avaliados com um inculo que contm um baixo nmero
de microrganismos de referncia (por exemplo 5 UFC por
unidade) seguido da medio da taxa de isolamentos. A
concentrao do inculo deve ser ajustada at que, pelo
menos, 50 por cento das amostras apresentem crescimento
no ensaio da Farmacopeia. necessrio repetir vrias
vezes esta determinao porque o limite de deteco de um
ensaio determina-se com base num nmero apropriado
de repeties (por exemplo, no inferior a 5). A aptido
dos 2 mtodos em detectar a presena de microrganismos
individuais pode ser demonstrada pelo teste do x2.
3-2-4. Robustez
A robustez de um mtodo alternativo qualitativo mede a
sua capacidade em no ser afectado por pequenas variaes
deliberadas nos parmetros de trabalho e d uma indicao
da fiabilidade do mtodo nas condies de ensaio normais,
mas variveis, como diferentes analistas, aparelhos, lotes de
reagentes e laboratrios. Pode ser definida como a resistncia
intrnseca s influncias exercidas nos resultados do ensaio
pelas variveis de trabalho e ambientais. A robustez um
parmetro de validao que o fornecedor est em melhor
condio de efectuar, mas, se o utilizador introduzir
modificaes a alguns parmetros crticos, o seu efeito na
robustez deve ser avaliado. Julga-se a robustez de um mtodo
qualitativo pela sua aptido em detectar os microrganismos
de referncia quando deliberadamente se variam os
parmetros de trabalho.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
3-3. VALIDAO DE ENSAIOS ALTERNATIVOS
QUANTITATIVOS (CONTAGEM DE MICRORGANISMOS)
3-3-1. Exactido
A exactido de um mtodo alternativo mede a proximidade
entre os resultados obtidos pelo mtodo alternativo e os
valores obtidos com o mtodo da Farmacopeia. A exactido
deve ser demonstrada no intervalo de valores do ensaio. A
exactido geralmente expressa pela percentagem de re-
isolamentos obtida com o mtodo.
A exactido pode ser demonstrada preparando uma suspenso
de microrganismos no limite superior do intervalo de valores
do ensaio e depois proceder a diluies em srie at ao
limite inferior desse intervalo. Se, por exemplo, o mtodo
alternativo se destina a substituir uma tradicional contagem
de microrganismos viveis em placa, um intervalo de medida
razovel pode ser de 100-106 UFC/ml. Se, em vez disso, se
5. Textos gerais
pretende substituir o mtodo do NMP, pode ser utilizado
um intervalo mais estreito. preciso analisar, para cada
microrganismo de referncia, no mnimo, 5 suspenses
repartidas pelo intervalo de medida. Se o mtodo alternativo
se destina a substituir um mtodo convencional, ele deve
fornecer um valor do nmero de microrganismos viveis
que no seja inferior em 70 por cento ao valor obtido com o
mtodo da Farmacopeia.
O protocolo utilizado para verificar a linearidade do mtodo
(ver 3-3-5.) pode tambm ser utilizado para verificar a
exactido: procede-se simultaneamente contagem pelo
mtodo da Farmacopeia das suspenses de microrganismos
preparadas para o mtodo alternativo. Demonstra-se a
exactido se os ensaios de conformidade mostrarem que o
declive da regresso linear no significativamente diferente
do valor 1 e se a ordenada na origem no significativamente
diferente de 0.
3-3-2. Preciso
A preciso de um mtodo alternativo mede o grau de
concordncia obtido entre os resultados individuais quando a
tcnica aplicada de forma repetida a mltiplas amostras de
suspenses homogneas de microrganismos nas condies
prescritas. geralmente expressa em termos de varincia, de
desvio padro ou de coeficiente de variao de uma srie de
resultados de medida.
Como procedimento mnimo, sujeita-se a vrias contagens
uma suspenso de microrganismos com uma concentrao
situada habitualmente no meio do intervalo de medida.
Escolhe-se o nmero de repeties de modo que todo o
ensaio possa ser efectuado durante a mesma sesso de
trabalho, quer dizer, nas mesmas condies de trabalho
e sem modificao da suspenso de microrganismos.
Efectuam-se depois outras sesses de trabalho em condies
de variabilidade mxima (diferentes reagentes, diferentes
operadores, dias diferentes, etc.). Calcula-se a varincia
dos resultados observados em cada sesso (grupo).
Se as varincias so homogneas, calcula-se a varincia
da repetibilidade. Calcula-se a varincia dos resultados
intergrupos. A varincia da preciso intermdia a soma
das varincias da repetibilidade e da varincia intergrupos.
Calculam-se depois os coeficientes de variao. Regra geral,
um coeficiente de variao na ordem de 10-15 por cento
aceitvel. Independentemente dos resultados especficos
obtidos, o mtodo alternativo no deve dar um coeficiente de
variao mais elevado que o mtodo da Farmacopeia.
663
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
3-3-3. Especificidade
Demonstra-se a especificidade de um mtodo alternativo
quantitativo com uma gama de microrganismos apropriados.
Se o objectivo do ensaio justificar, utilizam-se na validao
misturas de microrganismos.
3-3-4. Limite de quantificao
O limite de quantificao de um mtodo alternativo
quantitativo o mais pequeno nmero de microrganismos
que podem ser contados com exactido. Como no possvel
obter uma amostra fivel com um nmero conhecido de
microrganismos, torna-se indispensvel determinar o
limite de quantificao a partir de um determinado nmero
de repeties, por exemplo, no mnimo, 5. Os resultados
dos estudos de linearidade e de exactido podem tambm
ser utilizados. A mais baixa concentrao do intervalo de
linearidade ento considerada como limite de quantificao
5. Textos gerais
do mtodo. Este valor no deve ser superior ao limite de
quantificao do mtodo da farmacopeia.
3-3-5. Linearidade
A linearidade de um mtodo alternativo quantitativo mede
a sua capacidade em produzir, num determinado intervalo,
resultados proporcionais concentrao de microrganismos
na amostra. Convm determinar a linearidade no intervalo de
medida correspondente ao objectivo do mtodo alternativo.
Pode-se para o efeito seleccionar diferentes concentraes de
cada microrganismo de referncia e efectuar vrias repeties
para cada concentrao. Fixa-se o nmero de repeties de
modo que o conjunto do ensaio possa ser efectuado durante
a mesma sesso de trabalho. Efectuam-se de seguida 2 outras
sesses de trabalho em condies de variabilidade mxima
(diferentes reagentes, diferentes operadores, dias diferentes,
etc.). Aps verificao da homogeneidade da varincia dos
resultados obtidos em cada concentrao, calcula-se a
regresso linear. Determina-se a linearidade se o declive
estimado significativo e se o desvio de linearidade no for
significativo.
3-3-6. Intervalo de medida
O intervalo de medida de um mtodo alternativo quantitativo
o intervalo compreendido entre a menor e a mais
elevada concentrao em microrganismos que puderam
ser determinadas com preciso, exactido e linearidade
do mtodo descrito. O intervalo de medida deduzido dos
estudos de preciso, de exactido e de linearidade.
3-3-7. Robustez
A robustez de um mtodo alternativo quantitativo mede a
sua capacidade em no ser afectado por pequenas variaes
deliberadas nos parmetros de trabalho. D uma indicao
da fiabilidade do mtodo nas condies de ensaio normais,
mas variveis, como diferentes analistas, aparelhos, lotes de
reagentes e laboratrios. Pode ser definida como a resistncia
intrnseca s influncias exercidas nos resultados do ensaio
pelas variveis de trabalho e ambientais. A robustez um
parmetro de validao que o fornecedor est em melhor
condio de efectuar, mas, se o utilizador introduzir
modificaes a alguns parmetros crticos, o seu efeito na
robustez deve ser avaliado. Julga-se a robustez de um mtodo
qualitativo pela sua aptido em assegurar uma contagem
de microrganismos de referncia estatisticamente correcta
quando deliberadamente se variam os parmetros de trabalho.
664
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
3-4. VALIDAO DE ENSAIOS ALTERNATIVOS
DE IDENTIFICAO
Mltiplas observaes demonstram a considervel
variabilidade dos diferentes mtodos quanto sua
capacidade em identificar os microrganismos nos produtos
farmacuticos. preciso aceitar a ideia de que um mtodo
de sistemtica, se internamente consistente, pode diferir
de outros mtodos quanto identificao dos isolados. Por
outras palavras, a identificao de um isolado pode no
conduzir mesma concluso, consoante o mtodo utilizado
se baseia na actividade bioqumica, no perfil da composio
em cidos gordos, na anlise do ADN ou noutro mtodo. As
identificaes microbiolgicas, de acordo com um sistema
particular, derivam directamente da experincia adquirida
com o sistema e podem por isso diferir ligeiramente das
identificaes efectuadas por um outro sistema.
3-4-1. Exactido
A exactido de um mtodo alternativo de identificao mede
a sua capacidade em identificar o microrganismo estudado
ao nvel taxonmico pretendido e de o diferenciar de outros
microrganismos presentes na amostra. Deve demonstrar-
-se com uma gama de microrganismos de referncia ou
de microrganismos obtidos a partir de amostras tipo
previamente identificadas por um outro mtodo.
3-4-2. Preciso
A preciso de um mtodo alternativo de identificao mede o
grau de concordncia obtido entre os resultados individuais
quando o mtodo aplicado de forma repetida a mltiplas
amostras de suspenso de microrganismos de referncia
cobrindo o intervalo de medida do ensaio.
3-4-3. Robustez
A robustez de um mtodo alternativo de identificao
mede a sua capacidade em no ser afectado por pequenas
variaes deliberadas nos parmetros de trabalho. D uma
indicao da fiabilidade do mtodo nas condies de ensaio
normais, mas variveis, como diferentes analistas, aparelhos,
lotes de reagentes e laboratrios. Pode ser definida como a
resistncia intrnseca s influncias exercidas nos resultados
do ensaio pelas variveis de trabalho e ambientais. A robustez
um parmetro de validao que o fornecedor est em
melhor condio de realizar, mas, se o utilizador introduzir
modificaes a alguns parmetros crticos, o seu efeito na
robustez deve ser avaliado. Julga-se a robustez de um mtodo
de identificao pela sua aptido em assegurar de forma
constante a identificao dos microrganismos de referncia
quando deliberadamente se variam os parmetros de trabalho.
4. EXIGNCIAS ESPECFICAS DE VALIDAO
4-1. CONTEXTO
Consoante os contextos, a validao definida de forma um
pouco diferente, mas a sua definio consensual a de que
consiste em estabelecer uma prova documentada de que um
procedimento ir permitir realizar de forma reprodutvel o
objectivo a que se destina. Por consequncia, essencial para
a validao correcta de um novo mtodo compreender bem e
definir qual o seu objectivo.
Para a aplicao de mtodos microbiolgicos convencionais
ou alternativos, preciso encarar 2 nveis de validao. A
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
validao primria de um mtodo regra geral realizada pelo
fornecedor do mtodo, enquanto que a sua validao para o
uso efectivo previsto, que consiste em verificar a adequao
ou aplicabilidade do mtodo numa determinada situao, da
responsabilidade do utilizador. Antes da validao para o uso
efectivo previsto, o utilizador deve efectuar uma qualificao
do desempenho como se descreve na seco 3. Requisitos
gerais para a validao.
Os mtodos microbiolgicos utilizam tipicamente algumas
caractersticas especficas dos microrganismos como
indicadores ou princpios de deteco para responder
a questes mais gerais. As informaes necessrias so
a presena, o nmero, a viabilidade, a resistncia ou a
identidade dos microrganismos num produto ou num
determinado ambiente.
Um determinado mtodo d geralmente uma resposta
indirecta e condicional s questes colocadas. Por exemplo,
uma indicao do nmero total e da viabilidade dos
microrganismos dada pelo nmero de microrganismos
capazes de se reproduzirem em determinadas condies
de preparao da amostra, de cultura e de incubao. A
reproduo , pois, em microbiologia clssica, utilizada como
indicador geral de viabilidade. Existem, no entanto, outros
parmetros que podem servir de indicadores de viabilidade.
O nvel do ATP, a acumulao ou o metabolismo de substratos
nas clulas vivas so igualmente indicadores possveis de
viabilidade. Os resultados obtidos a partir de diferentes
indicadores de viabilidade no sero sempre idnticos. Os
microrganismos podem ser incapazes de se reproduzir num
determinado meio, sendo no entanto capazes de acumular
e metabolizar um substrato. Do mesmo modo, num
determinado estado de deteriorao, podem ser incapazes de
acumular um substrato mas serem no entanto capazes de se
perpetuar e reproduzir.
Estas consideraes aplicam-se tambm aos mtodos
utilizados na identificao de microrganismos. A
caracterizao do perfil metablico de microrganismos
muitas vezes utilizada na identificao das espcies, enquanto
que um outro mtodo consiste em comparar as sequncias
de ADN. Novamente, as respostas obtidas com os diferentes
mtodos de identificao podem no coincidir totalmente
e uma resposta pode ser apropriada construo de uma
rvore de correlao filogentica, enquanto que outra
mais til no contexto do poder patognico ou de outras
propriedades de microrganismos diferenciados.
4-1-1. Validao primria
Para caracterizar um mtodo microbiolgico especfico,
essencial que o princpio de deteco associado seja
claramente descrito pelo fornecedor. O mtodo deve ser
descrito com pormenor no que diz respeito s condies de
aplicao, aos produtos e equipamentos necessrios e ao sinal
esperado. O princpio do mtodo deve estar descrito numa
publicao cientfica reconhecida.
O princpio de deteco deve estar caracterizado num
sistema modelo e/ou com um conjunto de microrganismos
de referncia, no que diz respeito, no mnimo, aos seguintes
aspectos:
tratamento prvio das amostras ou dos microrganismos,
tipo de respostas,
especificidade da resposta,
limite de deteco,
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
intervalo de medida,
linearidade da resposta,
exactido e preciso das respostas,
robustez do mtodo num sistema modelo,
limites de aplicabilidade.
Desde que o mtodo tenha sido caracterizado desta forma
pelo fornecedor, o princpio de deteco no necessita de ser
verificado por cada utilizador.
4-1-2. Validao de um mtodo microbiolgico alternativo
4-1-2-1. Anlise risco/benefcio
Para a validao de mtodos microbiolgicos alternativos
especficos, crucial que o objectivo do procedimento
seja descrito rigorosamente. Com este propsito , pois,
5. Textos gerais
necessrio definir o tipo e o grau de preciso das informaes
pretendidas. No mbito de uma anlise de risco/benefcio,
deve ser efectuado um estudo comparativo do mtodo
convencional e do mtodo alternativo, quanto s informaes
obtidas e s suas limitaes.
A aplicao de um mtodo alternativo pode ser considerada
justificada se as informaes obtidas fornecerem respostas
cientificamente fundamentadas s questes colocadas pelo
procedimento e se o mtodo no for mais restritivo que o
mtodo convencional.
4-1-2-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
O mtodo alternativo deve ser aplicado no mbito do
procedimento em vigor e com as amostras a analisar sob
a responsabilidade do utilizador. Deve demonstrar-se que
um sistema modelo fornece resultados comparveis aos
caracterizados pelo fornecedor. As questes especficas que se
colocam neste contexto, consoante o caso, so, por exemplo:
a compatibilidade da resposta com as modalidades de
preparao das amostras para o ensaio,
os limites e a gama de deteco do mtodo, tendo em conta
o tamanho e a disponibilidade das amostras,
a especificidade da resposta, tendo em conta todos os tipos
de amostras a analisar,
a exactido e a preciso da resposta, tendo em conta todos
os tipos de amostras a analisar,
a robustez do mtodo, tendo em conta todos os tipos de
amostras a analisar.
Em funo da aplicao e dos dados da validao, ser
necessrio definir os critrios de aceitao aplicveis
utilizao de rotina do mtodo.
4-2. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS POR
BIOLUMINISCNCIA
4-2-1. Anlise risco/benefcio
Como comprovam os estudos cientficos aprofundados e
os anos de utilizao, o mtodo que utiliza o ATP como
marcador de viabilidade equivalente aos mtodos clssicos
de contagem em placa quanto gama de microrganismos
que permite detectar. Estando dependente do crescimento, a
principal melhoria trazida por este mtodo, comparando aos
mtodos clssicos, a vantagem de se obter um resultado
665
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
com maior rapidez (24 h para a bioluminiscncia, 5 dias para
a cultura em placa). A identificao dos microrganismos
detectados por bioluminiscncia possvel a partir do
meio de incubao, mas deve recordar-se que numa
cultura mista alguns microrganismos podem competir
com outros durante a incubao. Estes mtodos permitem
a avaliao das amostras em 24 h no caso de produtos
filtrveis e no filtrveis (gua, controlo durante o processo,
amostras ambientais, matrias primas slidas e lquidas,
produtos finais slidos e lquidos, etc.) assim como de um
grande nmero de amostras quando a etapa de deteco
automatizada.
4-2-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
O mtodo baseia-se na deteco de ATP de microrganismos
viveis. Deve ser efectuada uma qualificao do desempenho
com microrganismos de referncia para se assegurar que as
5. Textos gerais
condies de trabalho aplicadas pelo utilizador do laboratrio
permitem satisfazer aos critrios definidos pelo fornecedor
em matria de preciso, de exactido e de linearidade
(mtodo quantitativo), de limite de deteco (mtodo
qualitativo e semiquantitativo) no intervalo de medida
requerido para o uso pretendido. Aps esta etapa, prossegue-
-se a validao em 3 fases:
fase 1: fertilidade do meio em presena do produto (se for
realizada uma etapa de incubao),
fase 2: pesquisa de interferncias que podem aumentar ou
inibir a produo de ATP (atravs da adio na amostra de
uma soluo padro de ATP),
fase 3: estudo comparativo com o mtodo da Farmacopeia.
Descreve-se no final deste captulo um exemplo detalhado de
validao de um mtodo de bioluminiscncia.
4-3. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS POR CITOMETRIA
(DE FLUXO OU DE FASE SLIDA)
4-3-1. Anlise risco/benefcio
Como comprovam os estudos cientficos aprofundados,
este mtodo que utiliza um fluorforo como marcador de
viabilidade, superior aos mtodos clssicos de contagem
em placa, quanto gama de microrganismos que permite
detectar e/ou contar. A citometria permite com efeito
detectar a totalidade dos microrganismos viveis, incluindo
alguns que podiam no ser detectados pelos mtodos
baseados no crescimento. Embora rpido, o isolamento dos
microrganismos aps anlise limitado. O prosseguimento
da anlise das amostras tendo em vista uma identificao,
requer o emprego de outros corantes fluorescentes ou de um
mtodo alternativo. Actualmente, no possvel utilizar a
citometria por rotina na identificao dos microrganismos,
embora a sua morfologia geral seja claramente apreciada
com microscpio de fluorescncia com citometria de fase
slida. Este mtodo permite uma avaliao rpida das
amostras e permite uma interveno antecipada durante o
fabrico, facilitando assim integrar a qualidade nas operaes
farmacuticas. No estando dependente do crescimento,
este mtodo permite a deteco de todos os microrganismos
que tenham actividade metablica. Actualmente, contudo, o
limite de deteco da citometria de fluxo tal que no pode
ser utilizada na maior parte das amostras farmacuticas, na
contagem atravs do exame directo. Se for necessria uma
pr-incubao a estimativa torna-se semi-quantitativa (ensaio
limite).
666
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
4-3-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
A citometria baseia-se na deteco de um sinal de
fluorescncia emitido pelos microrganismos marcados.
Deve ser efectuada uma qualificao do desempenho para
assegurar que os aparelhos funcionam no limite dos parmetros
de trabalho definidos. Estes controlos envolvem a utilizao
de padres de fluorescncia com a intensidade prescrita bem
como de culturas contendo um tipo e um nmero conhecido
de microrganismos. Estes permitem comprovar o sistema de
deteco quantitativo. Os reagentes e consumveis (testemunhas
negativas) devem ser igualmente utilizados para assegurar a
aplicabilidade do protocolo do ensaio de rotina e verificar que
a qualidade dos materiais utilizados no ensaio no falseia o
resultado final. Utilizam-se culturas puras de microrganismos
de referncia para comprovar o sistema de deteco e para
comparar os resultados com os obtidos com a clssica contagem
em placas. Utilizam-se mltiplas repeties (pelo menos, 5) de
culturas incubadas durante 1 noite, diludas num determinado
intervalo de concentraes (por exemplo 100 por cento, 75 por
cento, 50 por cento, 25 por cento, 10 por cento), para avaliar
a linearidade, a exactido, a preciso, o intervalo de medida, a
especificidade, o limite de quantificao (mtodo quantitativo)
e o limite de deteco (citometria de fluxo com pr-incubao).
Dado que a citometria se caracteriza por uma elevada
sensibilidade (a citometria de fase slida permite a deteco
de clulas individuais e a citometria de fluxo possui uma
sensibilidade da ordem de 10-15 clulas por mililitro) e por uma
deteco no baseada no crescimento, a linearidade da resposta
instrumental pode ser verificada por comparao dos resultados
efectivos com o valor esperado. A seguir a esta etapa, a validao
prossegue em 2 fases: validao relativamente amostra e
ensaios comparativos. Os resultados de cada fase devem ser
avaliados em relao aos critrios de aceitao pr-estabelecidos
em presena de testemunhas positivas e negativas:
fase 1: para verificar que o processo de preparao das
amostras e as prprias amostras no afectam o desempenho
do sistema de deteco, necessrio sobrecarregar os
produtos a avaliar por citometria, com uma quantidade
definida de microrganismos; deve ser dada uma ateno
particular ausncia na matriz das amostras de factores
que podem influenciar a deteco (cromforos endgenos,
partculas auto-fluorescentes) e, no caso da citometria de
fluxo, o tamanho/diluio da amostra e o dbito devem ser
optimizados,
fase 2: devem ser efectuados ensaios para se comparar
os resultados obtidos por citometria e pelo mtodo da
Farmacopeia. Devem ser definidos num protocolo de
comparabilidade o nmero de amostras necessrias e a
durao do ensaio. O nmero de amostras necessrias
pode ser varivel, mas deve ser representativo do processo
de avaliao do produto (tempo/nmero) e permitir
uma avaliao estatstica. Todas as amostras devem ser
preparadas de acordo com os procedimentos definidos
e avaliados relativamente aos critrios de validao e de
aceitao escolhidos, semelhantes aos utilizados para a
avaliao de culturas puras.
4-4. IDENTIFICAO ATRAVS DA ANLISE DO PERFIL DE
COMPOSIO EM CIDOS GORDOS
4-4-1. Anlise risco/benefcio
A identificao atravs do perfil da composio em cidos
gordos pode ser mais precisa do que as identificaes
baseadas nos perfis metablicos dos mtodos de cultura
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
convencionais. As bases de dados so mais extensas do que os
mtodos de cultura convencionais. necessria uma pr-
-incubao, mas a extraco e a identificao so mais rpidas microrganismos vivos dos microrganismos mortos. Isto
que com os mtodos bioqumicos e, como consequncia
disso, mais rpida a obteno dos resultados. Outros
mtodos modernos como a anlise das sequncias 16S de
ADNr em que a impresso gentica apresenta um domnio
de diferenciao tambm grande, do resultados to rpidos
como este mtodo. A diferenciao de microrganismos muito
aparentados (como E. coli e salmonelas) atravs da anlise
dos perfis da composio em cidos gordos pode ser difcil.
Quando esta diferenciao particularmente importante,
outros sistemas podem dar resultados mais precisos. Para
uma determinada aplicao, importante especificar que
tipos de microrganismos importante identificar. Se for
crucial caracterizar correctamente a espcie do isolado do
ponto de vista filogentico, os mtodos de identificao
baseados na sequncia do ADN do resultados mais fiveis.
Outra das limitaes da identificao com base nos perfis
da composio em cidos gordos a necessidade de se
cultivar os microrganismos em meios padro e em condies
normalizadas de temperatura e de tempos de incubao.
Microrganismos que no podem ser cultivados nestes meios
no podem ser identificados.
4-4-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
Deve demonstrar-se que o mtodo d resultados constantes
com uma gama de microrganismos de referncia com, pelo
menos, 3 repeties em cada caso.
Deve ser efectuada pelo utilizador a identificao de um
nmero significativo de isolados obtidos a partir de amostras
tipo, 3 vezes para cada isolado, pelo menos. Os resultados
obtidos em cada caso devem ser coerentes e estar em
conformidade com os resultados obtidos por outros mtodos
de identificao. Se um outro sistema de identificao d um
resultado diferente, deve investigar-se a causa. Se existir uma
explicao cientificamente plausvel para o reconhecimento
de espcies diferentes, a divergncia entre os sistemas de
identificao pode ser aceitvel. Neste caso, necessrio
assegurar que o reconhecimento da espcie identificada
robusto. tambm necessrio verificar se o sistema no
reagrupa numa mesma espcie isolados mal conhecidos,
simulando o isolamento repetido da mesma espcie.
4-5. TCNICAS DE AMPLIFICAO DOS CIDOS
NUCLEICOS
4-5-1. Anlise risco/benefcio
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos so
muito utilizadas para fins de diagnstico em virtude da
sua preciso e da sua rapidez, aos quais se juntam o custo
relativamente baixo das anlises, mas no dos aparelhos,
relativamente aos mtodos tradicionais. Com a condio de
terem sido efectuadas validaes especficas, estes mtodos,
correctamente utilizados, podem trazer vantagens no
negligenciveis em algumas reas relativamente aos mtodos
clssicos. Os mtodos clssicos, em contrapartida, so
mais fceis de normalizar, necessitam um menor nvel de
competncias tcnicas e podem ter um custo menos elevado.
Regra geral, mesmo quando para pr em prtica os mtodos
de amplificao dos cidos nucleicos no mais difcil que
para os mtodos tradicionais, a interpretao dos resultados
requer um grau superior de competncias cientficas.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
Quando so utilizadas na identificao as tcnicas de
amplificao do ADN, estas no permitem distinguir os
significa que no podem ser utilizadas directamente no
produto mas apenas aps passagens num tradicional meio
de cultura, o que faz perder uma parte da sua vantagem
em termos de rapidez. Por outro lado, se so aplicados
directamente no produto, no permitem obter no final da
anlise uma estirpe que possa ser utilizada em experincias
posteriores, e no trazem qualquer vantagem quando os
microrganismos a detectar so dificilmente cultivveis ou
esto em stress. As tcnicas de amplificao do ARN (por
exemplo a RT-PCR) permitem a identificao directa de
microrganismos vivos no produto (mas no de esporos),
mas so muito mais difceis de utilizar na rotina que
os mtodos tradicionais. Em contrapartida, quando se
utilizam iniciadores especficos, os mtodos que recorrem
5. Textos gerais
amplificao de cidos nucleicos permitem uma identificao
(ou tipagem) mais precisa que os mtodos tradicionais e
trazem por vezes ainda outras vantagens. Por exemplo, na
identificao de algumas vacinas (vacina contra a clera,
vacina contra a tosse convulsa com clulas inteiras) a sua
utilizao pode substituir a utilizao de soros especficos e
contribuir para reduzir a utilizao de animais ou, noutras
vacinas especficas (BCG), podem permitir uma identificao
muito especfica, at agora impossvel.
Estes mtodos so em geral no quantitativos (PCR) ou semi-
-quantitativos (PCR em tempo real). Os seus resultados no
podem ser comparados aos da contagem de colnias, nos
quais se exige uma contagem exacta dos microrganismos
presentes na amostra. No entanto, apesar do valor assumido da
contagem de colnias, este dogma no se verifica na realidade
no caso das bactrias que apresentam uma tendncia para a
aglomerao (micobactrias) ou para a organizao em cadeias
ou agregados (estreptococos, estafilococos). Uma normalizao
precisa dos mtodos semi-quantitativos pode dar resultados
com fiabilidade comparvel.
4-5-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
O mtodo validado em conformidade com as disposies
descritas em 2.6.21. A comparao dos mtodos
convencionais e dos mtodos com base no PCR, que
apresentam importantes diferenas de sensibilidade e de
especificidade, particularmente difcil e pode conduzir a
concluses divergentes.
O exemplo seguinte publicado a ttulo informativo e no
para aplicao geral.
Exemplo de validao de um mtodo
alternativo: protocolo detalhado seguido
por um laboratrio para implementar a
bioluminiscncia
CONTEXTO
Os mtodos que comportam uma etapa de pr-incubao em
meio lquido (bioluminiscncia em tubo ou em microplaca)
no oferecem informaes quantitativas, mas permitem
667
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica
determinar uma presena/ausncia na quantidade de produto
analisada. Utilizando diferentes quantidades de amostra, o
sistema pode permitir uma determinao semi-quantitativa
(ensaio limite). Por exemplo, a quantidade de produto
classicamente examinada na contagem do total de germes
aerbios viveis nos produtos no estreis de 0,1 g ou 0,1 ml
e permite concluir a ausncia de germes em 0,1 g ou 0,1 ml;
um resultado negativo corresponde assim a um nmero de
microrganismos inferior a 10 em 1 g ou 1 ml, e um resultado
positivo a um nmero de microrganismos superior ou igual
a 10 em 1 g ou 1 ml. Se se examinar simultaneamente uma
quantidade de 0,01 g ou 0,01 ml, um resultado negativo
corresponde a um nmero de microrganismos inferior a 100
em 1 g ou 1 ml. A combinao de um resultado negativo para
0,01 g ou 0,01 ml e de um resultado positivo para 0,1 g ou
0,1 ml, d uma estimativa do nvel de contaminao do
produto, que inferior a 100 microrganismos mas superior
ou igual a 10 microrganismos por grama ou mililitro. Como
5. Textos gerais
se indica na seco 2, a bioluminiscncia pode ser utilizada
como mtodo quantitativo se os microrganismos forem
retidos numa membrana filtrante e depois incubados num
meio de cultura (bioluminiscncia em membrana).
O protocolo descrito a seguir diz respeito validao de
mtodos de bioluminiscncia qualitativos, semi-quantitativos
e quantitativos.
QUALIFICAO DO DESEMPENHO DO MTODO
ALTERNATIVO
Especificidade
Proceda a uma avaliao prvia do mtodo com
microrganismos de referncia apropriados. Por exemplo,
para a contagem do total de germes aerbios viveis nos
produtos no estreis, necessrio utilizar, no mnimo, os
microrganismos especificados em 2.6.12 para verificar a
fertilidade dos meios em presena do produto. Efectue esta
determinao 3 vezes, pelo menos, para cada microrganismo.
Critrio de aceitao: todos os microrganismos de referncia
so detectados.
Limite de deteco (apenas para mtodos semi-quantitativos
e qualitativos)
Prepare um pequeno inculo (cerca de 5 UFC na amostra
inicial) de cada microrganismo de referncia. Efectue a
anlise pelo mtodo da Farmacopeia e pelo mtodo de
bioluminiscncia considerado com, pelo menos, 5 repeties.
Critrio de aceitao: aptido dos 2 mtodos em detectar
a presena de um microrganismo isolado, que pode ser
determinada pelo teste do 2. Procedimento alternativo:
preparar para cada microrganismo de referncia uma srie de
diluies com vrias diluies com cerca de 5 UFC por inculo
(por exemplo 10 UFC/inculo, 5 UFC/inculo, 2,5 UFC/inculo,
1,25 UFC/inculo, 0,75 UFC/inculo). Efectue o ensaio em
5 sries independentes pelo mtodo da Farmacopeia e pelo
mtodo de bioluminiscncia. Determine o limite de deteco
para cada mtodo. O limite de deteco corresponde ltima
diluio na qual se obteve nas 5 sries, um resultado positivo.
Critrio de aceitao: o limite de deteco do mtodo de
bioluminiscncia inferior ou igual ao da Farmacopeia.
Limite de quantificao (mtodo quantitativo)
Pode ser determinado ao mesmo tempo que a linearidade.
Corresponde concentrao mais baixa do intervalo de
668
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
medida escolhido que satisfaz aos critrios de linearidade,
de exactido e de preciso. Critrio de aceitao: o limite de
quantificao do mtodo de bioluminiscncia inferior ou
igual ao da Farmacopeia.
Preciso
Avaliaes quantitativas. Para cada microrganismo de
referncia, efectue 5 repeties da mesma srie, no mnimo,
que inclua, pelo menos, a concentrao de microrganismos
que corresponde ao meio do intervalo. Efectue 3 ensaios
independentes. Proceda a uma anlise estatstica para
comparar a preciso dos dois mtodos ou calcule o coeficiente
de variao (CV). Critrio de aceitao: CV entre 15 por cento
e 30 por cento, ou sem diferena de preciso (com risco alfa
de 5 por cento) entre os 2 mtodos. Se a preciso for diferente,
o mtodo de bioluminiscncia superior ao mtodo da
farmacopeia se der um desvio padro inferior.
Avaliaes qualitativas ou semi-quantitativas. Utilize
o procedimento alternativo descrito para determinar o
limite de deteco e compare as percentagens de resultados
positivos obtidos com o mtodo de bioluminiscncia
e o mtodo da Farmacopeia. Critrio de aceitao: a
percentagem de resultados positivos obtidos com o mtodo
de bioluminiscncia no limite de deteco de 100 por cento
e esta frequncia superior ou igual obtida com o mtodo
da Farmacopeia.
Linearidade
Para cada microrganismo de referncia, prepare 5
concentraes compreendidas no intervalo de medida
(normalmente indicado pelo fornecedor) do mtodo de
bioluminiscncia. Efectue o ensaio em paralelo pelo mtodo
da farmacopeia e da bioluminiscncia. Repita mais 2 vezes
este ensaio para obter resultados de 3 ensaios independentes.
Efectue testes de regresso linear, de declive, de falta de
ajustamento pelo teste F (com risco alfa de 5 por cento). Se
no for possvel uma anlise estatstica, calcule o coeficiente
de correlao R2 para os 2 mtodos e o declive. Critrio
de aceitao: a anlise estatstica permite determinar a
regresso linear, a existncia de um declive e no haver falta
de ajustamento com risco de 5 por cento; determina-se a
equao y = a + bx, sendo b o declive e a a ordenada na
origem. Na ausncia de anlise estatstica, R2 deve ser igual ou
superior a 0,9 e o declive no se deve desviar mais de 20 por
cento do valor 1 (b compreendido entre 0,8 e 1,2). Se no for
demonstrada a linearidade em todo o intervalo, este intervalo
pode ser reduzido e a linearidade demonstrada apenas com 3
concentraes em vez de 5.
Exactido
Avaliaes quantitativas. A exactido pode ser determinada
a partir de valores obtidos para a linearidade. Para cada
microrganismo, utilize 3 a 5 concentraes compreendidas
no intervalo de linearidade do mtodo. Efectue uma anlise
estatstica (teste t de Student com risco de 5 por cento) para
verificar a conformidade entre o declive estimado (valor = 1)
e o declive obtido, e a conformidade entre a ordenada na
origem estimada (valor = 0) e a ordenada na origem obtida.
Por exemplo, para um declive estimado b com desvio padro
s(b) igual a 0,090 em 5 concentraes de microrganismos,
calcule t = (b - 1)/s(b)); para uma ordenada na origem a com
desvio padro s(a) calcule t = (a - 0)/ s(a) Compare estes valores
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
ao valor t de Student com 5 por cento, para 13 graus de
liberdade (3 ensaios, 5 concentraes). Critrio de aceitao:
se os valores t obtidos so inferiores aos valores t de Student,
o mtodo exacto no intervalo considerado. No caso de no
conformidade do declive (valor diferente de 1) ou da ordenada
na origem (valor diferente de 0), o mtodo no exacto no
intervalo considerado.
Avaliaes qualitativas ou semi-quantitativas. Utilize o
procedimento alternativo descrito para determinar o limite
de deteco. Calcule a percentagem de falsos negativos no
mtodo da bioluminiscncia e no mtodo da Farmacopeia no
conjunto das diluies examinadas. Compare as percentagens
de falsos negativos obtidos em 2 ou 3 concentraes de
microrganismos imediatamente inferiores ao limite de
deteco (por exemplo, 5 UFC/inculo ou 2,5 UFC/inculo ou
1,25 UFC/inculo) que do um resultado positivo. Critrio
de aceitao: a percentagem de falsos negativos obtida com o
mtodo da bioluminiscncia nas concentraes inferiores ao
limite de deteco inferior ou igual obtida com o mtodo
da Farmacopeia.
Intervalo de medida
Trata-se do intervalo compreendido entre a mais baixa e
a mais elevada concentrao de microrganismos onde foi
verificada a linearidade, a preciso e a exactido.
Robustez
Esta informao fornecida pelo fabricante.
VALIDAO PARA O USO EFECTIVO PREVISTO
No exemplo aqui considerado, no necessrio determinar a
exactido e o limite de deteco em presena do produto. A
validao comporta 3 fases que permitem verificar:
fase 1: a fertilidade do meio em presena do produto,
fase 2: a ausncia de interferncia do produto susceptvel de
aumentar ou reduzir a produo de ATP,
fase 3: o exame do produto em paralelo com o mtodo da
Farmacopeia.
Estas 3 fases de validao so efectuadas em 3 ensaios
independentes utilizando, por exemplo, 2 lotes do produto,
no mnimo.
Fase 1: fertilidade do meio de cultura
Se o produto apresenta um nvel de contaminao
conhecido elevado (mais de 500 microrganismos por
grama ou mililitro), a etapa de incubao intil e os
microrganismos podem ser detectados directamente. Neste
caso, o controlo de fertilidade em presena do produto
no necessrio. Contudo, o nvel de contaminao
dos produtos farmacuticos normalmente mais baixo
e necessrio o crescimento dos microrganismos para
permitir uma deteco por bioluminiscncia. preciso por
isso demonstrar que o produto no inibe o crescimento
dos microrganismos nas condies do ensaio. Com este
objectivo, adicione separadamente a uma poro do
meio contendo o produto, um inculo com o mximo
de 100 UFC de cada microrganismo de referncia. Na
bioluminiscncia em tubo ou em microplaca, efectue
o ensaio de bioluminiscncia. Na bioluminiscncia em
membrana, incube a 30-35C ou 20-25C durante 5 dias,
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
5.1.7. Segurana vrica
depois efectue a contagem das colnias bioluminiscentes
presentes na membrana. Critrio de aceitao: o ensaio
positivo (bioluminiscncia em tubo ou em microplaca); o
isolamento dos microrganismos superior ou igual a 70 por
cento (bioluminiscncia em membrana).
Fase 2: ausncia de interferncia do produto
O objectivo demonstrar que o produto no introduz luz
parasita ou ATP no microbiano (no induz resultados
falsamente positivos: critrio A) ou no diminui a deteco do
ATP (no induz resultados falsamente negativos: critrio B).
Bioluminiscncia em tubo ou em microplaca
A. Efectue o ensaio de bioluminiscncia apenas no meio de
cultura e no meio de cultura em presena do produto e
determine os valores de ULR correspondentes.
5. Textos gerais
B. Efectue o ensaio de bioluminiscncia apenas no meio
de cultura e no meio de cultura em presena de ATP e
determine o coeficiente de resposta concentrao de
ATP, em percentagem.
Critrios de aceitao:
critrio A: o valor de ULR obtido no meio de cultura na
presena do produto 2 vezes inferior ao valor obtido s
com o meio de cultura (se o critrio A no for satisfatrio,
necessrio determinar um limite especfico para o produto),
critrio B: o valor de ULR obtido no meio de cultura na
presena do produto e de ATP est compreendido entre
25 por cento e 200 por cento do valor obtido no meio de
cultura em presena de ATP.
Bioluminiscncia em membrana
Efectue integralmente o ensaio de bioluminiscncia
para pesquisa de interferncias. Critrios de aceitao: o
isolamento de microrganismos superior ou igual a 70 por
cento e inferior ou igual a 200 por cento.
Fase 3: exame do produto em paralelo com o mtodo da
Farmacopeia
Examine em paralelo o produto considerado pelo mtodo da
bioluminiscncia validado e pelo mtodo da Farmacopeia,
para determinar a correlao entre os 2 mtodos para o
produto considerado, efectuando 3 ensaios independentes
com 2 lotes diferentes, no mnimo. Exprima o resultado
como positivo ou negativo numa determinada quantidade de
produto (bioluminiscncia em tubo ou em microplaca) ou
em nmero de microrganismos por quantidade de produto
filtrado (bioluminiscncia em membrana). Critrio de
aceitao: os resultados devem estar correlacionados com o
mtodo da Farmacopeia.
5.1.7. SEGURANA VRICA
Este captulo geral contm exigncias gerais respeitantes
segurana vrica dos medicamentos cujo fabrico tenha
implicado o uso de substncias de origem humana ou
animal. A segurana vrica constitui uma questo complexa,
considerando-se importante proceder a uma avaliao do
risco. As exigncias aplicadas a um medicamento especfico
so decididas pela Autoridade competente.
Quando existe risco de contaminao vrica, so tomadas
medidas complementares, conforme o caso, para garantir a
669
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.1.7. Segurana vrica
segurana vrica dos medicamentos, com base:
na seleco da origem das substncias e na pesquisa de
contaminantes vricos,
no controlo da capacidade do mtodo de produo em
eliminar e/ou inactivar os vrus,
na pesquisa de uma contaminao vrica em fases de
produo apropriadas.
Nos casos apropriados, aplicam-se um ou vrios mtodos
validados de eliminao ou de inactivao dos vrus.
Recomendaes suplementares pormenorizadas sobre a
segurana vrica, incluindo os estudos de validao, so
fornecidas, em particular, pelas Normas aplicadas relativas
aos estudos de validao virolgica: planificao, contribuio
e interpretao dos estudos validando a inactivao e a
eliminao dos vrus (CPMP/BWP/268/95) do Comit das
5. Textos gerais
Especialidades Farmacuticas e a Orientao ICH Q5A sobre
a avaliao da segurana vrica dos produtos resultantes
da biotecnologia e derivados de linhas celulares de origem
humana ou animal (assim como as revises posteriores destes
documentos).
As exigncias respeitantes s vacinas e aos soros para uso
veterinrio figuram nas monografias Vacinas para uso
veterinrio e Soros para uso veterinrio e nos captulos
gerais associados.
Avaliao do risco
Efectua-se uma avaliao do risco virolgico, se forem
utilizadas substncias de origem humana ou animal, como
componentes de medicamentos ou durante o fabrico de
substncias activas, de excipientes ou de medicamentos.
O princpio da avaliao do risco considera vrios factores
670
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)
que possam influenciar o nvel potencial de partculas
infecciosas no medicamento, assim como factores ligados ao
uso do medicamento, determinando ou influenciando o risco
vrico para os indivduos tratados.
A avaliao do risco tem em considerao factores relevantes,
por exemplo:
a espcie de origem,
o rgo, o tecido, a origem do fluido,
os potenciais contaminantes tendo em vista a origem do
material de partida e dos antecedentes do(s) dador(es), de
preferncia incluindo dados epidemiolgicos,
os potenciais contaminantes resultantes do mtodo de
fabrico (por exemplo, proveniente de materiais de risco
utilizados durante o fabrico),
a infecciosidade e a patogenicidade dos potenciais
contaminantes para os indivduos aos quais o medicamento
destinado, tendo em conta a via de administrao do
medicamento,
a quantidade de substncia utilizada para produzir uma
dose de medicamento,
os controlos efectuados em dador(es), no material de
partida, durante a produo e no produto final,
o mtodo de fabrico do produto e a capacidade deste para
eliminar e/ou inactivar os vrus.
A avaliao do risco pode principalmente ser baseada nas
condies de fabrico se estas incluem etapas de inactivao
rigorosas (por exemplo, para a gelatina) e produtos que sejam
objecto de uma esterilizao final pelo vapor ou calor seco,
como descrito nos textos gerais em esterilidade (5.1).
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.2. TEXTOS GERAIS

SOBRE PRODUTOS
BIOLGICOS
5.2. Textos gerais sobre produtos biolgicos 673
5.2.1. Terminologia utilizada nas monografias
de produtos biolgicos 673
5.2.2. Bandos de frangos isentos de microrganismos
5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas para
uso veterinrio 683
5.2.7. Avaliao da eficcia das vacinas para uso
veterinrio 685

5. Textos gerais
patognicos especficos para a produo e o 5.2.8. Minimizao do risco da transmisso de
controlo da qualidade de vacinas 674 agentes de encefalopatias espongiformes
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao animais pelos medicamentosos para
de vacinas para uso humano 677 uso humano e para uso veterinrio 686
5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao 5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote
de vacinas para uso veterinrio 680 de vacinas e soros para uso veterinrio 698
5.2.5. Substncias de origem animal utilizadas na
preparao de vacinas para uso veterinrio 683

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 671

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.1. Terminologia utilizada nas monografias de produtos biolgicos
5.2. TEXTOS GERAIS SOBRE
PRODUTOS BIOLGICOS
5.2.1. TERMINOLOGIA UTILIZADA
NAS MONOGRAFIAS DE PRODUTOS
BIOLGICOS
Sistema de lote semente. Sistema em que lotes sucessivos de
um produto derivam do mesmo lote semente primrio. Para a
produo de rotina, um lote semente de trabalho preparado
a partir do lote semente primrio. A origem e a histria das
passagens do lote semente primrio e do lote semente de
trabalho so registadas.
Lote semente primrio. Cultura de um microrganismo
distribuda a partir de um nico granel, em recipientes
processados em conjunto numa nica operao de forma
a assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir a
contaminao. Um lote semente primrio na forma liquida
normalmente conservado a uma temperatura igual ou
inferior a -70C. Um lote semente primrio liofilizado
conservado a uma temperatura que reconhecidamente
assegure a sua estabilidade.
Lote semente de trabalho. Cultura de microrganismo
a partir do lote semente primrio e que se destina a ser
utilizado na produo. Os lotes semente de trabalho so
distribudos em recipientes e conservados como descrito
anteriormente para o lote semente primrio.
Sistema de banco de clulas. Sistema em que lotes
sucessivos de um produto so fabricados a partir de culturas
de clulas que derivam do mesmo banco de clulas primrio.
Utiliza-se um certo nmero de recipientes do banco de
clulas primrio para preparar o banco de clulas de
trabalho. O sistema de banco de clulas validado no nvel
mximo de passagens que se atinge na produo de rotina.
Banco de clulas primrio. Uma cultura de clulas
distribuda em recipientes numa nica operao,
processados em conjunto e conservados de forma a
assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir
a contaminao. Um banco de clulas primrio
normalmente conservado a uma temperatura igual ou
inferior a -70C.
Banco de clulas de trabalho. Cultura de clulas derivada
do banco de clulas primrio e destinada a ser utilizada na
preparao de culturas de clulas de produo O banco de
clulas de trabalho distribudo em recipientes e processado
e conservado como descrito para o banco de clulas
primrio.
Cultura de clulas primrias. Cultura de clulas obtida por
tripsinizao de um rgo ou tecido apropriado. As clulas
so essencialmente idnticas s do tecido animal de origem e
no tm mais do que 5 passagens in vitro aps a preparao
inicial obtida a partir do tecido animal.
Linhas celulares. Cultura de clulas com elevada capacidade
de multiplicao in vitro. Nas linhas celulares diplides, as
clulas tm essencialmente as mesmas caractersticas que as
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
do tecido animal de origem. Nas linhas celulares contnuas,
as clulas so capazes de se multiplicarem indefinidamente
em cultura e podem ser obtidas de tecidos sos ou tumorais.
Algumas linhas celulares contnuas podem, em certas
condies, ter actividade oncognica.
Cultura de clulas de produo. Cultura de clulas derivada
de um ou de vrios recipientes do banco de clulas de
trabalho ou cultura de clulas primrias destinadas a ser
utilizadas na produo.
Clulas testemunha. Quantidade de clulas reservadas,
no momento da inoculao do vrus, a servirem de clulas
testemunha no inoculadas. As culturas so incubadas
em condies similares s culturas celulares utilizadas na
produo.
5. Textos gerais
Colheita nica. Material colhido por uma ou vrias vezes
de uma nica cultura celular de produo inoculada com
o mesmo lote semente de trabalho ou com uma suspenso
proveniente do lote semente de trabalho, incubado e
colhido num nico ciclo de produo.
Mistura monovalente de colheitas. Mistura de colheitas
contendo a mesma estirpe ou tipo de microrganismo ou
antignio e derivadas de ovos, de recipientes de culturas
celulares etc. e processadas ao mesmo tempo.
Granel final. Produto submetido a todas as fases de fabrico
com excluso do acondicionamento final. constitudo
por uma ou vrias misturas de colheitas monovalentes,
provenientes de culturas de uma ou mais espcies ou tipos
de microrganismos, aps eventual clarificao, diluio ou
adio de adjuvante ou outra substncia auxiliar. tratado
de forma a assegurar a sua homogeneidade e utilizado
para enchimento dos recipientes pertencentes a um ou a
vrios lotes finais.
Lote final. Um conjunto de recipientes definitivos,
fechados, ou de outras unidades de dosagem, que se espera
seja homogneo nomeadamente no que respeita ao risco
de contaminao durante o enchimento ou preparao
do produto final. As unidades de dosagem so cheias ou
preparadas de forma diferente, a partir do mesmo granel
final, liofilizadas em conjunto, se for o caso, e fechadas
numa nica sesso contnua de trabalho. Levam um
nmero ou um cdigo de identificao que identifica o
lote final. Quando o granel final cheio e/ou liofilizado em
vrias sesses de trabalho diferentes, resultam vrios lotes
finais aparentados (tambm chamados sublotes ou lotes de
repartio) que normalmente so identificados com uma
parte comum no nmero ou cdigo de identificao.
Vacinas combinadas. Preparao com vrios componentes,
formulada de tal forma que os vrios antignios
so administrados simultaneamente. Os diferentes
componentes antignicos destinam-se a proteger contra
diferentes tipos ou estirpes do mesmo microrganismo e/ou
contra diferentes espcies de microrganismos. Uma vacina
combinada pode ser apresentada pelo fabricante, quer sob
a forma de uma preparao lquida nica ou liofilizada,
quer sob a forma de vrios constituintes acompanhados
das indicaes necessrias para a mistura antes da
utilizao.
673
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas
5.2.2. BANDOS DE FRANGOS ISENTOS
DE MICRORGANISMOS PATOGNICOS
ESPECFICOS PARA A PRODUO
E CONTROLO DA QUALIDADE DE
VACINAS
Quando vem especificado numa monografia, os frangos,
os embries e as culturas celulares utilizados na produo
e no controlo de qualidade das vacinas, so obtidos de
ovos provenientes de um bando de frangos isentos de
microrganismos patognicos especficos (SPF). A qualidade
de um bando SPF assegurada por meio do sistema descrito
a seguir. A lista de microrganismos especificada baseia-se nos
conhecimentos actuais e ser actualizada quando for necessrio.
Um bando definido como um grupo de aves pertencentes
5. Textos gerais
a um ambiente comum, com um criador prprio que no
tenha tido nenhum contacto com bandos no SPF. Uma vez
definido o bando, no se junta qualquer ave no SPF.
Coloca-se o bando em condies que reduzam ao mnimo o
risco de contaminao. Os locais onde os bandos esto instalados
encontram-se distanciados de qualquer bando no SPF
exceptuando os bandos imbudos no processo de qualificao
como SPF e colocados em locais e em condies adaptadas aos
bandos SPF. O bando SPF instalado num isolador ou num
local ventilado com ar filtrado sob presso positiva. So tomadas
medidas apropriadas a fim de impedir o acesso a roedores, aves
selvagens, insectos e ao pessoal no autorizado.
O pessoal autorizado a entrar nas instalaes no tem
qualquer contacto com outras aves ou agentes susceptveis
de infectar o bando. recomendado ao pessoal que tome
um duche e mude de roupa ou use vesturio protector para
entrar na instalao controlada.
Sempre que possvel, os produtos introduzidos no pavilho
so esterilizados. Nomeadamente, recomenda-se que os
alimentos sejam submetidos a tratamento apropriado de
modo a evitar a introduo de microrganismos indesejveis
e a utilizar gua com qualidade pelo menos equivalente
gua potvel, por exemplo proveniente de um reservatrio
clorado. No se administra aos animais do bando nenhum
medicamento que possa interferir com a deteco de doenas.
Mantm-se um registo permanente da sade geral do bando
e qualquer anomalia objecto de investigao. Os factores
a controlar compreendem a morbilidade, a mortalidade, a
condio fisica geral, o consumo de alimentos, a postura
diria e a qualidade dos ovos, a fertilidade e a taxa de ecloso
dos ovos. Conservam-se os registos, pelo menos, durante
5 anos. Qualquer desvio que se constate relativamente ao
normal quanto aos parmetros do rendimento mencionados
ou qualquer infeco detectada so objecto de uma
comunicao detalhada aos utilizadores dos ovos no mais
curto intervalo de tempo.
Os ensaios ou a combinao de ensaios descritos a seguir tm
uma especificidade e uma sensibilidade conveniente para os
serotipos dos vrus apropriados. Tomam-se as amostras para
o ensaio de forma aleatria.
Um resultado positivo no ensaio de pesquisa do vrus
da anemia do pinto (VAP) no exclui necessariamente a
utilizao dos produtos do bando. No entanto, as vacinas
vivas preparadas com substratos provenientes dos bandos
SPF e destinadas a aves com menos de 7 dias de idade,
674
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
so preparadas com substratos isentos do VAP. As vacinas
inactivadas administradas a aves com menos de 7 dias podem
ser produzidas a partir de material proveniente de bandos
sem prova de estarem isentos do VAP, com a condio de se
demonstrar que o mtodo de inactivao utilizado eficaz
para o VAP.
ESTABELECIMENTO DE UM BANDO SPF
Um bando qualificado como SPF quando provm de pintos
que se demonstrou estarem isentos de microrganismos
patognicos de transmisso vertical cuja lista consta do
quadro 1. Para o efeito, efectuam-se ensaios em 2 geraes
anteriores quela donde provm o bando a qualificar. O
procedimento a seguir para estabelecer e manter um bando
SPF est resumido no quadro 2. Para estabelecer um bando
SPF, so efectuados uma srie de ensaios em 3 geraes
de aves. Todas as aves da 1. gerao so submetidas, pelo
menos, uma vez antes das 20 semanas a ensaios para
confirmar a ausncia de antignios do grupo da leucose
aviria assim como de anticorpos contra os vrus dos subtipos
A, B e J da leucose aviria atravs de ensaios de doseamento
imunoenzimtico (ELISA). Alm disso, confirma-se a
ausncia de anticorpos contra os agentes patognicos de
transmisso vertical cuja lista consta do quadro 1. A partir
das 8 semanas de idade as aves do bando so controladas
para se verificar a ausncia de salmonelas. O exame clnico
das aves do bando efectuado a partir das 8 semanas no
revela qualquer sinal de doena infecciosa. Os mtodos a
utilizar para estes ensaios esto descritos no quadro referido
e explicaes suplementares so tambm fornecidas a
seguir na seco relativa aos controlos de rotina dos bandos
classificados SPF. Quando as aves atingem a idade de 20
semanas, controla-se o bando conforme se descreve em
Controlos de rotina dos bandos SPF.
Todas as fases deste regime de controlo aplicam-se s 2
geraes seguintes, com excepo dos ensaios para pesquisa
de agentes patognicos de transmisso vertical efectuada em
todas as aves antes da postura. Para que o bando constitudo
da 3. gerao possa ser qualificado SPF, todos os ensaios
efectuados indicam ausncia de agentes patognicos nas 3
geraes.
Admite-se a introduo nos bandos de embries SPF
provenientes de outros bandos SPF, colocados numa
instalao separada no mesmo local. A partir da idade
de 8 semanas, as aves de substituio so consideradas
como um bando e so submetidas aos controlos descritos
anteriormente
CONTROLO INICIAL A REALIZAR NAS NOVAS
GERAES PROVENIENTES DE UM BANDO SPF
Quando um bando de substituio exclusivamente
proveniente de um bando SPF completamente confirmado, a
nova gerao submetida a ensaios antes de ser classificado
SPF. Alm da pesquisa de salmonelas, da vigilncia do estado
geral de sade e dos critrios de rendimento do bando,
exigem-se ensaios especficos complementares a partir das
8 semanas de idade. Estes ensaios efectuam-se em amostras
de 2 populaes que representam cada uma 5 por cento do
bando (no mnimo, 10 e, no mximo, 200 aves), colhidas
respectivamente com um intervalo de, pelo menos, 4
semanas entre as idades de 12-16 semanas e 16-20 semanas.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

QUADRO 1

Agente infeccioso Mtodo a utilizar** Transmisso vertical Difuso rpida/lenta

Adenovrus avirios, grupo 1 AGP, ELISA sim lenta

Vrus da encefalomielite aviria AGP, ELISA sim rpida
Vrus da bronquite infecciosa aviria IH, ELISA no rpida
Vrus da laringotraquete infecciosa aviria SN, ELISA no lenta
Vrus da leucose aviria ELISA para o vrus sim lenta
SN para os anticorpos

Vrus da nefrite aviria IM no lenta

Orthoreovrus avirios IM, ELISA sim lenta
Vrus via reticuloendoteliose aviria AGP, IM, ELISA sim lenta
Vrus da anemia do pinto IM, ELISA, SN sim lenta
Vrus do sndrome da queda da postura IH, ELISA sim lenta

5. Textos gerais
Vrus da bursite aviria Serotipo 1: AGP, ELISA, SN no rpida
Serotipo 2: SN

Vrus da gripe tipo A AGP, ELISA, IH no rpida

Vrus da doena de Marek AGP no rpida
Vrus da doena de Newcastle IH, ELISA no rpida
Vrus da rinotraquete do peru ELISA no lenta
Mycoplasma gallisepticum Agl e IH para confirmar sim lenta
um resultado positivo,
ELISA, IH

Agl e IH para confirmar sim rpida

Mycoplasma synoviae um resultado positivo,
ELISA, III

Sallmonella pulloram Agl sim lenta

Agl: aglutinao. IH: inibio de hemaglutinao.

AGP: precipitao em gelose; esta tcnica apropriada se os ensaios forem efectuados semanalmente. IM: imunomarcao.

ELISA: doseamento imunoenzimtico. SN: seroneutralizao.

**Sob reserva de autorizao da Autoridade competente, pode-se utilizar outro tipo de ensaios na condio de se demonstrar que possuem uma sensibilidade,
pelo menos, igual dos mtodos mencionados e uma especificidade apropriada.

Todas as amostras so colhidas e examinadas
individualmente. Tomam-se amostras de sangue para a
pesquisa de anticorpos e tambm amostras apropriadas para
a pesquisa do antignio da leucose aviria. Os mtodos de
ensaio a utilizar so os descritos em Controlos de rotina dos
bandos SPF. A nova gerao classificada como SPF se e s
se todos os ensaios confirmarem a ausncia de infeco.
de amostras histolgicas que sero objecto de coloraes
especficas para verificar a ausncia de contaminao
por Mycobacterium avium. A ausncia de Salmonella
spp, pesquisa-se no contedo cecal de todas as carcaas
disponveis, atravs de exame microbiolgico com as tcnicas
anteriormente descritas. Nos casos apropriados, podem ser
misturadas amostras de contedos cecais de vrias aves (no
mximo, 5).

CONTROLOS DE ROTINA DOS BANDOS SPF
Exame geral e necrpsia. Durante toda a vida do bando,
efectua-se um exame clnico, pelo menos, 1 vez por semana,
para verificar se as aves esto indemnes do vrus da varola
aviria e esto isentos de qualquer sinal de infeco. Em
casos de mortalidade superior a 0,1 por cento por semana,
efectua-se a necrpsia de todas as carcaas disponveis
para verificar a ausncia de sinais de infeco. Nos casos
apropriados, realizam-se anlises histopatolgicas e/ou
microbiolgicas/virulgicas para confirmar o diagnstico.
Efectua-se uma pesquisa especfica de leses de tipo
tuberculoso, e qualquer leso suspeita d lugar colheita
Pesquisa de Salmonella spp. em cultura. Efectua-se a
pesquisa de Salmonella spp. tanto a partir de amostras de
fezes ou zaragatoas da cloaca, quer a partir de amostras
obtidas de zaragatoas de arrasto. No caso de ensaios
efectuados a partir de amostras de fezes ou zaragatoas da
cloaca, convm examinar um total de 60 amostras num
perodo de 4 semanas durante a vida do bando. Os ensaios
podem efectuar-se com misturas de amostras (no mximo,
10). No caso de amostras de zaragatoas de arrasto, convm
examinar, no mnimo, 2 de zaragatoas de arrasto por perodos
de 4 semanas durante toda a vida do bando. A deteco de
salmonelas efectua-se atravs do pr-enriquecimento das
amostras seguida de culturas em meio selectivo.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 675

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5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

Pesquisa do antignio da leucose. Antes do nicio da postura,
efectuam-se exames a partir de zaragatoas da cloaca, ou de
amostras de sangue (atravs da cultura da camada leucocitria)
para se detectar a presena de antignio especfico de cada
grupo da leucose. Estes exames efectuam-se em 5 por cento
do bando (no mnimo, 10 e, no mximo, 200 aves) durante 4
semanas. Durante a postura, realizam exames ao albmen de 5
por cento (no mnimo, em 10 e, no mximo 200 aves) dos ovos
durante 4 semanas. Efectuam-se por ELISA, para a pesquisa do
antignio especfico de cada grupo, por tcnicas que permitem
detectar o antignio dos subgrupos A, B e J.
Pesquisa de anticorpos contra outros agentes. Durante
todo o perodo de postura do bando efectua-se a pesquisa de
anticorpos contra todos os agentes mencionados no quadro 1.
Esta pesquisa realiza-se em 5 por cento (no mnimo, 10 e, no
mximo, 200 aves) do bando durante 4 semanas. Recomenda-
-se que a colheita de amostras seja efectuada todas as semanas
em 1,25 por cento do bando e alguns mtodos de pesquisa de
5. Textos gerais
cento do efectivo (no mnimo, em 10 e, no mximo, 200)
durante 4 semanas aps a ltima colheita de ovos. Durante
4 semanas colhem-se amostras de sangue de dada ave deste
grupo e 1,25 por cento das aves do bando (25 por cento do
bando retido) so sangrados o mais tardar 4 semanas aps a
ltima colheita de ovos. Pelos mtodos indicados efectua-se
a pesquisa dos agentes de transmisso vertical (identificados
no quadro 1) nas amostras de soros. Quando as amostras
so colhidas semanalmente, examinam-se, pelo menos, 1,25
por cento das aves (25 por cento do grupo retido) durante
o perodo considerado. Outra opo possvel proceder
colheita de sangue e/ou de outras amostras apropriadas em
5 por cento do efectivo do bando, nas 4 semanas seguintes
ltima colheita de ovos e pesquisar a presena de agentes
de transmisso vertical nas amostras atravs de tcnicas
validadas de amplificao dos cidos nucleicos. (2.6.21).

agentes infecciosos semanalmente. O quadro 1 classifica os MEDIDAS A TOMAR NO CASO DE DETECO DE UM

agentes de acordo com a sua rapidez de difuso, distinguindo
os que se propagam rapidamente no seio do bando e os que se
propagam lentamente ou que no so susceptveis de infectar
a totalidade do bando. Para os agentes classificados como de
difuso lenta, examinam-se as amostras individualmente.
Nos de difuso rpida, examinam-se individualmente 20 por
cento das amostras colhidas durante 4 semanas, a no ser
que se proceda por seroneutralizao ou ELISA, casos em que
todas as amostras podem ser examinadas individualmente
ou sob a forma de misturas preparadas a partir de 5 amostras
individuais colhidas na mesma altura.
No quadro 1 indicam-se os mtodos apropriados de pesquisa.
Sob reserva de autorizao da Autoridade competente, podem
ser utilizados outros tipos de ensaios com a condio de se ter
demonstrado que possuem uma sensibilidade, pelo menos,
igual dos mtodos citados e uma especificidade apropriada.
ENSAIO A EFECTUAR NO FINAL DO PERODO DE POSTURA
A seguir ltima colheita de ovos, efectua-se um controlo
final para se confirmar a ausncia dos agentes de transmisso
vertical mencionados no quadro 1. Para este retm-se 5 por
AGENTE ESPECIFICADO
Se os resultados evidenciarem a presena de uma
contaminao do bando por um agente classificado no quadro
1 de difuso lenta, todos os produtos provenientes do bando
nas 4 semanas anteriores so considerados no conformes.
Igualmente, se os resultados evidenciarem a presena de uma
contaminao do bando por um agente classificado no quadro
1 de difuso rpida, todos os produtos provenientes do bando
nas 2 semanas anteriores data em que a amostra positiva
foi colhida so considerados no conformes. Se os produtos
tiverem sido utilizados para produo ou para controlo, os
produtos para os quais obrigatria a utilizao de ovos
SPF so considerados no satisfatrios e so rejeitados e os
controlos efectuados no so vlidos.
Logo aps a descoberta da existncia de uma contaminao,
os produtores notificam todos os utilizadores dos ovos.
Um bando no qual foi detectada e confirmada uma
contaminao no pode reassumir o estatuto SPF. A
totalidade da descendncia proveniente deste bando a contar
das 4 semanas anteriores colheita da ltima amostra
negativa, excluda do estatuto SPF.

QUADRO 2 Representao esquemtica do processo de estabelecimentos e manuteno dos bandos SPF

NOVO BANDO Estabelecimento da ausncia de agentes de transmisso vertical

Pesquisa de antignio e de anticorpos da leucose aviria em todas as aves antes das 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
2. GERAO Pesquisa de antignio e de anticorpos da leucose aviria em todas as aves antes das 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
3. GERAO Pesquisa de antignio e de anticorpos da leucose aviria em todas as aves antes das 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
BANDO QUALIFICADO COMO SPF SE SATISFAZ TODOS OS ENSAIOS
3. GERAO Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
Ensaio aps a postura para estabelecer a ausncia de agentes de transmisso vertical
GERAES SEGUINTES Pesquisa de antignio da leucose aviria e de anticorpos contra agentes especficos em 2 amostras
representando cada uma 5 por cento do bando, entre as 12 e as 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
Ensaio aps a postura para estabelecer a ausncia de agentes de transmisso vertical

676 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

5.2.3. SUBSTRATOS CELULARES
UTILIZADOS NA PREPARAO DE
VACINAS PARA USO HUMANO
O presente captulo geral trata das linhas celulares diplides
e das linhas celulares contnuas utilizadas na preparao de
vacinas para uso humano; os aspectos especficos das vacinas
preparadas com a tecnologia do ADN recombinante so
tratados na monografia Produtos obtidos pela tecnologia
do ADN recombinante. O quadro 1 fornece uma lista de
ensaios a efectuar nas diferentes etapas (clulas semente,
banco de clulas primrio, banco de clulas de trabalho,
clulas pertencentes ao nvel de duplicao da populao,
pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado
na produo). Descrevem-se a seguir as disposies gerais
respeitantes utilizao das linhas celulares e aplicao dos
mtodos de ensaio.
Quando uma vacina produzida com clulas primrias, ou
clulas que foram submetidas apenas a uma pequeno nmero
de passagens, sem constituio de um banco de clulas, as
exigncias aplicveis vacina constam da monografia especfica.
Linhas celulares diplides. Uma linha celular diplide possui
uma capacidade elevada mas definida de multiplicao in vitro.
Linhas celulares contnuas. Uma linha celular contnua
possui uma capacidade ilimitada de multiplicao in vitro;
muitas vezes as clulas apresentam diferenas de cariotipo
com as clulas de origem; podem ser obtidas a partir de um
tecido saudvel ou de um tecido tumoral.

5. Textos gerais
QUADRO 1 Ensaios efectuados nas linhas celulares

Banco Banco Clulas do nvel de duplicao

Ensaio Clulas de clulas de clulas de populao pelo menos igual
semente primrio de trabalho ao nvel mximo que ir ser
(BCP) (BCT) utilizado na produo

1. IDENTIDADE E PUREZA

Morfologia

Seleco apropriada entre os seguintes

ensaios: bioqumicos (por ex.
isoenzimas), imunolgicos (por ex.
histocompatibilidade), marcadores
citogenticos, impresso genmica

Cariotipo (linhas celulares diplides) (1) (1)

Longevidade das clulas (linhas
celulares diplides) 2. AGENTES ESTRANHOS

Contaminao bacteriana e fngica

Micoplasmas

Ensaio em culturas celulares

Co-cultura (2) (2)

Ensaios em animais e em ovos (2) (2)

Pesquisa especfica de potenciais (2) (2)

contaminantes de acordo com a origem
das clulas (ver a seguir em Agentes
contaminantes infecciosos)

Retrovrus (3) (3)

3. PODER TUMORGENO

Poder tumorgeno (4)

(1)A caracterstica diplide demonstra-se para cada banco de clulas de trabalho utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos,
igual ao nvel mximo que ir ser utilizado para a produo.
(2)Ensaio efectuado em cada banco de clulas de trabalho utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que
ir ser utilizado para a produo.
(3)Ensaio efectuado em cada banco de clulas primrias utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que
ir ser utilizado para a produo.
(4)
As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como no possuindo poder tumorgeno e no necessitam do ensaio de poder tumorgeno. Os
ensaios de poder tumorgeno j no so realizados em linhas celulares com poder tumorgeno conhecido ou previsto.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 677

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5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano
No caso de vacinas injectveis preparadas com uma linha
celular contnua, o procedimento de purificao validado
para se demonstrar a reduo da concentrao de ADN das
clulas do substrato at um nvel equivalente, no mximo, a 10
ng por dose humana unitria, salvo indicao em contrrio.
Sistema de banco de clulas. A produo de vacinas em
linhas celulares contnuas ou em linhas celulares diplides
baseia-se num sistema de banco de clulas. A idade in vitro
das clulas contada a partir do lote semente primrio.
Cada banco de clulas de trabalho preparado a partir de
1 ou vrios recipientes do banco de clulas primrio. A
utilizao, a identidade e o inventrio dos recipientes so
minuciosamente registados.
Meios e substncias de origem humana ou animal. A
composio dos meios utilizados para o isolamento e para
5. Textos gerais
o conjunto das culturas posteriores minuciosamente
registado; se so utilizadas substncias de origem humana ou
animal, elas esto isentas de agentes estranhos.
Se for utilizada albumina humana, ela est em conformidade
com a monografia Soluo de albumina humana. Atravs
de ensaios apropriados, demonstra-se que os soros de origem
bovina utilizados para a preparao e manuteno das culturas
celulares so estreis e isentos de vrus bovinos, nomeadamente
do vrus da diarreia bovina assim como de micoplasmas.
Efectuam-se ensaios apropriados na tripsina utilizada
para a preparao das culturas celulares para demonstrar
a esterilidade e a ausncia de micoplasmas e de vrus,
nomeadamente de pestivrus e parvovrus.
Clulas semente. Os dados na base dos quais avaliada a
aceitabilidade das clulas semente compreendem, sempre que
possvel, a origem, a histria e a caracterizao.
Origem das clulas semente. Para as linhas celulares
humanas, o dossier contm as seguintes informaes
do dador: origem tnica e geogrfica, idade, sexo, estado
fisiolgico geral, tecido ou rgo utilizado, resultados da
eventual pesquisa de agentes patognicos.
Para as linhas celulares animais, o dossier contm as
seguintes informaes da origem das clulas: espcie,
linhagem, condies de explorao, origem geogrfica, idade,
sexo, estado fisiolgico geral, tecido ou rgo utilizado,
resultados da eventual pesquisa de agentes patognicos.
As clulas de origem neural (por exemplo, os neuroblastomas
e as clulas P12) podem conter substncias que concentrem
os agentes das encefalopatias espongiformes; estas clulas
no so utilizadas na produo de vacinas.
Histria das clulas semente. O dossier contm as seguintes
informaes: mtodo utilizado para isolar as clulas semente,
os mtodos de cultura e qualquer outro procedimento
utilizado para estabelecer o banco de clulas primrio,
nomeadamente aqueles susceptveis de provocar uma
exposio das clulas a agentes estranhos.
As informaes disponveis sobre os ingredientes dos meios
de cultura das clulas, por exemplo a provenincia das
substncias de origem animal, so muitas vezes incompletas;
em casos justificados e autorizados, os bancos de clulas j
estabelecidos com esses meios podem ser utilizados para a
produo de vacinas.
Caracterizao das clulas semente. A caracterizao das
clulas semente assenta nos seguintes aspectos:
678
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
(1) identidade (por exemplo, isoenzimas, serologia, impresso
genmica),
(2) caractersticas de crescimento e propriedades
morfolgicas (microscopia ptica e electrnica),
(3) cariotipo das linhas celulares diplides,
(4) longevidade in vitro das linhas celulares diplides, em
termos do nvel de duplicao da populao
Estabilidade dos substratos celulares. Demonstra-se que a
linha celular tem uma viabilidade apropriada nas condies
previstas para a sua conservao. Para cada produto
preparado com a linha celular, necessrio demonstrar que
pode ser obtida uma produo reprodutvel com as clulas
pertencentes aos nveis de passagens situadas entre o incio e
o fim da durao prevista de utilizao.
Agentes contaminantes infecciosos. As linhas celulares
utilizadas para a produo de vacinas esto isentas de agentes
infecciosos. As pesquisas de agentes contaminantes efectuam-
-se como indicado no quadro.
Consoante a origem e a histria da linha celular, pode ser
necessria a pesquisa de alguns potenciais contaminantes
especficos, nomeadamente aqueles que reconhecidamente
constituem agentes infecciosos latentes da espcie de origem
(por exemplo, o vrus smio 40 para o macaco rhesus). No caso
de linhas celulares provenientes de roedores, so efectuados
ensaios para a produo de anticorpos no murganho, no rato e
no hamster para detectar eventuais vrus especficos da espcie.
Pesquisam-se retrovrus nas linhas celulares como se
descreve adiante. Se for detectada a presena de retrovrus
capazes de se replicarem, a linha celular no aceitvel para
a produo de vacinas.
Poder tumorgeno. Para a preparao de vacinas vivas, a linha
celular no possui poder tumorgeno ao nvel de duplicao
da populao utilizada na produo.
Se a linha celular com poder tumorgeno for utilizada
na preparao de outras vacinas, valida-se o sistema de
purificao a fim de demonstrar que a concentrao de ADN
proveniente das clulas equivalente, no mximo, a 10 ng
por dose humana unitria, salvo indicao em contrrio, e
que a concentrao em protenas provenientes das clulas do
substrato reduzida at um limite aceitvel.
Se a linha celular possuir um reconhecido poder tumorgeno,
no necessrio proceder a ensaios de poder tumorgeno.
Se o potencial poder tumorgeno de uma linha celular for
desconhecido, a linha celular considerada como tumorgena,
ou submetida a um ensaio de poder tumorgeno in vitro como
adiante se descreve; se os resultados do ensaio in vitro forem
negativos ou se no forem claramente positivos, a linha celular
ser objecto de um ensaio in vivo como adiante se descreve.
Os ensaios so efectuados em clulas pertencentes ao nvel de
duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo
que ir ser utilizado na produo. As linhas celulares MRC-5,
WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como no possuindo poder
tumorgeno e no necessitam do ensaio de poder tumorgeno.
Caracterizao genmica. Demonstra-se a diploidia
das linhas celulares diplides; se no estiver validada a
eliminao de clulas intactas durante o tratamento aps
a colheita, necessrio efectuar uma caracterizao mais
aprofundada pela anlise do cariotipo. So examinadas
amostras provenientes de 4 nveis de passagens regularmente
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano
distribudas pelo perodo de vida da linha celular. Cada
exame incide em, pelo menos, 200 clulas em metafase, para
se verificar o nmero exacto de cromossomas e avaliar a
frequncia de hiperploidia, de hipoploidia, de poliploidia, de
fracturas e de anomalias estruturais.
As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas
como sendo diplides e bem caracterizadas; desde que no
tenham sido geneticamente modificadas, no necessrio
efectuar uma caracterizao mais aprofundada.
MTODOS DE ENSAIO APLICVEIS S CULTURAS
CELULARES
Identificao. A identidade das clulas estabelece-se com
base na impresso genmica e numa escolha apropriada dos
seguintes aspectos:
(1) caractersticas bioqumicas (anlise dos isoenzimas),
(2) caractersticas imunolgicas (antignios de
histocompatibilidade),
(3) marcadores citogenticos.
Clulas contaminantes. As impresses genmicas efectuadas
com finalidade de identificao servem igualmente para
demonstrar a ausncia de clulas contaminantes.
Contaminao bacteriana e fngica. O banco de clulas
primrio e o banco de clulas de trabalho satisfazem ao
ensaio de esterilidade (2.6.1), efectuado para cada meio em
10 ml do sobrenadante das culturas celulares e em 1 por
cento dos recipientes, com o mnimo de 2 recipientes.
Micoplasmas (2.6.7). O banco de clulas primrio e o banco
de clulas de trabalho satisfazem ao ensaio dos micoplasmas,
efectuado em 1 ou vrios recipientes pelo mtodo cultural e
pelo mtodo de epifluorescncia em culturas celulares.
Pesquisa de agentes estranhos em culturas celulares.
As clulas satisfazem ao ensaio dos vrus hemadsorventes e aos
ensaios de pesquisa dos agentes estranhos em culturas celulares
que esto descritos no capitulo 2.6.16 em Culturas celulares de
produo: clulas testemunhas. Se as clulas so de smio, so
tambm inoculadas em culturas de clulas renais de coelho para
pesquisa do herpesvrus B (herpesvrus 1 de cercopiteco).
Co-cultura. Co-cultive separadamente clulas intactas e
clulas lisadas com outros sistemas celulares compreendendo
clulas humanas e clulas de smio. Pesquise a apario de
eventuais alteraes morfolgicas. Efectue a pesquisa de
agentes hemaglutinantes nos lquidos de cultura. As clulas
satisfazem ao ensaio se no houver qualquer indicao da
presena de agente estranho.
Retrovrus. Pesquise a eventual presena de retrovrus:
(1) atravs de ensaio de infectividade,
(2) por microscopia electrnica de transmisso,
(3) se os ensaios (1) e (2) derem resultados negativos,
pela pesquisa da transcriptase inversa (em presena do
magnsio e do mangansio) realizada nos depsitos
obtidos por centrifugao a alta velocidade.
Ensaio em animais. A cada grupo dos seguintes animais,
injecte por via intramuscular (ou no caso de murganhos
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
recm-nascidos, por via subcutnea) 107 clulas viveis
igualmente repartidas entre os animais do grupo:
(1) 2 ninhadas com, pelo menos, 10 murganhos recm-
-nascidos com menos de 24 horas de idade,
(2) 10 murganhos adultos.
Injecte por via intracerebral em cada um dos 10 murganhos
adultos 106 clulas viveis para deteco da eventual presena
do vrus da coriomeningite linfocitria.
Mantenha os animais em observao durante, pelo menos, 4
semanas. Examine os animais que apresentam sintomas de
doena ou anomalia para determinar a sua causa. As clulas
satisfazem ao ensaio se no se observarem sinais de presena
de agentes estranhos. O ensaio s vlido se, pelo menos,
80 por cento dos animais de cada grupo permanecem de boa
sade e sobrevivem at ao final do perodo de observao.
No caso de clulas de roedores (por exemplo clulas ovricas
5. Textos gerais
de hamster chins ou clulas renais de hamster recm-
-nascido), efectue, nos animais aos quais as clulas foram
injectadas, uma pesquisa de anticorpos contra potencias
contaminantes vricos para a espcie.
Ensaios em ovos. Injecte, pelo menos, 106 clulas viveis
na cavidade alantide de cada um de 10 ovos de galinha SPF
(5.2.2) com 9 a 11 dias idade, e no saco vitelino de 10 ovos de
galinha SPF (5.2.2) com 5 a 6 dias idade. Incube-os durante,
pelo menos, 5 dias. Proceda pesquisa de hemaglutininas
nos lquidos alantides, com eritrcitos mamferos e avirios;
efectue o ensaio a temperaturas de 5 3C e 20-25C e
proceda leitura dos resultados decorridos 30 a 60 min. As
clulas satisfazem ao ensaio se no se observar qualquer sinal
da presena de agentes estranhos. O ensaio s vlido se,
pelo menos, 80 por cento dos embries permanecem sos e
sobrevivem at ao final do perodo de observao.
Ensaio de poder tumorgeno in vitro. Podem ser utilizados
os seguintes ensaios:
(1) formao de colnias em gelose mole,
(2) produo de crescimento celular invasivo aps inoculao
em culturas de rgos,
(3) estudo da actividade de transformao atravs, por
exemplo, do sistema de prova 3T3 que pe em evidncia a
presena de oncogenes activos.
Ensaio de poder tumorgeno in vivo. O ensaio consiste em
estabelecer uma comparao entre a linha celular contnua
e uma testemunha positiva apropriada (por exemplo, clulas
HeLa ou Hep2).
So apropriados os seguintes sistemas animais:
(1) murganhos atmicos (genotipo Nu/Nu),
(2) murganhos, ratos ou hamsters recm-nascidos tratados
com soro ou com globulina antitimocitria,
(3) murganhos timectomizados e irradiados que foram
reconstitudos T-, B+) com medula ssea de murganhos sos.
Qualquer que seja o sistema animal escolhido, a linha celular
e as clulas de referncia so injectadas em grupos distintos
de 10 animais cada um. Em ambos os casos, o inculo por
animal de 107 clulas em suspenso num volume de 0,2 ml
e a injeco pode ser por via intramuscular ou subcutnea. Se
se utiliza animais recm-nascidos, estes so tratados com
0,1 ml de soro ou globulina antitimocitria nos dias 0, 2,
7 e 14 aps o nascimento. So considerados soros ou as
679
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5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio
globulinas activos aqueles que suprimem os mecanismos
imunitrios dos animais em crescimento ao ponto de a
inoculao das 107 clulas de referncia positivas produzirem
regularmente tumores e metstases. Se os animais forem
severamente afectados e apresentarem sem ambiguidades
tumores de crescimento progressivo, sacrifique-os antes do
final do ensaio para evitar sofrimento intil.
No final do perodo de observao, sacrifique e examine todos
os animais, incluindo os grupos testemunhas; pesquise, no
local de injeco e noutros rgos por exemplo, os gnglios
linfticos, os pulmes, os rins e o fgado), sinais macroscpicos
e microscpicos de proliferao das clulas inoculadas.
Em todos os casos, examine os animais em intervalos
regulares procedendo palpao para detectar a formao
eventual de ndulos nos locais de injeco. Mea os ndulos
em 2 direces perpendiculares e registe regularmente
os resultados das medies para determinar se so de
5. Textos gerais
crescimento progressivo. Se alguns animais apresentarem,
durante a observao, ndulos com sinais de regresso,
sacrifique-os antes que os ndulos no sejam detectveis
palpao e proceda a um examine histolgico. Observe os
animais que apresentam ndulos em crescimento progressivo
durante 1-2 semanas. Nos animais que no apresentam
formao de ndulos, metade so observados durante 3
semanas e a outra metade durante 12 semanas, antes de
serem sacrificados para se proceder observao histolgica.
Efectue uma necrpsia em cada animal, para pesquisa
no local de injeco e em outros rgos (por exemplo,
gnglios linfticos, pulmes, crebro, bao, rins, fgado),
nomeadamente sinais macroscpicos de formao tumoral.
Proceda ao exame histolgico de todas as leses com
aparncia tumoral e do local de injeco. Alm disso,
dado que algumas linhas celulares podem dar metstases
sem manifestao de crescimento tumoral local, proceda
sistematicamente em todos os animais, ao exame histolgico
dos gnglios linfticos regionais detectveis e dos pulmes.
O ensaio s vlido se, pelo menos, 9 dos 10 animais
inoculados com clulas de referncia positivas apresentarem
tumores de crescimento progressivo.
5.2.4. CULTURAS CELULARES
UTILIZADAS NA PREPARAO
DE VACINAS PARA USO VETERINRIO
As culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas
para uso veterinrio satisfazem s exigncias descritas nesta
seco. Pode tambm ser necessrio que as culturas celulares
utilizadas no controlo das vacinas satisfaam todas ou
algumas destas exigncias.
Para a maioria dos vrus dos mamferos possvel a sua
multiplicao em clulas de linha celulares, no sendo por
isso aceite a utilizao de clulas primrias.
As clulas cronicamenie infectadas utilizadas na preparao
de vacinas veterinrias satisfazem s exigncias que lhes so
aplicveis descritas a seguir. Demonstra-se que as clulas se
encontram infectadas apenas com o agente indicado.
LINHAS CELULARES
As linhas celulares utilizadas na produo so normalmente
obtidas atravs de um sistema de banco de clulas. Cada banco
de clulas primrio identificado com um cdigo especfico.
O banco de clulas primrio conservado em alquotas a uma
680
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
temperatura igual ou inferior a -70C. No so utilizadas na
produo de vacinas clulas que tenham sido submetidas a
um nmero de passagens superior a 20 a partir do banco de
clulas primrio. Quando se utilizam culturas de clulas em
suspenso, um aumento do nmero de clulas correspondente
a trs duplicaes da populao equivale aproximadamente a
uma passagem. Se as clulas utilizadas na produo tiverem
sido submetidas a um nmero de passagens superior a 20,
demonstra-se, por validao ou atravs de novos ensaios,
que as clulas de produo so sensivelmente idnticas s
clulas do banco de clulas primrio no que diz respeito s
caractersticas biolgicas e pureza, e que a sua utilizao no
tem efeitos prejudiciais na produo da vacina.
conhecida com detalhe e registada por escrito a histria da
linha celular (por exemplo, origem, nmero de passagens e o
meio utilizado na multiplicao, condies de conservao).
Fica registada uma descrio dos mtodos de conservao
e de utilizao das clulas, incluindo pormenores que
permitam assegurar que durante a produo o nmero de
passagens permitidas no ultrapassado.
Conservam-se, para fins analticos, quantidades suficientes do
banco de clulas primrio e de cada banco de clulas de trabalho.
Os ensaios descritos a seguir so efectuados em culturas
do banco de clulas primrio e do banco de clulas de
trabalho ou em clulas do banco de clulas de trabalho com
o nmero mximo de passagens admitido para a produo e
provenientes de uma amostra homognea e representativa.
Demonstra-se a representatividade da amostra.
QUADRO 2 Fases das culturas celulares em que os ensaios
so efectuados
Banco de Banco de Clulas do banco
clulas clulas de clulas de
primrio de trabalho trabalho com o
nmero mximo
de passagens
Microscopia geral + + +
Bactrias e fungos + +
Micoplasmas + +
Vrus + +
Identificao da espcie + +
Anlise cariotpica + +
Poder tumorgeno +
Caractersticas das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete
celular antes e depois da colorao histolgica. Regista-se,
se possvel sob a forma numrica, a informao relativa
especialmente velocidade e taxa de crescimento.
igualmente indicada a presena ou ausncia de inibio por
contacto, de clulas plurinucleadas ou de qualquer outra
anomalia celular.
Anlise cariotpica. Efectua-se um exame cromossmico
em, pelo menos, 50 clulas em mitose do banco de clulas
primrio e da passagem mxima admitida para a produo.
Qualquer marcador cariotpico presente nas clulas do banco
de clulas primrio encontrado nas clulas com o nmero
mximo de passagens. O nmero de cromossomas (valor
modal) nas clulas da passagem mxima no superior a
15 por cento do valor obtido no banco de clulas primrio.
Os cariotipos so idnticos. Se o nmero de cromossomas
for superior ao valor declarado, se alguns marcadores
cariotpicos no forem encontrados nas clulas do banco
de clulas de trabalho com o nmero mximo de passagens
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio
utilizado na produo, ou se os cariotipos forem diferentes, a
linha celular no utilizada no fabrico de vacinas.
Identificao da espcie. Demonstra-se, por um mtodo validado,
que as clulas do banco de clulas primrio e do banco de clulas
de trabalho com o nmero mximo de passagens utilizado na
produo pertencem espcie indicada pelo fabricante.
Quando se efectua um ensaio de imunofluorescncia com
o soro especfico da espcie de origem das clulas e se
verifica que todas as clulas apresentam fluorescncia, no
necessrio realizar outros ensaios com reagentes capazes de
detectar contaminao com clulas de outras espcies.
Contaminao bacteriana e fngica. As clulas satisfazem
ao ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de clulas
contm, pelo menos, o nmero de clulas de um tapete
celular com uma rea de 70 cm2 e para clulas em suspenso
aproximadamente o mesmo nmero de clulas. Antes de se
realizar o ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante,
pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
Micoplasmas (2.6.7). As clulas satisfazem ao ensaio dos
micoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as clulas so mantidas
em cultura durante. pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
Ausncia de vrus contaminantes. Por tcnicas apropriadas,
e pelos ensaios descritos a seguir, verifica-se a ausncia de
qualquer contaminao por vrus.
Os tapetes celulares examinados tm uma rea de, pelo menos,
70 cm2, so preparados e mantidos em cultura no mesmo meio
(incluindo aditivos) e nas mesmas condies que as clulas
utilizadas na preparao da vacina. Os tapetes celulares so
mantidos em cultura, pelo menos, durante 28 dias no total. As
subculturas realizam-se com intervalos de 7 dias, a no ser que
seja impossvel manter as clulas com vida durante tanto tempo.
Neste caso, convm realizar as subculturas com intervalos
inferiores, mas to longos quanto possvel. O nmero de clulas
que se obtm na ltima subcultura, em recipientes apropriados,
suficiente para se efectuarem os ensaios descritos a seguir.
Os tapetes celulares so examinados regularmente durante
o perodo de incubao para se detectar eventuais efeitos
citopatognicos e, no final do perodo de observao,
so submetidos aos ensaios para pesquisa de vrus
citopatognicos, vrus hemadsorventes e vrus especficos,
estes ltimos efectuados por imunofluorescncia ou por
qualquer outro mtodo apropriado a seguir indicado.
Deteco de vrus citopatognicos. Efectue, com um corante
apropriado, a colorao citolgica a 2 tapetes celulares com, pelo
menos, 6 cm2 cada um. Examine toda a superfcie dos tapetes
celulares corados e verifique a presena eventual de corpos de
incluso, de clulas gigantes em nmero anormalmente elevado
ou de qualquer outra leso indicativa de anomalias celulares que
possam ser atribudas a um agente contaminante.
Deteco de vrus hemadsorventes. Lave vrias vezes, com
uma soluo tampo apropriada, tapetes celulares com uma
rea total de 70 cm2. Adicione uma suspenso apropriada de
hemcias em volume suficiente para cobrir uniformemente a
superfcie dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos
de incubao, verifique a presena de hemadsoro.
Deteco de vrus especficos. Verifique atravs de ensaios
apropriados a ausncia de contaminantes especficos da
espcie de origem da linha celular e das espcies s quais
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
o produto se destina. Para poder efectuar os ensaios de
deteco de vrus especficos prepare, em suportes adequados,
um nmero suficiente de clulas. includo em cada ensaio
um nmero apropriado de controlos positivos. Os ensaios
realizam-se, por exemplo, com anticorpos conjugados com
fluorescena ou reagentes similares.
Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha de
tapetes celulares com uma superfcie total de, pelo menos,
140 cm2. Congele e descongele as clulas pelo menos 3 vezes
e a seguir elimine por centrifugao os fragmentos celulares.
Inocule partes alquotas do lquido obtido, em clulas
com uma confluncia inferior ou igual a 70 por cento, dos
seguintes tipos:
clulas primrias da espcie de origem,
clulas sensveis aos vrus patognicos para as espcies alvo
da vacina,
5. Textos gerais
clulas sensveis aos pestivrus.
Mantenha as clulas inoculadas em cultura durante, pela
menos, 7 dias, prepare os extractos congelao-descongelao
como se descreveu anteriormente e inocule em culturas
frescas de clulas do mesmo tipo numa quantidade suficiente
que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube
as clulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas so
examinadas regularmente para se detectar a presena de
qualquer efeito citopatognico devido a microrganismos vivos.
Ao fim do perodo de 14 dias, as clulas inoculadas so
submetidas ao seguinte controlo:
verificao da ausncia de microrganismos
citopatognicos ou hemadsorventes pelos mtodos
anteriormente indicados,
verificao da ausncia de pestivrus ou outros
contaminantes especficos por imunofluorescncia
ou outros mtodos validados (Deteco de vrus
especficos).
Poder tumorgeno. Se necessrio, efectuam-se ensaios para
avaliar o risco potencial da linha celular para as espcies alvo.
CLULAS PRIMRIAS
A utilizao de clulas primrias como substrato de fabrico
de vacinas destinadas aos mamferos no na maior parte
dos casos aceite, uma vez que se podem utilizar linhas
celulares. Na entanto, se no houver alternativa utilizao
de clulas primrias, estas provm de exploraes ou de
bandos isentos de microrganismos patognicos especficos,
completamente protegidos contra a introduo de doenas
(barreiras sanitrias, filtros nas entradas de ar, sistema
apropriado de quarentena antes da introduo de animais).
No caso de se tratar de bandos de frangos, estes satisfazem
as exigncias prescritas em Bandos de Frangos Isentos de
Microrganismos Patognicos Especficos para a Produo e
o Controlo da Qualidade de Vacinas (5.2.2). No caso de se
tratar de outros animais, demonstra-se que a explorao se
encontra isenta de microrganismos patognicos especficos.
Tambm os reprodutores da explorao de onde se obtm
as clulas primrias destinadas ao fabrico de vacinas
so submetidos a controlos que incluiem, pelo menos,
2 exames serolgicos de rotina por ano e, entre estes, 2
exames serolgicos suplementares em 15 por cento dos
reprodutores.
681
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5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio
Particularmente no caso de clulas de mamferos, conveniente
utilizar, sempre que possvel, um sistema de lote semente
que compreenda, por exemplo, um banco de clulas primrio
submetido a menos de 5 passagens e um banco de clulas de
trabalho que no tenha sido submetido a mais do que 5 passagens
a partir da suspenso celular inicial obtida dos tecidos animais.
O banco de clulas primrio, banco de clulas de trabalho e
as clulas com o nmero mximo de passagens utilizado na
produo so submetidos aos ensaios indicados no quadro 3
de acordo com os mtodos descritos a seguir. A amostra cobre
todo o tipo de clulas utilizadas no fabrico da lote. Nenhum
lote de vacina produzida com estas clulas pode ser libertado
se algum dos ensaios no der resultados satisfatrios.
QUADRO 3 Fases das culturas de clulas primrias em
que os ensaios so efectuados
Banco de Banco de Nvel mximo
5. Textos gerais
clulas clulas de passagens
primrio de trabalho
Microscopia geral + + + clulas gigantes em nmero anormalmente elevado ou de
Bactrias e fungos + +
Micoplasmas + +
Vrus + +
Identificao da espcie + Deteco de vrus hemadsorventes. Lave vrias vezes, com
Caractersticas das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete
celular antes e depois da colorao histolgica. Registam-se,
se possvel sob a forma numrica, informaes relativas
especialmente velocidade e taxa de crescimento. Indica-se
igualmente a presena ou ausncia de inibio por contacto, de
clulas plurinucleadas ou de qualquer outra anomalia celular.
Identificao da espcie. Demonstra-se, por um mtodo
validado, que as clulas do banco de clulas primrio
pertencem espcie indicada.
Quando se efectua um ensaio de imunofluorescncia com o
soro especfico da espcie de origem das clulas e se verifica
que todas as clulas examinadas apresentam fluorescncia, no
necessrio realizar outros ensaios com reagentes capazes de
detectar contaminao com clulas de outras espcies.
Esterilidade bacteriana e fngica. As clulas satisfazem ao
ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de clulas contm,
pelo menos, o nmero de clulas de um tapete celular
com uma rea de 70 cm2 ou, para as clulas em suspenso,
aproximadamente o mesmo nmero de clulas. Antes de se
realizar o ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante,
pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
Micoplasmas (2.6.7). As clulas satisfazem ao ensaio dos
micoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as clulas so mantidas
em cultura durante, pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
Ausncia de vrus contaminantes. Pelos ensaios descritos a
seguir, verifica-se a ausncia de qualquer contaminao por vrus.
Os tapetes celulares examinados tm uma rea de, pelo
menos, 70 cm2 e so preparados e mantidos em cultura no
mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condies
que as clulas utilizadas na preparao da vacina.
Os tapetes celulares so mantidos em cultura, pelo menos,
durante 28 dias no total ou durante o perodo mais longo
possvel, se 28 dias for impossvel. As subculturas realizam-
-se com intervalos de 7 dias, a no ser que seja impossvel
682
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
manter as clulas com vida durante tanto tempo. Neste caso,
convm realizar as subculturas com intervalos inferiores,
mas to longos quanto possvel. O nmero de clulas que se
obtm na ltima subcultura, em recipientes apropriados,
suficiente para se efectuarem os ensaios descritos a seguir.
Os tapetes celulares so examinados regularmente durante
o perodo de incubao para se detectar eventuais efeitos
citopatognicos e, no final do perodo de observao,
so submetidos aos ensaios para pesquisa de vrus
citopatognicos, vrus hemadsorventes e vrus especficos,
estes ltimos efectuados por imunofluorescncia ou por
qualquer outro mtodo apropriado como se indica a seguir.
Deteco de vrus citopatognicos. Efectue, com um corante
apropriado, a colorao citolgica de 2 tapetes celulares com,
pelo menos, 6 cm2 cada um.
Examine toda a superfcie dos tapetes celulares corados
e verifique a presena eventual de corpos de incluso, de
qualquer outra leso indicativa de anomalias celulares que
possam ser imputadas a um agente contaminante.
uma soluo tampo apropriada, tapetes celulares com uma
rea total de 70 cm2. Adicione uma suspenso apropriada de
hemcias em volume suficiente para cobrir uniformemente a
superfcie dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos
de incubao, verifique a presena de hemadsoro.
Deteco de vrus especficos. Verifique atravs de ensaios
apropriados a ausncia de contaminantes especficos da espcie
de origem da linha celular e das espcies alvo do produto.
Para poder efectuar os ensaios de deteco de vrus especficos,
prepare, em suportes adequados, um nmero suficiente de
clulas includo em cada ensaio um nmero apropriado de
controlos positivos. Os ensaios realizam-se, por exemplo, com
anticorpos conjugados com fluorescena ou reagentes similares.
Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha
tapetes celulares com uma superfcie total de, pelo menos,
140 cm2. Congele e descongele as clulas pelo menos 3 vezes
e a seguir elimine por centrifugao os fragmentos celulares.
Inocule partes alquotas do lquido obtido, em clulas com uma
confluncia inferior ou igual a 70 por cento, dos seguintes tipos:
clulas primrias da espcie de origem,
clulas sensveis aos vrus patognicos para as espcies alvo
da vacina,
clulas sensveis aos pestivrus.
Mantenha as clulas inoculadas em cultura durante, pelo
menos, 7 dias, prepare os extractos congelao-descongelao
como se descreveu anteriormente, e inocule em culturas
frescas de clulas do mesmo tipo numa quantidade suficiente
que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube
as clulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas so
examinadas regularmente para se detectar a presena de
qualquer efeito citopatognico devido a microrganismos vivos.
Ao fim do perodo de 14 dias, as clulas inoculadas so
submetidas ao seguinte controlo:
verificao da ausncia de microrganismos citopatognicos
ou hemadsorventes pelos mtodos anteriormente indicados,
verificao da ausncia de pestivrus ou de outros
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas e soros para uso veterinrio
contaminantes especficos, por imunofluorescncia
ou outros mtodos validados (ver Deteco de vrus
especficos).
5.2.5. SUBSTNCIAS DE ORIGEM
ANIMAL UTILIZADAS NA PREPARAO
DE VACINAS PARA USO VETERINRIO
No fabrico de medicamentos veterinrios imunolgicos
podem ser utilizadas substncias de origem animal (por
exemplo, soro, tripsina e albumina srica), como ingredientes
dos meios de cultura ou como constituintes das vacinas ou
dos diluentes. Recomenda-se que a sua utilizao seja tanto
quanto possvel reduzida.
Colocam-se algumas restries utilizao de substncias de
origem animal com o objectivo de minimizar o risco associado
eventual presena de agentes patognicos nessas substncias.
A utilizao de substncias de origem animal como
constituintes das vacinas ou diluentes no em geral
aceite, a no ser que sejam esterilizados por um mtodo
validado apropriado. Quando a sua utilizao se revelar
indispensvel e a esterilizao seja impossvel, so aplicados
os critrios indicados em Exigncias.
As substncias de origem animal utilizadas durante o
fabrico so esterilizadas ou inactivadas por um mtodo
validado apropriado ou submetidas a um ensaio para
deteco de agentes estranhos como se descreve em
Exigncias. No caso de vacinas inactivadas, o mtodo
utilizado para a inactivao da estirpe da vacina
igualmente validado para a inactivao de eventuais
contaminantes das substncias de origem animal.
Alm das restries descritas a seguir, os fabricantes aplicam
restries relativas manipulao de substncias de origem
animal nas instalaes de fabrico de vacinas.
Pode tornar-se necessrio adaptar as restries impostas
nesta seco em funo da evoluo da situao zoo-sanitria este perodo de observao, todos os 7 dias, uma parte das
no pas de origem e na Europa.
EXIGNCIAS
As substncias de origem animal satisfazem s exigncias da
Farmacopeia no caso de existir a correspondente monografia.
Origem. Convm avaliar cuidadosamente as riscos associados
evoluo da situao zoo-sanitria no pas de origem da
substncia e s doenas infecciosas potencialmente presentes
na espcie animal de origem, tendo em conta as espcies alvo
propostas. Os critrios de seleco so os mais exigentes, em
particular para as substncias utilizadas nos produtos que se
destinam mesma espcie e para as substncias de origem
bovina, caprina, ovina e porcina.
Preparao. As substncias de origem animal so preparadas
a partir de um granel homogneo identificado por um
nmero de lote.
O lote pode conter substncias provenientes de um sem
nmero de animais. No entanto, uma vez definido e
identificado por um nmero, o lote no de qualquer forma
sujeito a adies ou a contaminaes.
Demonstra-se que todos os lotes da substncia se encontram
isentos de contaminaes como se descreve a seguir, e/ou
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
foram sujeitos a um processo de inactivao validado.
Inactivao. O processo de inactivao escolhido capaz
de reduzir o ttulo de pelo menos 106 de certos potenciais
contaminantes na substncia considerada. Se no se puder
demonstrar experimentalmente esta reduo de ttulo, so
feitos estudos de cintica no processo de inactivao, que do
resultados satisfatrios tendo em conta o nvel mais provvel
de contaminao.
A lista dos contaminantes potenciais para os quais se torna
necessrio demonstrar a eficcia do mtodo de inactivao
estabelecida em funo da espcie animal de origem da
substncia. A demonstrao da eficcia do mtodo, que
tem em linha de conta cada situao particular, pode ter a
forma de referncias a literatura publicada ou de resultados
experimentais produzidos pelo fabricante.
5. Textos gerais
Ensaio. Quando a amostra se apresenta na forma slida,
convm, para verificar a ausncia de contaminantes, dissolv-
-la ou suspend-la num lquido apropriado de maneira a obter
uma soluo ou uma suspenso com uma concentrao pelo
menos igual a 300 g/l. Se a amostra for insolvel, ou tiver uma
aco citotxica, utilizada uma concentrao mais baixa.
Qualquer lote em que se revele a existncia de
microrganismos vivos de qualquer espcie no satisfaz,
sendo rejeitado ou novamente processado e demonstrado
satisfatrio.
Ausncia de contaminao vrica. A soluo (suspenso)
da substncia slida ou da substncia lquida no diluda
submetida a um ensaio para pesquisa de contaminantes
por mtodos suficientemente sensveis. Os mtodos
utilizados compreendem ensaios em culturas de clulas
suficientemente sensveis e incluem clulas primrias
provenientes da mesma espcie da amostra. Uma parte das
clulas submetida a, pelo menos, duas passagens.
As clulas so regularmente observadas durante 21 dias
para deteco de eventuais efeitos citopatognicos. Durante
clulas da espcie de origem examinada para deteco
de efeitos citopatognicos aps fixao e colorao, uma
outra parte submetida a um ensaio para deteco de
agentes hemoadsorventes e uma outra pesquisa de agentes
especficos por mtodos apropriados de serodiagnstico.
Contaminao bacteriana e fngica. Antes da sua utilizao,
as substncias so submetidas ao ensaio de esterilidade
(2.6.1) e ao ensaio dos micoplasmas (2.6.7), ou a um processo
de esterilizao que assegure a inactivao de qualquer
contaminante bacteriano, fngico ou micoplsmico.
5.2.6. AVALIAO DA INOCUIDADE
DAS VACINAS E SOROS PARA USO
VETERINRIO
O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a
uma vacina como a um soro.
Durante a fase de desenvolvimento, efectuam-se ensaios
de inocuidade na espcie alvo ou nas espcies alvo, com a
finalidade de pr em evidncia os riscos potencialmente
associados com a utilizaao do produto.
Vacinas. Nos ensaios laboratoriais, o termo dose designa a
dose recomendada para um produto que contm o ttulo ou a
683
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas e soros para uso veterinrio
actividade mximos susceptveis de serem obtidos nos lotes de
fabrico. As vacinas vivas preparam-se apenas com estirpes cuja
inocuidade foi demonstrada. Para as vacinas vivas, necessrio
efectuar os ensaios com 1 ou vrios lotes da vacina preparada a
partir da passagem menos atenuada utilizada na produo.
No caso de vacinas combinadas, demonstra-se a inocuidade;
a conformidade s exigncias particulares que se aplicam
s vacinas vivas e que se descrevem a seguir para os
componentes vivos das vacinas combinadas, demonstram-se
separadamente para cada estirpe da vacina.
Nas vacinas inactivadas, os ensaios de inocuidade efectuados
com a vacina combinada podem ser considerados suficientes
para demonstrar a inocuidade dos componentes individuais.
Soros. Nos ensaios laboratoriais, o termo dose designa a
dose mxima recomendada para um produto apresentando
a actividade mxima e o teor mximo em protenas totais
5. Textos gerais
susceptveis de serem obtidos nos lotes de fabrico.
Alm disso, a dose utilizada no ensaio contm igualmente,
quando aplicvel, a quantidade mxima de imunoglobulina
ou de gamaglobulina.
Os ensaios descritos a seguir, com as modificaes ou ensaios
suplementares indicados na seco Produo das monografias, administrado vrias vezes num intervalo de tempo relativamente
efectuam-se no mbito dos ensaios de desenvolvimento
necessrios para demonstrar a inocuidade do produto.
A. ENSAIOS LABORATORIAIS
Inocuidade da administrao de uma dose nica. Administre,
por cada uma das vias de administrao recomendadas, 1
dose do produto a um grupo de animais de cada uma das
espcies e categorias alvo. Consoante o caso, este grupo
inclui animais com a idade mnima para vacinao e fmeas
gestantes. Observam-se e examinam-se os animais, pelo
menos, 1 vez por dia, para pesquisa de reaces gerais ou
locais. Quando apropriado, os estudos compreendem um
exame necrpsico detalhado, macroscpico e microscpico,
do local de injeco. Registam-se igualmente outros
critrios objectivos, por exemplo a temperatura corporal
dos mamferos e o rendimento zootcnico. Regista-se a
temperatura corporal, pelo menos, no dia anterior ao da
vacinao, no momento da vacinao, 4 h mais tarde e nos
4 dias seguintes. Mantm-se os animais em observao e
examinam-se, pelo menos, 1 vez por dia durante o perodo
de tempo em que se espera haver reaces mas, em todos os
casos, durante, no mnimo, 14 dias aps a administrao.
Estudos da funo reprodutora. Os estudos de inocuidade
podem igualmente incluir o exame da funo reprodutora
quando os dados sugerem que a origem da matria-prima do
produto constitui um factor de risco. Se estiver prescrito na
monografia, efectua-se o estudo das funes reprodutoras dos
machos e das fmeas gestantes e no gestantes, incluindo a
pesquisa de efeitos indesejveis na descendncia, por exemplo
de natureza teratognica e abortiva, para cada uma das vias
de administrao recomendadas.
Inocuidade da administrao de uma sobredose. Administra-
-se uma sobredose por cada uma das vias de administrao
recomendadas, aos animais das categorias mais sensveis
das espcies alvo, incluindo, quando aplicvel, animais
com a idade mnima recomendada e fmeas gestantes.
A sobredose consiste normalmente em 10 doses para as
vacinas vivas ou 2 doses para as vacinas inactivadas ou para
684
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
os soros. No caso das vacinas vivas liofilizadas, as 10 doses
so reconstitudas num volume apropriado de diluente
para o ensaio. Mantm-se os animais em observao e
examinam-se, pelo menos, 1 vez por dia para pesquisa de
reaces gerais ou locais. Registam-se igualmente outros
critrios objectivos, por exemplo a temperatura corporal
dos mamferos e o rendimento zootcnico. Mantm-se os
animais em observao e examinam-se durante, pelo menos,
14 dias aps a administrao. Se a vacina se destina a animais
gestantes, efectue o ensaio em animais nas fases em que a
administrao no est contra-indicada e prolongue o perodo
de observao, pelo menos, at ao parto. Observe os animais
e registe qualquer efeito na gestao ou na descendncia.
Em casos muito particulares, como os soros, quando est
comprovado que a administrao de uma sobredose no
indicada e que o ensaio no efectuado, os perigos potenciais
associados administrao de uma sobredose so claramente
assinalados nos documentos que acompanham o produto.
Inocuidade da administrao repetida de uma dose nica.
Pode ser necessria a administrao repetida de uma dose
nica para revelar quaisquer efeitos indesejveis associados a
esta situao. Estes ensaios so particularmente importantes
quando o produto (em particular os soros) susceptvel de ser
curto. Efectuam-se estes ensaios nas categorias de animais
mais sensveis da espcie alvo, para cada via de administrao
recomendada. O nmero de administraes , pelo menos,
igual ao nmero mximo recomendado; no caso das vacinas,
tem-se em conta o nmero de administraes para a vacinao
primria e para a revacinao; nos soros, tem-se em conta o
nmero de administraes requeridas para o tratamento. O
intervalo de tempo entre as administraes apropriado (por
exemplo, perodo de risco ou durao de tratamento requerido)
e compatvel com o modo de emprego do produto. No caso
das vacinas, por razes de comodidade, admite-se que sejam
utilizados perodos mais curtos que os recomendados no campo,
mas, no mnimo, mantm-se um intervalo de 14 dias entre as
administraes para permitir o desenvolvimento de eventuais
reaces de hipersensibilidade. Pelo contrrio, nos soros, a
administrao segue o esquema recomendado. Observam-se e
examinam-se os animais, pelo menos 1 vez por dia, no mnimo,
durante 14 dias aps a ltima administrao para pesquisa
de reaces gerais ou locais. Registam-se igualmente outros
critrios objectivos, por exemplo a temperatura corporal dos
mamferos e o rendimento zootcnico.
Resduos. No caso de vacinas vivas contra zoonoses bem
conhecidas, pode ser necessrio efectuar a pesquisa do
microrganismo da vacina residual no local de injeco, para
alm dos estudos de disseminao que se descrevem a seguir.
Efeitos indesejveis nas funes imunolgicas. No caso
de um produto poder afectar negativamente a resposta
imunitria do animal ao qual foi administrado ou da sua
descendncia, efectuam-se ensaios adequados das funes
imunolgicas.
Efeitos de interaco indesejveis. Quando se recomenda a
administrao do produto simultaneamente ou no quadro de
um programa de administrao de vrios produtos num curto
perodo de tempo, efectuam-se estudos para demonstrar a
ausncia de efeitos de interaco indesejveis na inocuidade do
produto.
Exigncias especiais aplicveis s vacinas vivas. Efectuam-se
os seguintes ensaios nas vacinas vivas.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.7. Avaliao da eficcia das vacinas e soros para uso veterinrio
(a) Difuso da estirpe da vacina. Utilizando a via de
administrao recomendada mais favorvel para a difuso,
investiga-se a possibilidade de transmisso da estirpe da vacina
de animais vacinados a animais no vacinados da espcie alvo.
Pode tambm ser necessrio investigar os riscos de transmisso
a espcies no alvo potencialmente muito sensveis estirpe da
vacina viva. Convm igualmente avaliar o nmero possvel de
transmisses de animal para animal em circunstncias normais,
assim como as suas consequncias previsveis.
(b) Disseminao no organismo do animal vacinado. Verifica-
-se a presena do microrganismo nas fezes, urina, leite, ovos
e secrees orais, nasais ou outras. Alm disso, pode ser
necessrio estudar a disseminao da estirpe da vacina no
corpo do animal, com especial destaque para os seus locais
de multiplicao preferenciais. Este estudo obrigatrio para
vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas e administradas
a animais destinados ao consumo.
(c) Aumento de virulncia. Utilize a estirpe do nvel de
passagem que se espera seja a mais virulenta para a espcie
alvo, entre o lote semente primrio e o produto final.
Os animais utilizados tm uma idade apropriada para
recuperao do vrus e os animais de todos os grupos tm
essa idade no momento da inoculao. A primeira vacinao
efectua-se pela via de administrao recomendada mais
favorvel reverso virulncia. Efectuam-se a seguir, pelo
menos, 5 passagens em srie em animais das espcies alvo.
As passagens realizam-se pela via de administrao mais
favorvel reverso virulncia. Se as propriedades do vrus e identificam-se as medidas preventivas necessrias para
permitem passagens sucessivas por propagao natural nos
5 grupos, pode ser utilizado este mtodo, seno efectua-se
uma passagem como se descreve em cada monografia e
pesquisa-se o aumento de virulncia no vrus recuperado no
nvel de passagem mais elevado. Utilizam-se, pelo menos,
2 animais em cada passagem. Comprova-se a presena de
microrganismos vivos provenientes da vacina no substrato de
cada passagem. Compara-se a inocuidade da estirpe do nvel
mais elevado de passagens com a da estirpe de origem.
No caso de vrus particulares, a monografia pode exigir
um maior nmero de passagens e para cada passagem um
nmero de animais mais elevado, se os dados disponveis
indicarem interesse. Efectua-se a ltima passagem, pelo
menos, em animais da categoria mais apropriada para avaliar
o risco potencial.
(d) Propriedades biolgicas da estirpe da vacina. Podem
ser necessrios mais ensaios por forma a determinar, to
precisamente quanto possvel, as propriedades biolgicas
intrnsecas da estirpe utilizada na vacina (por exemplo,
neurotropismo). No caso de vacinas que utilizam vectores,
necessrio fazer uma avaliao do risco de uma modificao
do tropismo ou da virulncia da estirpe e, se necessrio,
efectuar ensaios especficos. Estes ensaios so sistematica-
mente efectuados quando se incorpora um gene estranho na
estirpe como protena estrutural.
(e) Recombinao ou rearranjo genmico da estirpe. Analisa-
-se a probabilidade de recombinao ou rearranjo genmico
com a estirpe de campo ou outras.
B. ENSAIOS DE CAMPO
Os resultados dos ensaios laboratoriais normalmente
completam-se e confirmam-se com dados obtidos no
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
decurso dos ensaios de campo. Sob reserva de que os ensaios
laboratoriais tenham avaliado adequadamente a inocuidade
e a eficcia de um produto nas condies experimentais
utilizando vacinas com ttulo ou actividade respectivamente
mximo(a) ou mnimo(a), pode ser utilizado apenas um
nico lote para avaliar ao mesmo tempo a inocuidade e a
eficcia no campo. Neste caso, pode ser utilizado um lote de
rotina representativo, com ttulo ou actividade intermdios.
Nos mamferos destinados ao consumo, os ensaios incluem a
medio da temperatura corporal antes e aps a administrao
do produto num nmero suficientemente elevado de animais;
no caso de outras espcies de mamferos, essas medies
efectuam-se quando os ensaios laboratoriais indiciem qualquer
problema. Regista-se o tamanho e a persistncia de qualquer
reaco local e a proporo de animais que apresentam
reaces locais ou gerais. Nos casos apropriados, convm
igualmente medir o rendimento zootcnico.
5. Textos gerais
No caso de galinhas poedeiras, os ndices de rendimento
abrangem a mortalidade semanal, os ndices de consumo,
a idade ao abate e o peso, assim como a desvalorizao ou
rejeies do local de produo. Para as vacinas destinadas s
aves poedeiras ou s aves que se podem destinar postura,
consoante o caso, efectua-se um estudo sobre os efeitos da
vacina no rendimento da postura e na taxa de ecloso.
C. ECOTOXICIDADE
Avaliam-se os efeitos nocivos do produto para o ambiente
diminuir os referidos riscos. Avalia-se o grau de exposio
do ambiente ao produto, levando em conta a espcie alvo e
o modo de administrao e de excreo do produto. Se estes
factores indicarem haver um risco significativo de exposio
do ambiente ao produto, avalia-se a ecotoxicidade potencial
levando em linha de conta as propriedades do produto.
5.2.7. AVALIAO DA EFICCIA
DAS VACINAS E SOROS PARA USO
VETERINRIO
O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a
uma vacina como a um soro.
Durante a fase de desenvolvimento do produto, demonstra-se
a sua eficcia atravs de ensaios efectuados em cada uma das
espcies e categorias s quais a vacina se destina, utilizando
cada uma das vias de administrao recomendadas e o
esquema vacinal proposto. O natureza dos ensaios a efectuar
varia consideravelmente consoante o tipo de vacina.
Os ensaios indicados na seco Produo de uma
monografia especfica podem ser efectuados no quadro dos
ensaios de desenvolvimento necessrios para demonstrar a
eficcia. Convm ter em conta as seguintes consideraes.
A dose a utilizar nos ensaios ser a quantidade de produto
recomendada para utilizao, contendo o ttulo ou a
actividade mnimos admitidos no fim do prazo de validade.
No caso de vacinas vivas, necessrio efectuar os ensaios com
a vacina contendo vrus/bactria do nvel de passagem mais
atenuada que poder estar presente num lote de vacina.
No caso dos soros, quando aplicvel, a dose examinada contm
igualmente as quantidades mnimas de imunoglobulinas ou de
gamaglobulinas e/ou de protenas totais.
685
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Os ensaios de eficcia confirmam todas as indicaes
reclamadas para o produto. Se, por exemplo, se indica que
o produto confere proteco contra doenas respiratrias,
pelo menos, demonstra-se que a proteco contra os sinais
clnicos da doena respiratria est assegurada. Quando se
reclama uma proteco anti-infecciosa, este facto demonstra-
-se por tcnicas de reisolamento. Se apresentam vrias
indicaes, a sua eficcia demonstra-se para cada uma delas.
Vacinas. Avalia-se adequadamente a influncia na eficcia
da presena de anticorpos adquiridos passivamente ou
transmitidos pela me. Qualquer declarao ou indicao
implcita quanto ao incio e durao da proteco
reivindicada corroborada com resultados dos estudos.
Para as vacinas combinadas e multivalentes, a eficcia de cada
componente demonstra-se utilizando a vacina combinada.
Soros. D-se uma ateno particular aos dados que
demonstram a eficcia do esquema recomendado. Por
5. Textos gerais
laboratoriais tenham avaliado adequadamente a inocuidade e a
eficcia de um produto nas condies experimentais utilizando
vacinas com ttulo ou actividade respectivamente mximo(a)
ou mnimo(a), pode ser utilizado apenas um nico lote para
avaliar ao mesmo tempo a inocuidade e a eficcia no campo.
Neste caso, pode ser utilizado um lote de rotina representativo,
com ttulo ou actividade intermdios. Quando os ensaios
laboratoriais no permitem demonstrar a eficcia, admite-se
que sejam efectuados apenas ensaios no campo.
5.2.8. MINIMIZACO DO RISCO DE
TRANSMISSO DE AGENTES DE
ENCEFALOPATIAS ESPONGIFORMES
ANIMAIS PELOS MEDICAMENTOS
PARA USO HUMANO E PARA USO

exemplo, se se recomenda administrar o soro apenas uma VETERINRIO

vez para fornecer um efeito profilctico ou teraputico,
demonstra-se este facto. Qualquer indicao, declarada ou Este captulo idntico Nota Explicativa sobre a
implcita quanto ao incio e durao da proteco ou do minimizao do risco de transmisso de agentes de
efeito teraputico, apoia-se nos dados obtidos nos ensaios. encefalopatias espongiformes animais atravs dos
Por exemplo, estuda-se a durao da proteco permitida por medicamentos para uso humano e para uso veterinrio
uma dose profilctica de um soro para se poder fornecer no Reviso 2, Outubro de 2003 [Comit de Especialidades
rtulo indicaes apropriadas ao utilizador. Farmacuticas (CEF). Comit de Medicamentos
Conduzem-se ensaios de compatibilidade imunolgica quando Veterinrios (CMV), Agncia Europeia para a Avaliao de
se recomenda a administrao simultnea de vrios produtos Medicamentos].
ou quando ele faz parte de um esquema de administrao Contedo
habitual. Quando o produto faz parte de um esquema habitual
de administrao recomendado, demonstra-se a seu papel 1. INTRODUO
tanto na vacinao primria como na revacinao, ou a sua 1-1. Contexto cientfico
contribuio na eficcia do esquema no seu todo. 1-2. Conformidade regulamentar
Avalia-se adequadamente a influncia da imunidade 2. MBITO DO CAPTULO
conferida por anticorpos passivamente adquiridos ou de
origem materna na eficcia da vacina. Qualquer declarao 3. CONSIDERAES DE ORDEM GERAL
ou indicao respeitante ao incio e durao da proteco 3-1. Princpios cientficos de minimizao do risco
corroborada com os resultados obtidos nos ensaios. 3-2. Animais de origem
Demonstra-se a eficcia de cada um dos componentes das 3-2-1. Origem geogrfica
vacinas combinadas, utilizando a vacina combinada.
3-2-1-1. Matrias de origem bovina
3-2-1-2. Ovinos e caprinos (pequenos ruminantes)
ENSAIOS LABORATORIAIS
3-2-2. Efectivos (fechados) de bovinos com risco
insignificante de BSE
Em princpio, a demonstrao da eficcia efectua-se no
laboratrio em condies controladas atravs de prova 3-3. Partes dos animais, fluidos e secrees utilizados como
matrias-primas
virulenta no animal alvo, nas condies de utilizao
recomendadas. Na medida do possvel, as condies de 3-4. Idade dos animais
realizao da prova virulenta reproduzem as condies 3-5. Processo de fabrico
naturais de infeco, por exemplo quanto ao nmero de
microrganismos e via de administrao utilizados. 4. AVALIAO DO RISCO LIGADO S MATRIAS OU
SUBSTNCIAS UTILIZADAS NO FABRICO OU NA PREPARAO
Vacinas. Salvo excepo justificada, a prova virulenta efectua- DE UM MEDICAMENTO NO CONTEXTO DA CONFORMIDADE
-se utilizando uma estirpe diferente daquela que foi utilizada REGULAMENTAR
na produo da vacina. 5. AVALIAO RISCO/BENEFCIO
Se possvel, convm determinar qual o tipo de mecanismo 6. CONSIDERAES ESPECFICAS
imunitrio (celular/humoral, local/geral, classe de 6-1. Colagnio
imunoglobulina) que resulta da administrao do produto
aos animais alvo. 6-2. Gelatina
6-3. Derivados do sangue bovino
6-4. Derivados do sebo
ENSAIOS DE CAMPO
6-5. Carvo animal
De uma forma geral, os resultados dos ensaios laboratoriais 6-6. Leite e derivados do leite
so completados por dados obtidos nos ensaios de campo,
6-7. Derivados da l
efectuados, salvo excepo justificada, com animais
testemunhas no tratados. Sob reserva de que os ensaios 6-8. Aminocidos

686 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
1. INTRODUO
1-1. CONTEXTO CIENTFICO
As encefalopatias espongiformes transmissveis (TSE -
transmissible spongiform encephalopathies) so doenas
degenerativas crnicas do sistema nervoso caracterizadas pela
acumulao de uma isoforma anormal de uma glicoproteina
celular denominada PrP ou protena do prio. Esta isoforma
anormal da PrP (PrPSc) difere da PrP normal (PrPc) pelo
facto de ser altamente resistente ao tratamento pela protease
e desnaturao trmica. Cr-se que a PrPSc o agente
infeccioso responsvel pela transmisso das TSE.
As TSE veterinrias incluem:
a encefalopatia espongiforme bovina (BSE - bovine
spongiform encephalopathy), nos bovinos,
o tremor epizotico (scrapie), nos ovinos e caprinos,
a doena crnica emaciante (CWD - chronic wasting
disease) dos cervdeos (veados e alces),
a encefalopatia transmissvel do vison (TME - transmissible
mink encephalopathy), nos visons de criao,
a encefalopatia espongiforme dos felinos (FSE - feline
spongiform encephalopathy), especificamente nos gatos
domsticos e em felinos de grande porte em cativeiro,
a encefalopatia espongiforme dos ungulados exticos dos
jardins zoolgicos.
No ser humano, as encefalopatias espongiformes abrangem
vrias formas da doena de Creutzfeldt-Jakob (DCJ), o Kuru,
a sndroma de Gerstmann-Strussler-Scheinker (GSS) e a
Insnia Fatal Familiar (FF).
Foi notificada a transmisso iatrognica das encefalopatias
espongiformes Nos ovinos, o tremor epizotico foi
acidentalmente transmitido pela utilizao da vacina
Louping Ill, preparada a partir da mistura do crebro e bao
de ovinos tratados com formaldedo, na qual tinham sido
inadvertidamente incorporadas matrias-primas provenientes
de ovinos infectados com essa doena. No homem, foram
notificados casos de transmisso da DCJ atribudos
administrao parentrica repetida de hormona do crescimento
e de gonadotropina derivadas da hipfise de cadveres humanos.
Alguns casos de DCJ foram igualmente atribudos utilizao
de instrumentos contaminados na cirurgia do crebro e ao
transplante de dura-mter e crneas humanas.
A transmisso das TSE entre espcies limitada por vrias
barreiras naturais, sendo a transmissibilidade afectada
pela espcie de origem, a estirpe do prio, a dose, a via
de exposio e, nalgumas espcies, o alelo do gene PrP
do hospedeiro. As barreiras entre espcies podem ser
ultrapassadas em condies adequadas.
A encefalopatia espongiforme bovina (BSE) foi identificada
pela primeira vez no Reino Unido em 1986, tendo sido
afectados muitos bovinos e efectivos. Apurou-se que a BSE
uma doena transmitida por via alimentar atravs da carne
e das farinhas de carne e de ossos de animais afectados
pelas TSE. Verificaram-se casos de BSE noutros pases, quer
em animais importados do Reino Unido, quer em animais
autctones. H provas convincentes de que a nova variante
da DCJ (vDCJ) causada pelo agente etiolgico da BSE
dos bovinos. Por conseguinte, continua a justificar-se a
mxima prudncia caso os materiais biolgicos das espcies
espontaneamente afectadas por essas doenas, em especial os
bovinos, sejam utilizados no fabrico de medicamentos.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
O tremor epizotico est presente em todo o mundo e foi
notificado na maior parte dos pases europeus. A sua incidncia
mais elevada no Reino Unido. Embora o ser humano tenha
sido exposto durante mais de 200 anos ao tremor epizotico
espontneo, no h dados epidemiolgicos que permitam
estabelecer uma relao directa entre ele e as encefalopatias
espongiformes do ser humano. No entanto, subsiste um
risco terico actualmente inquantificvel de que alguns
suplementos proteicos contaminados pela BSE possam ter
sido ingeridos por ovinos. Se tais alimentos causarem uma
infeco recorrente com o agente da BSE, essa infeco
poder ser diagnosticada como tremor epizotico e constituir,
portanto, um risco de TSE humana. Alm disso, h que partir
do pressuposto de que qualquer agente da BSE introduzido
na populao dos pequenos ruminantes atravs de alimentos
contaminados ser provavelmente reciclado e amplificado.
5. Textos gerais
1-2. CONFORMIDADE REGULAMENTAR
Avaliao do risco - Dado ser impossvel evitar a utilizao
de matrias de origem animal na produo de alguns
medicamentos e s raramente ser possvel suprimir
totalmente o risco na fonte, as medidas adoptadas para
controlar o risco de transmisso das TSE atravs dos
medicamentos constituem uma minimizao, e no uma
supresso do risco. Por conseguinte, a conformidade
regulamentar deve assentar numa avaliao do risco que
atenda a todos os factores pertinentes explicitados no
presente captulo (ver adiante).
Aspectos jurdicos - A Nota Explicativa tem fora de lei,
nos termos do Anexo I das Directivas 2001/82/CE e 2001/83/CE
do Parlamento Europeu e do Conselho [com a redaco
que lhes foi dada pela Directiva 2003/63/CE (1) relativas,
respectivamente, aos medicamentos para uso veterinrio
e para uso humano. Estas directivas estabelecem que os
requerentes de autorizaes de introduo no mercado de
medicamentos para uso humano e para uso veterinrio
comprovem que tais medicamentos so fabricados de acordo
com a ltima verso da presente Nota Explicativa publicada
no Jornal Oficial da Unio Europeia. Trata-se de uma
obrigao que se mantm aps a concesso da autorizao de
introduo no mercado.
Por definio, o princpio das matrias de risco especfico,
tal como definidas no Regulamento (CE) n 999/2001
do Parlamento Europeu e do Conselho(2), no se aplica
aos medicamentos. A utilizao de substncias derivadas
de tecidos com elevada infecciosidade deve justificar-se
plenamente e surgir na sequncia de uma avaliao adequada
da relao risco/benefcio (ver adiante).
A Nota Explicativa deve ser lida em conjugao com
os vrios instrumentos jurdicos da Comunidade
Europeia, nomeadamente as vrias decises da Comisso
progressivamente aplicadas desde 1991. Sempre que
necessrio, so indicadas referncias a essas decises. As
declaraes de tomada de posio e as notas explicativas
elaboradas pelo Comit das Especialidades Farmacuticas
(CEF) e pelo Comit dos Medicamentos Veterinrios (CMV) so
ainda aplicveis para efeitos de conformidade regulamentar, a
menos que sejam alteradas na Nota Explicativa.
(1) JO L 159 de 27.6.2003, p.46.
(2) JO 1- 147 de 31.5-20017 p.1.
687
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
A monografia geral Produtos com risco de transmisso
dos agentes das encefalopatias espongiformes animais da
Farmacopeia Europeia remete para um captulo de carcter
geral que idntico Nota Explicativa. Esta monografia
constitui a base para a emisso de certificados de conformidade,
um procedimento que demonstra a conformidade TSE das
substncias e matrias utilizadas no fabrico de medicamentos
para uso humano e para uso veterinrio.
Clarificao da Nota Explicativa - medida que os
conhecimentos cientficos sobre as TSE, e em especial sobre a
patognese destas doenas, progredirem, o CEF e o respectivo
Grupo de Trabalho Biotecnologia, em colaborao com o
CMV e o seu Grupo de Trabalho Produtos Imunolgicos,
podero necessitar de elaborar orientaes suplementares,
sob a forma de declaraes de tomada de posio ou de notas
explicativas, para clarificar a Nota Explicativa.
5. Textos gerais
Estas orientaes suplementares sero publicadas pela
Comisso, bem como no stio web da Agncia Europeia de
Avaliao dos Medicamentos (EMEA - European Agency for the
Evaluation of Medicinal Products), e sero devidamente
tomadas em considerao no mbito da certificao da Directrio
Europeia da Qualidade dos Medicamentos (EDQM - European
Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare).
Aplicao da Nota Explicativa revista - Todos os
medicamentos autorizados na UE esto em conformidade
com a Nota Explicativa sobre a minimizao do risco de
transmisso de agentes das encefalopatias espongiformes
animais pelos medicamentos para uso humano e para
uso veterinrio (EMEA/410/01 - Rev. 1), dado o requisito
legal constante do Anexo I das Directivas 2001/82/CE
(medicamentos para uso veterinrio) e da Directiva
2001/83/CE, com a ltima redaco que lhe foi dada pela
Directiva 2003/63/CE (medicamentos para uso humano). A
Nota Explicativa revista dever ser aplicada prospectivamente,
ou seja, em relao a todos os medicamentos futuramente
autorizados ou cuja autorizao de introduo no mercado
seja renovada aps a data inicial da sua aplicao.
2. MBITO DO CAPTULO
ESPCIES ANIMAIS RELEVANTES EM TERMOS DAS TSE
Os bovinos, ovinos, caprinos e outros animais que possam ser
espontaneamente infectados pelos agentes das encefalopatias
espongiformes transmissveis, ou a quem a infeco possa
ser transmitida por via oral, excepto o ser humano(3) e outros
primatas, so definidos como espcies animais relevantes
em termos das TSE(4).
Matrias - O presente captulo diz respeito a matrias
derivadas de espcies animais relevantes em termos das
TSE usadas na preparao de:
(3) O Comit das Especialidades Farmacuticas e o respectivo Grupo de
Trabalho de Biotecnologia publicaram orientaes regulamentares e
documentos de tomada de posio sobre os medicamentos derivados
de tecidos humanos no que respeita DCJ e vDCJ. Estas orientaes
encontram-se no seguinte endereo: http:www.emea.eu.int
(4) Os sunos e as aves, que so espcies animais particularmente teis
para a produo de medicamentos, no so susceptveis de ser infectados
espontaneamente por via oral. Por conseguinte, no so espcies animais
relevantes em termos das TSE, na acepo do presente captulo. Tambm os ces,
os coelhos e os peixes no so espcies animais relevantes em termos das TSE, na
acepo do presente capitulo.
688
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
substncias activas,
excipientes e adjuvantes,
matrias-primas e reagentes utilizados na produo (por
exemplo, albumina srica bovina; enzimas; meios de
cultura, incluindo os utilizados na preparao de bancos
de clulas de trabalho, ou de novos bancos de clulas
primrias, para medicamentos sujeitos a uma nova
autorizao de introduo no mercado).
O presente captulo igualmente aplicvel s matrias que
entram em contacto directo com o equipamento de produo
dos medicamentos, ou que possam entrar em contacto
corn eles, e constituem, portanto, uma eventual fonte de
contaminao.
As matrias usadas na validao das instalaes e do
equipamento, como meios de cultura usados em experincias
de enchimento para validar processos de enchimento
assptico, devem ser consideradas em conformidade com o
presente captulo se o ou os seus constituintes derivarem de
tecidos sem infecciosidade detectvel (tecidos da categoria C),
se tiver sido analisado o risco de contaminao cruzada com
tecidos potencialmente infecciosos (ver seco 3.3) e se essas
matrias provierem de um pas com um RGB I/II (ver seco
3.2). Estas informaes podem ser apresentadas no dossier
de autorizao de introduo no mercado e verificadas no
decurso da inspeco de rotina para conformidade com as
Boas Prticas de Fabrico (BPF).
Outros materiais, como agentes de limpeza, amaciadores e
lubrificantes, que entrem em contacto com o medicamento
no decurso do fabrico de rotina, da fase de acabamento ou da
embalagem primria, consideram-se em conformidade com
o presente captulo caso se trate de derivados do sebo que
respeitem as condies descritas na seco 6.
LOTES SEMENTE, BANCOS DE CLULAS E
FERMENTAO PRODUO DE ROTINA(5)
Para efeitos de conformidade regulamentar, as sementes
primrias, ou bancos de clulas primrias, respeitantes
aos pedidos de autorizao de introduo no mercado
apresentados aps 1 de Julho de 2000 (no que respeita aos
medicamentos para uso humano) e 1 de Outubro de 2000 (no
que se refere aos medicamentos para uso veterinrio) esto
cobertas pela Nota Explicativa.
As sementes primrias e bancos de clulas primrias,
para antignios de vacinas,
para medicamentos obtidos por processos biotecnolgicos,
na acepo da parte A do Anexo do Regulamento CE
n. 2309/93 do Conselho, e
para outros medicamentos em cujo fabrico sejam utilizados
lotes semente e sistemas de bancos de clulas,
j aprovados em relao ao fabrico de um constituinte
de um medicamento autorizado sero considerados em
conformidade com a Nota Explicativa, mesmo que constem
dos pedidos de autorizao de introduo no mercado
(5)Consultar igualmente o documento para adopo de uma posio sobre a
avaliao do risco de transmisso de agentes das encefalopatias espongiformes
animais pelos lotes semente primrios utilizados na produo de vacinas
veterinrias (EMEA/CVMP/019/01 - Fevereiro de 2001), adoptado pelo Comit
dos Medicamentos Veterinrios (CMV) em Julho de 2001 (Jornal Oficial das
Comunidades Europeias C 286 de 12 de Outubro de 2001, p. 12).
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
apresentados aps 1 de Julho de 2000 (no que respeita aos
medicamentos para uso humano) e 1 de Outubro de 2000 (no
que se refere aos medicamentos para uso veterinrio).
No que respeita aos bancos de clulas primrias e aos lotes
semente primrios criados antes de 1 de Julho de 2000 (no
que respeita aos medicamentos para uso humano) e 1 de
Outubro de 2000 (no que se refere aos medicamentos para
uso veterinrio) e ainda no aprovados como constituintes
de um medicamento autorizado, deve comprovar-se que
satisfazem aos requisitos da Nota Explicativa. Se, em relao
a alguma matria-prima, produto de base ou reagente
utilizado para a criao destes bancos de clulas ou de lotes
semente, se no encontrarem, ou j se no encontrarem,
disponveis provas documentais exaustivas, o requerente deve
apresentar a avaliao de risco descrita na seco 4 da Nota
Explicativa.
Os lotes semente ou bancos de clulas de trabalho
estabelecidos utilizados no fabrico de medicamentos
autorizados antes de 1 de Julho de 2000 (medicamentos para
uso humano) e 1 de Outubro de 2000 (medicamentos para
uso veterinrio) que foram sujeitos a uma avaliao de risco
adequada pela Autoridade competente dos Estados- Membros
ou pela EMEA e declarados aceitveis devem ser igualmente
considerados conformes.
No entanto, se as matrias derivadas de espcies animais
relevantes em termos das TSE forem utilizadas em
processos de fermentao/produo de rotina ou para a
criao de lotes semente de trabalho e de bancos de clulas
de trabalho, o requerente deve comprovar que observam os
requisitos da Nota Explicaliva.
3. CONSIDERAES DE ORDEM GERAL
3-1. PRINCPIOS CIENTFICOS DE MINIMIZAO DO RISCO
Caso possam optar, os fabricantes devem preferir a utilizao
de matrias de espcies animais no relevantes em termos
das TSE ou de origem no animal. Devem ser expostos os
motivos da utilizao de matrias derivadas de espcies
animais relevantes em termos das TSE, e no de matrias
derivadas de espcies animais no relevantes em termos
das TSE ou de origem no animal. Se tiverem de ser
utilizadas matrias derivadas de espcies animais relevantes
em termos das TSE, deve atender-se a todas as medidas
necessrias para minimizar o risco de transmisso das TSE.
Ainda no se encontram disponveis testes de diagnstico
in vivo da infeco pelas TSE. O diagnstico baseia-se na
confirmao post mortem da existncia de leses cerebrais
caractersticas, atravs da histopatologia e/ou da deteco da
PrPSc pelo western blot ou por imunoensaio. Para confirmao,
utiliza-se igualmente a demonstrao da infecciosidade atravs
da inoculao de tecido suspeito em espcies-alvo ou em
animais de laboratrio. No entanto, dado o longo perodo de
incubao de todas as TSE, os resultados dos testes in vivo
apenas esto disponveis meses ou anos depois.
Foram aprovados vrios testes de diagnstico in vitro capazes
de detectar a PrPSc em amostras de tecido cerebral de animais
infectados, embora, em termos gerais, sejam menos sensveis
do que os testes de infecciosidade in vivo. No entanto, a
despistagem dos animais de origem atravs de testes in
vitro pode evitar a utilizao de animais nas fases tardias
de incubao da doena e conduzir a informaes sobre a
situao epidemiolgica de um dado pas ou regio.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
A minimizao do risco de transmisso das TSE baseia-se em
trs parmetros complementares:
os animais de origem e a sua origem geogrfica,
a natureza das matrias de origem animal utilizadas no
fabrico e dos eventuais procedimentos aplicados para
evitar a contaminao cruzada com matrias de risco mais
elevado,
o ou os processos de produo, incluindo o sistema
de garantia da qualidade aplicado para assegurar a
uniformidade e a traabilidade do produto.
3-2. ANIMAIS DE ORIGEM
As matrias-primas usadas na produo de matrias
destinadas ao fabrico de medicamentos devem ser
5. Textos gerais
provenientes de animais considerados adequados para
consumo humano, na sequncia de uma inspeco ante
e post mortem em conformidade com as condies
comunitrias ou equivalentes (pases terceiros), excepto
as matrias derivadas de animais vivos, que devem ser
declarados saudveis na sequncia de um exame clnico.
3-2-1. Origem geogrfica
3.2.1.1. Matrias de origem bovina. Actualmente, h duas
organizaes envolvidas na avaliao da situao em matria
de BSE de um dado pas ou zona especfica. Por um lado, a
OIE (Organisation Internationale des Epizooties(6) estabelece
critrios de avaliao da situao dos pases no captulo do
Cdigo Zoossanitrio Internacional sobre a encefalopatia
espongiforme bovina. A OIE tambm disponibiliza uma lista
de casos notificados de BSE a nvel mundial. Por outro lado,
o Comit Cientfico Director (CCD)(7) da Comisso Europeia
estabeleceu um sistema de classificao dos pases de acordo
com o respectivo risco geogrfico de BSE (RGB).
O Regulamento (CE) n 999/2001 do Parlamento Europeu
e do Conselho, que estabelece regras para a preveno, o
controlo e a erradicao de determinadas encefalopatias
espongiformes transmissveis (Regulamento TSE)(2), entrou
em vigor em 1 de Julho de 2001. Embora os medicamentos,
os dispositivos mdicos e os cosmticos estejam excludos
do mbito desse regulamento, h que atender aos princpios
de determinao da situao em matria de BSE na
categorizao de um dado pas ou regio.
Para efeitos do presente captulo, a classificao RGB do
Comit Cientfico Director deve ser utilizada como um
indicador da situao de um dado pas. No entanto, quando os
pases forem categorizados de acordo com o Regulamento (CE)
n 999/2001, h que recorrer a esta ltima categorizao.
Classificao do Comit Cientifico Director da comisso
Europeia
A classificao do risco geogrfico de BSE (RGB) do Comit
Cientfico Director da Comisso Europeia indica o grau de
probabilidade da existncia de um ou mais bovinos infectados
(6)http:www.oie.int
(7)O Comit Cientfico Director estabelecido pela Deciso 97/404/CE da
Comisso assiste a Comisso na obteno dos melhores pareceres cientficos
disponveis sobre questes relacionadas corn a sade dos consumidores.
A partir de Maio de 2003, as suas funes foram retomadas pela Autoridade
Europeia para a Segurana dos Alimentos (AESA): http://www.efsa.eu.int
689
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
com a BSE, em fase clnica ou pr-clnica, num dado pas
ou regio. O quadro que se segue apresenta a definio das
quatro categorias:
Grau de Presena de um ou mais bovinos infectados com a BSE,
RGB em fase clnica ou pr-clnica, numa regio geogrfica ou pas
I Altamente improvvel
II Improvvel, mas no excluda
III Provvel, mas no confirmada, ou confirmada a um nvel provenientes de efectivos (fechados) de bovinos com risco
inferior
IV Confirmada a um nvel superior (1)
(1) 100 casos/1 milho de bovinos adultos por ano
No stio web do CCD (8), encontram-se os relatrios de
avaliao do RGB por pas. Se a situao do pas em matria
de BSE no tiver sido definida pelo CCD, deve ser apresentada
5. Textos gerais
a avaliao de risco tendo em conta os critrios do CM em
relao classificao RGB.
Sempre que possvel, os animais devem provir de pases com
o mnimo RGB possvel, a menos que se justifique a utilizao
de matrias originrias de pases com um RGB mais elevado.
Algumas das matrias indicadas na seco 6 Condies
especficas podem ser originrias de pases com um RGB da
categoria III e, nalguns casos, da categoria IV, desde que sejam
aplicados os controlos e respeitados os requisitos especificados
nas seces relevantes que se seguem. Fora estas excepes, os
animais no devem ser originrios de pases da categoria IV e
deve apresentar-se sempre uma justificao para a utilizao de
animais da categoria III.
3.2.1.2. Ovinos e caprinos (pequenos ruminantes). Foram
notificados casos clnicos espontneos de tremor epizotico
em vrios pases a nvel mundial. Uma vez que, nos ovinos,
a BSE poder ser confundida com o tremor epizotico, a
origem das matrias derivadas de pequenos ruminantes deve
atender, como medida de precauo, prevalncia quer da
BSE, quer do tremor epizotico no pas em causa, bem como
aos tecidos de onde provm as matrias.
Os princpios respeitantes aos efectivos de bovinos com
risco insignificante de BSE (fechados) (ver seco 3-2-2)
deveriam ser igualmente aplicados no contexto dos pequenos
ruminantes, a fim de desenvolver um enquadramento
que permita definir a situao em matria de BSE de um
efectivo de pequenos ruminantes. No que respeita aos ovinos,
dada a preocupao em relao possvel existncia de
BSE, ponderar-se- a utilizao de um ou mais gentipos
comprovadamente resistentes BSE/tremor epizotico no
estabelecimento de efectivos isentos das TSE. No entanto,
nos caprinos no h estudos suficientes sobre a sensibilidade
especfica de um gentipo.
As matrias provenientes de pequenos ruminantes devem
preferivelmente ser originrias de pases com uma longa
tradio de ausncia de tremor epizotico, como a Nova
Zelndia ou a Austrlia, ou de efectivos isentos de TSE. Ser
obrigatrio justificar matrias provenientes de outras origens.
3-2-2. EFECTIVOS (FECHADOS) DE BOVINOS COM RISCO
INSIGNIFICANTE DE BSE
A origem mais segura a de pases em que a BSE altamente
improvvel, ou seja, de pases com RGB I. Os restantes pases
podem ter, ou ter tido, casos de BSE.
(8) http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/outcome/en.html
690
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
O conceito prtico de efectivos (fechados) de bovinos
com risco insignificante de BSE foi elaborado pelo CCD e
aprovado pelo CEF e pelo CMV. Os critrios de atribuio e
manuteno da situao de efectivos (fechados) de bovinos
com risco insignificante de BSE constam do parecer do CCD
de 22-23 de Julho de 1999(9)
Actualmente, ainda no possvel quantificar a reduo
do risco geogrfico de BSE em relao aos bovinos
insignificante de BSE. No entanto, cr-se que tal reduo
do risco seja significativa. Por conseguinte, o recurso a tais
efectivos (fechados) de bovinos ser analisado no mbito da
avaliao de risco, conjuntamente com a classificao RGB
do pas.
3-3. PARTES DOS ANIMAIS, FLUIDOS E SECREES
UTILIZADOS COMO MATERIAS-PRIMAS
Os diversos rgos e secrees de um animal infectado
com uma TSE tm graus diferentes de infecciosidade(10) Os
quadros constantes do anexo ao presente captulo (11) resumem
dados actualizados sobre a distribuio da infecciosidade e da
PrPSc em bovinos com a BSE e em ovinos ou caprinos com o
tremor epizotico.
As informaes constantes dos quadros baseiam-se
unicamente em observaes de casos de doena
espontnea ou de infeco primria experimental por
via oral (em bovinos) e no incluem dados relativos a
modelos que utilizem estirpes dos agentes das TSE que
foram adaptadas a animais de experincia, visto que os
fentipos das estirpes passadas podem diferir de modo
significativo e imprevisvel dos fentipos implicados na
doena espontnea. Uma vez que se comprovou que a
deteco imuno-histoqumica e/ou atravs do western
blot da protena do hospedeiro anormalmente configurada
(PrPSc) um marcador de infecciosidade, os resultados do
teste da PrPSc foram apresentados paralelamente aos dados
do bioensaio. Os tecidos so agrupados em trs grandes
categorias de infecciosidade, independentemente da fase
da doena:
Categoria A Tecidos com elevada infecciosidade
Tecidos do sistema nervoso central (SNC), com
um elevado grau de infecciosidade nas ltimas
fases de todas as TSE, bem como certos tecidos
anatomicamente ligados ao SNC
Categoria B Tecidos com baixa infecciosidade
Tecidos perifricos com resultados positivos de
infecciosidade e/ou PrPSc em pelo menos uma das TSE
Categoria C Tecidos sem infecciosidade detectvel
Tecidos cuja infecciosidade foi analisada sem que
tenha sido detectada infecciosidade e/ou PrPSc
(resultados negativos)
(9) Parecer cientifico do CCD relativo aos efectivos (fechados) de bovinos com
risco insignificante de BSE. Adoptado na sua reunio de 22-23 de Julho de
1999.
(10) Se houver que recorrer a espcies animais relevantes em termos das
TSE, dever-se- ponderar a utilizao das matrias da categoria de risco mais
reduzido.
(11) Os quadros de classificao dos tecidos baseiam-se nas directrizes mais
recentes da OMS sobre as encefalopatias espongiformes transmissveis e os
produtos biolgicos e os medicamentos (Fevereiro de 2003).
WHO/BCT/QSD/03.01.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
Os tecidos da categoria A e as substncias deles derivados no
devem ser utilizados no fabrico de medicamentos, a menos
que tal se justifique (ver seco 5).
Embora a categoria dos tecidos de baixo risco (tecidos da
categoria B) quase seguramente abranja alguns (como o
sangue) que envolvem um risco inferior a outros (como
os tecidos linfo-reticulares), os dados sobre o grau de
infecciosidade so insuficientes para que se possa subdividir
esta categoria em vrios graus de risco. igualmente
evidente que a incluso de um dado tecido numa categoria
pode depender da doena e da espcie em causa e estar
sujeito a reviso, medida que surjam novos dados.
No que respeita avaliao do risco (ver seco 4), os
fabricantes e/ou os titulares ou requerentes da autorizao
de introduo no mercado devem atender aos quadros de
classificao dos tecidos constantes do Anexo ao presente
captulo(12).
As categorias constantes dos quadros so meramente
indicativas, sendo importante sublinhar os seguintes aspectos.
Em determinadas situaes, pode ocorrer a contaminao
cruzada de tecidos com vrias categorias de infecciosidade.
O risco potencial influenciado pelas circunstncias
em que os tecidos foram obtidos, em especial caso haja
contacto de tecidos com menor infecciosidade ou sem
infecciosidade detectvel (tecidos das categorias B e C) com
tecidos de elevada infecciosidade (tecidos da categoria
A) Assim, a contaminao cruzada de alguns tecidos
pode ser maior se os animais infectados forem abatidos
por atordoamento cerebral com penetrao, ou se o
crebro e/ou a medula espinal forem serrados. O risco de
contaminao cruzada ser menor se os fluidos corporais
forem recolhidos com danos tecidulares mnimos, se os
componentes celulares forem retirados e se o sangue
fetal for recolhido sem ser contaminado por outros
tecidos maternos ou fetais, incluindo a placenta e os
fluidos amniticos e alantides. Em relao a certos
tecidos, muito dificil, ou at mesmo impossvel, evitar a
contaminao cruzada com tecidos da categoria A (como o
crnio). A avaliao de risco deve atender a este facto.
Em relao a certas classes de substncias, as tcnicas de
atordoamento/abate utilizadas, podem ser importantes
para minimizar o risco potencial(13), dada a probabilidade
da disseminao de partculas cerebrais para os rgos
perifricos, designadamente para os pulmes. Tais
tcnicas, bem como os procedimentos de remoo de
tecidos com elevada infecciosidade, devem ser descritos.
Os procedimentos de recolha de tecidos/rgos animais a
utilizar e as medidas aplicadas para evitar a contaminlo
cruzada com matrias de risco mais elevado devem tambm
ser pormenorizadamente expostos.
O risco de contaminao de tecidos e rgos por matrias
do sistema nervoso com possvel infecciosidade BSE em
virtude do mtodo de atordoamento utilizado no abate de
bovinos depende dos seguintes factores:
(12) A introduo do sistema de classificao de tecidos em 3 categorias no
afecta as avaliaes de risco respeitantes aos medicamentos autorizados,
baseadas na classificao de tecidos em 4 categorias anteriormente utilizada.
(13) Parecer do CCD sobre mtodos de atordoamento e risco de BSE (Risco de
disseminao de partculas cerebrais para o sangue e a carcaa quando so
utilizados determinados mtodos de atordoamento), adoptado na sua reunio
de 10-11 de Fevereiro de 2002.
http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/out245_en.pdf
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
quantidade de infecciosidade BSE existente no crebro do
animal abatido,
grau de leso cerebral,
disseminao de partculas cerebrais no corpo do animal.
Deve atender-se a estes factores em conjunto com a
classificao RGB dos animais de origem, idade dos animais
(no que respeita aos bovinos) e aos resultados dos testes post
mortem dos bovinos que envolvam mtodos validados.
Os princpios subjacentes acima expostos poderiam ser
igualmente aplicveis aos ovinos e aos caprinos.
O risco de contaminao cruzada depender de vrios
factores complementares, designadamente:
das medidas adoptadas para evitar a contaminao durante
a recolha de tecidos (ver supra);
5. Textos gerais
do grau de contaminao (quantidade de tecido
contaminante);
da quantidade e tipos de matrias recolhidos
simultaneamente.
Os fabricantes ou os titulares/requerentes de autorizaes
de introduo no mercado devem atender ao risco de
contaminao cruzada.
3-4. IDADE DOS ANIMAIS
Uma vez que a infecciosidade das TSE aumenta
cumulativamente nos bovinos durante um perodo de
incubao de vrios anos, prudente utilizar matrias
provenientes de animais jovens.
3-5. PROCESSO DE FABRICO
A avaliao da reduo global do risco de TSE ligado a um
medicamento deve atender s medidas de controlo institudas
em relao aos seguintes pontos:
origem das matrias-primas/produtos de base
processo de fabrico.
A origem controlada urn critrio muito importante para
que se alcance uma segurana aceitvel do produto, em
virtude da resistncia comprovada dos agentes das TSE
maioria dos processos de inactivao.
Devem existir sistemas de garantia da qualidade, como a
certificao ISO 9000, a anlise dos riscos e identificao dos
pontos crticos de controlo (HACCP)(14) ou as BPF, para o
controlo do processo de produo e a delimitao dos lotes
(isto , a definio de lote, a separao dos lotes e a limpeza
entre lotes). Devem existir procedimentos que assegurem a
traabilidade, bem como a auditoria interna e auditoria aos
fornecedores de matrias-primas.
Alguns processos de produo, como os processos utilizados
no fabrico do sebo e dos seus derivados (ver seco 6), podem
contribuir muito para a reduo do risco de contaminao com
TSE. Uma vez que processamentos to rigorosos no podem ser
aplicados a uma grande quantidade de produtos, provvel que
processos que envolvam a remoo fisica, como a precipitao e
(14)HACCP - Hazard Analysis Critical Control Points (anlise do risco e pontos
de controlo crticos).
691
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
a filtrao para remoo de matrias ricas em pries, sejam mais
adequados do que tratamentos qumicos. Deve ser apresentada
uma descrio do processo de fabrico, nomeadamente dos
controlos aplicados durante o processamento, e h que expor
as medidas que podero contribuir para reduzir ou suprimir a
contaminao com agentes das TSE. Caso haja vrios locais de
fabrico, preciso identificar claramente os passos efectuados em
cada stio. Devem ser descritas as medidas aplicadas para assegurar
a traabilidade de cada lote de produo at aos produtos de base.
Processo de limpeza - Pode ser dificil validar a limpeza
do equipamento utilizado no que respeita eliminao
dos agentes das TSE. Foi referido que, aps a exposio a
preparaes com um ttulo muito elevado de agentes das
TSE, a infecciosidade detectvel pode permanecer associada
superficie de ao inoxidvel. A remoo de todas as
protenas adsorvidas atravs da utilizao de desinfectantes
que libertem hidrxido de sdio ou cloro (p ex., 20 000 ppm
5. Textos gerais
de cloro durante 1 hora) foi considerada uma abordagem
aceitvel caso dos equipamentos no substituveis expostos
a material possivelmente contaminado. Caso se utilizem
matrias da categoria A no fabrico de um produto, deve ser
usado equipamento dedicado, a no ser que devidamente
justificado.
Caso se utilizem matrias de risco no fabrico de um produto,
deve aplicar-se processos de limpeza, incluindo medidas de
controlo, para minimizar o risco de contaminao cruzada entre
lotes de produo. Tais processos so especialmente importantes
se, na mesma instalao, forem manuseadas matrias de vrias
categorias de risco utilizando o mesmo equipamento.
Validao da remoo/inactivao - Os estudos de validao
dos processos de remoo/inactivao dos agentes das
TSE so dificeis de interpretar, pois necessrio atender
natureza do produto intencionalmente contaminado e
sua relevncia para a situao real, concepo do estudo
(incluindo a reduo de escala dos processos) e ao mtodo
de deteco do agente (teste in vitro ou in vivo). So
necessrios estudos complementares para compreender
qual a metodologia de preparao 1 intencionalmente
contaminada mais adequada para os estudos de validao.
Por esse motivo, de um modo geral, estes estudos de
validao no so actualmente exigidos. No entanto, se se
alegar a segurana de um produto em relao s TSE com
base na capacidade de remoo ou inactivao dos agentes
das TSE do processo de fabrico, tais alegaes devem ser
comprovadas atravs de estudos de validao adequados.
Os fabricantes, para alm de deverem recorrer a fontes
adequadas, devem ser incentivados a prosseguir a
investigao de mtodos de remoo e inactivao, para
identificarem passos/procedimentos que possam assegurar a
remoo ou inactivao dos agentes das TSE. Em todo o caso,
a concepo de um processo de produo deve ter em conta,
sempre que possvel, as informaes disponveis sobre os
mtodos que presumivelmente possam inactivar ou remover
estes agentes.
4. AVALIAO DE RISCO DAS MATRIAS OU
SUBSTNCIAS UTILIZADAS NO FABRICO E
PREPARAO DE UM MEDICAMENTO NO MBITO DA
CONFORMIDADE REGULAMENTAR
A avaliao do risco associado s TSE requer uma ateno
escrupulosa a todos os parmetros expostos na seco 3-1
Princpios cientficos de minimizao do risco.
692
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
Como foi referido na introduo ao presente captulo, a
conformidade regulamentar baseia-se nos resultados favorveis
da avaliao de risco A avaliao de risco efectuada pelo
fabricante e/ou pelo titular ou requerente da autorizao de
introduo no mercado em relao a cada uma das matrias
ou substncias provenientes de espcies animais relevantes
em termos das TSE utilizadas no fabrico do medicamento,
deve demonstrar que foram tomados em considerao todos
os factores de risco das TSE e, sempre que possvel, que
o risco foi minimizado graas aplicao dos princpios
descritos no presente captulo. Os certificados de conformidade
TSE emitidos pela EDQM podem ser utilizados como base
da avaliao de risco pelos titulares ou requerentes de
autorizaes de introduo no mercado.
A avaliao de risco global do medicamento, efectuada pelos
titulares ou requerentes de autorizaes de introduo no
mercado, deve atender s avaliaes de risco de todas as
matrias provenientes de espcies animais relevantes em
termos das TSE e, se adequado, reduo ou inactivao dos
agentes das TSE nas etapas de fabrico da substncia activa e/
/ou do produto acabado.
A determinao final da conformidade regulamentar incumbe
Autoridade competente. Os fabricantes e/ou titulares ou
requerentes das autorizaes de introduo no mercado
de medicamentos para uso humano e para uso veterinrio
devem seleccionar e justificar as medidas de controlo em
relao a um dado produto derivado de uma espcie animal
relevante em termos das TSE, atendendo ao estado da
cincia e da tecnologia.
5. AVALIAO DA RELAO RISCO/BENEFCIO
A aceitabilidade de um dado medicamento que contenha
matrias provenientes de espcies animais relevantes em
termos das TSE, para alm dos parmetros referidos nas
seces 3 e 4, deve atender aos seguintes factores:
via de administrao do medicamento;
quantidade de matrias animais utilizadas no medicamento;
dose teraputica mxima (dose diria e durao do
tratamento);
utilizao prevista do medicamento e suas vantagens clnicas
Os tecidos com elevada infecciosidade (categoria A) e
as substncias deles derivadas no devem, portanto, ser
utilizados no fabrico de medicamentos, nem das respectivas
matrias-primas e produtos intermedirios (incluindo
substncias activas, excipientes e reagentes), excepto em casos
devidamente justificados. Nestes casos devem ser apresentados
os motivos pelos quais no podem ser utilizadas quaisquer
outras matrias. Em tais circunstncias excepcionais e
fundamentadas, pode ser previsto o recurso a tecidos com
elevada infecciosidade no fabrico de substncias activas se,
aps a execuo da avaliao de risco tal como descrito na
seco 4 do presente captulo e tendo em conta a indicao
clnica prevista, o requerente da autorizao de introduo no
mercado puder apresentar uma avaliao positiva da relao
risco/benefcio. As substncias provenientes de matrias
da categoria A, caso a sua utilizao se justifique, devem ser
produzidas a partir de animais originrios de pases com RGB I.
6. CONSIDERAES ESPECIFCAS
As matrias que se seguem, preparadas a partir de espcies
animais relevantes em termos das TSE, so consideradas em
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
conformidade com o presente captulo desde que observem,
no mnimo, as condies que se seguem. Os requerentes/
/titulares das autorizaes de introduo no mercado devem
apresentar as informaes relevantes e o certificado de
conformidade concedido pela EDQM.
6-1. COLAGNIO
O colagnio uma protena fibrosa e um dos componentes do
tecido conjuntivo dos mamferos.
A documentao que comprova a conformidade do colagnio
com o presente captulo deve ser apresentada tendo em conta
as medidas enumeradas nas seces 3 a 5. Alm disso, h que
atender ao seguinte:
em relao ao colagnio obtido a partir do osso, aplicam-se as
condies especificadas para a gelatina (ver adiante).
o colagnio obtido a partir de tecidos, como os couros e
peles, no envolve geralmente um risco mensurvel de TSE
desde que, na sua extraco, seja evitada a contaminao
com matrias potencialmente infectadas, como o sangue
e/ou tecidos do sistema nervoso central.
6-2. GELATINA
A gelatina uma protena solvel natural, gelificante ou no,
obtida por hidrlise parcial do colagnio proveniente dos
ossos, couros e peles, tendes e msculos de animais.
Deve ser apresentada a documentao que comprova a
conformidade da gelatina com o presente captulo tendo em
conta as medidas enumeradas nas seces 3 a 5. Alm disso,
h que atender ao seguinte.
Matria-prima utilizada
A gelatina utilizada nos medicamentos pode ser fabricada a
partir do osso ou do couro.
Couro como matria-prima. Em termos dos conhecimentos
actuais, o couro utilizado para a produo de gelatina
constitui uma matria-prima muito mais segura do que
o osso. No entanto, recomenda-se vivamente que sejam
aplicadas medidas para evitar a contaminao cruzada com
matrias potencialmente infectadas durante a extraco.
Osso como matria-prima. Se for utilizado o osso para
fabricar a gelatina, h que aplicar condies de produo
mais rigorosas (ver adiante). Em todo o caso, considera-se
que a primeira medida de precauo, que afecta em grande
medida a segurana do produto, a remoo do crnio e da
medula espinal da matria-prima. Na medida do possvel,
o osso deve provir de pases com RGB I e II O que provm
de pases com RGB III pode ser utilizado se a gelatina for
fabricada nas condies especificas adiante descritas e se se
proceder remoo das vrtebras dos bovinos com idade
superior a 12 meses(15).
(15) Salvojustificao em contrrio, aplica-se o Regulamento (CE) n.
1774/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho, que estabelece
regras sanitrias relativas aos subprodutos animais no destinados ao
consumo humano. No que respeita ao fabrico de gelatina e colagnio
ou importao das suas matrias-primas com vista sua utilizao em
medicamentos, apenas devem ser utilizadas matrias provenientes de
animais adequados para consumo humano. Continua a ser autorizada a
utilizao das vrtebras de tais animais originrios de pases da categoria II
que foram considerados seguros na sequncia da avaliao de risco.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
Mtodos de fabrico
No h medidas especficas em relao s condies de
processamento exigidas em relao gelatina produzida a
partir do couro, desde que sejam aplicadas medidas de controlo
para evitar a contaminao cruzada quer durante a extraco a
partir do couro, quer durante o processo de fabrico.
No entanto, se o osso for utilizado como matria-prima, h
que atender ao modo de fabrico.
O osso (incluindo as vrtebras) destinado produo de
gelatina em que se recorra ao tratamento cido apenas deve
provir de pases com RGB I ou II. Um tratamento alcalino
adicional (pH 13 durante 1 hora) do osso ou da ossena
poder aumentar ainda mais a segurana em relao s TSE
da gelatina derivada do osso por tratamento cido.
Ao osso proveniente de pases da categoria RGB III deve ser
aplicado um tratamento alcalino. No entanto, este mtodo
5. Textos gerais
de fabrico facultativo no que respeita ao osso originrio de
pases das categorias RGB I e II.
Num processo tpico de fabrico alcalino, o osso
finamente triturado, desengordurado com gua quente e
desmineralizado com cido clordrico diludo (com uma
concentrao no inferior a 4 por cento e a pH inferior a
1,5) durante um perodo de, pelo menos, 2 dias, a fim de
produzir ossena Segue-se um tratamento alcalino com uma
soluo saturada de cal (pH de 12,5, pelo menos) durante um
perodo de, no mnimo, 20 dias. A gelatina extrada, lavada,
filtrada e concentrada. Procede-se a uma fase de tratamento
trmico instantneo (esterilizao) a 138-140 C durante
4 s. A gelatina proveniente do couro bovino tambm pode
ser produzida atravs do processo alcalino. O osso bovino
pode igualmente ser tratado atravs de um processo cido.
A etapa do tratamento pela cal ento substituda pelo
pr-tratamento cido, em que a ossena embebida numa
soluo com pH inferior a 4, durante a noite.
6-3. DERIVADOS DO SANGUE BOVINO
O soro fetal de bovino frequentemente utilizado em culturas
de clulas. O soro fetal de bovino deve ser obtido a partir de
fetos colhidos em matadouros em vacas saudveis e adequadas
para o consumo humano. O tero deve ser completamente
removido e o sangue fetal deve ser colhido num espao ou
local destinado a esse efeito por puno cardaca para um
sistema fechado de colheita, em condies de assepsia.
O soro de vitelo recm-nascido obtido a partir de vitelos com
menos de 20 dias de vida e o soro de vitelo a partir de animais
com idade inferior a 12 meses. No que respeita ao soro bovino
de dadores, visto poder derivar de animais com idade inferior
a 36 meses, deve ser bem definida e documentada a situao
em matria de TSE do efectivo dador. O soro deve ser sempre
recolhido de acordo com protocolos especificados pelo pessoal
formado em relao a estes procedimentos, a fim de evitar a
contaminao cruzada com tecidos de risco mais elevado.
No que respeita aos derivados do sangue de bovino,
necessrio apresentar a documentao comprovativa da
observncia do presente captulo, tendo em conta as medidas
enumeradas nas seces 3 a 5. Alm disso, devem ser
igualmente tomados em considerao os seguintes aspectos:
Traabilidade
H que assegurar a traabilidade at ao matadouro de cada lote
de soro ou plasma. Os matadouros devem dispor de listas de
693
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
exploraes de onde os animais provm. Se o soro for obtido a
partir de animais vivos, devem existir registos de cada lote de
soro que assegurem a traabilidade at s exploraes.
Origem geogrfica
Embora a infecciosidade da BSE nos bovinos seja mais
limitada do que sucede com o tremor epizotico, como
medida de precauo o sangue de bovino deve ser originrio
de pases com RGB I ou II, salvo justificao em contrrio.
Mtodos de atordoamento
Se for obtido a partir de animais abatidos, o mtodo de abate
importante para garantir a segurana do material. Foi
comprovado que o atordoamento atravs de pistola de dardo
perfurante, com ou sem mielotomia, bem como atravs de
pistola pneumtica, especialmente se houver injeco de
5. Textos gerais
ar, pode destruir o crebro e disseminar tecido cerebral no
sangue O risco pode ser considerado insignificante caso se
recorra a um mtodo de atordoamento no-penetrante ou
electronarcose(16). No que respeita ao processo de recolha de
sangue de bovino h, portanto, que descrever os mtodos de
atordoamento. Se forem autorizadas matrias originrias de
pases em que foram detectados casos de BSE (com RGB III),
deve ser utilizado no abate um mtodo de atordoamento no
penetrante.
6-4. DERIVADOS DO SEBO
O sebo a gordura obtida a partir de tecidos como os das
zonas subcutneas, abdominais e intermusculares e o osso.
O sebo utilizado como matria-prima para o fabrico dos
seus derivados deve provir de matrias da categoria 3 ou
equivalente, tal como definidas no Regulamento (CE)
n 1774/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho, de
3 de Outubro de 2002, que estabelece regras sanitrias
relativas aos subprodutos animais no destinados ao
consumo humano(17).
Cr-se ser improvvel que produtos derivados do sebo, como
a glicerina e os cidos gordos, fabricados atravs de processos
rigorosos, possam ser infecciosos. Estes produtos foram
objecto de anlises especficas do CEF e do CMV. Por este
motivo, estas matrias, desde que fabricadas em condies
pelo menos to rigorosas como as adiante indicadas, sero
consideradas em conformidade com o presente captulo,
independentemente da sua origem geogrfica e da natureza
dos tecidos de que os derivados do sebo provm. So exemplo
de processo rigorosos:
a transesterificao ou hidrlise a uma temperatura no
inferior a 200 C, durante pelo menos 20 minutos, sob
presso (produo de glicerina, cidos gordos e steres de
cidos gordos),
a saponificao com NaOH 12 M (produo de glicerina e de
sabo),
processo por lote: a uma temperatura no inferior a 95 C,
durante, pelo menos, 3 horas,
(16)
Parecer do CCD sobre mtodos de atordoamento e risco de BSE
(Risco de disseminao de partculas cerebrais para o sangue e a carcaa
quando so utilizados determinados mtodos de atordoamento), adoptado
na sua reunio de 10-11 de Janeiro de 2002. http://europa.eu.int/comm/
food/fs/sc/ssc/out245_en.pdf
(17) JO L 273, 10.10.2002, p.1.
694
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
processo em contnuo: a uma temperatura no inferior a
140C, sob presso, durante pelo menos 8 minutos, ou
equivalente,
destilao a 200C.
improvvel que os derivados do sebo fabricados de acordo
com estas condies constituam qualquer espcie de risco de
TSE, pelo que devem ser considerados em conformidade com
o presente capitulo.
Deve comprovar-se a conformidade com o presente captulo
dos derivados do sebo produzidos noutras condies.
6-5. CARVO ANIMAL
O carvo animal preparado atravs da carbonizao de
tecidos animais (como o osso) a temperaturas elevadas,
superiores a 800 C. Salvo justificao em contrrio, a
matria-prima para o fabrico de carvo animal devem ser
matrias da categoria 3 ou equivalente, tal como definidas
no Regulamento (CE) n 1774/2002 do Parlamento Europeu
e do Conselho, de 3 de Outubro de 2002, que estabelece
regras sanitrias relativas aos subprodutos animais no
destinados ao consumo humano. Independentemente da
origem geogrfica e da natureza do tecido, para efeitos
de conformidade regulamentar, o carvo animal deve ser
considerado em conformidade com o presente captulo.
E improvvel que o carvo fabricado de acordo com estas
condies constitua qualquer espcie de risco de TSE, pelo
que deve ser considerado em conformidade com o presente
captulo. H que comprovar a conformidade com o presente
captulo do carvo produzido noutras condies.
6-6. LEITE E DERIVADOS DO LEITE
luz dos actuais conhecimentos cientficos, e
independentemente da sua origem geogrfica, pouco
provvel que o leite constitua qualquer espcie de risco de
contaminaco com as TSE.
Algumas matrias, como a lactose, so extradas do soro
lcteo, o lquido proveniente da coagulao na produo
de queijo. A coagulao tambm envolve a utilizao de
coalheira de vitelo, um extracto do abomaso, ou de coalheira
derivada de outros ruminantes. O CEF/CMV procedeu a uma
anlise de risco da lactose e de outros derivados do soro
lcteo produzidos a partir da coalheira de vitelo e concluiu
que o risco de TSE insignificante se ela for produzida de
acordo com o processo descrito no relatrio de avaliao do
risco(18). Esta concluso foi avalizada pelo Comit Cientfico
Director(19), que tambm procedeu a uma avaliao geral do
risco TSE da coalheira(20).
(18) O Comit das Especialidades Farmacuticas e o respectivo Grupo de
Trabalho Biotecnologia procederam a uma avaliao regulamentar e do
risco da lactose preparada utilizando a coalheira de vitelo. Esta avaliao de
risco abrangeu a origem dos animals, a exciso do abomaso e a existncia de
procedimentos bem definidos de garantia da qualidade. particularmente
importante a qualidade dos eventuais substitutos do leite utilizados na
alimentao dos animais de que os abomasos provm. Estas orientaes
encontram-se acessveis no seguinte endereo: http://iwww.emea.eu.int
(19) Declarao provisria sobre a segurana da coalheira de vitelo no fabrico
da lactose. Adoptada na reunio de 4-5 de Abril de 2002 do Comit Cientifico
Director, (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/out255_en.pdf).
(20) O CCD emitiu um parecer sobre a segurana da coalheira animal no que
respeita ao risco de EET veterinrias e, em especial, de BSE, na sua reunio de
16 de Maio de 2002. (http://europa.eu.int//comm/food/fs/sc/ssc/out265_en.pdf).
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais
improvvel que os derivados do leite fabricados de acordo
com condies que se seguem constituam qualquer espcie
de risco de TSE, pelo que devem ser considerados em
conformidade com o presente captulo.
leite que provenha de animais saudveis e nas mesmas
condies que o leite destinado ao consumo humano;
no utilizao de outras matrias de ruminantes, excepto a
coalheira de vitelo, na preparao de tais derivados
(ex.: tratamento da casena por enzimas pancreticas).
Deve comprovar-se a conformidade com o presente captulo
dos derivados do leite produzidos atravs de outros processos
e da coalheira derivada de outras espcies de ruminantes.
6-7. DERIVADOS DA L
Os derivados da l e do plo de ruminantes, como a lanolina
e os lcoois de l derivados do plo, devem ser considerados
em conformidade com o presente captulo se a l e o plo
provierem de animais vivos.
improvvel que os derivados da l produzidos a partir de
l proveniente de animais abatidos declarados adequados
para consumo humano e cujo processo de fabrico, no
que respeita ao pH, temperatura e durao do tratamento,
observe pelo menos uma das condies exigidas de
processamento que se seguem constituam qualquer espcie
de risco de TSE, pelo que devem ser considerados em
conformidade corn o presente captulo.
Tratamento a pH 13 (inicial; correspondente a uma
concentrao mnima de NaOH 0,1 M) e a uma temperatura
60C durante, pelo menos, 1 hora, o que sucede
normalmente durante a fase de refluxo do tratamento
alcalino orgnico;
destilao molecular a uma temperatura 220C e a presso
reduzida. Deve comprovar-se a conformidade com o presente
captulo dos derivados da l produzidos noutras condies.
6-8. AMINOCIDOS
Os aminocidos podem ser obtidos por hidrlise de materiais
provenientes de vrias fontes.
Salvo justificao em contrrio, a matria-prima utilizada no
fabrico de aminocidos deve provir de matrias da categoria
3 ou equivalente, tal como definidas no Regulamento (CE)
n 1774/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 3 de
Outubro de 2002, que estabelece regras sanitrias relativas aos
subprodutos animais no destinados ao consumo humano.
improvvel que os aminocidos preparados nas
condies de processamento que se seguem, bem como em
conformidade com a Deciso 98/256/CE da Comisso(21) e
com a Deciso 2001/376/CE da Comisso(22), constituam
qualquer espcie de risco de TSE, pelo que devem ser
considerados em conformidade com o presente captulo.
(21) JO L 113 de 15.04.1998. p.32.
(22) JO L 132 de 15.05.2001, p. 17.
(23) No corpo do texto do presente captulo, a isoforma anormal da
protena do prio designada PrPSc. No entanto, uma vez que estes
quadros so reproduzidos directamente a partir da directriz da OMS
supracitada, foi mantida a nomenclatura da OMS em relao protena
do prio anormal (PrPTSE).
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
Aminocidos produzidos a partir de couros e peles atravs
de um processo que envolva a exposio das matrias a
um pH de 1 a 2, seguida do tratamento a um pH > 11, e,
aps isso, de um tratamento trmico a 140 C durante 30
minutos a 3 bares;
os aminocidos ou pptidos resultantes devem ser filtrados
aps a produo;
efectuar-se uma anlise, utilizando um mtodo validado e
sensvel, para verificar a ausncia de eventuais macromolculas
residuais intactas, sendo fixado um limite adequado.
necessrio comprovar a conformidade com o presente
captulo dos aminocidos produzidos noutras condies.
ANEXO: PRINCIPAIS CATEGORIAS DE INFECCIOSIDADE
5. Textos gerais
Os quadros que se seguem constituem uma adaptao
dos publicados na WHO Guideline on Transmissible
Spongiform Encephalopathies in Relation to Biological and
Pharmaceutical Products (Nota Explicativa da OMS sobre
as encefalopatias espongiformes transmissveis relativa aos
produtos biolgicos e farmacuticos), de Fevereiro de 2003.
Abreviaturas utilizadas:
+ = Existncia de infecciosidade ou da PrPTSE (23)
- = Inexistncia de infecciosidade ou de PrPTSE detectvel
NT = No testado(a)(s)
? = Resultados controversos ou incertos
Categoria A: tecidos com elevada infecciosidade
Tecidos Bovinos Ovinos e caprinos
BSE Tremor epizotico
Infecciosidade1 PrPTSE Infecciosidade1 PrPTSE
Crebro + + + +
Medula espinal + + + +
Retina, nervo ptico + NT NT +
Gnglios espinais + NT NT +
Gnglio do trigmeo + NT NT +
Hipfise2 - NT + NT
Dura-mter2 NT NT NT NT
1. Foram efectuados bioensaios de inlecciosidade de tecidos de bovinos quer
em bovinos, quer no murganho (ou em ambas as espcies); a maior parte dos
bioensaios de tecidos de ovinos e/ou caprinos apenas foram efectuados no
murganho. Em relao aos ovinos e caprinos, nem todos os resultados foram
consistentes em ambas as espcies.
2. No foram notificados dados experimentais sobre a infccciosidade da
hipfise ou da dura-meter humanas, embora os enxertos de dura-mter
de cadver e a hormona do crescimento derivada das hipfises de cadver
tenham transmitido doena a inmeros pacientes e devam, portanto, ser
includas na categoria dos tecidos com elevada infecciosidade.
695
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Categoria B: tecidos com menor infecciosidade

Tecidos Bovinos Ovinos e caprinos
BSE Tremor epizotico
Infecciosidade PrPTSE Infecciosidade PrPTSE
Sistema nervoso perifrico
Nervos perifricos - NT + NT
Plexos entricos1 NT + NT +
Tecidos info-reticulares
Bao - - + +
Gnglios linfticos - - + +
Amgdalas + NT + +
Membrana nictitante NT - NT +
Timo - NT + NT
Tubo digestivo
5. Textos gerais

Esfago - NT NT +
Pr-estmago2 (apenas ruminantes) - NT NT +
Estmago/abomaso2 - NT NT +
Duodeno - NT NT +
Jejuno - NT NT +
leo3 + + + +
Intestino grosso + NT + +
Tecidos reprodutivos
Placenta - NT + +
Outros tecidos
Pulmo* - NT - NT
Fgado - NT + NT
Rim* - - - -
Glndula supra-renal NT NT + NT
Pncreas - NT + NT
Medula ssea + NT + NT
Vasos sanguneos - NT NT +
Mucosa olfactiva - NT + NT
Tecido gengival* NT NT NT NT
Glndula salivar - NT + NT
Crnea4* NT NT NT NT
Fluidos corporais
Lquido cerebrospinal - NT + NT
Sangue 5 - NT + -

1. Limitado ao leo distal nos bovinos.

2.O pr-estmago dos ruminantes (retculo, rmen e omaso) largamente consumido, tal como sucede com o estmago verdadeiro (abomaso). O abomaso dos
bovinos (e, por vezes, dos ovinos) tambm uma fonte de coalheira.
3. Nos bovinos e ovinos, s se procedeu ao bioensaio de infecciosidade do leo distal.
4.Visto que s um ou dois casos de DCJ foram plausivelmente atribudos a transplantes da crnea em centenas de milhares de procedimentos, a cmea
classificada como um tecido com menor infecciosidade; outros tecidos da cmara anterior (cristalino, humor aquoso, ris e conjuntiva) foram testados, com
resultados negativos em relao quer vDCJ, quer a outras TSE humanas e no h dados epidemiolgicos que comprovem estarem associados transmisso
iatrognica de doena.
5.No foram confirmadas as primeiras notificaes da transmisso da doena a roedores a partir do sangue de doentes com DCJ e a avaliao do conjunto dos
dados experimentais e epidemiolgicos relevantes para a transmisso de TSE atravs do sangue, de componentes do sangue e de produtos plasmticos para fins
teraputicos no sugere a transmisso de nenhum tipo de TSE clssica atravs do sangue dos doentes. No h dados suficientes que permitam formular a
mesma afirmao em relao ao sangue de doentes com a vDCJ. No h infecciosidade detectvel no sangue fetal de vitelo, embora em ovinos genotipicamente
sensveis com tremor epizotico natural ou com BSE induzida experimentalmente a transfuso de grandes volumes de sangue tenha resultado na transmisso
da doena a ovinos saudveis. Foi igualmente demonstrada a infecciosidade em estudos de estirpes de TSE adaptadas aos roedores.
*Estes tecidos foram classificados na categoria B-Tecidos com menor infecciosidade, visto ter sido comprovada infecciosidade e/ou PrPTSE no contexto da DCJ
humana (vDCJ ou outra).

696 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Categoria C: tecidos sem infecciosidade detectvel

Tecidos Bovinos Ovinos e caprinos
BSE Tremor epizotico
Infecciosidade PrPTSE Infecciosidade PrPTSE
Tecidos reprodutivos
Testculo - NT - NT
Prstata/Epiddimo/
/Vesicula seminal - NT - NT
Smen - NT NT NT
Ovrio - NT - NT
tero (no-grvido) - NT - NT
Fluidos placentares - NT NT NT
Feto1 - NT - NT
Embries1 - NT ? NT

5. Textos gerais
Tecidos
msculo-esquelticos
Osso - NT NT NT
Msculo esqueltico2 - NT - NT
Lngua - NT NT NT
Corao/pericrdio - NT - NT
Tendo - NT NT NT
Outros tecidos
Traqueia - NT NT NT
Pele - NT - NT
Tecido adiposo - NT NT NT
Glndula tiride NT NT - NT
Glndula mamria/bere - NT - NT
Fluidos, secrees e
excrees corporais
Leite3 - NT - NT
Colostro4 NT NT - NT
Sangue do cordo4 - NT NT NT
Saliva NT NT - NT
Suor NT NT NT NT
Lgrimas NT NT NT NT
Muco nasal NT NT NT NT
Urina 4, 5 - NT NT NT

Fezes - NT - NT

1.Os embries de bovinos afectados pela BSE no transmitiram a doena aos murganhos, embora se no tenham efectuado medies da infecciosidade em
tecidos fetais de vitelos para alm do sangue (bioensaio negativo no murganho). Os vitelos descendentes de vacas que receberam embries de bovinos afectados
pela BSE sobreviveram durante perodos de observao de at sete anos e o exame dos crebros quer das vacas no afectadas, quer dos respectivos vitelos no
revelaram encefalopatia espongiforme, nem a existncia dc PrPTSE.
2.A inoculao intracerebral de msculo homogeneizado no transmitiu a doena a: 1) primatas, a partir de doentes com a DCJ: 2) murganhos e bovinos, a
partir de bovinos com a BSE; 3) murganhos, a partir de ovinos e caprinos com tremor epizotico espontneo ou induzido experimentalmente. No entanto,
notificaes prvias haviam descrito casos isolados de transmisso a partir do msculo de caprinos e de cobaias e uma notificao mais recente descreve a
transmisso a partir do msculo de murganhos de tipo selvagem e transgnico, no entanto, tendo em conta que estes estudos foram efectuados com estirpes de
agentes das TSE que sofreram vrias passagens, a sua relevncia em termos da ocorrncia espontnea da doena permanea por esclarecer. Um caso humano
recente descreve um doente com DCJ e miosite de corpos de incluso, que apresentava uma quantidade abundante de PrPTSE no msculo doente. Aps anlise
aprofundada, o Comit decidiu, no entanto, manter o msculo na categoria de tecidos sem inlecciosidade detectvel enquanto se aguardam mais informaes
sobre a infeco espontnea e sem complicaces
3. Os dados comprovativos de que a infecciosidade no detectvel no leite incluem observaes epidemiolgicas temporo-espaciais que no permitiram detectar

transmisso materna; observaes clnicas de mais de uma centena de vitelos amamentados por vacas infectadas, os quais no desenvolveram a BSE; observaes
experimentais de que o leite proveniente de vacas infectadas no transmitiu a doena quando foi administrado a murganhos intracerebral ou oralmente. Esto a decorrer
experincias em que grandes volumes de leite proveniente de vacas infectadas experimentalmente so concentrados e testados para detectar a presena de PrPTSE.
4.A notificao de casos isolados de transmisso da infecciosidade da DCJ a partir do sangue do cordo umbilical, do colostro e da urina humanos nunca foi
comprovada e considerada improvvel.
5.Um tipo de PrP nunca antes notificado, denominado PrPu, foi identificado na urina de doentes com a DCJ espordica e familiar, mas continua por esclarecer o
seu significado em termos de risco de transmisso.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 697

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio
5.2.9. AVALIAO DA INOCUIDADE
DE CADA LOTE DE VACINAS E SOROS
PARA USO VETERINRIO
O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a
uma vacina como a um soro.
Definio das reaces anormais. Durante os estudos de
desenvolvimento, o tipo e o tamanho das reaces esperadas
aps administrao do produto so definidas luz dos
estudos de inocuidade. No quadro dos ensaios de inocuidade
efectuados em cada lote, esta definio das reaces locais e
gerais normais ou anormais depois utilizada para se avaliar
as reaces aceitveis e no aceitveis.
Quantidade administrada durante o ensaio. Para um
5. Textos gerais
produto apresentando o ttulo ou a actividade pretendidos
dentro dos limites especificados para os lotes de produo,
o termo dose nos ensaios, designa a dose recomendada.
A quantidade a ser administrada no ensaio geralmente
definida em nmero de doses. No caso de vacinas vivas
liofilizadas, as 10 doses so reconstitudas num volume
apropriado de solvente para o ensaio. No caso de produtos
que se apresentam na forma de 2 recipientes contendo
respectivamente um ou vrios componentes vivos liofilizados
e um ou vrios componentes inactivados a utilizar como
diluente, pode ser necessrio utilizar lquido suplementar
para reconstituir o(s) componente(s) liofilizado(s). Quando
necessrio e justificado, convm injectar num local o
contedo de 2 recipientes do componente inactivado
misturado no contedo de um nmero mximo de
recipientes do componente vivo liofilizado e os restantes
componentes vivos liofilizados reconstitudos num solvente
apropriado podem ser inoculados num local separado. No
caso de vacinas combinadas, os ensaios efectuados na vacina
combinada consideram-se como suficientes para estabelecer
a inocuidade dos componentes individuais.
Via de administrao. O produto administra-se por uma das
vias recomendadas. Em princpio, convm preferencialmente
utilizar a via de administrao mais favorvel para permitir a
deteco de reaces.
Quando se sabe que existe um risco particular, por exemplo
na sequncia dos estudos de desenvolvimento, efectua-se
uma segunda administrao com a dose apropriada aps um
intervalo apropriado como se determinou durante a fase de
desenvolvimento.
Espcies animais e categorias alvo. Salvo excepo
justificada e autorizada, convm utilizar animais com idade
mnima recomendada e da espcie mais sensvel para a
vacinao ou administrao do produto.
Nmero de animais. Nas monografias indica-se o nmero de
animais a utilizar. Regra geral, de 2 para os mamferos e de
10 para as aves e os peixes.
Identificao dos animais. Salvo excepo justificada, todos
os animais so objecto de uma marcao que permita o
registo individual dos dados respeitantes ao perodo total de
observao.
698
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
Perodo de observao. Quando se registam critrios
objectivos como se descreve a seguir, tal como a temperatura
corporal, os animais so examinados e observados durante,
pelo menos, 3 dias antes da administrao do produto.
Aps administrao do produto, os animais so mantidos
em observao e examinados, pelo menos, 1 vez por dia,
durante, no mnimo, 14 dias, para se detectar reaces locais
e gerais. No dia da administrao do produto, necessrio
efectuar, pelo menos, 1 inspeco suplementar aps 4 h, ou
nos intervalos de tempo especificados nas monografias. Nos
casos de segunda administrao do produto, o perodo de
observao termina 14 dias aps a segunda administrao.
Reaces locais e gerais. Os animais que apresentam
reaces locais ou gerais anormais graves so abatidos. Em
todos os animais mortos efectua-se um exame necrpsico
macroscpico. Podem ser indicados exames microscpicos e
microbiolgicos complementares.
Os animais mantidos em observao so examinados com
vista a serem detectadas reaces locais ou gerais.
Quando constituam indicadores de utilidade reconhecida,
so tambm registados outros critrios, por exemplo a
temperatura corporal, a massa corporal, outros ndices de
rendimento e consumo de alimentos.
Reaces locais. Na medida em que for apropriado e possvel,
registam-se o tamanho e a persistncia de qualquer reaco
local (incluindo o aparecimento de reaces dolorosas) e
tambm o nmero de animais que manifestam as reaces
locais.
Reaces gerais. A temperatura e, se apropriado, a massa
corporal so anotados como indicadores gerais dos efeitos
sistmicos da administrao do produto. Todos os sinais
clnicos so igualmente registados.
Temperatura corporal. Nos mamferos, os estudos incluem
a medio da temperatura corporal durante o perodo
de observao. A temperatura corporal registada, pelo
menos, 3 dias antes da administrao do produto, na altura
da administrao e depois, decorridas 4 h e em intervalos
regulares. A temperatura corporal antes da administrao
do produto encontra-se entre os valores fisiolgicos. Pelo
menos nos produtos em que previsvel um aumento
significativo da temperatura (por exemplo, nos produtos que
contm endotoxinas e vrias vacinas vricas vivas) ou nos
quais a monografia correspondente especifica um aumento
da temperatura (por exemplo, no mximo, 2C nas vacinas
contra a actinobacilose do porco), recomenda-se a utilizao
da temperatura mdia dos dias anteriores administrao
do produto (por exemplo, 3 dias ao dia 0) como linha base
de temperatura, para se dispor de um critrio claro para a
avaliao do ensaio.
Massa corporal e consumo de alimento. Quando constitui
um indicador de inocuidade com uma fiabilidade e uma
utilidade reconhecidas, por exemplo nos animais jovens
em fase de crescimento ou nos peixes, a massa corporal
medida e documentada pouco tempo antes da administrao
do produto e durante o perodo de observao. Controla-se
o consumo de alimentos e documenta-se como indicador
do efeito da administrao do produto. Na maior parte dos
casos, suficiente registar a rao diria consumida ou a
que parcial ou totalmente rejeitada, mas, em alguns casos,
pode ser necessrio registar o peso efectivo da alimentao
consumida, quando se trata de um indicador apropriado da
inocuidade do produto.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio
Sinais clnicos. Anotam-se todos os sinais clnicos de
natureza geral, esperados ou no, nomeadamente as
modificaes do estado de sade e as alteraes de
comportamento.
Fichas de avaliao. Em funo dos sinais esperados,
preparam-se as fichas de avaliao para cada produto. Todos
os parmetros e todos os dados so registados nestas fichas. As
fichas incluem parmetros gerais mas tambm so adaptadas
a cada tipo de produto e incluem a lista de sinais clnicos que
podem ser mais marcantes para um dado produto.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
Critrios para a repetio do ensaio. Se surge um sinal
anormal, com base, se necessrio, de um exame necrpsico,
o veterinrio responsvel determina se esse sinal devido ao
produto. Se a causa do sinal clnico no for clara, ou quando
um animal retirado do ensaio por motivos independentes do
produto, o ensaio pode ser repetido. Se, no segundo ensaio,
reaparece o mesmo sinal anormal, o produto no satisfaz
ao ensaio. Regista-se qualquer tratamento administrado aos
animais durante o perodo de observao. Se o tratamento
puder interferir com o ensaio, o ensaio no vlido.
5. Textos gerais
699
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.3. ANLISES
ESTATSTICAS DE
RESULTADOS DE ENSAIOS
E TESTES BIOLGICOS
5.3. Anlise estatstica de resultados de ensaios e testes 5. Exemplos....................................................................... 715

biolgicos................................................................... 703
1. Introduo.................................................................... 703
2. Aleatoriedade e independncia
de tratamentos individuais........................................ 703
3. Ensaios dependentes de respostas quantitativas......... 704
4. Ensaios dependentes de respostas qualitativas............ 713
5. Textos gerais
6. Combinao de resultados de ensaios.......................... 727
7. Para alm desta monografia......................................... 729
8. Tabelas e mtodos de clculo....................................... 730
9. Glossrio de smbolos e termos................................... 734
10. Bibliografia recomendada.......................................... 735

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 701

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
A segunda verso desta monografia aparece agora
restruturada, mantendo-se os conceitos definidos na
introduo feita na traduo portuguesa para a Farmacopeia
Portuguesa VI. Aconselhamos a consulta daquela monografia,
pois alguns conceitos no esto aqui contemplados; por outro
lado, e mantendo o princpio j consignado, apresenta-se em
suplemento um glossrio de termos estatsticos nas verses
portuguesa e inglesa, uma vez que a terminologia estatstica
est muito ligada lngua inglesa.
1. INTRODUO
Este captulo contm indicaes relativas concepo de tal como definidos nos manuais de bioestatstica mais
ensaios biolgicos prescritos na Farmacopeia e anlise dos
seus resultados. Foi redigido para uso dos utilizadores de que
nem a formao nem as funes principais sejam de estatstica,
mas que, pelas suas funes devem analisar ou interpretar os
resultados daqueles ensaios, muitas vezes sem o auxlio ou
orientao de um especialista. Os mtodos de clculo descritos
aqui no tm um carcter obrigatrio para interpretao dos
doseamentos que constituem parte integrante da Farmacopeia.
Podem ser utilizados mtodos alternativos, sob a condio
de serem to fiveis como os aqui descritos. H uma grande
escolha de programas de clculo informticos disposio do
analista, e podem ser mais ou menos teis de acordo com as
facilidades disponveis e as competncias do analista.
H situaes onde a orientao de um especialista necessria:
tratamento global da organizao e anlise de ensaios no mbito
da investigao ou do desenvolvimento de novos produtos; as
restries impostas ao desenho do ensaio neste captulo no
sejam satisfeitas, por exemplo restries laboratoriais especficas
podem requerer desenhos de ensaios particulares, ou quando o
uso de doses em nmero igual e equidistantes no apropriado;
anlise de curvas dose-resposta no lineares de grande extenso,
como por exemplo nos ensaios imunolgicos. Um esboo
pormenorizado de anlises de curva dose-resposta para um
conjunto alargado de modelos includo na seco 3.4 e um
exemplo simples dado na seco 5.4.
1.1. DESENHO GERAL E PRECISO
A Farmacopeia descreve mtodos biolgicos destinados ao
doseamento de substncias e preparaes em que a actividade
no pode ser correctamente determinada por mtodos qumicos
ou fsicos. Na medida do possvel, o princpio aplicado nos
doseamentos a comparao com a preparao padro de modo
a determinar a quantidade da amostra que produz o mesmo
efeito biolgico que uma quantidade determinada da substncia
padro, a Unidade. Uma das condies essenciais aplicao
destes mtodos de titulao que os ensaios so efectuados
simultaneamente com as preparaes padro e as amostras,
e em condies idnticas. Para certos ensaios (por exemplo,
determinao de ttulos de vrus), a actividade da amostra no
expressa em termos relativos em relao ao padro. A seco 4.5
refere-se a este tipo de ensaio.
Qualquer avaliao da actividade derivada do ensaio biolgico
sujeita a erro aleatrio devido variabilidade inerente
das respostas biolgicas e devem ser feitos os clculos dos
erros, se possvel, a partir dos resultados dos ensaios, mesmo
quando so utilizados os mtodos oficiais. Os mtodos para
o desenho dos ensaios e clculos dos respectivos erros so,
assim, descritos a seguir. Em cada caso, antes da adopo
de um mtodo estatstico, devem ser realizados ensaios
preliminares em nmero apropriado de modo a certificar a
aplicabilidade do mtodo.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
5.3. Anlises estatsticas
Os limites de confiana para uma determinada actividade
do uma indicao da preciso com a qual a actividade foi
calculada no ensaio. So calculados tendo em ateno o
desenho experimental e o tamanho da amostra. O limite de
confiana para 95 por cento habitualmente escolhido para
os ensaios biolgicos. Os mtodos matemticos so utilizados
para calcular aqueles limites e para garantir que existe a
probabilidade de 95 por cento de que estes limites incluam a
actividade real. A aceitao desta preciso pela Farmacopeia
depende dos requisitos estipulados na monografia da
preparao em causa.
Os termos mdia e desvio padro so usados aqui
divulgados.
Os termos actividade declarada ou actividade rotulada,
actividade atribuda, actividade assumida, relao de
actividade e actividade estimada so usados neste captulo
5. Textos gerais
para os conceitos seguintes:
actividade declarada ou actividade rotulada: no caso
de um produto preparado, um valor nominal atribudo a
partir do conhecimento existente da actividade da matria
prima; no caso da matria prima, consiste na actividade
prevista pelo fabricante,
actividade atribuda: a actividade da substncia padro,
actividade assumida: actividade provisria de uma
amostra que forma a base de clculo da dose que ir ter
uma actividade equivalente dose da preparao com o
padro a utilizar,
relao de actividade de uma amostra: relao entre
as doses da preparao padro e da amostra com uma
actividade equivalente nas condies do ensaio,
actividade estimada: actividade calculada a partir dos
dados do ensaio.
A seco 9 (Glossrio de smbolos e termos) contm uma
tabela com os smbolos mais usados neste anexo. Quando
o texto se referir a um smbolo inexistente naquela seco
ou usar um smbolo para um conceito diferente, ele ser
definido na respectiva parte do texto.
2. ALEATORIEDADE E INDEPENDNCIA
DE TRATAMENTOS INDIVIDUAIS
A distribuio de diferentes tratamentos a diferentes unidades
experimentais (animais, tubos, etc.) deve ser realizada
estritamente por processos aleatrios. Qualquer outra escolha
de condies experimentais, que no sejam contempladas
no desenho experimental, deve igualmente ser aleatria.
Exemplos disso so a escolha da posio das jaulas num
laboratrio e a ordem de administrao dos tratamentos. Em
particular, um grupo de animais que receba a mesma dose de
qualquer preparao no deve ser tratado em conjunto (ao
mesmo tempo ou na mesma posio), a no ser que exista uma
forte evidncia que a fonte de variao relevante (por exemplo,
entre tempos ou entre posies) seja negligencivel. A
distribuio aleatria pode ser obtida a partir de computadores
usando a funo aleatria pr-definida. O experimentador deve
verificar que so produzidas sries de nmeros diferentes cada
vez que a funo activada.
As preparaes atribudas a cada unidade experimental devem
ser to independentes quanto possvel. Dentro de cada grupo
experimental, as diluies atribudas a cada tratamento no
703
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.3. Anlises estatsticas
devem ser apenas divises da mesma dose, mas preparadas
individualmente. Sem esta precauo indispensvel, a
variabilidade inerente preparao no estar completamente
representada na varincia do erro experimental. O resultado
ser uma subestimao do erro residual conduzindo a:
1) um aumento injustificado do rigor dos testes da anlise de
varincia (ver seces 3.2.3 e 3.2.4),
2) uma subestimativa dos verdadeiros limites de confiana
para o teste, que so calculados a partir da estimativa de s2
(mdia quadrtica do erro residual), tal como mostrado
na seco 3.2.5.
3. ENSAIOS DEPENDENTES
DE RESPOSTAS QUANTITATIVAS
5. Textos gerais
3.1. MODELOS ESTATSTICOS
3.1.1. PRINCPIOS GERAIS
Os ensaios biolgicos includos na Farmacopeia foram
concebidos como ensaios de diluio, o que significa
que suposto que as amostras a serem ensaiadas tenham
a mesma substncia activa que as preparaes padro, mas
em propores diferentes de substncia activa e substncias
inertes. Em tal caso, as amostras podem, em teoria,
ser derivadas das preparaes padro por diluio com
substncias inertes. Para verificar se um ensaio em especial
pode ser considerado um ensaio de diluio, necessrio
observar os efeitos da diluio dos padres na relao dose-
-resposta da substncia activa. Quando a diferena entre a
relao dose-resposta das preparaes padro e da amostra
num ensaio se desvia marcadamente do efeito da diluio da
substncia activa na diluio terica do ensaio, este modelo
no validado para este ensaio especfico.
Diferenas significativas nas relaes dose-resposta do
padro e da amostra podem sugerir que uma das preparaes
contm, para alm da substncia activa, outras componentes
que no so inertes mas que podem influenciar as respostas
medidas.
Para realizar o efeito da diluio no modelo terico aparente,
til transformar a relao dose-resposta numa funo linear
na maior latitude possvel de doses. Dois modelos estatsticos
so de interesse para os ensaios biolgicos prescritos: o
modelo de linhas paralelas e o modelo de relao de declives.
A aplicao de qualquer um deles dependente do
preenchimento das seguintes condies:
1) os diferentes tratamentos foram atribudos aleatoriamente
s unidades experimentais,
2) as respostas de cada tratamento esto normalmente
distribudas,
3) os desvios padres da resposta dentro de cada
grupo tratado do padro e da amostra no diferem
significativamente uns dos outros.
Quando um ensaio desenvolvido, o analista deve determinar
que os dados recolhidos em mltiplos ensaios obedecem s
seguintes condies tericas:
a condio 1 pode ser preenchida atravs de um uso
eficiente da seco 2,
a condio 2 um requisito que na prtica sempre
cumprido. Desvios menores deste requisito geralmente no
704
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
introduzem defeitos nas anlises, desde que as diferentes
rplicas por tratamento sejam includas. Em caso de
dvida, pode ser feito um teste para desvio normalidade
(p. ex. o teste de Shapiro-Wilk(1)),
a condio 3 pode ser verificada com um teste de
homogeneidade de varincias (p. ex. o teste de
Bartlett(2) ou o teste de Cochran(3)). A inspeco das
representaes grficas dos dados pode igualmente ser
elucidativa deste objectivo (ver exemplos na seco 5).
Quando as condies 2 e/ou 3 no forem satisfeitas, a
transformao das respostas podem originar um melhor
preenchimento daquelas condies. Exemplos so ln y, y ou y2:
a transformao logartmica das respostas y em ln y pode
ser til quando a homogeneidade das varincias no
satisfatria. Pode igualmente melhorar a normalidade da
distribuio quando ela est desviada para a direita,
a transformao de y em y til quando as observaes
seguem a distribuio de Poisson, isto , quando so obtidas
por contagem,
a transformao quadrtica de y em y2 til quando, por
exemplo, mais provvel que a dose seja proporcional rea de
uma zona de inibio do que medida do dimetro da zona.
Para alguns ensaios dependentes de respostas quantitativas,
tal como os imunoensaios ou ensaios in vitro em clulas,
deve ser usado um grande nmero de doses. Estas doses
do respostas que abarcam toda a latitude de respostas e
produzem uma curva no linear prolongada da dose-
-resposta. Tais curvas so tpicas de todos os bioensaios, mas
para muitos ensaios o uso de um largo nmero de doses
no tico (por exemplo, ensaios in vivo) ou prtico, e os
objectivos do ensaio podem ser atingidos com um nmero
limitado de doses. , deste modo, habitual restringir as
doses parte linear da curva dose-resposta obtida por uma
transformao apropriada, de modo a que os mtodos
descritos nas seces 3.2 ou 3.3 sejam aplicveis. Contudo,
em alguns casos a anlise de toda a curva dose-resposta
desejvel. Um esboo de um modelo aplicvel para tais
anlises dado na seco 3.4 e um exemplo simplificado
apresentado na seco 5.4.
Uma categoria separada constituda pelos ensaios em
que a resposta no pode ser mensurada em cada unidade
experimental, mas em que apenas a fraco das unidades
respondendo a cada tratamento podem ser contadas. Esta
categoria abordada na seco 4.
3.1.2. ENSAIOS DE ROTINA
Quando um ensaio de utilizao em rotina, normalmente
possvel verificar sistematicamente o cumprimento das
condies 1 a 3, porque o nmero limitado de observaes
por ensaio pode influenciar a sensibilidade dos testes
estatsticos. Felizmente, foi demonstrado que, em
ensaios balanceados simetricamente, pequenos desvios
homogeneidade da varincia e da normalidade no afectam
seriamente os resultados do ensaio.
(1) Wilk, M. B. e Shapiro, S. S. (1968). The joint assessment of nor- mality of
several independent samples, Technometrics, 10: 825-839.
(2) Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests, Proc.
Roy. Soc. London, Series A, 160: 280-282.
(3) Cochran, W. G. (1951). Testing a linear regression amoung variances,
Biometrics 7, 17-32.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
A aplicabilidade do modelo estatstico deve ser questionada
apenas quando uma srie de ensaios demonstrar uma
validao duvidosa. Pode ento ser necessrio desenvolver
uma srie de investigaes preliminares como discutido na
seco 3.1.1.
Duas outras condies necessrias condicionam o modelo
estatstico a ser usado:
para o modelo de linhas paralelas
4A. A relao entre o logaritmo da dose e a resposta pode
ser representada por uma linha recta no intervalo das doses
usadas,
5A. Para qualquer amostra no ensaio, a linha recta
paralela obtida com o padro.
para o modelo de relao de declives
4B. A relao entre a dose e a resposta pode ser
representada por uma linha recta para cada preparao no
ensaio acima do intervalo de doses utilizadas,
5B. Para cada amostra no ensaio, a linha recta intersecta o
eixo y (na dose zero) no mesmo ponto que a linha recta da
preparao padro (isto , as funes de resposta de todas
as preparaes do ensaio devem ter o mesmo ponto de
intercepo da resposta da funo padro).
As condies 4A e 4B apenas podem ser verificadas em
ensaios em que, pelo menos, 3 diluies de cada preparao
foram testadas. O uso de um ensaio com apenas 1 ou
2 diluies pode ser justificado quando a experincia
demonstrou que a linearidade e o paralelismo ou igual
intercepo so regularmente realizadas.
Depois de recolher os resultados de um ensaio, e antes de
calcular a sua actividade relativa de cada amostra, deve
ser feita uma anlise de varincia de modo a verificar se as
condies 4A e 5A (ou 4B e 5B) so cumpridas. Para tal, o
total da soma dos quadrados subdividido num certo nmero
de somas de quadrados correspondentes a cada condio que
foi realizada. O restante da soma dos quadrados representa o
erro experimental residual para a qual a ausncia ou presena
de causas relevantes de variao pode ser comparada pelas
sries de rcios-F.
Quando a validao est estabelecida, a actividade de cada
amostra relativamente ao padro pode ser calculada e
expressa como uma relao de actividade ou convertida numa
qualquer unidade relevante para a amostra em teste, por
exemplo em Unidades Internacionais. Os limites de confiana
podem ser calculados para cada conjunto de dados do ensaio.
Se alguma das cinco condies (1, 2, 3, 4A e 5A ou 1, 2, 3,
4B e 5B) no for preenchida, os mtodos de calculo aqui
descritos no so vlidos e deve ser realizado um estudo
especial do ensaio tcnico.
O analista no deve usar mais nenhuma transformao a
no ser que seja demonstrado que o incumprimento dos
requisitos no acidental mas devido a uma modificao
sistemtica das condies experimentais. Neste caso, os
ensaios, tal como descrito na seco 3.1.1., devem ser
repetidos antes de adoptar uma nova transformao nos
ensaios de rotina.
Um nmero excessivo de ensaios invlidos devido ausncia
de paralelismo ou de linearidade, num ensaio de rotina
realizado para comparar materiais similares, indica desenhos
experimentais com replicao inadequada. Esta inadequao
resulta normalmente do reconhecimento incompleto de
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
5.3. Anlises estatsticas
todas as causas de variao que podem afectar o ensaio, o que
pode originar na subavaliao do erro residual conducente a
grandes rcios-F.
Nem sempre possvel ter em ateno todas as causas
possveis de variao num nico ensaio (por exemplo,
variao diria). Nestes casos, os limites de confiana
de ensaios repetidos da mesma amostra podem no se
sobreporsatisfatoriamente, e deve ter-se cuidado na
interpretao dos limites de confiana individuais. De modo
a obter uma avaliao mais correcta do limite de confiana
pode ser necessrio realizar vrios ensaios independentes e
combin-los numa nica actividade estimada e num nico
intervalo de confiana (ver seco 6).
Com o objectivo fazer o controlo de qualidade de ensaios de rotina
recomendado manter o registo das previses do declive da
regresso e da previso do erro residual nos mapas de controlo.
Um erro residual excepcionalmente elevado pode indicar
5. Textos gerais
um problema tcnico. Este facto deve ser investigado e, se
for demonstrado que algo correu mal durante o processo,
o ensaio deve ser repetido. Um erro residual invulgarmente
elevado pode igualmente indicar a presena de uma resposta
fora de contexto (outlying) ou de uma observao aberrante.
Uma resposta questionvel devido falha de cumprimento
do procedimento durante um ensaio rejeitada. Se for
descoberto um valor aberrante aps o registo das respostas,
mas puder ser relacionado com irregularidades do ensaio,
pode ser justificada a sua omisso. A rejeio ou reteno
arbitrria de uma resposta aparentemente aberrante pode ser
uma forte causa de interferncia. Em geral, desencoraja-se a
rejeio de observaes apenas devido significncia de um
teste de contexto.
Um erro residual excepcionalmente baixo pode verificar-
se esporadicamente e d origem a rcios-F que excedem
os valores crticos. Em tal caso, pode justificar-se a
substituio do erro residual estimado a partir do ensaio
individual pelo erro residual mdio baseado nos dados
histricos registados nos mapas de controlo.
3.1.3. CLCULOS E RESTRIES
De acordo com os princpios gerais de um bom desenho
experimental as seguintes 3 restries so normalmente
impostas no desenho dos ensaios. Elas tm vantagens quer na
facilidade de clculo quer na preciso.
a) Cada preparao no ensaio deve ser testada com o mesmo
nmero de diluies.
b) No modelo de linhas paralelas, o rcio de doses adjacentes
deve ser constante para todos os tratamentos do ensaio;
no modelo de relao de declives, o intervalo entre doses
adjacentes deve ser constante para todos os tratamentos
do ensaio.
c) Deve existir um nmero igual de unidades experimentais
em cada tratamento.
Se for usado um desenho experimental que satisfaa
estas condies os clculos so simples. As frmulas so
apresentadas nas seces 3.2 e 3.3. recomendado o uso
de programas informticos (software) que tenha sido
desenvolvido expressamente para este objectivo. Existem
vrios programas que podem facilmente ser utilizados para
todos os desenhos experimentais descritos nas monografias.
Nem todos os programas usam as mesmas frmulas e
algoritmos, mas todos eles devem chegar aos mesmos
resultados.
705
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.3. Anlises estatsticas
Desenhos experimentais que no cumpram as restries
acima mencionadas podem ser realizveis e correctos, mas as
frmulas necessrias so demasiado complicadas para serem
descritas neste texto. Uma breve descrio dos mtodos de
clculo apresentada na seco 7.1. Estes mtodos podem
igualmente ser usados em desenhos restringidos, mas nesse
caso eles so equivalentes com as frmulas simples. As
frmulas para os desenhos restringidos apresentadas neste
texto podem ser usadas, por exemplo, para criar programas
especficos numa folha de clculo. Os exemplos na seco 5
podem ser usados para clarificar o especialista e para verificar
se um dado programa fornece os resultados correctos.
3.2. MODELO DE LINHAS PARALELAS
3.2.1. INTRODUO
5. Textos gerais
O modelo de linhas paralelas ilustrado na figura 3.2.1.-I. O
logaritmo das doses est representado no eixo horizontal com
a menor concentrao esquerda a com a maior direita.
As respostas esto indicadas no eixo vertical. As respostas
individuais de cada tratamento esto indicadas com pontos
negros. As 2 linhas representam as relaes ln(dose)-resposta
do padro e da amostra.
FIGURA 3.2.1.-I Modelo de linhas paralelas para um ensaio 3 + 3.
Nota: o logaritmo natural (ln ou loge) usado
extensivamente neste texto. O termo antilogaritmo usado
para designar ex. No entanto, igualmente possvel utilizar os
logaritmos decimais ou de Briggs (log ou log10); neste caso, o
antilogaritmo correspondente 10x.
Para a existncia de um ensaio satisfatrio a actividade
assumida das amostras do teste deve ser prxima da
actividade real. Com base nesta actividade assumida e na
actividade atribuda do padro, so preparadas diluies
equivalentes (se possvel), isto , doses correspondentes do
padro e da amostra devem dar a mesma resposta. Se no
existir informao sobre a actividade assumida, devem ser
realizados ensaios preliminares num grande amplitude de
doses para determinar a amplitude onde a curva linear.
Quanto mais prximo da actividade assumida correcta da
amostra, mais prximas estaro as 2 linhas, uma vez que
706
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
devem existir respostas iguais para doses iguais. A distncia
horizontal entre as linhas representa a verdadeira
actividade da amostra, relativamente sua actividade
assumida. Quanto maior a distncia entre as 2 linhas, pior
a actividade assumida da amostra. Se a linha da amostra
est situada direita da do padro, a actividade assumida foi
sobrestimada, e os clculos indicam uma actividade estimada
menor do que a actividade assumida. Igualmente, se a linha
da amostra est situada esquerda da do padro, a actividade
assumida foi subestimada, e os clculos indicam uma
actividade estimada superior actividade assumida.
3.2.2. DESENHO EXPERIMENTAL
As seguintes condies so teis na optimizao da preciso
do desenho experimental:
1) o rcio entre o declive e o erro residual deve ser o maior
possvel,
2) a amplitude das doses deve ser a maior possvel,
3) as linhas devem estar to prximas quanto possvel, isto
, a actividade assumida deve ser um bom clculo da
verdadeira actividade.
A alocao de unidades experimentais (animais, tubos, etc.) a
diferentes tratamentos pode ser feita de vrias maneiras.
3.2.2.1. Desenho completamente aleatrio
Se a totalidade das unidades experimentais parecer
ser razoavelmente homognea sem indicao de que a
variabilidade da resposta menor dentro de certos subgrupos
reconhecidos, a distribuio das unidades a diferentes
tratamentos deve ser efectuada aleatoriamente.
Se unidades dentro de subgrupos, tais como posies fsicas
ou dias de experimentao, tiverem tendncias a serem mais
homogneos do que a totalidade das unidades, a preciso do
ensaio pode ser aumentada atravs da introduo de uma
ou mais restries no desenho. Uma escolha cuidadosa do
balano sobre estas restries permite a eliminao de fontes
de variao irrelevantes.
3.2.2.2. Desenho de bloco aleatrio
Neste desenho possvel segregar uma fonte de variao
identificvel, tal como a variao sensvel entre ninhadas de
animais de experimentao ou a variao entre caixas de Petri
nos ensaios de difuso microbiolgica. O desenho requer
que cada tratamento seja aplicado em igual nmero de vezes
em cada bloco (ninhada ou caixa de Petri) e s adequado
quando o bloco for suficientemente grande para acomodar
todos os tratamentos.
Isto est ilustrado na seco 5.1.3. igualmente possvel usar
um desenho aleatrio com replicao. Os tratamentos devem
atribudos aleatoriamente a cada bloco. Na seco 8.5
apresentado um algoritmo para obter permutaes aleatrias.
3.2.2.3. Desenho do quadrado latino
Este desenho apropriado quando a resposta pode ser
afectada por duas fontes de variao diferentes, cada uma das
quais assume k diferentes nveis ou posies. Por exemplo,
num ensaio de um antibitico em placa os tratamentos
podem ser arranjados numa ordenao de k k numa placa
grande, cada tratamento ocorrendo uma vez em cada linha
de cada coluna. O desenho apropriado quando o nmero
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de linhas, o nmero de colunas e o nmero de tratamentos
for igual. As respostas so registadas num quadrado de
formato conhecido por quadrado latino. As variaes devidas
s diferenas nas respostas entre as k linhas e entre as k
colunas podem ser segregadas, deste modo reduzindo o erro.
Na seco 5.1.2 apresenta-se um exemplo de desenho de
quadrado latino, e na seco 8.6 fornecido um algoritmo
para obter quadrados latinos.
3.2.2.4. Desenho de permutao
Este desenho til quando a experincia pode ser subdividida
em blocos mas possvel aplicar apenas dois tratamentos
a cada bloco, por exemplo um bloco pode ser uma unidade
singular que pode ser testada em duas ocasies. O desenho
pretende incrementar a preciso eliminando os efeitos das
diferenas entre unidades ao mesmo tempo que balana o efeito
de qualquer diferena entre nveis gerais de resposta nas duas
etapas do teste. Se forem testadas duas doses de um padro e de
uma amostra designado como um teste de permutao duplo.
A experincia dividida em duas partes separadas por um
intervalo de tempo apropriado. As unidades so divididas em
quatro grupos e cada grupo recebe um dos quatro tratamentos
na primeira parte do teste. As unidades que receberam
uma preparao na primeira parte do teste recebem a outra
preparao na segunda parte, e unidades recebendo pequenas
doses numa parte do teste recebem as grandes doses na outra.
O arranjo das doses mostrado na tabela 3.2.2.-I. Na seco
5.1.5 pode ser encontrado um exemplo.
TABELA 3.2.2.-I Ordenao das doses num ensaio cruzado
Grupo de unidades Tempo I Tempo II
1 S1 T2
2 S2 T1
3 T1 S2
4 T2 S1
3.2.3. ANLISE DE VARINCIA
Esta seco fornece as frmulas requeridas para desenvolver
a anlise de varincia e ser mais facilmente percebida
referenciando com os exemplos prticos da seco 5.1. Igualmente
deve ser consultado o glossrio de smbolos (seco 9).
As frmulas so indicadas para ensaios simtricos onde uma
ou mais amostras (T, U, etc.) so comparadas com o padro
(P). Deve ser realado que as frmulas apenas podem ser
usadas se as doses forem igualmente espaadas, se forem
TABELA 3.2.3.-I Frmulas para os ensaios de linhas paralelas com d doses de cada preparao
Padro (S)
Resposta mdia dose mais baixa S1
Resposta mdia 2 dose S2
... ...
Resposta mdia dose mais elevada Sd
Total da amostra PS S1 S2 ... Sd
Contraste linear LS 1S1 2S2 ...
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TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
5.3. Anlises estatsticas
aplicados nmeros iguais de tratamentos por amostra e a
cada tratamento aplicado um nmero igual de vezes. No se
devem usar estas frmulas em quaisquer outras circunstncias.
Para alm de alguns ajustamentos ao termo de erro, a anlise
bsica dos dados resultantes de um ensaio a mesma para
os desenhos completamente aleatrio, de bloco aleatrio e
de quadrado latino. As frmulas de testes de bloco aleatrio
no se adaptam completamente a este esquema, pelo que so
incorporadas no Exemplo 5.5.5.
Tendo considerado os pontos discutidos na seco 3.1.
e transformado as respostas, se necessrio, devem ser
calculadas as mdias dos valores em cada tratamento e em
cada preparao, como mostrado nas tabelas 3.2.3.-I. Os
contrastes lineares, que relacionam os declives das rectas de
ln(dose)-resposta, devem igualmente ser formados. Na tabela
3.2.3.-II so apresentadas 3 frmulas adicionais, necessrias
para a construo da anlise de varincia.
5. Textos gerais
A variao total na resposta causada por diferentes tratamentos
agora dividida, como mostrado na tabela 3.2.3.-III., sendo as
somas dos quadrados derivadas dos valores obtidos nas tabelas
3.2.3.-I e 3.2.3.-II. A soma dos quadrados devidos ausncia de
linearidade apenas pode ser calculada se pelo menos 3 doses
por preparao forem includas no ensaio.
O erro residual do ensaio obtm-se pela subtraco das
variaes permitidas no desenho variao total da resposta
(tabela 3.2.3.-IV). Nesta tabela representa a mdia de todas as
respostas registadas no ensaio. Deve ter-se em ateno que
para um quadrado latino, o nmero de respostas replicadas
(n) igual ao nmero de linhas, colunas ou tratamentos (dh).
A anlise de varincia agora completada do seguinte modo.
Cada soma de quadrados dividida pelo nmero de graus
de liberdade correspondentes para dar origem s mdias
quadrticas. A mdia quadrtica para cada varivel em teste
expressa como o rcio do erro residual (s2) e a significncia
destes valores (conhecidos como rcios-F) so verificadas
pelo uso da tabela 8.1 ou uma subrotina apropriada de um
programa informtico.
3.2.4. TESTES DE VALIDAO
Os resultados dos ensaios so considerados estatisticamente
vlidos se o resultado desses testes for o seguinte.
1) O termo da regresso linear significativo, isto , a
probabilidade calculada inferior a 0,05. Se este critrio
no for satisfeito, no possvel calcular os limites de
confiana para 95 por cento,
1 amostra (T) 2 amostra (U, etc.)
T1 U1
T2 U2
... ...
Td Ud
PT T1 T2 ... Td PU ... etc.
LT 1T1 2T2 ... LU ... etc.
707
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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 3.2.3.-II Frmulas complementares para a construo da anlise de varincia

TABELA 3.2.3.-III Frmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade

Origem da variao Graus de liberdade (f) Soma dos quadrados

Amostras h1 SSprep HP (PS2 P T2 ...) K

Regresso linear 1 SSreg HL (LS LT ...) 2

No paralelismo h1 SSpar HL (LS2 LT2 ...) SSreg
No linearidade (*) h (d 2)
5. Textos gerais

SSlin SStreat SSprep SSreg SSpar

Tratamentos hd 1 SStreat n(S12 ... Sd2 T 12 ... T d2 ...) K
(*) No calculado para as titulaes de 2 doses.

TABELA 3.2.3.-IV Clculo do erro residual

Origem da variao Graus de liberdade Soma dos quadrados

blocos (linhas) (*) n1 SSblock hd (R12 ... Rn2) K

colunas (**) n1 SScol hd (C12 ... Cn2) K

total aleatrio hd (n 1) SSres SStot SStreat

erro residual (***) blocos completos (hd 1) (n 1) SSres SStot SStreat SSblock

quadrado latino (hd 2) (n 1) SSres SStot SStreat SSblock SScol

total nhd 1 SStot (y

y) 2
(*)(*) No calculado para os ensaios totalmente aleatrios.
(**) S calculado para os quadrados latinos.
(***) Depende do tipo de ensaio utilizado.

2) o termo de no-paralelismo no significativo, isto , a preparao, o declive comum (b) de ensaios com d doses de
probabilidade calculada no inferior a 0,05. Isto indica cada preparao obtm-se a partir de:
que a condio 5A, da seco 3.1 satisfeita,
3) o termo de no-linearidade no significativo, isto , a
probabilidade calculada no inferior a 0,05. Isto indica
que a condio 4A, da seco 3.1 satisfeita. e o logaritmo da relao de actividade de uma amostra, por
exemplo T, :
Um desvio significativo ao paralelismo num ensaio mltiplo
pode ser devido incluso no ensaio de uma amostra que
d uma recta ln(dose)-resposta com um declive diferente
do das outras preparaes. Em vez de declarar a invalidao
do ensaio, pode ser decidido eliminar todos os dados
relacionados com aquela preparao e recomear a anlise do A actividade calculada uma estimativa da verdadeira
princpio. actividade de cada desconhecido. Os limites de confiana
podem ser calculados como os antilogaritmos de:
Quando a validao estatstica estabelecida, podem ser
calculadas as actividades e os limites de confiana pelos
mtodos descritos na seco seguinte.

3.2.5. CLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE

CONFIANA
O valor de t pode ser obtido na tabela 8.2 para p = 0,05 e
Sendo I o ln do rcio entre doses adjacentes de uma com os graus de liberdade iguais ao nmero de graus de

708 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

liberdade do erro residual. A actividade estimada (RT) e os em que B a soma das respostas do bloco contendo o valor
limites de confiana associados obtm-se multiplicando os em falta, T o total do tratamento correspondente e G a soma
valores obtidos por AT depois da obteno dos antilogaritmos. de todas as respostas registadas no ensaio.
Se as solues de armazenamento no so exactamente
equivalentes, com base nas actividades atribudas e Desenho do quadrado latino
assumidas, necessrio introduzir um factor de correco
(ver Exemplos 5.1.2 e 5.1.3). O valor em falta obtm-se de:
k(B C T) 2G
y = (3.2.6.-2)
3.2.6. VALORES EM FALTA (k 1) (k 2)

Num ensaio balanceado, um acidente totalmente desligado
dos tratamentos aplicados pode conduzir perda de uma
ou mais respostas, por exemplo devido morte de um
animal. Se se considerar que o acidente no est ligado
composio da preparao administrada, os clculos exactos
podem ser realizados mas as frmulas so mais complicadas
e podem apenas ser dadas dentro do contexto dos modelos
onde B e C so as somas das respostas na linha e coluna
contendo o valor em falta. Neste caso k = n.
Desenho de permutao
Se ocorrer um acidente conduzindo perda de valores num
desenho de permutao, deve ser consultado um livro de
estatstica (por exemplo, D. J. Finney, ver seco 10), pois a

5. Textos gerais
lineares gerais (ver seco 7.1). Contudo, existe um mtodo aplicao das frmulas apropriadas depende das combinaes
aproximado que mantm a simplicidade do desenho de tratamentos efectuados.
balanceado substituindo a resposta em falta por um valor
calculado. A perda de informao tomada em considerao 3.3. MODELO DE RELAO DE DECLIVES
diminuindo os graus de liberdade do total da soma dos
quadrados e para o erro residual pelo nmero de valores em 3.3.1. INTRODUO
falta e usando uma das frmulas a seguir fornecidas para
o valor em falta. Deve ter-se em ateno que este mtodo
Este modelo adequado, por exemplo, para alguns ensaios
apenas aproximativo, e que o uso de um mtodo exacto
microbiolgicos quando a varivel independente a
preferencial.
concentrao de um factor de crescimento essencial inferior
Se mais do que uma observao estiver em falta pode usar- concentrao ptima do meio. O modelo de relao de
-se a mesma frmula. O procedimento consiste em fazer uma declives ilustrado na figura 3.3.1.-I.
estimativa aproximada de todos os valores em falta, excepto de
um, e usar a frmula apropriada para esse valor e usar todos
os restantes valores incluindo os estimados por aproximao.
Preencha o valor calculado. Continue de modo semelhante
calculando o valor da primeira estimativa grosseira. Depois
de calcular todos os valores em falta deste modo, todo o ciclo
deve ser repetido desde o princpio, e em cada clculo utilize o
valor mais recente, calculado ou estimado, para cada resposta
qual a frmula tenha sido aplicada. Este procedimento deve
ser repetido at que 2 ciclos consecutivos dem os mesmos
valores; a convergncia normalmente rpida.
Considerando que o nmero de valores substitudos
pequeno relativamente ao nmero total de observaes na
experincia completa (digamos, inferior a 5 por cento), a
aproximao implcita nesta substituio e reduo dos graus
de liberdade pelo nmero de valores em falta substitudos
deste modo normalmente satisfatria. Contudo, a anlise
deve ser interpretada com grande cuidado, especialmente
se existir uma preponderncia de valores em falta num
tratamento ou bloco; se forem encontrados aspectos
invulgares deve consultar-se um especialista. A substituio
de valores em falta num teste sem rplicas uma operao
particularmente delicada.
FIGURA 3.3.1.-I Modelo de relao de declives para um ensaio
Desenho completamente aleatrio 231
Num ensaio completamente aleatrio o valor em falta pode As doses esto representadas no eixo horizontal com a
ser substitudo pela mdia aritmtica das outras respostas do concentrao zero esquerda e a maior concentrao
mesmo tratamento. direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As
respostas individuais de cada tratamento esto indicadas
Desenho de bloco aleatrio
com pontos negros. As 2 linhas so as relaes dose-resposta
O valor em falta obtm-se aplicando a equao: calculadas para o padro e para a amostra, na condio que se
interceptam na dose zero. Ao contrrio do modelo de linhas
paralelas, as doses no so transformadas logaritmicamente.
Tal como no caso de um ensaio baseado no modelo de linhas
paralelas, importante que a actividade assumida esteja
prxima da actividade real, e preparar diluies equivalentes

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 709

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5.3. Anlises estatsticas
das amostras e do padro (se possvel). Quanto mais correcta
for a actividade assumida mais juntas estaro as 2 linhas. O
rcio dos declives representa a verdadeira actividade da
amostra relativamente actividade assumida. Se o declive da
amostra for mais ngreme que o do padro, a actividade foi
subestimada e os clculos indicam uma actividade estimada
maior que a actividade assumida. De igual modo, se o declive
da amostra for menos ngreme que o do padro, a actividade
foi sobrestimada e os clculos indicam uma actividade
estimada inferior actividade assumida.
Na preparao de uma experincia, todas as respostas devem
ser examinadas quanto ao cumprimento das condies 1, 2 e
3 da seco 3.1. A anlise de varincia a realizar em ensaios de
rotina descrita na seco 3.3.3 de modo a que o cumprimento
das condies 4B e 5B da seco 3.1 possa ser examinado.
3.3.2. DESENHO DO ENSAIO
5. Textos gerais
A utilizao da anlise estatstica apresentada a seguir impe
as seguintes restries ao ensaio:
a) o padro e as amostras devem ser testadas com o mesmo
nmero de diluies igualmente espaadas,
b) um grupo extra de unidades experimentais que no esteja
sujeito ao tratamento deve ser testado (os brancos),
c) deve existir um nmero igual de unidades experimentais
em cada tratamento.
Tal como j foi referido na seco 3.1.3, os desenhos experimentais
que no cumpram estas restries podem ser possveis e
correctos, mas as anlises estatsticas simples aqui apresentadas
no so aplicveis e deve ser obtido aconselhamento especializado
ou ser utilizada programao apropriada.
O desenho com 2 doses por preparao e 1 branco, o desenho
(2h+1) com zero comum prefervel, uma vez que permite
a maior preciso combinada com a possibilidade de verificar a
validao dentro das restries atrs mencionadas.
No entanto, nem sempre pode ser assumida como vlida
uma relao linear abaixo da dose zero. Com uma ligeira
perda de preciso um desenho sem brancos pode ser usado.
Neste caso, 3 doses por preparao, o desenho (3h) com
zero comum, prefervel a 2 doses por preparao. As doses
devem ser como se segue:
1) o padro dado numa dose alta, perto mas no excedendo
a mais alta dose com uma resposta mdia na parte
rectilnea da curva dose-resposta,
2) as outras doses devem estar uniformemente distribudas
entre a dose mais alta e a dose zero,
3) as amostras devem ser dadas em doses correspondentes
baseadas na actividade assumida do material.
Um desenho completamente aleatrio, de blocos aleatrios
ou de quadrado latino pode ser usado, tal como descrito na
seco 3.2.2. O uso de qualquer um dos desenhos necessita
de ajustamentos ao erro da soma dos quadrados tal como
descrito para os ensaios baseados no modelo de linhas
paralelas. A anlise de um ensaio de uma ou mais amostras
contra um padro descrita a seguir.
3.3.3. ANLISE DE VARINCIA
3.3.3.1. O desenho (hd 1)
As respostas so verificadas tal como descrito na seco 3.1
e, se necessrio, transformadas. ento calculada a mdia
710
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
das respostas para cada tratamento e cada preparao como
mostrado na tabela 3.3.3.1.-I. Adicionalmente calcula-se a
resposta mdia dos brancos (B).
A soma dos quadrados nas anlises de varincia so calculadas
como se mostra nas tabelas 3.3.3.1.-I at 3.3.3.1.-III. A soma
dos quadrados devidos no linearidade pode apenas ser
calculada se, pelo menos 3 doses de cada preparao tiverem
sido includas no ensaio. O erro residual obtido subtraindo
as variaes permitidas no desenho variao total da
resposta (tabela 3.3.3.1.-IV).
A anlise de varincia completada como se segue. Cada
soma de quadrados divido pelo correspondente nmero
de graus de liberdade para obter mdias quadrticas. A
mdia quadrtica de cada varivel a ser testada expressa
como o rcio do erro residual (s2) e a significncia destes
valores (rcios-F) avaliada atravs da tabela 8.1 ou de uma
subrotina adequada de um programa informtico.
3.3.3.2. O desenho (hd)
As frmulas so basicamente as mesmas do desenho (hd + 1),
mas existem algumas pequenas diferenas.
B retirado de todas as frmulas,
n(PS PT ...)2
K ,
hd
SSblank removido da anlise de varincia,
o nmero de graus de liberdade para os tratamentos torna-
se hd 1,
o nmero de graus de liberdade do erro residual e da
varincia total calculado como descrito para o modelo de
linhas paralelas (ver tabela 3.2.3.-IV).
As validaes do ensaio, da actividade e dos intervalos de
confiana so descritas nas seces 3.3.4. e 3.3.5.
3.3.4. TESTES DE VALIDAO
Os resultados dos ensaios so considerados estatisticamente
vlidos se o resultado das anlises de varincia forem os
seguintes:
1) a variao devida aos brancos nos desenhos (hd+1) no
significativa, isto , a probabilidade calculada no
menor que 0,05. Isto indica que as respostas dos brancos
no diferem significativamente da intercepo comum e a
relao linear vlida abaixo da dose zero,
2) a variao devida intercepo no significativa, isto , a
probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto indica
que a condio 5B, seco 3.1 satisfeita,
3) em ensaios incluindo pelo menos 3 doses por preparao,
a variao devida no-linearidade no significativa, isto
, a probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto
indica que a condio 4B, seco 3.1 satisfeita.
A variao significativa devida aos brancos indica que a
hiptese da linearidade no vlida perto da dose zero. Se
isto for sistemtico e no acidental para o tipo de ensaio, o
desenho hd mais apropriado. Qualquer resposta dos brancos
deve ser rejeitada.
Quando estes testes indicam que o ensaio vlido, a
actividade calculada com os seus limites de confiana tal
como descrito na seco 3.3.5.
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5.3. Anlises estatsticas

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 711

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5.3. Anlises estatsticas
3.3.5. CLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE
CONFIANA
3.3.5.1. O desenho (hd+1)
A intercepo comum a das preparaes pode ser calculada a
partir de:
O declive do padro, e de modo idntico para cada uma das
preparaes, calculado a partir de:
5. Textos gerais
A relao de actividade de cada amostra pode agora ser
calculada a partir de:
que deve multiplicado por AT, a actividade assumida da
amostra, de modo a determinar a actividade estimada RT.
Se o intervalo entre doses adjacentes no for idntico para o
padro e amostra, a actividade deve ser multiplicada por
IS /IT. Note que, ao contrrio da anlise de linhas paralelas,
no so calculados os antilogaritmos.
O intervalo de confiana para RT calculado a partir de:
V1 e V2 esto relacionados com a varincia e covarincia do
numerador e denominador de RT . Eles podem ser calculados
a partir de:
Os limites de confiana so multiplicados por AT, e se
necessrio por IS/IT.
3.3.5.2. O desenho (hd)
As formulas so as mesmas do que no desenho (hd+1), com
as seguintes modificaes:
712
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
3.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS
Este modelo aconselhado, por exemplo, para alguns
imunoensaios quando a anlise requerida para curvas dose-
-resposta sigmoides prolongadas. Este modelo ilustrado na
figura 3.4.-I.
Os logaritmos das doses esto representados no eixo
horizontal com a menor concentrao esquerda e a maior
direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As
respostas individuais de cada tratamento esto indicadas com
pontos negros. As 2 curvas so as relaes ln(dose)-resposta
calculadas para o padro e amostras.
FIGURA 3.4.-I Modelo de curva logstica de 4 parmetros
A forma geral das curvas pode usualmente ser descrita pela
funo logstica, mas outras formas so igualmente possveis.
Cada curva pode ser caracterizada por 4 parmetros: a
assmptota superior (), a assmptota inferior (), o factor
de declive () e a locao horizontal (). Este modelo assim
habitualmente referido como o modelo dos 4 parmetros. A
representao matemtica da curva ln(dose)-resposta :
Para um ensaio vlido necessrio que as curvas do padro e
das amostras tenham o mesmo factor de declive, e o mesmo
nvel de respostas mximas e mnimas nos extremos. Apenas a
locao horizontal () das curvas pode ser diferente. A distncia
horizontal entre as curvas est relacionada com a actividade
verdadeira da amostra. Se o ensaio usado em rotina, pode
ser suficiente testar as condies de igualdade de resposta dos
nveis superior e inferior quando o ensaio desenvolvido e
ento voltar a testar esta condio directamente apenas em
intervalos apropriados ou quando existirem alteraes dos
materiais ou das condies de ensaio.
Os clculos de semelhanas mximas dos parmetros e dos seus
intervalos de confiana podem ser obtidos atravs de programas
informticos apropriados. Estes programas informticos podem
incluir alguns testes de validao. Por exemplo, se os clculos
de semelhanas mximas mostrarem desvios significativos
aos modelos ajustados nas condies assumidas de igualdade
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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superior e inferir das assmptotas e declives, ento uma ou todas
as condies podem no estar satisfeitas.
O modelo logstico levanta um nmero de problemas
estatsticos que podem requerer solues diferentes para
diferentes tipos de ensaios, e no possvel fazer um
resumo simples. Uma grande variedade de aproximaes
descrita na literatura relevante. Para este tipo de anlises
recomendado aconselhamento profissional. De qualquer
maneira, includo um exemplo simples na seco 5.4 de
modo a ilustrar uma via possvel para analisar os dados
apresentados. Na seco 7.5 apresentada uma pequena
discusso de mtodos alternativos juntamente com outras
consideraes estatsticas.
Se no for possvel nem o aconselhamento profissional
nem o recurso a programas apropriados, possvel o uso de
mtodos alternativos: 1) se existirem estimativas razoveis
dos limites superior () e inferior (), seleccionar para
todas as amostras as doses com mdias de respostas (u)
compreendidas entre 20 por cento e 80 por cento dos limites,
transforme as respostas das doses seleccionadas para e use
o modelo de linhas paralelas (seco 3.2) para a anlise; 2)
seleccione a amplitude de doses para as quais as respostas (u)
ou as respostas apropriadamente transformadas, por exemplo
ln(u), sejam aproximadamente lineares quando graficadas
contra o ln(dose); o modelo de linhas paralelas (seco 3.2)
podem ento ser usado para a anlise.
4. ENSAIOS DEPENDENTES DE
RESPOSTAS QUALITATIVAS
4.1. INTRODUO
Em certos ensaios impossvel, ou excessivamente
trabalhoso, medir o efeito de cada unidade experimental
numa escala quantitativa. Em alternativa, um efeito tal como
a morte ou sintomas de hipoglicmia podem ser observados
quer ocorrendo ou no em cada unidade, e o resultado
depende do nmero de unidades em que ocorreu. Tais ensaios
so designados qualitativos ou tudo-ou-nada.
A situao muito semelhante descrita para os ensaios
quantitativos na seco 3.1, mas em vez de n repostas
separadas para cada tratamento um nico valor registado,
isto , a percentagem de unidades em cada grupo de
tratamento mostrando um efeito positivo. Quando estas
percentagens so graficadas em funo do logaritmo das
doses a curva resultante tende a ser sigmoide (forma de S)
em vez de ser linear.
O clculo da curva dose-resposta feito atravs de uma
funo matemtica que representa esta curvatura sigmoide.
A funo mais utilizada a funo da distribuio normal
cumulativa. Esta funo tem algum mrito terico, e
talvez a melhor escolha quando a resposta um reflexo da
tolerncia das unidades. Se a resposta mais provavelmente
depende de um processo de crescimento, o modelo de
distribuio logstica prefervel, embora o resultado da
diferena entre os 2 modelos seja muito pequeno.
As estimativas das semelhanas mximas do declive e
localizao das curvas apenas podem ser encontradas aplicando
um procedimento iterativo. H muitos procedimentos que
conduzem aos mesmos resultados, mas eles diferem em
eficcia devido velocidade de convergncia. Um dos mtodos
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
5.3. Anlises estatsticas
mais rpidos consiste na optimizao directa da funo
das semelhanas mximas (ver seco 7.1), que pode ser
facilmente realizado com programas informticos que tenham
uma subrotina interna para este objectivo. Infelizmente, a
maior parte destes procedimentos no fazem a estimativa dos
limites de confiana, e a tcnica para os obter demasiado
complica para ser aqui descrita. A tcnica a seguir descrita no
a mais rpida, mas foi escolhida devido sua simplicidade
comparativamente com outras tcnicas alternativas. Pode
ser usada para ensaios em que uma ou mais amostras so
comparadas com um padro. Para alm disso, devem estar
preenchidas as seguintes condies:
1) a relao entre o logaritmo da dose e a resposta pode
ser representada pela curva da distribuio normal
cumulativa,
2) as curvas do padro e da amostra so paralelas, isto , tm
forma idntica e apenas podem diferir pela sua localizao
5. Textos gerais
horizontal,
3) em teoria, no existe uma resposta natural a doses
extremamente baixas nem uma ausncia de resposta a
doses extremamente altas.
4.2. MTODO DA PROBABILIDADE ITERATIVA (4)
A curva sigmoide pode ser linearizada substituindo cada
resposta, isto , a fraco de resposta positiva do grupo, pelo
valor correspondente da distribuio normal padronizada
cumulativa. Este valor, muitas vezes referido como normit,
distribui-se teoricamente entre e . No passado,
foi proposto acrescentar 5 a cada normit para obter o
probit. Este facto facilita os clculos manuais porque
os valores negativos so evitados. Com a chegada dos
computadores, a necessidade de adicionar 5 aos normits
desapareceu. O termo mtodo normit mais adequado
para o mtodo descrito a seguir. No entanto, e uma vez que
a designao anlise probit est to divulgada, neste texto
ir-se- manter aquela designao.
Uma vez linearizadas as respostas possvel aplicar a anlise
de linhas paralelas, como descrito na seco 3.2. Infelizmente,
a condio de validao da homogeneidade da varincia para
cada dose no cumprida. A varincia mnima para o normit
= 0 e aumenta para valores positivos e negativos do normit. ,
por isso, necessrio dar maior peso resposta na parte mdia
da curva, e menor peso nas zonas extremas da curva. Este
mtodo, a anlise de varincia, e a estimativa da actividade e
dos intervalos de confiana descrito a seguir.
4.2.1. TABULAO DE RESULTADOS
A tabela 4.2.1.-I utilizada para introduzir os dados nas
colunas indicadas por nmeros:
(1) a dose do padro ou da amostra,
(2) o nmero de n unidades submetidas a tratamento,
(3) o nmero de unidades r com resposta positiva ao
tratamento,
(4) o logaritmo x da dose,
(5) a fraco p = r/n das respostas positivas do grupo.
(4)
Embora na maioria dos textos de estatstica publicados em portugus se
mantenha o termo probit, entendeu-se traduzir pelo seu real significado
probabilidade iterativa.
713
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

O primeiro ciclo comea aqui. e a intercepo a do padro, e igualmente para as amostras,

(6) a coluna Y preenchida com zeros na primeira iteraco,
(7) o valor = (Y) da funo da distribuio normal
padronizada cumulativa (ver igualmente a tabela 8.4).
As colunas (8) a (10) so calculadas usando as seguintes
obtm-se
A coluna (6) da primeira tabela de trabalho pode agora ser
substituda por Y = a + bx e o ciclo repete-se at que a diferena
entre 2 ciclos seja pequena (por exemplo, a mxima diferena de
Y entre dois ciclos consecutivos menor que 10-8).

P 4.2.2. TESTES DE VALIDAO

y Y
Z
A validade dos ensaios deve ser avaliada antes de calcular
a actividade e os intervalos de confiana. Os desvios
linearidade podem ser medidos como se segue, se pelos
2 menos 3 doses de cada preparao forem includas: adicione
uma 13 coluna tabela 4.2.1.-II e preencha-a com:
5. Textos gerais

As colunas (11) a (15) podem ser facilmente calculadas a partir

das colunas (9) e (10) como wx, wx2 e wxy, respectivamente,
e o somatrio () de cada uma das colunas (10) a (15)
calculada separadamente para cada uma das preparaes.
Os somatrios calculados na tabela 4.2.1.-I so transferidos
para as colunas (1) a (6) da tabela 4.2.1.-II e as 6 colunas
adicionais (7) a (12) so calculadas como se segue:
O somatrio da coluna a medida dos desvios linearidade
e segue aproximadamente uma distribuio 2 com N-2h
graus de liberdade. A significncia deste valor pode ser
avaliada com a ajuda da tabela 8.3 ou com uma subrotina
apropriada de um programa informtico. Se o valor for
significativo para o nvel de probabilidade 0,05, o ensaio deve
provavelmente ser rejeitado (ver seco 4.2.4). Quando o
teste acima no der uma indicao de desvios significativos
regresso linear, os desvios ao paralelismo so testados para o
nvel de significncia 0,05 com:

com h-1 graus de liberdade.

4.2.3. CLCULO DA ACTIVIDADE E SEUS LIMITES DE

CONFIANA

Quando no existirem indicaes de um desvio significativo

do paralelismo e linearidade o ln(relao de actividade) MT
calculado com:

TABELA 4.2.1.-I. Primeira tabela de trabalho

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)
dose n r x p Y Z y w wx wy wx2 wy2 wxy
S . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .

T . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .

etc.

714 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 4.2.1.-II. Segunda tabela de trabalho

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)
w wx wy wx2 wy2 wxy Sxx Sxy Syy
x y a
S . . . . . . . . . . . .
T . . . . . . . . . . . .
etc. . . . . . .

e o antilogaritmo retido. Faa t = 1,96 e s = 1. Os limites de
confiana so calculados como os antilogaritmos de:
50 por cento das unidades. O mtodo probit pode ser usado
para determinar a dose efectiva mediana (ED50), mas uma vez
que no h necessidade de exprimir esta dose relativamente a
um padro, as frmulas so ligeiramente diferentes.
Nota: pode opcionalmente ser includo um padro de modo
a validar um ensaio. Habitualmente o ensaio considerado
vlido se o valor calculado de ED50 para o padro for
suficientemente prximo da ED50 assumida. O significado
de suficientemente prximo neste contexto depende dos

5. Textos gerais
requisitos especificados na monografia.
A tabulao das respostas das amostras, e opcionalmente do
4.2.4. RESULTADOS INVLIDOS padro, realizada de acordo com o descrito na seco 4.2.1. O
teste para a linearidade realizado tal como descrito na seco
Se o teste de desvio linearidade descrito na seco 4.2.2 4.2.2. Para este tipo de ensaio no h necessidade de fazer o teste
for significativo, o ensaio deve normalmente ser rejeitado. de paralelismo. A ED50 da amostra T, e de igual modo para as
Se existirem razes para conservar o ensaio, as frmulas so outras amostras, obtido tal como descrito na seco 4.2.3, com
ligeiramente modificadas. t transforma-se no valor-t as seguintes modificaes nas frmulas 4.2.3.-1 e 4.2.3.-2).
(p = 0,05) com o mesmo nmero de graus de liberdade usado
para verificar a linearidade e s2 transforma-se no valor de 2
dividido pelo mesmo nmero de graus de liberdade (e assim
tipicamente maior que 1).
O teste para paralelismo tambm ligeiramente modificado.
O valor de 2 para no-paralelismo dividido pelo seu
nmero de graus de liberdade. O valor obtido dividido pelo
valor de s2 anteriormente calculado de modo a obter o rcio-
-F com h-1 e N-2h graus de liberdade, que avaliado do
modo habitual para o nvel de significncia 0,05.

4.3. O MTODO LOGIT
Tal como indicado na seco 4.1 o mtodo logit pode, por
vezes, ser o mais apropriado. O nome do mtodo derivado
da funo logit que o inverso da distribuio logstica. O
procedimento idntico ao descrito para o mtodo probit
com as seguintes modificaes nas frmulas e Z.
5. EXEMPLOS
Esta seco composta por exemplos trabalhados para ilustrar
a aplicao das frmulas. Os exemplos foram seleccionados
com o objectivo principal de ilustrar os mtodos estatsticos
de clculo. No tm por objectivo reflectir o mtodo mais
adequado para o ensaio, caso as monografias individuais
permitam a possibilidade de usar alternativas. Para aumentar o
seu valor para a validao de programas, so apresentados mais
nmeros decimais do que o necessrio. Deve igualmente ser
notado que existem outros mtodos de clculo equivalentes.
Esses mtodos devem conduzir exactamente aos mesmos
resultados do que os apresentados nos exemplos.

4.4. OUTRAS FORMAS DA CURVA 5.1. MODELO DE LINHAS PARALELAS

Os mtodos probit e logit so quase sempre adequados para
as anlises de respostas qualitativas exigidas na Farmacopeia.
No entanto, deve ser referido que a curva ln(dose)-resposta
tem outras formas para alm das 2 curvas descritas, podendo
ser adoptada uma outra curva .
5.1.1. ENSAIO MLTIPLO DE DUAS DOSES COM DESENHO
COMPLETAMENTE ALEATRIO
Ensaio de corticotrofina por injeco subcutnea em rato

Por exemplo, se for demonstrado que a curva no simtrica,
pode ser apropriado aplicar a distribuio de Gompertz (mtodo
gompit) sendo nesse caso e 1 e e Y e Z eY eY.
4.5. A DOSE EFECTIVA MEDIANA
Em alguns tipos de ensaios desejvel determinar a dose
efectiva mediana que a dose que produz uma resposta em
O padro administrado nas doses de 0,25 e 1,0 unidade
por 100 g de peso corporal. Assumiu-se que as 2 amostras
tm uma actividade de 1 unidade por miligrama e so
administradas nas mesmas quantidades que o padro. As
respostas individuais e as mdias de cada grupo tratado so
apresentadas na tabela 5.1.1.-I. A representao grfica no
sugere qualquer dvida quanto homogeneidade da varincia
e normalidade dos dados, mas sugere problemas quanto ao
paralelismo da preparao U.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 715

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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.1.1.-I Resposta instrumental y massa de cido tambm significativo (p = 0,0075) o que era esperado da
ascrbico (mg) por 100 g de glndula supra-renal observao do grfico onde a amostra U no paralela ao
padro. Esta amostra por isso rejeitada e a anlise repetida
Padro S Amostra T Amostra U
usando apenas a amostra T e o padro.
S1 S2 T1 T2 U1 U2
300 289 310 230 250 236 TABELA 5.1.1.-III Anlise de varincia sem a amostra U
310 221 290 210 268 213 Graus Soma
330 267 360 280 273 283 Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F
290 236 341 261 240 269 liberdade quadrados
364 250 321 241 307 251 Amostras 1 390,6 390,6
328 231 370 290 270 294 Regresso 1 66830,6 66830,6 90,5 0,000
390 229 303 223 317 223 No lineariadade 1 34,2 34,2 0,05 0,831
360 269 334 254 312 250
Tratamentos 3 67255,5
342 233 295 216 320 216
306 259 315 235 265 265 Erro residual 36 26587,3 738,54
mdia 332,0 248,4 323,9 244,0 282,2 250,0 Total 39 93842,8

A anlise sem a amostra U conclui que os resultados esto de

5. Textos gerais

acordo com os requisitos quanto regresso e ao paralelismo,

e em consequncia a actividade pode ser calculada. As
frmulas na seco 3.2.5 do:

FIGURA 5.1.1.-I.

As frmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos

resultados:

PS 580,4 LS 41,8
Tomando os antilogaritmos encontramos a relao de
P T 567,9 LT 39,95 actividade de 1,11 com os limites de confiana para 95 por
cento entre 0,82 e 1,51.
PU 532,2 LU 16,1
120 Multiplicando pela actividade assumida da amostra T conduz
HP 10/2 5 HL 20 a uma actividade de 1,11 unidades/mg com os limites de
6
confiana para 95 por cento entre 0,82 e, 1,51 unidades/mg.
A anlise de varincia pode agora ser completada com as
frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.1.-II
apresenta os resultados. 5.1.2. DESENHO DE QUADRADO LATINO COM 3 DOSES
TABELA 5.1.1.-II Anlise de varincia
Ensaio de difuso de um antibitico usando um tabuleiro
Graus Soma rectangular
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F O padro tem uma actividade atribuda de 4855 UI/mg. A
liberdade quadrados
Amostas 2 6256,6 3128,3 amostra tem uma actividade assumida de 5600 UI/mg. Para
as solues de armazenamento dissolva 25,2 mg de padro
Regresso 1 63830,8 63830,8 83,38 0,000
em 24,5 ml de solvente, e 21,4 mg de amostra em 23,95 ml
No paralelismo 2 8218,2 4109,1 5,37 0,007 de solvente. As solues finais so preparadas diluindo
Tratamentos 5 78305,7 inicialmente as solues de armazenamento a 1/20 e de
seguida usando uma razo de diluio de 1,5.
Erro residual 54 41340,9 765,57
Total 59 119646,6 O quadrado latino gerado com o mtodo descrito na seco
8.6 (ver tabela 5.1.2.-I). As respostas deste ensaio de rotina
A anlise confirma a existncia de uma regresso linear so mostradas na tabela 5.1.2.-II (halos de inibio em mm
altamente significativa. O desvio ao paralelismo, no entanto, 10). Os valores mdios dos tratamentos so mostrados

716 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

na tabela 5.1.2.-III. A representao grfica dos dados (ver A anlise de varincia pode agora ser completada com as
figura 5.1.2.-I) no coloca dvidas quanto normalidade e frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.2.-IV
homogeneidade da varincia dos dados. apresenta os resultados

TABELA 5.1.2.-I Distribuio dos tratamentos na placa TABELA 5.1.2.-IV Anlise de varincia
1 2 3 4 5 6 Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
S1 T1 T2 S3 S2 T3 de dos Probabilidade
1 da variao mdio F
liberdade quadrados
2 T1 T3 S1 S2 T2 S3 Amostas 1 11,1111 11,1111
3 T2 S3 S2 S1 T3 T1 Regresso 1 8475,0417 8475,0417 408,1 0,000
4 S3 S2 T3 T1 S1 T2 No paralelismo 1 18,3750 18,3750 0,885 0,358
5 S2 T2 S3 T3 T1 S1 No
2 5,4722 2,7361 0,132 0,877
6 T3 S1 T1 T2 S3 S2 lineariadade
Tratamentos 5 8510
TABELA 5.1.2.-II Medidas das zonas de inibio (mm 10) Blocos 5 412 82,40 3,968 0,012

5. Textos gerais
Colunas 5 218,6667 43,73 2,106 0,107
1 2 3 4 5 6 mdia de linha
Erro residual 20 415,3333 20,7667
1 161 160 178 187 171 194 175,2 R1
Total 35 9556
2 151 192 150 172 170 192 171,2 R2
3 162 195 174 161 193 151 172,7 R3 A anlise mostra diferenas significativas entre as linhas.
4 194 184 199 160 163 171 178,5 R4 Isto indica o aumento de preciso adquirido pela utilizao
5 176 181 201 202 154 151 177,5 R5 desenho do quadrado latino em vez de um desenho
completamente aleatrio. Uma regresso altamente
6 193 166 161 186 198 182 181,0 R6
significativa e uma origem sem significncia das linhas
mdia individuais da regresso para o paralelismo e linearidade
de 172,8 179,7 177,2 178,0 174,8 173,5
coluna C1 confirmam que o ensaio satisfaz as actividades calculadas.
C2 C3 C4 C5 C6
As frmulas na seco 3.2.5 do:
TABELA 5.1.2.-III Mdia dos tratamentos
para o declive comum:
Padro S Amostra T 3 (35,833 39,333)
S1 S2 S3 T1 T2 T3
b 46,346
ln 1,5 6 2
mdia 158,67 176,50 194,50 156,17 174,67 195,50
o ln(actividade) :
526,333 529,667
MT 0,023974
3 46,346

A relao de actividade encontrada tomando os

antilogaritmos, resultando em 0,9763 com os limites de
confiana para 95 por cento de 0,9112 a 1,0456.

FIGURA 5.1.2.-I. necessrio aplicar o factor de correco de

As frmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos 4855 25,2/24,5

0,00700
resultados: 5600 21,4 / 23,93

PS 529,667 LS 35,833 porque as solues no so exactamente equivalentes com

base na sua actividade assumida. Multiplicando por este factor
P T 526,333 LT 39,333
a potncia assumida de 5 600 UI/mg obtm-se a potncia de
72 5 456 UI/mg com limites de confiana para 95 por cento entre
HP 6/3 2 HL 3
24
5 092 e 5 843 UI/mg.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 717

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5.3. Anlises estatsticas

5.1.3. DESENHO DE UM BLOCO ALEATRIO DE 4 DOSES TABELA 5.1.3.-II Anlise de varincia

Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
Titulao de um antibitico por turbidimetria da variao
de dos
mdio F
Probabilidade
liberdade quadrados
O objectivo desta titulao a atribuio de uma actividade
Amostas 1 632,025 632,025
em unidades internacionais por ampola. A actividade
atribuda do padro de 670 UI/ml, a actividade assumida da Regresso 1 101745,6 101745,6 1887,1 0,000
amostra de 20 000 UI/ampola. Com base nestes dados, so
No paralelismo 1 25,205 25,205 0,467 0,500
preparadas as solues-me como se segue: dissolver
16,7 mg do padro em 25 ml de solvente, e o contedo de No lineariadade 4 259,14 64,785 1,202 0,332
uma ampola da amostra em 40 ml de solvente. As solues
finais so obtidas atravs de uma primeira diluio a 1/40 das Tratamentos 7 102662
2 solues-me, seguidas de uma srie de diluies na razo Linhas 4 876,75 219,188 4,065 0,010
de 1,5. Os tubos so colocados em banho de gua segundo
uma repartio em blocos completos (ver seco 8.5). As Erro residual 28 1509,65 53,916
respostas obtidas so registadas na tabela 5.1.3.-I. Total 39 105048,4
A anlise da figura 5.1.3.-I no pe em dvida a validao das
hipteses da normalidade dos dados e da homogeneidade da
5. Textos gerais

Existe uma diferena significativa entre os blocos, o que

varincia. O desvio padro de S3 um pouco elevado mas sem demonstra que um ensaio de blocos completos permite obter
apresentar razes para preocupao. A aplicao das frmulas uma fidelidade superior. O carcter altamente significativo
das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduz aos seguintes resultados: da regresso e a ausncia de desvios de paralelismo e de
linearidade significativos confirmam que a titulao permite
PS 719,4 LS 229,1
calcular as actividades. As frmulas da seco 3.2.5 do:
P T 687,6 LT 222
60
HP 5/4 1,25 HL 1
60
A anlise de varincia efectuada com a ajuda das frmulas
apresentadas nas tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados
obtidos so apresentados na tabela 5.1.3.-II.

TABELA 5.1.3.-I Absorvncia das suspenses ( 1000)

Padro S Amostra T
Bloco S1 S2 S3 S4 T1 T2 T3 T4 Mdia
1 252 207 168 113 242 206 146 115 181,1
2 249 201 187 107 236 197 153 102 179,0
3 247 193 162 111 246 197 148 104 176,0
4 250 207 155 108 231 191 159 106 175,9
5 235 207 140 98 232 186 146 95 167,4
mdia 246,6 203,0 162,4 107,4 237,4 195,4 150,4 104,4 Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos
uma relao de actividade de 1,0741 com um intervalo de
confiana para 95 por cento de 1,0291 a 1,1214. A aplicao
670 16,7 / 25
de um factor de correco de 0,89512
20000 1 / 40
necessria porque, tendo em conta a actividade prevista
da amostra, as doses utilizadas no so exactamente
equivalentes. Multiplicando a relao de actividade por este
factor de correco e pela actividade assumida de
20 000 UI/ampola, obtemos uma actividade estimada de
19 228 UI/ampola, com um intervalo de confiana para 95 por
cento de 18 423 a 20 075 UI/ampola.

5.1.4. ENSAIO MLTIPLO DE 5 DOSES COMPLETAMENTE

ALEATRIAS

Titulao in vitro de 3 vacinas da hepatite B por comparao

com um padro
Trs sries independentes de 5 diluies a 0,5 so preparadas
a partir de cada vacina. Aps alguns passos adicionais
inerentes ao ensaio, a absorvncia foi medida. Os resultados
FIGURA 5.1.3.-I. obtidos so apresentados na tabela 5.1.4.-I.

718 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.1.4.-I Absorvncia

PS 9,108 LS 6,109
Diluio Padro S Amostra T
1:16000 0,043 0,045 0,051 0,097 0,097 0,094 P T 5,586 LT 6,264
1:8000 0,093 0,099 0,082 0,167 0,157 0,178
1:4000 0,159 0,154 0,166 0,327 0,355 0,345 PU 6,544 LU 6,431

1:2000 0,283 0,295 0,362 0,501 0,665 0,576

PV 6,027 LV 6,384
1:1000 0,514 0,531 0,545 1,140 1,386 1,051
3 36
HP 0,6 HL 0,3
5 120
Diluio Amostra U Amostra V
1:16000 0,086 0,071 0,073 0,082 0,082 0,086 A anlise de varincia completada com as frmulas das
1:8000 0,127 0,146 0,133 0,145 0,144 0,173 tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados obtidos so
1:4000 0,277 0,268 0,269 0,318 0,306 0,316
apresentados na tabela 5.1.4.-III.
1:2000 0,586 0,489 0,546 0,552 0,551 0,624
1:1000 0,957 0,866 1,045 1,037 1,039 1,068 TABELA 5.1.4.-III Anlise de varincia

5. Textos gerais
Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F
liberdade quadrados
Os logaritmos da densidade ptica tm uma relao linear
Amostas 3 4,475 1,492
com os logaritmos das doses. As mdias das transformadas
logartmicas dos valores da densidade ptica so apresentadas Regresso 1 47,58 47,58 7126 0,000
na tabela 5.1.4.-II. A representao grfica dos dados no No paralelismo 3 0,0187 0,006 0,933 0,434
demonstra nenhuma anomalia.
No lineariadade 12 0,0742 0,006 0,926 0,531

Tratamentos 19 52,152
TABELA 5.1.4.-II Mdia das transformadas logartmicas Erro residual 40 0,267 0,0067
de absorvncia
Total 59 52,42
S1 3,075 T1 2,344 U1 2,572 V1 2,485

S2 2,396 T2 1,789 U2 2,002 V2 1,874

Uma regresso altamente significativa e a ausncia de desvios
S3 1,835 T3 1,073 U3 1,305 V3 1,161
do paralelismo e de linearidade confirmam que a actividade
S4 1,166 T4 0,550 U4 0,618 V4 0,554 pode ser calculada com segurana. As frmulas da seco
S5 0,635 T5 0,169 U5 0,048 V5 0,047 3.2.5 do:
para o declive comum

0,3 (6,109 6,264 6,431 6,384)

b 0,90848
ln 2 3 4

para ln(relao de actividade) da amostra T:

FIGURA 5.1.4.-I.
Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos
A aplicao das frmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II uma relao de actividade de 2,171 com um intervalo de
conduz aos seguintes resultados: confiana para 95 por cento de 2,027 a 2,327.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 719

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5.3. Anlises estatsticas

Como todas as preparaes tm uma actividade assumida TABELA 5.1.5.-II Resposta y: soma dos valores da glicmia
de 20 g de protena por mililitro, o clculo d para a (mg/100ml) aps 1 hora e 2,5 horas
mostra T uma actividade de 43,3 g de protena por
grupo 1 grupo 2 grupo 3 grupo 4
mililitro com um intervalo de confiana para 95 por cento
de 40,5 a 46,5 g de protena por mililitro. S1 T2 S2 T1 T1 S2 T2 S1

O mesmo procedimento usado para calcular a actividade 112 104 65 72 105 91 118 144
das outras amostras e dos intervalos de confiana 126 112 116 160 83 67 119 149
associados. Os resultados obtidos so apresentados na 62 58 73 72 125 67 42 51
tabela 5.1.4.-IV. 86 63 47 93 56 45 64 107
52 53 88 113 92 84 93 117
TABELA 5.1.4.-IV Clculos finais da actividade das vacinas a
examinar e limites de confiana para 95 por cento (em g de 110 113 63 71 101 56 73 128
protena por mililitro) 116 91 50 65 66 55 39 87
101 68 55 100 91 68 31 71
Limite inferior Estimativa Limite superior
mdia 95,6 82,8 69,6 93,3 89,9 66,6 72,4 106,8
Vacina T 40,5 43,4 46,5
5. Textos gerais

Vacina U 32,9 35,2 37,6

Vacina V 36,8 39,4
5.1.5. DUPLO ENSAIO CRUZADO
Titulao de insulina por injeco subcutnea em coelhos
O padro administrado a 1 unidade e 2 unidades por
mililitro. A amostra administrada em doses equivalentes
determinadas com base na actividade assumida do produto
que de 40 unidades por mililitro. Cada animal recebe por
via subcutnea 0,5 ml das solues apropriadas, de acordo
com o plano representado na tabela 5.1.5.-I. As respostas
obtidas so apresentadas na tabela 5.1.5.-II. A grande
varincia constatada reflecte a variabilidade dos resultados
entre os animais e mostra a utilidade de aplicar um ensaio
cruzado.
A anlise de varincia mais complicada neste ensaio do que nos
42,2 outros porque, na soma dos quadrados, a componente devida
ao paralelismo no independente da devida s diferenas entre
animais. Para verificar o paralelismo das rectas de regresso,
necessrio calcular um segundo termo de erro obtido subtraindo
a componente do paralelismo e duas componentes de interaco
componente devida s diferenas entre animais.
A anlise de varincia usa 3 componentes de interaco
resultantes da repetio dos tratamentos no interior de cada
grupo:
dias preparao; dias regresso; dias paralelismo.
Estes termos reflectem a tendncia que tm os factores
considerados (preparaes, regresso e paralelismo) para
variar de dia para dia. Os rcio-F correspondentes permitem
verificar a validade do ensaio neste aspecto. Se os valores
de F so significativamente elevados, convm interpretar
os resultados do ensaio com circunspeco e mesmo, se
possvel, de o reiniciar.
A anlise de varincia realizada aplicando as frmulas das
tabelas 3.2.3.-I a 3.2.3.-III separadamente para cada um dos 2
dias e ao conjunto de todos os dados. As frmulas das tabelas
3.2.3.I e 3.2.3.-II do:

Dia 1 PS 165,25 LS 13

P T 162,25 LT 8,75
8 96
HP 4 HL 16
2 6
Dia 2 PS 173,38 LS 20,06

P T 176,99 LT 5,25
8 96
HP 4 HL 16
2 6
conjunto PS 169,31 LS 16,53

P T 169,13 LT 7,00
16 192
HP 8 HL 32
FIGURA 5.1.5.-I. 2 6
e as frmulas da tabela 3.2.3.-III permitem calcular:
TABELA 5.1.5.-I Ordem dos tratamentos
Dia 1 Dia 2 Conjunto
Grupo de coelhos
1 2 3 4
SSprep 18,000 SSprep 13,781 SSprep 0,141

dia 1 S1 S2 T1 T2 SSreg 3784,5 SSreg 5125,8 SSreg 8859,5

dia 2 T2 T1 S2 S1 SSpar 144,5 SSpar 1755,2 SSpar 1453,5

720 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

Os termos da interaco obtm-se pela operao: Dia 1 Dia Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos
2 conjunto: uma relao de actividade de 1,003 com um intervalo
de confiana para 95 por cento de 0,835 a 1,204. Estes
SSdias prep 31,64 resultados multiplicados por AT = 40 do uma actividade de
SSdias reg 50,77 40,1 unidades por mililitro com um intervalo de confiana
para 95 por cento de 33,4 a 48,2 unidades por mililitro.
SSdias par 446,27
Calcula-se tambm a soma dos quadrados devidos 5.2. MODELO DE RELAO DE DECLIVES
variabilidade diria:
5.2.1. DESENHO COMPLETAMENTE ALEATRIO (0,3,3)

Ensaio do factor VIII

e a soma dos quadrados devidos aos blocos (variabilidade
Um laboratrio desenvolve um ensaio colorimtrico do
entre animais):
factor VIII em solues concentradas. O laboratrio no
tem experincia deste tipo de titulaes mas tenta torn-lo
operacional. So preparadas 3 diluies equivalentes para o
padro e para a amostra. igualmente preparado um branco

5. Textos gerais
onde Bi a resposta mdia por animal. embora no seja esperada uma relao dose-resposta linear
para as doses mais baixas. Cada diluio observada com
A anlise de varincia pode ser completada conforme descrito 8 rplicas, um nmero superior ao que ser utilizado nos
na tabela 5.1.5.-III. ensaios de rotina.
TABELA 5.1.5.-III Anlise de varincia A representao grfica dos dados mostra claramente que a
relao dose-resposta efectivamente no linear para as doses
Graus Soma baixas. As respostas obtidas para o branco no so usadas nos
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao
liberdade quadrados
mdio F clculos (so necessrios novos ensaios para justificar esta
deciso). As frmulas das tabelas 3.3.3.2.-I e 3.3.3.1-II do:
No paralelismo 1 1453,5 1453,5 1,064 0,311
PS = 0,6524 PT = 0,5651
Dias amostra 1 31,6 31,6 0,023 0,880
Dias reg. 1 50,8 50,8 0,037 0,849 LS = 1,4693 LT = 1,2656
Erro residual aS = 0,318 aT = 0,318
28 38258,8 1366,4
entre coelhos
bS = 0,329 bT = 0,271
Coelhos 31 39794,7 1283,7
Amostras 1 0,14 0,14 0,001 0,975
GS = 0,1554 GT = 0,1156
Regresso 1 8859,5 8859,5 64,532 0,000 JS = 4,17 . 10-8 JT = 2,84 . 10-6
Dias 1 478,5 478,5 3,485 0,072 e
Dias no para 1 446,3 446,3 3,251 0,082 HI = 0,09524 a= 0,05298 K = 1,9764
Erro residual
entre coelhos
28 3844,1 137,3 E a anlise de varincia realizada com a ajuda das frmulas
das tabelas 3.3.3.1.-III e 3.3.3.1.-IV.
Total 63 53423,2
A existncia de uma regresso muitssimo significativa e a
As frmulas da seco 3.2.5. do: ausncia de desvio da linearidade e interseco indicam que a
actividade pode ser calculada.
para o declive comum
Declive da curva do padro:

para ln(relao de actividade): Declive da curva da amostra

A aplicao da frmula 3.3.5.1.-3 d:

e para o In(limites de confiana):

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 721

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5.3. Anlises estatsticas

e os limites de confiana para 95 por cento so: 5.2.2. ENSAIO TOTALMENTE ALEATRIO (0,4,4,4)

Ensaio in vitro de vacinas da gripe

O teor em antigneo da hemaglutinina (AH) de 2 vacinas
gripais determinado por imunodifuso radial simples. As 2
vacinas possuem uma actividade declarada de 15 g de AH
A relao de actividade estimada de 0,823 com um intervalo por dose, equivalente a um teor em AH de 30 g/ml. O teor
de confiana para 95 por cento entre 0,817 e 0,829. em AH atribudo ao padro de 39 g/ml.
O padro e as vacinas a titular so examinadas em 4
TABELA 5.2.1.-I Absorvncias concentraes, preparadas em duplicado com base nos
respectivos teores (atribudo ou declarado). Quando obtido
branco padro S (em UI/ml) amostra T (em UI/ml) o equilbrio entre o reagente interno e o reagente externo,
Conc. B S1 S2 S3 T1 T2 T3 mede-se a rea da zona anelar da precipitao. Os resultados
0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03
obtidos so apresentados na tabela 5.2.2.-I.
0,022 0,133 0,215 0,299 0,120 0,188 0,254 A representao grfica dos dados no apresenta nenhum
aspecto fora do habitual. A aplicao das frmulas das tabelas
0,024 0,133 0,215 0,299 0,119 0,188 0,253
5. Textos gerais

3.3.3.1.-I e 3.3.3.1-II do:

0,024 0,131 0,216 0,299 0,118 0,190 0,255
0,026 0,136 0,218 0,297 0,120 0,190 0,258 PS = 108,2 P T = 103,85 PU = 85,8
0,023 0,137 0,220 0,297 0,120 0,190 0,257 LS = 301,0 LT = 292,1 LU = 234,1
0,022 0,136 0,220 0,305 0,121 0,191 0,257
aS = 141,0 aT = 116,7 aU = 139,8
0,022 0,138 0,219 0,299 0,121 0,191 0,255
bS = 61,2 bT = 64,95 bU = 39,2
0,023 0,137 0,218 0,302 0,121 0,190 0,254
GS = 3114,3 GT = 2909,4 GU = 1917,3
mdia 0,0235 0,1351 0,2176 0,2996 0,1200 0,1898 0,2554
JS = 0,223 JT = 2,227 JU = 0,083

e
HI = 0,0093 a = 11,04 K = 14785,8

E a anlise de varincia realizada com a ajuda das frmulas

das tabelas 3.3.3.1.III e 3.3.3.1.-IV. Os resultados obtidos so
apresentados na tabela 5.2.2.-II.
A existncia de uma regresso muitssimo significativa e a
ausncia de desvio da linearidade e interseco indicam que a
actividade pode ser calculada.
Declive da curva do padro:

Declive da curva da vacina T:

FIGURA 5.2.1.-I.

Declive da curva da vacina U:

TABELA 5.2.1.-II Anlise de varincia

Origem Graus Soma Quadrado Rcio

da variao de dos mdio F Probabilidade
liberdade quadrados
Regresso 2 0,1917 0,0958 24850 0,000
Interseco 1 3.109 3.109 7.104 0,978 A relao de actividade estimada de 6,056/6,356 = 0.953
para a vacina T e de 4,123/6,356 = 0,649 para a vacina U.
No linear 2 2.105 1.105 2,984 0,061
Tratamentos 5 0,1917
Erro residual 42 1,62.104 3,86.106
Total 47 0,1919

722 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

Os limites de confiana so dados pela frmula 3.3.5.1.-4. TABELA 5.2.2.-III Estimativa da quantidade de AH (g/dose)

Para a vacina T: Limite inferior Estimativa Limite superior

Vacina T 13,4 14,3 15,3
Vacina U 8,9 9,7 10,6

Para a vacina U:
5.3. RESPOSTAS QUALITATIVAS

5.3.1. TITULAO DE UMA PREPARAO RELATIVAMENTE

O teor em AH, expresso em g/dose, calculado
multiplicando as relaes de actividade e os limites de
confiana pela actividade assumida (15 g/dose). Os
resultados obtidos figuram na tabela 5.2.2.-III.
A UM PADRO PELO MTODO DA PROPABILIDADE
ITERACTIVA (PROBIT)
Ensaio in vivo de uma vacina diftrica
Uma vacina diftrica, com a actividade assumida de 140
UI/ampola, titulada por comparao com um padro
com a actividade atribuda de 132 UI/ampola. Com bases

5. Textos gerais
TABELA 5.2.2.-I Superfcie de precipitao (mm2) nestas actividades, preparam-se doses equivalentes destas
preparaes, que so administradas de modo aleatrio a um
Conc. Padro S Amostra T Amostra U grupo de cobaios. Aps determinado intervalo de tempo, os
(g/ml) I II I II I II animais so submetidos a uma prova de virulncia atravs da
7,5 18,0 18,0 15,1 16,8 15,4 15,7 toxina diftrica. Os resultados obtidos, expressos em nmero
de animais sobreviventes, so apresentados na tabela 5.3.1.-I.
15,0 22,8 24,5 23,1 24,2 20,2 18,6
22,5 30,4 30,4 28,9 27,4 24,2 23,1 Os valores so transpostos para a primeira tabela de trabalho,
onde so calculadas as colunas seguintes como descrito na
30,0 35,7 36,6 34,4 37,8 27,4 27,0
seco 4.2.1. A tabela 5.3.1.-II representa o primeiro ciclo de
clculo.

TABELA 5.3.1.-I Dados brutos do ensaio

em cobaios da vacina diftrica

Padro (S) Amostra (T)

actividade atribuda actividade assumida
132 UI/ampola 140 UI/ampola
dose submetidos protegidos dose submetidos protegidos
(UI/ml) a prova (UI/ml) a prova
1,0 12 0 1,0 11 0
1,6 12 3 1,6 12 4
2,5 12 6 2,5 11 8
4,0 11 10 4,0 11 10

FIGURA 5.2.2.-I.

TABELA 5.2.2.-II Anlise de varincia

Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F
liberdade quadrados
Regresso 3 1087,7 362,6 339,5 0,000
Interseco 2 3,474 1,737 1,626 0,237
No linear 6 5,066 0,844 0,791 0,594
Tratamentos 11 1096,2
Erro residual 12 12,815 1,068
Total 23 1109,0
FIGURA 5.3.1.-I.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 723

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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.3.1.-II. Primeira tabela de trabalho no primeiro ciclo

Vacina Dose n r x p Y Z y w wx wy wx2 wy2 wxy

S 1,0 12 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 1,253 7,64 0,00 9,57 0,00 12,00 0,00

1,6 12 3 0,470 0,250 0 0,5 0,399 0,627 7,64 3,59 4,79 1,69 3,00 2,25

2,5 12 6 0,916 0,500 0 0,5 0,399 0,000 7,64 7,00 0,00 6,41 0,00 0,00

4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95

T 1,0 11 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 1,253 7,00 0,00 8,78 0,00 11,0 0,00

1,6 12 4 0,470 0,333 0 0,5 0,399 0,418 7,64 3,59 3,19 1,69 1,33 1,50

2,5 11 8 0,916 0,727 0 0,5 0,399 0,570 7,00 6,42 3,99 5,88 2,27 3,66

4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95

TABELA 5.3.1.-III. Segunda tabela de trabalho no primeiro ciclo

5. Textos gerais

vacina w wx wy wx2 wy2 wxy2 Sxx Sxy Syy

x
y a
S 29,92 20,30 7,18 21,56 22,36 7,70 7,79 12,58 20,64 0,68 0,24 1,36

T 28,65 19,72 0,80 21,03 21,97 12,11 7,46 12,66 21,95 0,69 0,03 1,17

TABELA 5.3.1.-IV. Primeira tabela de trabalho no segundo ciclo

Vacina Dose n r x p Y Z y w wx wy wx2 wy2 wxy

S 1,0 12 0 0,000 0,000 1,36 0,086 0,158 1,911 3,77 0,00 7,21 0,00 13,79 0,00
1,6 12 3 0,470 0,250 0,58 0,279 0,336 0,672 6,74 3,17 4,53 1,49 3,04 2,13
2,5 12 6 0,916 0,500 0,15 0,561 0,394 0,001 7,57 6,94 0,01 6,36 0,00 0,01
4,0 11 10 1,386 0,909 0,93 0,824 0,258 1,260 5,07 7,03 6,39 9,75 8,05 8,86
T 1,0 11 0 0,000 0,000 1,17 0,122 0,202 1,769 4,20 0,00 7,43 0,00 13,14 0,00
1,6 12 4 0,470 0,333 0,39 0,349 0,370 0,430 7,23 3,40 3,11 1,60 1,34 1,46
2,5 11 8 0,916 0,727 0,35 0,637 0,375 0,591 6,70 6,14 3,96 5,62 2,34 3,63
4,0 11 10 1,386 0,909 1,13 0,870 0,211 1,311 4,35 6,03 5,70 8,36 7,48 7,90

TABELA 5.3.1.-V. Segunda tabela de trabalho depois do ltimo ciclo

vacina w wx wy wx2 wy2 wxy Sxx Sxy Syy

x
y a
S 18,37 14,80 2,14 14,85 17,81 5,28 2,93 7,00 17,56 0,81 0,12 2,05
T 17,96 12,64 0,55 11,86 18,35 6,76 2,96 7,15 18,34 0,70 0,03 1,72

A soma das 6 ltimas colunas desta tabela realizada de teste de paralelismo pode ser efectuado como descrito na
seguida para cada uma das preparaes, e os resultados so mesma seco. O valor de 2 com 1 grau de liberdade de
transportados para a segunda tabela de trabalho (ver tabela
5.3.1.-III), onde as outras colunas so calculadas com a
ajuda das frmulas 4.2.1.-4 a 4.2.1.-10. O declive comum b
resultante de 1,655.
de 0,974 o que no significativo.
De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na primeira Procedendo como indicado na seco 4.2.3, obtemos as
tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o segundo ciclo de seguintes estimativas:
clculo (tabela 5.3.1.-IV).
para ln(relao de actividade):
Procede-se assim por ciclos de clculos iteractivos at
obteno de uma diferena mnima entre 2 ciclos
consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se
ento sob a forma indicada na tabela 5.3.1.-V.
O teste de linearidade feito conforme descrito na seco
4.2.2. O valor de 2 com 4 graus de liberdade de
0,851 1,070 1,921, ou seja, um valor de p de 0,750 o
que no significativo.
Uma vez que no h desvio significativo da linearidade, o

724 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

e para ln(limites de confiana): TABELA 5.3.3.-I Diluies (10x l de vacina no diluda)

A actividade e os limites de confiana podem agora ser

obtidos multiplicando os antilogaritmos pela actividade
assumida (149 UI/ampola). A estimativa assim obtida de
160,6 UI/ampola com um intervalo de confiana para 95 por
cento entre 121,0 e 215,2 UI/ampola.

5.3.2. MTODO LOGIT E OUTROS MTODOS DE ANLISE

DA TITULAO DE UMA AMOSTRA RELATIVAMENTE A UM
PADRO

5. Textos gerais
Os resultados sero fornecidos para a situao onde o mtodo
logit e outros mtodos clssicos desta famlia so aplicados
para os dados da seco 5.3.1. Este exemplo deve ser
considerado como um exerccio iluestrativo, e no como uma
alternativa ao mtodo da probabilidade iteractiva (probit)
no caso particular. S poder ser utilizada outra funo com
base em justificaes experimentais ou tericas.

FIGURA 5.3.3.-I.

A soma das 6 ltimas colunas desta tabela realizada de

5.3.3. DETERMINAO DA DE50 DE UMA SUBSTNCIA
PELO MTODO DA PROBABILIDADE ITERACTIVA (PROBIT)
seguida e os resultados so transportados para a segunda
tabela de trabalho (ver tabela 5.3.3.-III), onde as outras
colunas so calculadas com a ajuda das frmulas 4.2.1.-4 a
4.2.1.-10. O declive comum b resultante de -0,295.
De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na primeira
tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o segundo ciclo de
clculo. Procede-se assim por ciclos de clculos iteractivos
at obteno de uma diferena mnima entre 2 ciclos
consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se
ento sob a forma indicada na tabela 5.3.3.-IV.
O teste de linearidade feito conforme descrito na seco
4.2.2. O valor de 2 com 8 graus de liberdade de 2,711, ou
seja, um valor de p de 0,951 o que no significativo.
Procedendo como indicado na seco 4.5, obtemos as
seguintes estimativas:
para ln(relao de actividade):

Ensaio in vitro de uma vacina oral da poliomielite (7,931)

MT 12,273
A titulao de uma vacina oral da poliomielite efectuada 0,646
pela determinao de DE50 em placas ELISA com 10 diluies
diferentes e 8 rplicas de 50 l. Os resultados obtidos so
apresentados na tabela 5.3.3.-I.
Estes valores so transpostos para a primeira tabela de
trabalho, onde so calculadas as colunas seguintes como
descrito na seco 4.2.1. A tabela 5.3.3.-II representa o
primeiro ciclo deste mtodo de clculo.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 725

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5.3. Anlises estatsticas

5. Textos gerais

e para ln(limites de confiana): no conduzem, na maior parte das situaes, a resultados

muito diferentes. Encontramos na seco 7.5 uma breve
discusso destas aproximaes alternativas bem como de
outras consideraes estatsticas.

TABELA 5.4.1.-I Respostas observadas

Esta estimativa expressa em termos de ln(diluio).
Para converter esta expresso em ln(DE50)/ml necessrio

Como a actividade deste tipo de vacina expresso em termos

de log10(DE50)/ml, necessrio dividir os resultados por
ln(10). A actividade estimada assim obtida igual a 6,63
log10(DE50)/ml, com um intervalo de confiana para 95 por
cento entre 6,30 e 6,96 log10(DE50)/ml.

5.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS

5.4.1. ANLISE DE UMA CURVA LOGSTICA DE 4

PARMETROS

Titulao serolgica de imunosoros tetnicos

Como j foi previamente indicado na seco 3.4, este exemplo
tem por objectivo ilustrar um modo possvel de anlise
dos dados apresentados, mas no necessariamente reflectir
o nico modo de anlise ou o mais apropriado. Muitas
outras aproximaes esto descritas na literatura, mas elas
Um imunosoro de cobaio doseado por comparao com
um imunosoro de referncia (0,4 UI/ml) com uma tcnica
de imunoadsoro por enzima conjugado (ELISA) Aplicam-
-se 10 diluies de cada soro numa placa ELISA com 96
pocilhos. Cada diluio aplicada 2 vezes. Os resultados
observados so apresentados na tabela 5.4.1.-I.

726 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.3. Anlises estatsticas

Para este exemplo assume-se que o laboratrio validou as
condies 1 a 3 especificadas na seco 3.1.1, quando o ensaio
foi desenvolvido em condies de rotina. Para alm disso,
o laboratrio validou tambm as condies de igualdade do
limite superior e do limite inferior das amostras.
A representao grfica no demonstra aspectos anormais.
Procede-se ao ajustamento dos parmetros da funo
logstica pelo mtodo dos mnimos quadrados, utilizando um
programa informtico apropriado, supondo que os termos de
erro residual so variveis aleatrias normais independentes
e identicamente distribudas. Neste caso so necessrios 3
parmetros ( , e ) para descrever o factor de declive
comum e as assmptotas comuns inferior e superior, mais
2 parmetros complementares (S e T) para descrever a
posio horizontal das 2 curvas. O programa fornece as
estimativas para os diferentes parmetros:
assmptotas superior e inferior no for satisfeita, provvel
que se observem desvios significativos de linearidade e/ou
paralelismo, uma vez que os testes de paralelismo e de
linearidade reflectem a justeza do ajustamento do modelo de
4 parmetros na sua totalidade. O erro residual na anlise de
varincia sempre igual a 1 em resultado da transformao.
, no entanto, possvel calcular um factor de heterogeneidade
(anlogo ao utilizado no mtodo dos probits).
A actividade relativa da amostra pode ser obtida pelo clculo
do antilogaritmo de S T. Multiplicando este valor pela
actividade atribuda da preparao de referncia, obtemos
uma actividade estimada de 1,459 0,4 0,584 UI/ml. A
frmula 4.2.3.-2 d, para os limites de confiana para 95 por
cento, os valores de 0,557 e 0,612 UI/ml.

5. Textos gerais
6. COMBINAO DE RESULTADOS
DE ENSAIOS
6.1. INTRODUO

Alm disso, fornece para a varincia residual s2 uma Para satisfazer as exigncias da Farmacopeia muitas
estimativa de 0,001429 com 20 graus de liberdade (variao vezes necessrio realizar vrios ensaios independentes e
intra-tratamentos). combinar os seus resultados. A questo coloca-se quanto
admissibilidade da combinao dos resultados dos ensaios, e
Para obter os limites de confiana, e verificar o paralelismo e
em caso afirmativo, de que modo.
a linearidade, linearisam-se as respostas u observadas, antes
de as submeter a uma anlise de linhas paralelas ponderada Dois ensaios podem ser considerados como independentes
atravs do programa. Este procedimento muito semelhante quando a execuo de um deles no afecta as probabilidades
ao descrito na seco 4.2 pelo mtodo da probabilidade associadas aos resultados dos outros. Isto implica que
iteractiva (probit), introduzindo-se as seguintes modificaes: o conjunto dos erros aleatrios ligados aos principais
factores de influncia de um dos ensaios (por exemplo,
diluies do padro e da amostra, sensibilidade do indicador
biolgico) devem ser independentes dos erros aleatrios
correspondentes ao outro ensaio. Os ensaios realizados
em vrios dias consecutivos a partir de diluies do padro
preparadas no mesmo momento no so considerados
ensaios independentes.
Existem vrios mtodos para combinar os resultados de
ensaios independentes, sendo o mais aceitvel do ponto
de vista terico o que apresenta maior dificuldade de
Obtm-se assim, uma anlise de varincia ponderada das aplicao. A seguir so descritos 3 mtodos de aproximao
respostas transformadas y com as ponderaes w: simplificada; outros podem ser usados desde que as condies
necessrias sejam satisfeitas.
TABELA 5.4.1.-II. Anlise de varincia ponderada
Antes de combinar as actividades obtidas a partir dos ensaios
Origem graus de
da variao liberdade
Chi-quadrado Probabilidade baseados no modelo de linhas paralelas ou no modelo da
probabilidade iteractiva (probit) devem ser expressos em
Amostras 1 0,529653 0,467
logaritmos; pelo contrrio, as actividades obtidas a partir
Regresso 1 6599,51 0,000
de ensaios baseados no modelo de relao de declives so
No paralelismo 1 0,0458738 0,830 utilizadas tal qual. Como os 2 primeiros modelos so de
No linearidade 16 8,89337 0,918 utilizao mais corrente que o da relao de declives, o
Tratamentos 19 6608,98 0,000 smbolo M (representando o logaritmo da actividade) que
Erro residual 20 20,0000 usado nas frmulas desta seco. Lendo R (relao de declive)
Total 39 6628,98 em vez de M, o experimentador pode aplicar as mesmas
frmulas para calcular os resultados dos ensaios baseados no
No se observam desvios significativos de paralelismo e de modelo de relao de declives. Antes de serem combinados,
linearidade; o mtodo de doseamento satisfatrio para todas as estimativas de actividade devem ser corrigidas
os clculos da actividade. Se a condio de igualdade das relativamente actividade atribuda para preparao.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 727

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5.3. Anlises estatsticas

6.2. COMBINAO PONDERADA DE RESULTADOS DE 6.2.3. CLCULO DA MDIA PONDERADA E DOS LIMITES
ENSAIOS DE CONFIANA

Este mtodo pode ser utilizado se as seguintes condies Os produtos WM so formados para cada ensaio e a sua soma
forem satisfeitas: dividida pela soma dos factores de ponderao de todos os
ensaios, para dar a mdia logartmica ponderada da actividade.
1) As estimativas de actividade resultam de ensaios
independentes,
2) para cada ensaio, C est perto de 1 (digamos inferior a 1,1),
O erro tipo de ln(actividade mdia) a raiz quadrada do
3) o nmero de graus de liberdade dos erros residuais inverso da soma dos factores de ponderao:
individuais superior ou igual a 6 e de preferncia
superior a 15,
4) as estimativas individuais de actividade formam uma srie
homognea (ver seco 6.2.2).
Se as condies no forem satisfeitas, este mtodo no pode e os limites de confiana aproximados so obtidos tomando o
ser aplicado. O mtodo descrito na seco 6.3 pode ento antilogaritmo do valor dado pela equao:
5. Textos gerais

ser utilizado para obter a melhor estimativa da actividade

mdia, podendo ser adoptado para os ensaios ulteriores como
actividade assumida.
6.2.1. CLCULO DOS FACTORES DE PONDERAO
onde o nmero de graus de liberdade associado a t igual
soma do nmero de graus de liberdade para os quadrados
mdios do erro nos ensaios individuais.

presumido que os resultados de cada um dos n ensaios

foram analisados para dar origem a n valores de M com os
limites de confiana associados. Para cada ensaio, o intervalo
de confiana logartmico L obtido por subtraco ao limite
superior o inferior. O factor de ponderao W calculado
para cada valor de M com a ajuda da frmula 6.2.1.-1, onde t
toma o mesmo valor que o utilizado no clculo dos limites de
confiana.
6.2.4. CLCULO DA MDIA PONDERADA E DOS LIMITES
DE CONFIANA BASEADO NAS VARIAES INTRA- E
INTER-ENSAIOS
Quando os resultados de vrios ensaios repetidos so
combinados, o valor de 2 pode ser significativo. Considera-se
ento que a variabilidade observada tem duas componentes:

6.2.2. HOMOGENEIDADE DAS ESTIMATIVAS DE

onde M a mdia no ponderada. A primeira varia de um
ACTIVIDADE ensaio para outro, enquanto que a segunda comum a todos
os valores M.
Elevando ao quadrado o desvio de cada valor de M
Calculamos ento, para cada valor M, um factor de
relativamente mdia ponderada, e depois multiplicando ponderao:
cada um dos desvios pelo factor de ponderao apropriado
e efectuando a sua soma no conjunto dos ensaios, obtemos
uma varivel estatstica em que a distribuio segue
aproximadamente uma lei de 2 (ver tabela 8.3) e que pode
ser utilizado para verificar a homogeneidade de uma srie de
que substitui W na seco 6.2.3, onde t toma aproximadamente
estimativas do logaritmo da actividade: o valor 2.

6.3. COMBINAO NO PONDERADA DE RESULTADOS DE

ENSAIOS
Se o valor de 2 assim calculado inferior ao valor da tabela
que corresponde a (n1) graus de liberdade, as actividades Para combinar da maneira mais simples as n estimativas de
so homogneas e os valores obtidos na seco 6.2.3 para a M obtidas a partir de n ensaios, determinamos a sua mdia
actividade mdia e os limites associados tero significado. seguida do clculo do desvio padro segundo a frmula:
Se o valor de 2 calculado superior ao valor da tabela, as
actividades so heterogneas. Isto significa que as variaes
entre as estimativas individuais de M so superiores ao que
seria previsvel pelas estimativas dos limites de confiana,
quer dizer que existe uma variabilidade significativa entre os
ensaios. Nestas circunstncias, a condio 4 no satisfeita e os limites de confiana so dados por
e as equaes da seco 6.2.3 no so aplicveis, mas elas
podem ser substitudas pelas da seco 6.2.4.

728 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
onde t possui (n1) graus de liberdade. O nmero n de
estimativas de M normalmente pequeno, e em consequncia
o valor de t relativamente grande.
6.4. EXEMPLO DE ACTIVIDADE MDIA PONDERADA E DOS
SEUS LIMITES DE CONFIANA
Na tabela 6.4.-I esto representadas 6 estimativas
independentes da actividade da mesma preparao, com os
limites de confiana para 95 por cento e os nmeros de graus
de liberdade correspondentes. As condies 1, 2 e 3 da seco
6.2 so satisfeitas. Os valores ln(actividade) e os factores de
ponderao so calculados como descrito na seco 6.2.
TABELA 6.4.-I. Anlise de varincia ponderada
A homogeneidade das estimativas de actividade avaliada por
meio da frmula 6.2.2.-1, que d um valor de 2 de 4,42 com
5 graus de liberdade. Este resultado no significativo
(p 0,49) e portanto todas as condies so satisfeitas.
O clculo da actividade mdia ponderada para a frmula
6.2.3.-1 d um valor de 9,8085.
A frmula 6.2.3.-2 d um desvio padro de 0,00673 e
os limites de confiana para 95 por cento aproximados
calculados pela frmula 6.2.3.-3, onde t possui 120 graus de
liberdade, so de 9,7951 e 9,8218.
Tomando o antilogaritmo destes valores, obtemos uma
actividade de 18 187 UI/ampola com um intervalo de
confiana para 95 por cento entre 17 946 e 18 431 UI/ampola.
7. PARA ALM DESTA MONOGRAFIA
impossvel apresentar uma exposio completa de
mtodos estatsticos num texto da Farmacopeia, mas os
mtodos anteriormente descritos devem ser normalmente
suficientes para a maior parte dos ensaios da farmacopeia.
O objectivo desta seco a de tentar trazer uma viso
mais global sobre os mtodos alternativos ou mais gerais
que foram desenvolvidos. O leitor que estiver interessado
convidado a aprofundar o assunto explorando a literatura
existente. De qualquer modo, a aplicao de mtodos
estatsticos mais especializados dever ser deixada ao
cuidado de especialistas.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
5.3. Anlises estatsticas
7.1 MODELOS LINEARES GERAIS
Os mtodos descritos neste anexo podem, globalmente, ser
descritos como modelos lineares gerais (ou generalistas para
poder incluir os mtodos de probits e de logits). O princpio
geral consiste na definio de uma matriz de estrutura linear X
(ou matriz de planificao) em que cada linha representa uma
observao e cada coluna um efeito linear (preparao, bloco,
coluna, dose). Por exemplo, o ensaio de quadrado latino do
exemplo 5.1.2 poder ser representado por uma matriz de 36
linhas e 13 colunas: 1 coluna para cada preparao, 1 coluna para
as 5 doses, 5 colunas para os blocos com excepo do primeiro
e 5 colunas para as linhas com excepo da primeira. Todas as
colunas, com excepo daquela contendo as doses so preenchidas
com o valor 0 ou 1 dependendo da observao corresponder
5. Textos gerais
ou no ao efeito considerado. Um vector Y construdo com as
observaes (transformadas). As actividades so estimadas com
auxlio da frmula (XtX)-1XtY, e fcil de deduzir a estimativa da
actividade m atravs do rcio dos efeitos relevantes. O intervalo de
confiana calculado pelo teorema de Fieller:
e v11, v22, v12 representam respectivamente os multiplicadores
da varincia para o numerador e denominador e o
multiplicador da covarincia. Eles so obtidos directamente a
partir de (XtX)1 ou indirectamente fazendo:
Var(a1a2) Var(a1) Var(a2) 2Cov(a1,a2)
e Cov(a1a2,b) Cov(a1,b) Cov(a2,b)
Uma anlise de varincia completa implicando a partio
de todas as componentes ligeiramente mais complexa
porque ela implica uma redefinio de X, com mais colunas,
para verificar as hipteses de paralelismo e de linearidade,
depois do qual as hipteses lineares podem ser testadas. Para
as titulaes baseadas em respostas qualitativas, os efeitos
lineares (ordenadas na origem aS, aT, etc e declive comum b)
so determinadas maximizando a soma dos tratamentos
nln (ai bx) (n r)ln(1 (ai bx)), onde x
ln(dose), representa a forma da distribuio e i {S, T, ...}.
7.2. HETEROGENEIDADE DA VARINCIA
Nem sempre possvel resolver o problema da
heterogeneidade da varincia pela simples transformao das
respostas. Uma aproximao possvel consiste na utilizao de
uma regresso linear ponderada. Para obter uma estimativa
sem distoro (bias) aplica-se s observaes um factor de
ponderao proporcional ao inverso do erro das varincias.
Como o verdadeiro erro das varincias nem sempre
conhecido, pode-se proceder atravs da determinao
729
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.3. Anlises estatsticas
iteractiva das ponderaes. No entanto, o clculo do intervalo
de confiana coloca ainda novos problemas.
7.3. VALORES ABERRANTES E ROBUSTEZ DOS MTODOS
O mtodo dos mnimos quadrados descrito neste anexo
apresenta o inconveniente de ser extremamente sensvel a
resultados aberrantes. Um resultado nitidamente aberrante
pode falsear totalmente os resultados. Resolve-se esse
problema normalmente, rejeitando esses resultados dos
dados do ensaio. Esta pratica pode conduzir rejeio
arbitrria de dados, e no isenta de perigos. No fcil
propor regras gerais sobre o modo de decidir se uma
observao especfica constitui ou no um resultado
aberrante, e por isso mtodos mais robustos foram
5. Textos gerais
desenvolvidos, que so menos sensveis presena de
resultados aberrantes porque atribuem menor peso s
observaes que se afastam muito do valor presumido. Estes
mtodos colocam, no entanto, outros problemas ligados ao
clculo dos intervalos de confiana ou definio de uma
funo de ajustamento satisfatria.
7.4. ERROS CORRELACIONADOS
A aleatoriedade absoluta nem sempre realizvel ou
verdadeiramente sustentvel do ponto de vista prtico.
, por isso, frequente que as doses sucessivas de uma srie
de diluies apresentem erros correlacionados e que, em
consequncia, os limites de confiana sejam demasiado
aproximados.
Foram desenvolvidos mtodos que permitem ter em ateno
este efeito de autocorrelao.
7.5. CURVAS DOSE-RESPOSTA NO LINEARES
PROLONGADAS
A anlise das curvas dose-resposta no lineares prolongadas
coloca um conjunto de problemas estatsticos que
indispensvel ter em considerao, e por causa dos quais
recomendada a consulta a um especialista. Alguns desses
problemas so apresentados sucintamente a seguir.
1) Um exemplo utilizando a funo logstica de 4 parmetros
descrito anteriormente. No entanto, igualmente possvel
utilizar modelos baseados em funo que dem outras
curvas sigmoides. Foi sugerido o emprego de modelos
comportando parmetros suplementares de assimetria.
2) A heterogeneidade da varincia corrente quando as
respostas se distribuem numa grande intervalo. Se a
anlise ignora esta heterogeneidade, a interpretao
dos resultados corre o risco de ser incorrecta e as
estimativas distorcidas (biased). Perante um nmero
de rplicas limitado o recurso a factores de ponderao
proporcionais ao inverso das varincias de erro tem
poucas oportunidades de ser fivel. Uma aproximao
satisfatria pode ser o clculo de uma funo que exprima
uma relao entre a varincia e a resposta mdia.
730
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)
3) Os procedimentos estatsticos de ajustamento das curvas
podem originar estimativas diferentes dependendo das
hipteses colocadas quanto homogeneidade da varincia
e ao intervalo das respostas utilizado.
4) Em princpio, a igualdade das respostas mxima e
mnima, obtidas com as diferentes preparaes includas
numa dosagem, pode ser directamente verificada em
cada ensaio. No entanto, a interpretao dos resultados
destes testes estatsticos pode no ser evidente. Os
testes de linearidade e de paralelismo descritos no
mtodo de anlise simplificada (exemplo 5.4.1) incluem
indirectamente as verificaes de igualdade e de preciso
dos limites inferior e superior.
5) Muitos doseamentos incluem os controlos que
servem para identificar as respostas limite (inferior e/ou
superior), mas estes valores podem no ser coincidir com
os limites superior e inferior obtidos pelo ajustamento
estatstico a partir da curva dose-resposta prolongada.
6) O mtodo de anlise simplificado descrito no exemplo
5.4.1 fornece intervalos de confiana aproximados. Outros
mtodos podem igualmente ser utilizados para o clculo,
como por exemplo o mtodo baseado na ausncia de
ajustamento do modelo completamente especificado.
Para dados de doseamentos tpicos, com respostas
cobrindo o conjunto do intervalo para cada preparao
testada, todos os mtodos do resultados similares.
8. TABELAS E MTODOS DE CLCULO
As tabelas contidas nesta seco apresentam os valores
crticos correspondentes aos nmeros de graus de
liberdade mais usuais. Se determinado valor crtico no
figurar, devem ser consultadas tabelas mais detalhadas.
Numerosos programas informticos contm funes
estatsticas, e o seu emprego prefervel ao uso das tabelas
aqui apresentadas. Uma outra aproximao possvel
consiste na utilizao dos mtodos de clculo descritos
a seguir a cada tabela, para determinar a probabilidade
correspondente a uma varivel estatstica e a um nmero
de graus de liberdade dados.
8.1 DISTRIBUIO DE F
Se o valor observado superior ao valor indicado na Tabela,
8.1-I considerado como significativo (linhas superiores,
p = 0,05) ou muito significativo (linhas inferiores, p = 0,01).
df1 o nmero de graus de liberdade do numerador e df2 o
nmero de graus de liberdade do denominador.
Mtodo de clculo: seja F o rcio-F e df1 e df2 como descrito
acima. Seja pi p 3,14159265358979... O mtodo
seguinte Tabela 8.1-II permite o clculo do valor p.
8.2. DISTRIBUIO DE T
Se o valor observado superior ao valor indicado na tabela
8.2-I, considerado significativo (p 0,05) ou muito
significativo (p 0,01).
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 8.1.-I. Valores crticos da distribuio de F

df1 1 2 3 4 5 6 8 10 12 15 20
df2

10 4,965 4,103 3,708 3,478 3,326 3,217 3,072 2,978 2,913 2,845 2,774 2,538
10,044 7,559 6,552 5,994 5,636 5,386 5,057 4,849 4,706 4,558 4,405 3,909

12 4,747 3,885 3,490 3,259 3,106 2,996 2,849 2,753 2,687 2,617 2,544 2,296
9,330 6,927 5,953 5,412 5,064 4,821 4,499 4,296 4,155 4,010 3,858 3,361

15 4,543 3,682 3,287 3,056 2,901 2,790 2,641 2,544 2,475 2,403 2,328 2,066
8,683 6,359 5,417 4,893 4,556 4,318 4,004 3,805 3,666 3,522 3,372 2,868

20 4,351 3,493 3,098 2,866 2,711 2,599 2,447 2,348 2,278 2,203 2,124 1,843
8,096 5,849 4,938 4,431 4,103 3,871 3,564 3,368 3,231 3,088 2,938 2,421

5. Textos gerais
25 4,242 3,385 2,991 2,759 2,603 2,490 2,337 2,236 2,165 2,089 2,007 1,711
7,770 5,568 4,675 4,177 3,855 3,627 3,324 3,129 2,993 2,850 2,699 2,169

30 4,171 3,316 2,922 2,690 2,534 2,421 2,266 2,165 2,092 2,015 1,932 1,622
7,562 5,390 4,510 4,018 3,699 3,473 3,173 2,979 2,843 2,700 2,549 2,006

50 4,034 3,183 2,790 2,557 2,400 2,286 2,130 2,026 1,952 1,871 1,784 1,438
7,171 5,057 4,199 3,720 3,408 3,186 2,890 2,698 2,563 2,419 2,265 1,683

3,841 2,996 2,605 2,372 2,214 2,099 1,938 1,831 1,752 1,666 1,571 1,000
6,635 4,605 3,782 3,319 3,017 2,802 2,511 2,321 2,185 2,039 1,878 1,000

TABELA 8.2.-I. Valores crticos da distribuio de T TABELA 8.2.-II. Mtodos de clculo para a distribuio de T

df p 0,05 p 0,01 df p 0,05 p 0,01

t = 1,959964 +

1 12,706 63,656 22 2,074 2,819 2,37228 / df +

2 4,303 9,925 24 2,064 2,797 2,82202 / df ^ 2 +
3 3,182 5,841 26 2,056 2,779 2,56449 / df ^ 3 +
4 2,776 4,604 28 2,048 2,763
1,51956 / df ^ 4 +
5 2,571 4,032 30 2,042 2,750
1,02579 / df ^ 5 +
6 2,447 3,707 35 2,030 2,724
0,44210 / df ^ 7
7 2,365 3,499 40 2,021 2,704
8 2,306 3,355 45 2,014 2,690
8.3. DISTRIBUIO DE 2
9 2,262 3,250 50 2,009 2,678
10 2,228 3,169 60 2,000 2,660 TABELA 8.3.-I. Valores crticos da distribuio de 2
12 2,179 3,055 70 1,994 2,648
df p 0,05 p 0,01 df p 0,05 p 0,01
14 2,145 2,977 80 1,990 2,639
1 3,841 6,635 11 19,675 24,725
16 2,120 2,921 90 1,987 2,632
2 5,991 9,210 12 21,026 26,217
18 2,101 2,878 100 1,984 2,626
3 7,815 11,345 13 22,362 27,688
20 2,086 2,845 1,960 2,576
4 9,488 13,277 14 23,685 29,141
5 11,070 15,086 15 24,996 30,578
Mtodos de clculo: o valor p para determinado t com df
6 12,592 16,812 16 26,296 32,000
graus de liberdade obtido pelos mtodos descritos na seco
8.1 com F = t2, df1 = 1 e df2 = df. 7 14,067 18,475 20 31,410 37,566
8 15,507 20,090 25 37,652 44,314
O valor t (p = 0,05) para um dado nmero de graus de
liberdade df obtido pelo mtodo seguinte tabela 8.2-II, que 9 16,919 21,666 30 43,773 50,892
exacto at 6 casas decimais. 10 18,307 23,209 40 55,758 63,691

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 731

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 8.1.-II. Mtodo de clculo para a distribuio de F

5. Textos gerais

Se um valor observado superior ao valor indicado na tabela 8.4. DISTRIBUIO (DISTRIBUIO NORMAL
8.3-I, ele considerado significativo (p = 0,05) ou muito REDUZIDA CUMULATIVA)
significativo (p = 0,01).
TABELA 8.4.-I. Valores de distribuio de
Mtodo de clculo: seja x2 o valor da varivel 2 e df tal
como descrito acima. O mtodo seguinte permite calcular o
valor de p.

Neste mtodo phi a distribuio normal reduzida

cumulativa (ver seco 8.4).

732 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

Para os valores de x negativos, o valor de obtm-se a partir
da Tabela 8.4-I tomando 1-(-x).
Mtodo de clculo: Seja x o valor da varivel x. O mtodo
seguinte permite obter o valor de correspondente se
0 x 8,15. Se x 8,15 o valor de pode ser igualado a 1.
Se x negativo, pode-se utilizar a frmula indicada acima. Este
mtodo assume que o computador pode apresentar cerca de 15
casas decimais. Se o nmero de dgitos for inferior ou superior
a 15, este mtodo necessita de alguns ajustamentos simples.
independentes para obter um quadrado latino.
1). gerar uma permutao aleatria de N tratamentos
possveis (ver seco 8.5):
T3 S3 S1 T2 T1 S2
2). pode construir-se um quadrado latino simples rodando para
a direita os termos desta permutao. Inscreva na primeira
linha a permutao obtida na etapa 1. A segunda linha
constituda pela mesma permutao, mas em que os termos
foram transpostos para a direita, o tratamento situado
na extrema direita vem ocupar o espao livre na extrema
esquerda. Repita esta operao em cada linha at que todos
os tratamentos apaream uma vez em cada coluna:

T3 S3 S1 T2 T1 S2

S2 T3 S3 S1 T2 T1

5. Textos gerais
T1 S2 T3 S3 S1 T2

T2 T1 S2 T3 S3 S1

S1 T2 T1 S2 T3 S3

S3 S1 T2 T1 S2 T3

8.5. PERMUTAES ALEATRIAS 3). gere de seguida 2 permutaes aleatrias independentes

dos nmeros 1 a N:
As permutaes aleatrias so indispensveis no caso de ensaios
de blocos completos. O algoritmo representado a seguir mostra uma para as linhas:
como obter uma permutao aleatria de N tratamentos por
meio da funo de clculo de um sistema informtico. 2 3 6 1 4 5

1. inscrever na linha os N tratamentos possveis. e uma para as colunas:

2. escolher aleatoriamente um nmero inteiro r tal que 1 r N.
3 4 6 2 5 1
3. permutar o r-simo tratamento e N-simo tratamento da linha.
4). O quadrado latino pode agora ser encontrado colocando
4. fazer N N 1 e repetir os passos 2 a 4 at N 1. por ordem as linhas e colunas do quadrado latino simples
O exemplo seguinte, de 6 tratamentos, ilustra este algoritmo. de acordo com as 2 permutaes para as linhas e colunas:

1. N 6 S1 S2 S3 T1 T2 T3

2. r 2
3. S1 T3 S3 T1 T2 S2

4. N 5

2. r 4

3. S1 T3 S3 T2 T1 S2

4. N 4

2. r 4

3. S1 T3 S3 T2 T1 S2

4. N 3

2. r 1

3. S3 T3 S1 T2 T1 S2

4. N 2

2. r 1
3. T3 S3 S1 T2 T1 S2

4. N 1

8.6. QUADRADOS LATINOS

O exemplo seguinte mostra como utilizar 3 permutaes

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 733

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5.3. Anlises estatsticas

9. GLOSSRIO DE SMBOLOS E TERMOS H B , HI Multiplicadores usados na anlise de varincia dos

ensaios de relao de declives.
9.1. GLOSSRIO DE SMBOLOS I Nos ensaios de linhas paralelas, o ln do rcio entre
doses adjacentes. Nos ensaios de relao de declives, o
Smbolo Definio intervalo entre doses adjacentes.
a Interseco da regresso linear das respostas com a JS, JT,... Valores lineares usados na anlise de varincia dos
dose ou ln(dose) ensaios de relao de declives
b Declive da regresso linear da resposta em dose, ou K Termo de correco utilizado no clculo da soma de
logaritmo da dose quadrados numa anlise de varincia
d Nmero de nveis de doses para cada preparao L Amplitude do intervalo de confiana em logaritmos
(excluindo o branco nos ensaios do modelo de relao
de declives) LS, LT,... Contrastes lineares de padres e amostras

e Base de logaritmos naturais (= 2,71828182845905...) M ln relao da actividade de uma amostra especfica

g Clculo usado no teorema de Fieller: N Nmero total de respostas num ensaio ( dh)
PS,P T,.... Soma do padro e das amostras
5. Textos gerais

h Nmero de preparaes num ensaio, incluindo a

preparao padro R Actividade estimada de uma amostra especfica

m Actividade estimada obtida como o rcio dos efeitos R Relao da actividade de uma amostra especfica
nos modelos lineares R1 ... Rn Resposta mdia em cada linha 1 a n do desenho do
n Nmero de rplicas de cada tratamento quadrado latino, ou em cada bloco num desenho de
blocos aleatrio
p Probabilidade de que determinado clculo seja
S Padro
superior ao valor observado. Igualmente usado no
rcio r/n na probabilidade iteractiva S1,...,Sd Resposta mdia menor dose 1 at maior d de um
r Nmero de unidades respondendo em cada grupo padro S
tratado em ensaios dependentes de respostas SS Soma dos quadrados de uma fonte especfica de
qualitativas variao
s Estimativa do desvio padro T, U, V, ... Amostras em ensaio
s 2 Estimativa da varincia residual dada pelo erro mdio T1,...,Td Resposta mdia menor dose 1 at maior d de um
quadrtico na anlise de varincia padro T
t Estatstica de Student (tabela 8.2) V Coeficiente de varincia no clculo dos limites de
u Resposta observada na anlise de quatro parmetros confiana
W Factor de ponderao usada na combinao de
v11, v12, v22 Multiplicadores de (co)varincia para o numerador e resultados de ensaios
denominador do rcio m no teorema de Fieller
X Estrutura linear ou desenho matricial usado para
w Coeficiente de ponderao gerar modelos lineares
x O ln(dose) Y Vector representativo das respostas (transformadas)
y nos modelos lineares gerais
Resposta individual ou transformada
Z A primeira derivada de
A Actividade assumida das amostras quando se
preparam doses Assmptota superior da curva ln(dose)-resposta na
B anlise de quatro parmetros
Resposta mdia dos brancos nos ensaios de de relao
de declives Factor de declive da curva ln(dose)-resposta na
anlise de quatro parmetros
C Estatstica usada no clculo dos limites de confiana:
1 O ln(dose) correspondente a 50 por cento de resposta
C no modelo de quatro parmetros
1g
Cp,...,Cn Resposta mdia de cada coluna do desenho do Assmptota inferior da curva ln(dose)-resposta na
quadrado latino anlise de quatro parmetros

D1, D2 3,141592653589793238...
Resposta total no tempo I, tempo II no ensaio de
permutao duplo Distribuio normal reduzida cumulativa (tabela 8.4)
F Rcio de 2 estimativas independente de varincia 2 Estatstica chi-quadrado (tabela 8.3)
seguindo a distribuio-F (tabela 8.1.)
GS,GT,... Valores do tratamento usados na anlise de varincia
dos ensaios de relao de declives.
HP, HL Multiplicadores usados na anlise de varincia dos
ensaios de linhas paralelas.

734 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

9.2. GLOSSRIO DE TERMOS 10. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

Correspondncia utilizada entre a terminologia portuguesa e
a inglesa (5).
Terminologia Terminologia
em lngua portuguesa em lngua inglesa
actividade potency
actividade atribuda assigned potency
actividade declarada stated potency
actividade estimada estimated potency
actividade real true potency
actividade rotulada labelled potency
aleatoriedade randomisation
amplitude range
distoro bias
Esta seco contm uma lista de referncias bibliogrficas de
leitura recomendada para um estudo mais aprofundado do
assunto.
Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3a Ed. Cambridge
University Press, Cambridge.
Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized
linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series
A 135, 370-384.
DeLean, A., Munson, P. J. e Rodbard, D. (1978).
Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves:
Application to bioassay, radioligand assay and physiological
dose-response curves, Am J. Physiol. 235 (2): E97-E102.
Finney, D. J. (1978). Statistical method in biological assay,

5. Textos gerais
coeficiente de regresso conjunto pooled regression coeficient
curvatura oposta opposite curvature 3a Ed. Griffin, London.
desenho de 5 ponto com zero comum common-zero 5 point design Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and
desvio padro standard deviation Practice of Statistics in Biological Research, 2 Ed. W. H.
desvio padro da mdia standard deviation of the mean Freeman & Co, New York.
ensaio assay
Peace, K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug
ensaios qualitativos quantal assays Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.
erro das varincias error variances
erro padro standard error Bowerman, B. L. & OConnell (1990). Linear Statistical
fluxograma flowchart Models an Applied Approach, 2 Ed. PWS-KENT Publishing
limite de confiana confidence interval
Company, Boston.
mdia no ponderada unweighted mean Govindarajulu, Z. (2001). Statistical Techniques in Bioassay,
mdia ponderada weighted mean 2 Ed, Karger, New York.
mdia(s) mean(s)
mtodo das semelhanas mximas maximum likehood method
modelo de linhas paralelas parallel-line model
modelo de relao de declives slope-ratio model
no paralelismo non-parallelism
ordenao array
permutao cross-over
probabilidade iterativa probit
probabilidade iterativa funcional working probit
relao de actividade potency ratio
soma dos quadrados para o erro sum of squares for error
termo de erro error term
termo de erro mdio quadrtico error-mean square term
termo de no-paralelismo non-parallelism term
teste test
transformao probabilstica iterativa probit transformation

(5)Esta sub seco aqui introduzida para facilidade de consulta, pelo leitor da
bibliografia em ingls e compreenso da terminologia adoptada nesta rea pela
Comisso da Farmacopeia Portuguesa, a partir da 6 edio. Em estatstica est
muito consagrada a termino- logia em ingls, e foi nossa inteno proceder
adequao termi- nologia portuguesa, pelo que apresenta aqui um glossrio
de termos com a correspondncia verso inglesa da Farmacopeia Europeia.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 735

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.4. SOLVENTES
RESIDUAIS
5.4. Solventes residuais.................................................... 739
Limitao dos teores de solventes residuais nas
substncias activas, nos excipientes
e nos medicamentos................................................... 739
Impurezas : nota explicativa relativa aos solventes......... 739
1. Introduo.................................................................... 739
2. mbito da presente nota explicativa........................... 740
3. Princpios gerais.......................................................... 740
3.1. Classificao dos solventes residuais em funo
da avaliao do risco............................................. 740
3.2. Mtodos que permitem estabelecer os limites
de exposio.......................................................... 740
3.3. Opes que permitem descrever os limites dos
solventes da classe 2............................................. 740
3.4. Procedimentos analticos..................................... 741
3.5. Declarao de conformidade dos limites em
solventes residuais................................................ 741
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)
4. Limites de solventes residuais..................................... 741
4.1. Solventes a evitar.................................................. 741
4.2. Solventes de utilizao limitada........................... 742
4.3. Solventes com baixo potencial txico.................. 742
4.4. Solventes para os quais no foram encontrados
dados toxicolgicos adequados............................. 742
Glossrio........................................................................... 742
Anexo 1. Lista dos solventes includos nesta
nota explicativa........................................................... 743
5. Textos gerais
Anexo 2. Informaes complementares........................... 745
A2.1. Regulamentao ambiental para os solventes
orgnicos volteis....................................................... 745
A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacuticos... 745
Anexo 3. Mtodos relativos ao estabelecimento
de limites de exposio............................................... 745
737
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.4 SOLVENTES RESIDUAIS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.4. SOLVENTES RESIDUAIS
LIMITAO DOS TEORES
DE SOLVENTES RESIDUAIS
NAS SUBSTNCIAS ACTIVAS,
NOS EXCIPIENTES E NOS
MEDICAMENTOS
A Conferncia Internacional para a Harmonizao (ICH)
(International Conference on Harmonization of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for
Human Use) adoptou um documento intitulado Impurezas:
Nota explicativa relativa aos solventes residuais, que
prescreve os limites do teor de solventes que podem
permanecer nas substncias activas, nos excipientes e nos
medicamentos aps fabrico. Esta nota explicativa, cujo texto
reproduzido a seguir, exclui os produtos j comercializados.
Contudo, a Farmacopeia Portuguesa aplica s substncias
activas, aos excipientes e aos medicamentos existentes os
princpios enunciados na nota explicativa, tenham estes
sido objecto, ou no, de uma monografia na Farmacopeia.
conveniente pesquisar, no conjunto das substncias e
produtos, eventuais vestgios de solventes que tenham
subsistido aps fabrico.
Quando os limites a aplicar esto conformes aos a seguir
fornecidos, os ensaios de solventes residuais no so, regra
geral, mencionados nas monografias especficas, uma vez
que os solventes utilizados podem diferir de fabricante para
fabricante e os requisitos deste captulo geral so postos
em prtica pela aplicao da monografia geral Substncias
para uso farmacutico. Por consequncia, a Autoridade
competente deve estar informada dos solventes utilizados
durante o processo de fabrico. Estas informaes devem
figurar igualmente no processo apresentado para pedido de
obteno de um certificado de conformidade s monografias
da Farmacopeia Portuguesa e so mencionadas no
certificado.
Quando se utilizam solventes da classe 3, a substncia pode
ser submetida a um ensaio de perda por secagem ou pode ser
efectuada uma determinao especfica. Se um solvente da
classe 3 apresenta um limite justificado e autorizado superior
a 0,5 por cento, necessrio proceder determinao
especfica desse solvente.
Em caso de utilizao de solventes residuais das classes 1 e
2 (ou solventes da classe 3 cujo teor seja superior a 0,5 por
cento), deve ser aplicada, sempre que possvel, a metodologia
descrita no mtodo geral (2.4.24.). Nos restantes casos, deve
recorrer-se a um mtodo validado apropriado.
Quando efectuada a determinao quantitativa de um
solvente residual, esta tida em conta para o clculo do teor
da substncia, a no ser que tambm se efectue um ensaio de
perda por secagem.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.4 SOLVENTES RESIDUAIS (NDICE)
5.4. Solventes residuais
IMPUREZAS: NOTA EXPLICATIVA
RELATIVA AOS SOLVENTES RESIDUAIS
(CSP/ICH/283/95)
1. INTRODUO
2. MBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA
3. PRINCPIOS GERAIS
3.1. Classificao dos solventes residuais em funo da avaliao
do risco
3.2. Mtodos que permitem estabelecer os limites de exposio
3.3. Opes que permitem descrever os limites dos solventes da
classe 2
3.4. Procedimentos analticos
3.5. Declarao de conformidade dos limites em solventes
residuais
4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS
4.1. Solventes a evitar
4.2. Solventes de utilizao limitada
5. Textos gerais
4.3. Solventes com baixo potencial txico
4.4. Solventes para os quais no foram encontrados dados
toxicolgicos adequados
GLOSSRIO
ANEXO 1. Lista dos solventes includos nesta nota explicativa
ANEXO 2. Informaes complementares
A2.1. Regulamentao ambiental para os solventes
orgnicos volteis
A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacuticos
ANEXO 3. Mtodos relativos ao estabelecimento de limites de exposio
1. INTRODUO
A presente nota explicativa tem por objectivo recomendar as
quantidades de solventes residuais admissveis nos produtos de
utilizao farmacutica por forma a excluir qualquer risco para a
sade do paciente. Preconiza a utilizao de solventes de menor
toxicidade e descreve, para alguns solventes, as taxas residuais
consideradas aceitveis sob um ponto de vista toxicolgico.
Os solventes residuais nos produtos de utilizao farmacutica
so aqui definidos como produtos qumicos orgnicos volteis
utilizados ou produzidos no fabrico de substncias activas e
excipientes ou entrando na preparao de medicamentos. Os
processos de fabrico correntes no permitem a eliminao
completa dos solventes. A escolha apropriada do solvente para
a sntese da substncia activa pode melhorar o rendimento ou
determinar caractersticas como a forma cristalina, a pureza
e a solubilidade. Assim, o solvente pode, por vezes, constituir
um elemento crtico do processo de sntese. A presente nota
explicativa no se refere aos solventes exclusivamente utilizados
como excipientes nem aos solvatos. , contudo, conveniente
avaliar e justificar o teor em solventes de tais produtos.
Sabendo que os solventes residuais no apresentam qualquer
vantagem teraputica, conveniente elimin-los, sempre
que possvel, para satisfazer s exigncias da qualidade
(especificaes, Boas Prticas de Fabrico de Medicamentos).
Os medicamentos no devem apresentar teores de solventes
residuais superiores aos previstos nos dados de segurana.
Os solventes da classe 1 (quadro 1), pela elevada toxicidade que
possuem, no devem ser utilizados na fabrico de substncias
activas, de excipientes, ou de medicamentos, a no ser que
se justifique claramente aps uma avaliao risco/benefcio.
Os solventes da classe 2 (quadro 2), cuja toxicidade menor,
devem ter utilizao limitada, tendo em vista a proteco
dos pacientes de reaces adversas. Idealmente, devem ser
utilizados sempre que possvel os solventes da classe 3 (quadro
3), menos txicos. A lista completa dos solventes figura no
Anexo 1 da presente nota explicativa.
739
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.4. Solventes residuais
As listas apresentadas neste documento no so exaustivas,
podendo outros solventes em uso actualmente vir a ser
acrescentados s diferentes listas. Os limites recomendados
para os solventes das classes 1 e 2, ou a classificao dos
solventes, podem variar em funo do aparecimento de novos
dados de segurana. Os dados de segurana que permitem
suportar o pedido de colocao no mercado de um novo
medicamento, contendo um novo solvente, podem inspirar-
-se nas informaes apresentadas neste documento ou nas
Guideline ICH-Q3A (Impurezas nas novas substncias
activas) Guideline ICH-Q3B (Impurezas nos novos
medicamentos), ou, ainda, no conjunto dos trs documentos.
2. MBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA
Esta nota faz o inventrio dos solventes residuais presentes
nas substncias activas, nos excipientes e nos medicamentos.
Por consequncia, deve ser realizado um ensaio dos Solventes
5. Textos gerais
residuais sempre que os processos de fabrico ou de purificao
decorrem na presena de tais solventes. A pesquisa incidir
apenas sobre os solventes utilizados ou produzidos durante o
processo de fabrico ou na purificao das substncias activas,
dos excipientes ou dos medicamentos. Mesmo que os fabricantes
possam escolher efectuar a determinao sobre o medicamento,
possvel utilizar um mtodo cumulativo que permite calcular
os teores de solventes residuais no medicamento a partir dos
teores existentes nos diferentes elementos constitutivos. Se este
clculo der um resultado inferior ou igual ao nvel de solvente
indicado nesta nota explicativa, a determinao dos solventes
residuais no medicamento no exigida. Pelo contrrio, se o
teor de solventes residuais for superior ao nvel recomendado, o
ensaio deve ser efectuado no medicamento para assegurar que
o teor de solventes residuais foi conduzido a valores admissveis
durante a formulao. Os medicamentos devem igualmente ser
submetidos a este ensaio sempre que um solvente for utilizado
durante o fabrico.
A presente nota explicativa no se aplica s novas substncias
activas, excipientes ou medicamentos potenciais utilizados
nos estdios de desenvolvimento de pesquisa clnica, nem aos
medicamentos j comercializados.
A presente nota explicativa aplica-se a todas as formas
farmacuticas e a todas as vias de administrao. Teores
elevados de solventes residuais so admissveis em certos
casos, por exemplo em tratamentos de curta durao (30 dias
ou menos) ou em aplicaes tpicas. Estes teores devem ser
objecto de uma justificao caso a caso.
Para complementar as informaes relativas aos solventes
residuais ver o anexo 2.
3. PRINCPIOS GERAIS
3.1. CLASSIFICAO DOS SOLVENTES RESIDUAIS EM
FUNO DA AVALIAO DO RISCO
O International Program on Chemical Safety (IPCS) utiliza
a expresso dose diria tolervel (DDT) (em ingls TDI =
tolerable daily intake) para descrever os limites de exposio
aos produtos qumicos txicos. Para este mesmo conceito,
a OMS e outras autoridades ou institutos (nacionais ou
internacionais) de sade pblica utilizam a expresso dose
diria admissvel (DDA) (em ingls ADI = acceptable
daily intake). A exposio diria admissvel (EDA) (em
ingls PDE = Permitted daily exposure) a nova expresso
consagrada para o presente documento, a qual permite evitar
qualquer confuso entre os diferentes valores de DDA para
uma mesma substncia.
740
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.4 SOLVENTES RESIDUAIS (NDICE)
Os solventes residuais referidos neste documento esto
listados no anexo 1 por nomes e estrutura, e foram avaliados
em funo do risco que apresentam para a sade humana.
Subdividem-se em trs classes:
Classe 1: Solventes a evitar.
Carcinognios humanos conhecidos ou fortemente
suspeitos, perigosos para o ambiente.
Classe 2: Solventes cuja utilizao est submetida a
limitaes.
Carcinognios animais no genotxicos ou
eventuais agentes causadores de outros efeitos
txicos irreversveis como a neurotoxicidade ou a
teratogenicidade.
Solventes suspeitos de estarem na origem de outros
efeitos txicos importantes mas reversveis.
Classe 3: Solventes com baixo potencial txico.
Solventes com baixo potencial txico para o homem
no sendo exigido qualquer limite em relao
exposio. Os solventes da classe 3 apresentam
valores de EDA iguais ou superiores a 50 mg.
3.2. MTODOS QUE PERMITEM ESTABELECER OS
LIMITES DE EXPOSIO
O mtodo utilizado para estabelecer os valores de EDA aos
solventes residuais est apresentado no Anexo 3. Os resumos
dos dados de toxicidade que serviram para estabelecer estes
valores esto publicados em Pharmeuropa, Vol. 9, n 1,
suplemento do ms de Abril de 1997.
3.3. OPES QUE PERMITEM DESCREVER OS LIMITES
DOS SOLVENTES DA CLASSE 2
Duas opes permitem fixar os limites que se aplicam aos
solventes da classe 2.
Opo 1: Podem ser utilizados os limites de concentrao
(em ppm) indicados no quadro 2. Estes limites foram
determinados com ajuda da expresso (1) a seguir
apresentada e tomam como referncia uma dose de 10 g
administrada quotidianamente.
Neste caso o valor da EDA indicado em mg/dia e a dose em g/dia.
Estes limites so considerados aceitveis para todas as substncias,
excipientes ou medicamentos. Em consequncia, esta opo pode
ser aplicada quando a dose diria desconhecida ou varivel.
Se o conjunto dos excipientes e das substncias activas de uma
formulao satisfizerem aos limites da opo 1 estes componentes
podem ser utilizados em quaisquer propores. No necessrio
qualquer outro clculo desde que a dose diria no ultrapasse
10 g. Os medicamentos administrados em doses superiores a 10 g
por dia devem ser considerados na opo 2.
Opo 2: No se considera necessrio que cada componente do
medicamento satisfaa aos limites indicados na opo 1. O valor
da EDA, expresso em mg/dia, tal como se mostra no quadro
2, pode ser utilizado com a dose diria mxima conhecida
e a equao (1), atrs apresentada, pode ser usada para
determinar a concentrao de solvente residual autorizada num
medicamento. Tais limites so considerados aceitveis se ficar
demonstrado que a presena de solvente residual foi reduzida
ao mnimo possvel. Os limites devem ser realistas em relao
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
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5.4. Solventes residuais

preciso analtica, capabilidade no decurso do fabrico e a uma
variao razovel no processo de fabrico. Em suma, os limites
devem reflectir os padres de fabrico actuais.
possvel utilizar a opo 2 adicionando as quantidades de
solventes residuais presentes em cada um dos componentes do
medicamento. A soma das quantidades de solventes admissveis
por dia deve ser inferior indicada pelo valor de EDA.
A ttulo de exemplo, consideremos a aplicao das opes 1 e 2
ao acetonitrilo contido num medicamento. A exposio diria
admissvel ao acetonitrilo de 4,1 mg/dia, por consequncia
o limite preconizado pela opo 1 de 410 ppm. A quantidade
mxima de medicamento administrada por dia de 5,0 g e
este medicamento contm dois excipientes. A composio
do medicamento e o clculo do teor mximo em acetonitrilo
residual esto apresentados no quadro seguinte:
Quantidade na Teor em Exposio
Componente
Formulao acetonitrilo diria
particular. Em presena de solventes exclusivamente da classe 3,
pode utilizar-se um mtodo no especfico, como por exemplo
a perda por secagem. A validao dos mtodos de determinao
dos nveis de solventes residuais deve obedecer s normas
ICH seguintes: Text of Analytical Procedures e Extension on
Validation of Analytical Procedures.
3.5. DECLARAO DE CONFORMIDADE DOS LIMITES EM
SOLVENTES RESIDUAIS
A fim de respeitar os critrios descritos nesta nota explicativa,
os fabricantes de produtos farmacuticos necessitam de
informaes sobre os teores de solventes residuais contidos nos
excipientes e substncias activas. As seguintes afirmaes so
dadas como exemplos aceitveis da informao que deve ser
facultada pelos fornecedores de excipientes ou de substncias
activas aos fabricantes de produtos farmacuticos. Conforme o
caso, o fornecedor deve escolher uma das seguintes:

5. Textos gerais
Substncia activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mg provavelmente s esto presentes solventes da classe 3. A
Excipiente 1 0,9 g 400 ppm 0,36 mg perda por secagem inferior a 0,5 por cento,
Excipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mg provavelmente s esto presentes os solventes X, Y, da
Medicamento 5,0 g 728 ppm 3,64 mg classe 2. Todos se encontram abaixo dos limites preconizados
na opo 1. (Neste caso o fornecedor deve indicar o nome dos
O excipiente 1 satisfaz ao limite imposto pela opo 1, mas solventes da classe 2 representados por X, Y, ),
a substncia activa, o excipiente 2 e o medicamento no
correspondem s exigncias deste limite. No entanto, o provavelmente s esto presentes os solventes X, Y,
medicamento satisfaz ao limite da opo 2 (4,1 mg por dia) e, da classe 2 e solventes da classe 3. Os teores de solventes
consequentemente, s recomendaes desta nota explicativa. residuais da classe 2 encontram-se abaixo dos limites
preconizados na opo 1 e os teores dos solventes residuais
Consideremos um segundo exemplo de acetonitrilo residual. da classe 3 so inferiores a 0,5 por cento.
A quantidade mxima de um medicamento administrada
diariamente de 5,0 g e este medicamento contm dois Se solventes da classe 1 estiverem provavelmente presentes,
excipientes. devem ser identificados e quantificados. Provavelmente
presente refere-se simultaneamente ao solvente utilizado no
A composio do medicamento e o clculo do teor de passo final do fabrico e aos solventes que so usados no decurso
acetonitrilo residual esto indicadas no quadro seguinte: das etapas precedentes do fabrico e que no so removidos
sistematicamente recorrendo a um processo validado.
Quantidade na Teor em Exposio
Componente Se solventes da classe 2 ou classe 3 estiverem presentes em
Formulao acetonitrilo diria
Substncia activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mg quantidade, respectivamente, superior ao limite da opo 1 ou
superior a 0,5 por cento, devem ser identificados e quantificados.
Excipiente 1 0,9 g 2000 ppm 1,80 mg
Excipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mg
4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS
Medicamento 5,0 g 1016 ppm 5,08 mg

Neste caso, acontece que pela soma dos teores de cada
constituinte, o medicamento no respeita nem o limite da
opo 1, nem o da opo 2. O fabricante pode ento analisar
o medicamento com vista a saber se o processo de fabrico
permitiu reduzir o teor de acetonitrilo. Se o teor de acetonitrilo
no foi reduzido para o limite autorizado durante a formulao,
o fabricante deve tomar outras medidas para reduzir a
quantidade de acetonitrilo no medicamento. Se todos estes
procedimentos no permitirem a reduo do teor de solvente
residual, o fabricante pode, a ttulo excepcional, relatar as
medidas tomadas para reduzir o teor de solvente para o limite
preconizado e apresentar uma anlise avaliadora dos riscos e dos
benefcios que justifiquem a utilizao do medicamento com um
teor de solvente residual superior ao limite autorizado.
4.1. SOLVENTES A EVITAR
Os solventes da classe 1 no devem ser utilizados no fabrico
de substncias activas, excipientes e medicamentos devido
sua toxicidade inaceitvel ou ao seu efeito nocivo no ambiente.
Contudo, se a utilizao destes solventes for incontornvel para
a produo de um medicamento que corresponda a um avano
teraputico importante, os seus teores no devem ultrapassar
os valores apresentados no quadro 1, salvo excepo justificada.
O 1,1,1-tricloroetano est includo no quadro 1 devido ao seu
efeito nocivo sobre o ambiente. O limite assinalado de 1500
ppm est fundamentado na avaliao dos dados de segurana.
QUADRO 1 Solventes da classe 1 em produtos farmacuticos
(solventes que devem ser evitados)

3.4. PROCEDIMENTOS ANALTICOS Solvente

Concentrao
Nocividade
limite (ppm)
Os teores de solventes residuais so habitualmente Benzeno 2 Carcinognico
determinados por tcnicas cromatogrficas, como, por exemplo, Tetracloreto de carbono 4 Txico e nocivo
a cromatografia em fase gasosa. Para determinar os teores de para o ambiente
solventes residuais conveniente aplicar, na medida do possvel, 1,2-Dicloroetano 5 Txico
os procedimentos harmonizados descritos nas farmacopeias. 1,1-Dicloroetano 8 Txico
Em caso de impossibilidade, os fabricantes podem escolher um
1,1,1-Tricloroetano 1500 Nocivo para o ambiente
procedimento analtico validado e apropriado a uma aplicao

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 741

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5.4. Solventes residuais

4.2. SOLVENTES DE UTILIZAO LIMITADA QUADRO 3 Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas
BPF ou outros requisitos de qualidade (continuao)
Os solventes apresentados no quadro 2 devem estar limitados
nos produtos farmacuticos, devido sua toxicidade intrnseca. Acetato de isopropilo Etilmetilcetona
Os valores das EDA so apresentados com a aproximao Acetato de metilo Formato de etilo
de 0,1 mg/dia e as concentraes so apresentadas com a Acetato de propilo Heptano
aproximao de 10 ppm. Os valores apresentados no reflectem Acetona Isobutilmetilcetona
necessariamente a preciso analtica da determinao. A preciso cido actico 3-Metil-l-butanol
deve ser calculada e fazer parte da validao do mtodo. cido frmico 2-Metil-l-propanol
QUADRO 2 Solventes da classe 2 em produtos farmacuticos Anisol Pentano
1-Butanol 1-Pentanol
Solvente EDA (mg/dia) Concentrao limite (ppm) 2-Butanol 1-Propanol
Acetonitrilo 4,1 410 Cumeno 2-Propanol
Ciclo-hexano 38,8 3880 Dimetilsulfxido
Clorobenzeno 3,6 360
Clorofrmio 0,6 60
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870 4.4. SOLVENTES PARA OS QUAIS NO FORAM
Diclorometano 6,0 600 ENCONTRADOS DADOS TOXICOLGICOS ADEQUADOS
5. Textos gerais

N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090

Os solventes seguintes (quadro 4) podem tambm ter
N,N-Dimetilformamida 8,8 880
interesse para os fabricantes de excipientes, de substncias
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
activas ou de medicamentos. Contudo, no foram ainda
1,4-Dioxano 3,8 380
encontrados dados toxicolgicos adequados que permitam
Etilenoglicol 6,2 620
determinar uma EDA. Os fabricantes devem fornecer uma
2-Etoxietanol 1,6 160
justificao relativa aos nveis residuais destes solventes nos
Formamida 2,2 220
produtos farmacuticos.
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000 QUADRO 4 Solventes para os quais no foram encontrados dados
Metilbutilcetona 0,5 50 toxicolgicos adequados
Metilciclo-hexano 11,8 1180
N-Metilpirrolidona 5,3 530 cido tricloractico ter de petrleo
2-Metoxietanol 0,5 50 cido trifluoractico ter isoproplico
Nitrometano 0,5 50 1,1-Dietoxipropano Isoctano
Piridina 2,0 200 1,1-Dimetoxietano Isopropilmetilcetona
Sulfolano 1,6 160 2,2-Dimetoxipropano Metiltetra-hidrofurano
Tetra-hidrofurano 7,2 720
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890 GLOSSRIO
1,1,2-Tricloroetano 0,8 80
Carcinognios genotxicos: Carcinognios que produzem
Xileno* 21,7 2170
cancro por afectarem genes ou cromossomas.
* Habitualmente 60 por cento de m-xileno, 14 por cento de p-xileno, 9 por
LOEL: Abreviatura de lowest-observed effect level.
cento de o-xileno com 17 por cento de etilbenzeno.
Lowest-observed effect level: A menor dose de substncia
que, num estudo ou grupo de estudos, produz aumentos
4.3. SOLVENTES COM BAIXO POTENCIAL TXICO
biologicamente significativos na frequncia ou gravidade de
qualquer efeito nos animais ou humanos expostos.
Os solventes da classe 3 (apresentados no quadro 3) podem
ser considerados como os de menor toxicidade e de menor Factor de modificao: Um factor determinado por um
risco para a sade humana. A classe 3 no inclui qualquer toxicologista profissional e aplicado aos resultados de um
solvente que se saiba ser nocivo para a sade humana bioensaio para obter a relao com os dados humanos nas
nos limites autorizados para os produtos farmacuticos. condies de segurana satisfatrias.
Contudo, no existem estudos de toxicidade a longo
prazo nem estudos de carcinogenicidade para muitos dos Neurotoxicidade: A capacidade de uma substncia para
solventes da classe 3. Os dados disponveis indicam que eles provocar efeitos indesejveis sobre o sistema nervoso.
apresentam baixa toxicidade em estudos de toxicidade aguda
NOEL: Abreviao de no-observed-effect level
ou de curta durao e resultados negativos nos estudos
de genotoxicidade. O limite admissvel, sem justificao No-observed-effect level: A dose mais elevada de substncia
particular, para os solventes desta classe inferior ou igual para a qual no se verificam aumentos biologicamente
a 50 mg/dia (correspondendo a 5000 ppm ou a 0,5 por cento significativos da frequncia ou da gravidade de qualquer
de acordo com a opo 1). Quantidades superiores referida efeito no homem ou nos animais expostos.
podem tambm ser aceites desde que sejam realistas em
relao capabilidade de fabrico e s boas prticas de fabrico. EDA: Abreviatura de exposio diria admissvel (em ingls
PDE = permitted daily exposure).
QUADRO 3 Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas
BPF ou outros requisitos de qualidade Exposio diria admissvel: a dose mxima diria de
solvente residual admitida num produto farmacutico.
Acetato de butilo Etanol
Toxicidade reversvel: Ocorrncia de efeitos nocivos causados
Acetato de etilo ter etlico
por uma substncia e que desaparecem uma vez que cesse a
Acetato de isobutilo terc-butilmetilter
exposio substncia.

742 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.4. Solventes residuais

Carcinognio humano fortemente suspeito: Uma substncia Teratogenicidade: Aparecimento de malformaes

para a qual as provas epidemiolgicas de carcinognese no estruturais no decurso do desenvolvimento fetal quando se
puderam ser estabelecidas, ainda que existam dados genotxicos administra uma substncia durante a gravidez.
positivos e provas evidentes de carcinognese em roedores.

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 743

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5.4. Solventes residuais

5. Textos gerais

744 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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ANEXO 2. INFORMAES COMPLEMENTARES
A2.1. REGULAMENTAO AMBIENTAL PARA OS
SOLVENTES ORGNICOS VOLTEIS
Um certo nmero de solventes residuais, correntemente
utilizados no fabrico de produtos farmacuticos, considerado
como substncias txicas nas monografias EHC (Environmental
Health Criteria) relativas aos critrios de sade e de ambiente
e no sistema IRIS (Integrated Risk Information System). Faz
parte dos objectivos dos organismos como o International
Programme on Chemical Safety (IPCS), o United States
Environmental Protection Agency (USEPA) e o United States
Food and Drug Administration (USFDA), a determinao dos
teores de exposio admissveis. O objectivo desta determinao
proteger a sade pblica e preservar o ambiente contra
os eventuais efeitos nocivos resultantes de uma exposio
prolongada a estas substncias. Os mtodos utilizados para a
avaliao dos limites mximos de exposio sem causar efeitos
nocivos assentam geralmente em estudos conduzidos a longo
prazo. Se no se dispuser de resultados de estudos a longo
prazo, podem utilizar-se os resultados obtidos em estudos
de curto prazo, com a condio de certos parmetros serem
modificados (por exemplo, a utilizao de factores de segurana
mais elevados). A contribuio aqui descrita baseia-se numa
exposio a longo prazo ou exposio durante o tempo de vida
da populao no seu meio ambiente, ou seja, ao ar ambiente,
alimentao, gua potvel e a outros meios.
A2.2. SOLVENTES RESIDUAIS NOS PRODUTOS
FARMACUTICOS
Os limites de exposio contidos nesta nota explicativa
so definidos a partir de mtodos e dados de toxicidade
apresentados nas monografias ECH e IRIS. Contudo, ao
estabelecer estes limites, deve ter-se em conta alguns
postulados relativos aos resduos dos solventes utilizados na
sntese e no fabrico de produtos farmacuticos. Os postulados
so os seguintes:
1) Apenas os pacientes (e no a populao em geral) utilizam
produtos farmacuticos com o objectivo de se tratarem ou
prevenir as infeces e doenas.
2) Para a maior parte dos produtos farmacuticos, o
princpio de uma exposio durante toda a vida no
necessria, mas pode servir de hiptese de trabalho com
vista reduo de riscos para a sade.
3) Os solventes residuais entram inevitavelmente na
fabricao dos produtos farmacuticos e fazem
frequentemente parte integrante dos medicamentos.
4) Excepo feita para casos muito particulares, o teor
em solventes residuais no deve ultrapassar os limites
prescritos.
5) Os resultados dos estudos toxicolgicos utilizados para
determinar os teores aceitveis de solventes residuais
devem ter origem em protocolos experimentais
apropriados, tais como os descritos pela OCDE e pelo
Red Book da FDA.
ANEXO 3. MTODOS RELATIVOS AO ESTABELECIMENTO
DE LIMITES DE EXPOSIO
O mtodo de Gaylor-Kodell, relativo avaliao do risco
(Gaylor, D. W. and Kodell, R. L.: Linear Interpolation
algorithm for low dose assessmerzt of toxic substance,
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.4 SOLVENTES RESIDUAIS (NDICE)
5.4. Solventes residuais
J. Environ. Pathology, 4,305,1980), est apropriado para os
solventes carcinognicos da classe 1. No estabelecimento de
limites de exposio, apenas os dados de carcinogenicidade
fiveis podem justificar uma extrapolao por aplicao
de modelos matemticos. Os limites de exposio dos
solventes da classe 1 podem ser determinados combinando
factores de segurana elevados (ex. 10 000 a 1000 000) e
os dados de no-observed-effect level (NOEL). A deteco e
quantificao destes solventes deve responder aos ltimos
desenvolvimentos em matria de tcnicas analticas.
Os teores de exposio aceitveis apresentados nesta nota
explicativa para os solventes da classe 2 foram estabelecidos
aps calcular os valores de EDA, de acordo com os
procedimentos que permitem estabelecer os limites aplicveis
aos produtos farmacuticos (Pharmacopeia Forum, Nov-Dez
1989) e o mtodo adoptado pela IPCS para avaliao do risco
apresentado pelas substncias qumicas (Assessing Human
5. Textos gerais
Health Risk of Chemicals-Environmental Health Criteria
170, WHO, Geneve, 1994). Estes mtodos so semelhantes
aos utilizados pela EPA (RIS), FDA (Red Book) e por outros
organismos. O mtodo aqui apresentado para permitir uma
melhor compreenso da origem dos valores de EDA. No
necessrio efectuar estes clculos para utilizar os valores de
EDA indicados no ponto 4 do presente documento. A EDA
calculada a partir do no-observed-effect level (NOEL), ou
ainda do lowest-observed-effect level (LOEL), obtidos no
estudo mais relevante realizado com animais, com a ajuda da
expresso:
Preferencialmente a EDA deve ser derivada do NOEL. Se
o NOEL no puder ser obtido, deve utilizar-se o LOEL. Os
factores de modificao aqui propostos, que permitem aplicar
aos seres humanos os dados obtidos, assemelham-se aos
factores de incerteza utilizados nas EHC (Environmental
Health Criteria 170, WHO, Geneve, 1994), e aos factores
de modificao aos factores de segurana mencionados
no Pharmacopeial Forum. A hiptese de uma exposio
sistmica de 100% utilizada em todos as clculos, sem
distino das diferentes vias de administrao.
Os factores de modificao so as seguintes:
F1 = um factor que permite a extrapolao entre as espcies:
F1 = 2 para extrapolar do co para o homem
F1 = 2,5 para extrapolar do coelho para a homem
F1 = 3 para extrapolar da macaco para a homem
F1 = 5 para extrapolar da rato para a homem
F1 = 10 para extrapolar dos outros animais para o homem
F1 = 12 para extrapolar do ratinho para o homem.
F1 permite ter em conta as relaes comparativas superfcie/
/massa corporal para as espcies em questo e para o homem.
A superfcie (S) calculada com ajuda da expresso seguinte:
S = k M0,67 (2)
em que M corresponde massa corporal e k uma constante
cujo valor est fixado em 10. As massas corporais utilizadas
na equao esto no quadro A3.1, apresentado mais frente.
F2 = 10 e representa o factor que tem em conta a
variabilidade entre os indivduos. Em regra, um factor
de 10 est indicado para o conjunto dos solventes
745
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5.4. Solventes residuais

orgnicos. Este valor aplicado sistematicamente na
presente nota.
F3 = um factor varivel que corresponde aos estudos de
toxicidade relativos a uma exposio a curto prazo:
F3 = 1, para os estudos cuja durao corresponde, pelo
menos, a um tempo de semi-vida (1 ano para os
roedores ou coelhos; 7 anos para os gatos, ces e
macacos)
F3 = 1, para os estudos relativos reproduo, no
decurso dos quais est coberto todo o perodo da
organognese
F3 = 2, para um estudo de 6 meses com roedores ou de
3,5 anos com no roedores
F3 = 5, para um estudo de 3 meses com roedores ou de
2 anos com no roedores
5. Textos gerais
Para ilustrar a aplicao desta equao, tomemos, a ttulo
de exemplo, um estudo de toxicidade do acetonitrilo no
rato, que apresentado no suplemento de Abril de 1997 de
Pharmeuropa, vol. 9, n 1, pgina S24 (verso inglesa). O
valor de NOEL estimado 50,7 mg kg1 dia1. Neste caso
concreto, o valor da EDA calculado como se segue:
EDA = 50,7 mg kg1 dia1 50 kg/12 10 5 1 1
EDA = 4,22 mg dia1
Neste exemplo,
F1 = 12, para ter em conta a extrapolao do rato para o
homem
F2 = 10, para ter em conta as diferenas entre os indivduos
F3 = 5, uma vez que a durao do estudo est limitada a
apenas 13 semanas
F4 = 1, porque no se verifica qualquer toxicidade grave

F3 = 10, para os estudos de curta durao.

F5 = 1, porque foi determinada a dose no efectiva
Quando os estudos tm uma durao que se situa entre o
incio e o fim de perodos acima determinados, utiliza-se o QUADRO A3.1 Valores utilizados para os clculos apresentados
factor mais elevado, por exemplo, um factor de 2 para um neste documento
estudo de 9 meses com roedores.
Massa corporal do rato 425 g
F4 = um factor que pode ser utilizado em todos os casos Massa corporal de uma rata em gestao 330 g
de toxicidade elevada, por exemplo carcinogenicidade Massa corporal do ratinho 28 g
no genotxica, neurotoxicidade ou teratogenicidade. Massa corporal de uma ratinha em gestao 30 g
Nos estudos de toxicidade ligada reproduo devem Massa corporal do cobaio 500 g
utilizar-se os factores indicados a seguir: Massa corporal do macaco Rhesus 2,5 kg
Massa corporal do coelho (em gestao ou no) 4 kg
F4 = 1, para a toxicidade associada ao feto ou me
Massa corporal do co beagle 11,5 kg
F4 = 5, para a toxicidade associada ao feto sem a me Volume respiratrio do rato 290 1/dia
Volume respiratrio do ratinho 43 1/dia
F4 = 5, para um efeito teratognico com efeito txico
Volume respiratrio do coelho 1440 1/dia
para a me
Volume respiratrio do cobaia 430 1/dia
F4 = 10, para um efeito teratognico sem efeito txico Volume respiratrio do homem 28800 1/dia
para a me. Volume respiratrio do co 9000 1/dia
Volume respiratrio do macaco 1150 1/dia
F5 = um factor varivel que pode ser utilizado se a dose no Consumo de gua do ratinho 5 ml/dia
efectiva no foi estabelecida. Consumo de gua do rato 30 ml/dia
Quando apenas se conhece o valor LOEL, pode utilizar-se um Consumo alimentar do rato 30 g/dia
factor que pode ir at 10, em funo do grau de toxicidade.
No que se refere s concentraes de gs utilizadas nos
O ajustamento do peso efectuado assumindo o valor estudos de inalao, a equao dos gases perfeitos,
arbitrrio de 50 Kg para a massa corporal de um adulto do PV = nRT, permite converter ppm em mg/l ou mg/m3.
sexo masculino ou feminino. Este valor, relativamente baixo, A ttulo de exemplo, o estudo de toxicidade reprodutiva
oferece uma margem de segurana acrescida em relao ao do rato por inalao de tetracloreto de carbono (massa
peso padro, 60 ou 70 kg, frequentemente utilizado neste tipo molecular 153,84) apresentado no Suplemento de Abril
de clculo. Para os adultos com menos de 50 kg, considera- de 1997 de Pharmaeuropa, vol. 9, n 1, pgina S9.
se que esto protegidos pela acumulao dos factores de
n/V = P/RT = 300 106 atm 153840 mg mol1/0,082 atm
segurana utilizados na determinao da EDA. Se o solvente K1 mol1 298K = 46,15 mg/24,45 l = 1,89 mg/l
estiver presente num medicamento exclusivamente para uso
peditrico, deve proceder-se correco do peso, ajustando-o Foi utilizada a correspondncia 1000 l = 1 m3, para converter
para o valor inferior adequado. o resultado em mg/m3.

746 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.5. TABELAS
ALCOOMTRICAS
5.5. Tabelas alcoomtricas 749

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 747

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)
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5.5. Tabelas alcoomtricas

5.5. TABELAS ALCOOMTRICAS % V/V % m/m 20 (kg/m3)

5,3 4,22 990,65
A frmula geral fixada pelo Conselho das Comunidades 5,4 4,30 990,52
Europeias nas suas Directivas de 27 de Julho de 1976 sobre 5,5 4,38 990,39
a alcoometria serviu de base para estabelecer as tabelas 5,6 4,46 990,26
seguintes. 5,7 4,54 990,12
5,8 4,62 990,99
% V/V % m/m 20 (kg/m3) 5,9 4,70 989,86
0,0 0,0 998,20
0,1 0,08 998,05 6,0 4,78 989,73
0,2 0,16 997,90 6,1 4,86 989,60
0,3 0,24 997,75 6,2 4,95 989,47
0,4 0,32 997,59 6,3 5,03 989,34
6,4 5,11 989,21
0,5 0,40 997,44
6,5 5,19 989,08
0,6 0,47 997,29
6,6 5,27 988,95
0,7 0,55 997,14
6,7 5,35 988,82
0,8 0,63 996,99
6,8 5,43 988,69

5. Textos gerais
0,9 0,71 996,85
6,9 5,51 988,56

1,0 0,79 996,70

7,0 5,59 988,43
1,1 0,87 996,55
7,1 5,67 988,30
1,2 0,95 996,40
7,2 5,75 988,18
1,3 1,03 996,25
7,3 5,83 988,05
1,4 1,11 996,11
7,4 5,91 987,92
1,5 1,19 995,96
7,5 5,99 987,79
1,6 1,27 995,81
7,6 6,07 987,67
1,7 1,35 995,67
7,7 6,15 987,54
1,8 1,43 995,52
7,8 6,23 987,42
1,9 1,51 995,38
7,9 6,32 987,29

2,0 1,59 995,23

8,0 6,40 987,16
2,1 1,67 995,09
8,1 6,48 987,04
2,2 1,75 994,94
8,2 6,56 986,91
2,3 1,82 994,80
8,3 6,64 986,79
2,4 1,90 994,66
8,4 6,72 986,66
2,5 1,98 994,51
8,5 6,80 986,54
2,6 2,06 994,37
8,6 6,88 986,42
2,7 2,14 994,23
8,7 6,96 986,29
2,8 2,22 994,09
8,8 7,04 986,17
2,9 2,30 993,95
8,9 7,12 986,05

3,0 2,38 993,81

9,0 7,20 985,92
3,1 2,46 993,66
9,1 7,29 985,80
3,2 2,54 993,52
9,2 7,37 985,68
3,3 2,62 993,38
9,3 7,45 985,56
3,4 2,70 993,24
9,4 7,53 985,44
3,5 2,78 993,11
9,5 7,61 985,31
3,6 2,86 992,97
9,6 7,69 985,19
3,7 2,94 992,83
9,7 7,77 985,07
3,8 3,02 992,69
9,8 7,85 984,95
3,9 3,10 992,55
9,9 7,93 984,83

4,0 3,18 992,41

10,0 8,01 984,71
4,1 3,26 992,28
10,1 8,10 984,59
4,2 3,34 992,14
10,2 8,18 984,47
4,3 3,42 992,00
10,3 8,26 984,35
4,4 3,50 991,87
10,4 8,34 984,23
4,5 3,58 991,73
10,5 8,42 984,11
4,6 3,66 991,59
10,6 8,50 983,99
4,7 3,74 991,46
10,7 8,58 983,88
4,8 3,82 991,32
10,8 8,66 983,76
4,9 3,90 991,19
10,9 8,75 983,64

5,0 3,98 991,06

11,0 8,83 983,52
5,1 4,06 990,92
11,1 8,91 983,40
5,2 4,14 990,79
11,2 8,99 983,29

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 749

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

11,3 9,07 983,17 17,3 13,98 976,46

11,4 9,15 983,05 17,4 14,07 976,35
11,5 9,23 982,94 17,5 14,15 976,25
11,6 9,32 982,82 17,6 14,23 976,14
11,7 9,40 982,70 17,7 14,31 976,03
11,8 9,48 982,59 17,8 14,40 975,92
11,9 9,56 982,47 17,9 14,48 975,81

12,0 9,64 982,35 18,0 14,56 975,71

12,1 9,72 982,24 18,1 14,64 975,60
12,2 9,80 982,12 18,2 14,73 975,49
12,3 9,89 982,01 18,3 14,81 975,38
12,4 9,97 981,89 18,4 14,89 975,28
12,5 10,05 981,78 18,5 14,97 975,17
12,6 10,13 981,67 18,6 15,06 975,06
12,7 10,21 981,55 18,7 15,14 974,95
5. Textos gerais

12,8 10,29 981,44 18,8 15,22 974,85

12,9 10,37 981,32 18,9 15,30 974,74

13,0 10,46 981,21 19,0 15,39 974,63

13,1 10,54 981,10 19,1 15,47 974,52
13,2 10,62 980,98 19,2 15,55 974,42
13,3 10,70 980,87 19,3 15,63 974,31
13,4 10,78 980,76 19,4 15,72 974,20
13,5 10,87 980,64 19,5 15,80 974,09
13,6 10,95 980,53 19,6 15,88 973,99
13,7 11,03 980,42 19,7 15,97 973,88
13,8 11,11 980,31 19,8 16,05 973,77
13,9 11,19 980,19 19,9 16,13 973,66

14,0 11,27 980,08 20,0 16,21 973,56

14,1 11,36 979,97 20,1 16,30 973,45
14,2 11,44 979,86 20,2 16,38 973,34
14,3 11,52 979,75 20,3 16,46 973,24
14,4 11,60 979,64 20,4 16,55 973,13
14,5 11,68 979,52 20,5 16,63 973,02
14,6 11,77 979,41 20,6 16,71 972,91
14,7 11,85 979,30 20,7 16,79 972,80
14,8 11,93 979,19 20,8 16,88 972,70
14,9 12,01 979,08 20,9 16,96 972,59

15,0 12,09 978,97 21,0 17,04 972,48

15,1 12,17 978,86 21,1 17,13 972,37
15,2 12,26 978,75 21,2 17,21 972,27
15,3 12,34 978,64 21,3 17,29 972,16
15,4 12,42 978,53 21,4 17,38 972,05
15,5 12,50 978,42 21,5 17,46 971,94
15,6 12,59 978,31 21,6 17,54 971,83
15,7 12,67 978,20 21,7 17,62 971,73
15,8 12,75 978,09 21,8 17,71 971,62
15,9 12,83 977,98 21,9 17,79 971,51

16,0 12,91 977,87 22,0 17,87 971,40

16,1 13,00 977,76 22,1 17,96 971,29
16,2 13,08 977,65 22,2 18,04 971,18
16,3 13,16 977,55 22,3 18,12 971,08
16,4 13,24 977,44 22,4 18,21 970,97
16,5 13,32 977,33 22,5 18,29 970,86
16,6 13,41 977,22 22,6 18,37 970,75
16,7 13,49 977,11 22,7 18,46 970,64
16,8 13,57 977,00 22,8 18,54 970,53
16,9 13,65 976,89 22,9 18,62 970,42

17,0 13,74 976,79 23,0 18,71 970,31

17,1 13,82 976,68 23,1 18,79 970,20
17,2 13,90 976,57 23,2 18,87 970,09

750 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

23,3 18,96 969,98 29,3 24,01 963,07

23,4 19,04 969,87 29,4 24,10 962,95
23,5 19,13 969,76 29,5 24,18 962,83
23,6 19,21 969,65 29,6 24,27 962,71
23,7 19,29 969,54 29,7 24,35 962,58
23,8 19,38 969,43 29,8 24,44 962,46
23,9 19,46 969,32 29,9 24,52 962,33

24,0 19,54 969,21 30,0 24,61 962,21

24,1 19,63 969,10 30,l 24,69 962,09
24,2 19,71 968,99 30,2 24,78 961,96
24,3 19,79 968,88 30,3 24,86 961,84
24,4 19,88 968,77 30,4 24,95 961,71
24,5 19,96 968,66 30,5 25,03 961,59
24,6 20,05 968,55 30,6 25,12 961,46
24,7 20,13 968,43 30,7 25,20 961,33

5. Textos gerais
24,8 20,21 968,32 30,8 25,29 961,21
24,9 20,30 968,21 30,9 25,38 961,08

25,0 20,38 968,10 31,0 25,46 960,95

25,1 20,47 967,99 31,1 25,55 960,82
25,2 20,55 967,87 31,2 25,63 960,70
25,3 20,63 967,76 31,3 25,72 960,57
25,4 20,72 967,65 31,4 25,80 960,44
25,5 20,80 967,53 31,5 25,89 960,31
25,6 20,88 967,42 31,6 25,97 960,18
25,7 20,97 967,31 31,7 26,06 960,05
25,8 21,05 967,19 31,8 26,15 959,92
25,9 21,14 967,08 31,9 26,23 959,79

26,0 21,22 966,97 32,0 26,32 959,66

26,1 21,31 966,85 32,1 26,40 959,53
26,2 21,39 966,74 32,2 26,49 959,40
26,3 21,47 966,62 32,3 26,57 959,27
26,4 21,56 966,51 32,4 26,66 959,14
26,5 21,64 966,39 32,5 26,75 959,01
26,6 21,73 966,28 32,6 26,83 958,87
26,7 21,81 966,16 32,7 26,92 958,74
26,8 21,90 966,05 32,8 27,00 958,61
26,9 21,98 965,93 32,9 27,09 958,47

27,0 22,06 965,81 33,0 27,18 958,34

27,1 22,15 965,70 33,1 27,26 958,20
27,2 22,23 965,58 33,2 27,35 958,07
27,3 22,32 965,46 33,3 27,44 957,94
27,4 22,40 965,35 33,4 27,52 957,80
27,5 22,49 965,23 33,5 27,61 957,66
27,6 22,57 965,11 33,6 27,69 957,53
27,7 22,65 964,99 33,7 27,78 957,39
27,8 22,74 964,88 33,8 27,87 957,26
27,9 22,82 964,76 33,9 27,95 957,12

28,0 22,91 964,64 34,0 28,04 956,98

28,1 22,99 964,52 34,1 28,13 956,84
28,2 23,08 964,40 34,2 28,21 956,70
28,3 23,16 964,28 34,3 28,30 956,57
28,4 23,25 964,16 34,4 28,39 956,43
28,5 23,33 964,04 34,5 28,47 956,29
28,6 23,42 963,92 34,6 28,56 956,15
28,7 23,50 963,80 34,7 28,65 956,01
28,8 23,59 963,68 34,8 28,73 955,87
28,9 23,67 963,56 34,9 28,82 955,73

29,0 23,76 963,44 35,0 28,91 955,59

29,1 23,84 963,32 35,1 28,99 955,45
29,2 23,93 963,20 35,2 29,08 955,30

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 751

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

35,3 29,17 955,16 41,3 34,46 945,93

35,4 29,26 955,02 41,4 34,55 945,76
35,5 29,34 954,88 41,5 34,64 945,59
35,6 29,43 954,73 41,6 34,73 945,43
35,7 29,52 954,59 41,7 34,82 945,26
35,8 29,60 954,44 41,8 34,91 945,09
35,9 29,69 954,30 41,9 35,00 944,93

36,0 29,78 954,15 42,0 35,09 944,76

36,1 29,87 954,01 42,1 35,18 944,59
36,2 29,95 953,86 42,2 35,27 944,42
36,3 30,04 953,72 42,3 35,36 944,25
36,4 30,13 953,57 42,4 35,45 944,08
36,5 30,21 953,42 42,5 35,54 943,91
36,6 30,30 953,28 42,6 35,63 943,74
36,7 30,39 953,13 42,7 35,72 943,57
5. Textos gerais

36,8 30,48 952,98 42,8 35,81 943,40

36,9 30,56 952,83 42,9 35,90 943,23

37,0 30,65 952,69 43,0 35,99 943,06

37,1 30,74 952,54 43,1 36,08 942,88
37,2 30,83 952,39 43,2 36,17 942,71
37,3 30,92 952,24 43,3 36,26 942,54
37,4 31,00 952,09 43,4 36,35 942,37
37,5 31,09 951,94 43,5 36,44 942,19
37,6 31,18 951,79 43,6 36,53 942,02
37,7 31,27 951,63 43,7 36,62 941,84
37,8 31,35 951,48 43,8 36,71 941,67
37,9 31,44 951,33 43,9 36,80 941,49

38,0 31,53 951,18 44,0 36,89 941,32

38,1 31,62 951,02 44,1 36,98 941,14
38,2 31,71 950,87 44,2 37,07 940,97
38,3 31,79 950,72 44,3 37,16 940,79
38,4 31,88 950,56 44,4 37,25 940,61
38,5 31,97 950,41 44,5 37,35 940,43
38,6 32,06 950,25 44,6 37,44 940,26
38,7 32,15 950,10 44,7 37,53 940,08
38,8 32,24 949,94 44,8 37,62 939,90
38,9 32,32 949,79 44,9 37,71 939,72

39,0 32,41 949,63 45,0 37,80 939,54

39,1 32,50 949,47 45,1 37,89 939,36
39,2 32,59 949,32 45,2 37,98 939,18
39,3 32,68 949,16 45,3 38,08 939,00
39,4 32,77 949,00 45,4 38,17 938,82
39,5 32,86 948,84 45,5 38,26 938,64
39,6 32,94 948,68 45,6 38,35 938,46
39,7 33,03 948,52 45,7 38,44 938,28
39,8 33,12 948,37 45,8 38,53 938,10
39,9 33,21 948,21 45,9 38,62 937,91

40,0 33,30 948,05 46,0 38,72 937,73

40,1 33,39 947,88 46,1 38,81 937,55
40,2 33,48 947,72 46,2 38,90 937,36
40,3 33,57 947,56 46,3 38,99 937,18
40,4 33,66 947,40 46,4 39,08 937,00
40,5 33,74 947,24 46,5 39,18 936,81
40,6 33,83 947,08 46,6 39,27 936,63
40,7 33,92 946,91 46,7 39,36 936,44
40,8 34,01 946,75 46,8 39,45 936,26
40,9 34,10 946,58 46,9 39,54 936,07

41,0 34,19 946,42 47,0 39,64 935,88

41,1 34,28 946,26 47,1 39,73 935,70
41,2 34,37 946,09 47,2 39,82 935,51

752 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

47,3 39,91 935,32 53,3 45,55 923,50

47,4 40,00 935,14 53,4 45,65 923,30
47,5 40,10 934,95 53,5 45,74 923,09
47,6 40,19 934,76 53,6 45,84 922,88
47,7 40,28 934,57 53,7 45,93 922,68
47,8 40,37 934,38 53,8 46,03 922,47
47,9 40,47 934,19 53,9 46,13 922,26

48,0 40,56 934,00 54,0 46,22 922,06

48,1 40,65 933,81 54,1 46,32 921,85
48,2 40,75 933,62 54,2 46,41 921,64
48,3 40,84 933,43 54,3 46,51 921,43
48,4 40,93 933,24 54,4 46,61 921,22
48,5 41,02 933,05 54,5 46,70 921,01
48,6 41,12 932,86 54,6 46,80 920,80
48,7 41,21 932,67 54,7 46,90 920,59

5. Textos gerais
48,8 41,30 932,47 54,8 46,99 920,38
48,9 41,40 932,28 54,9 47,09 920,17

49,0 41,49 932,09 55,0 47,18 919,96

49,1 41,58 931,90 55,1 47,28 919,75
49,2 41,68 931,70 55,2 47,38 919,54
49,3 41,77 931,51 55,3 47,47 919,33
49,4 41,86 931,31 55,4 47,57 919,12
49,5 41,96 931,12 55,5 47,67 918,91
49,6 42,05 930,92 55,6 47,77 918,69
49,7 42,14 930,73 55,7 47,86 918,48
49,8 42,24 930,53 55,8 47,96 918,27
49,9 42,33 930,34 55,9 48,06 918,06

50,0 42,43 930,14 56,0 48,15 917,84

50,1 42,52 929,95 56,1 48,25 917,63
50,2 42,61 929,75 56,2 48,35 917,42
50,3 42,71 929,55 56,3 48,45 917,20
50,4 42,80 929,35 56,4 48,54 916,99
50,5 42,90 929,16 56,5 48,64 916,77
50,6 42,99 928,96 56,6 48,74 916,56
50,7 43,08 928,76 56,7 48,84 916,35
50,8 43,18 928,56 56,8 48,93 916,13
50,9 43,27 928,36 56,9 49,03 915,91

51,0 43,37 928,16 57,0 49,13 915,70

51,1 43,46 927,96 57,1 49,23 915,48
51,2 43,56 927,77 57,2 49,32 915,27
51,3 43,65 927,57 57,3 49,42 915,05
51,4 43,74 927,36 57,4 49,52 914,83
51,5 43,84 927,16 57,5 49,62 914,62
51,6 43,93 926,96 57,6 49,72 914,40
51,7 44,03 926,76 57,7 49,81 914,18
51,8 44,12 926,56 57,8 49,91 913,97
51,9 44,22 926,36 57,9 50,01 913,75

52,0 44,31 926,16 58,0 50,11 913,53

52,1 44,41 925,95 58,1 50,21 913,31
52,2 44,50 925,75 58,2 50,31 913,09
52,3 44,60 925,55 58,3 50,40 912,87
52,4 44,69 925,35 58,4 50,50 912,65
52,5 44,79 925,14 58,5 50,60 912,43
52,6 44,88 924,94 58,6 50,70 912,22
52,7 44,98 924,73 58,7 50,80 912,00
52,8 45,07 924,53 58,8 50,90 911,78
52,9 45,17 924,32 58,9 51,00 911,55

53,0 45,26 924,12 59,0 51,10 911,33

53,1 45,36 923,91 59,1 51,19 911,11
53,2 45,46 923,71 59,2 51,29 910,89

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 753

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

59,3 51,39 910,67 65,3 57,46 896,94

59,4 51,49 910,45 65,4 57,56 896,71
59,5 51,59 910,23 65,5 57,67 896,47
59,6 51,69 910,01 65,6 57,77 896,23
59,7 51,79 909,78 65,7 57,87 896,00
59,8 51,89 909,56 65,8 57,98 895,76
59,9 51,99 909,34 65,9 58,08 895,52

60,0 52,09 909,11 66,0 58,18 895,28

60,1 52,19 908,89 66,1 58,29 895,05
60,2 52,29 908,67 66,2 58,39 894,81
60,3 52,39 908,44 66,3 58,49 894,57
60,4 52,49 908,22 66,4 58,60 894,33
60,5 52,59 908,00 66,5 58,70 894,09
60,6 52,69 907,77 66,6 58,81 893,85
60,7 52,79 907,55 66,7 58,91 893,61
5. Textos gerais

60,8 52,89 907,32 66,8 59,01 893,37

60,9 52,99 907,10 66,9 59,12 893,13

61,0 53,09 906,87 67,0 59,22 892,89

61,1 53,19 906,64 67,1 59,33 892,65
61,2 53,29 906,42 67,2 59,43 892,41
61,3 53,39 906,19 67,3 59,54 892,17
61,4 53,49 905,97 67,4 59,64 891,93
61,5 53,59 905,74 67,5 59,74 891,69
61,6 53,69 905,51 67,6 59,85 891,45
61,7 53,79 905,29 67,7 59,95 891,20
61,8 53,89 905,06 67,8 60,06 890,96
61,9 53,99 904,83 67,9 60,16 890,72

62,0 54,09 904,60 68,0 60,27 890,48

62,1 54,19 904,37 68,1 60,37 890,23
62,2 54,30 904,15 68,2 60,48 889,99
62,3 54,40 903,92 68,3 60,58 889,75
62,4 54,50 903,69 68,4 60,69 889,50
62,5 54,60 903,46 68,5 60,80 889,26
62,6 54,70 903,23 68,6 60,90 889,01
62,7 54,80 903,00 68,7 61,01 888,77
62,8 54,90 902,77 68,8 61,11 888,52
62,9 55,00 902,54 68,9 61,22 888,28

63,0 55,11 902,31 69,0 61,32 888,03

63,1 55,21 902,08 69,1 61,43 887,79
63,2 55,31 901,85 69,2 61,54 887,54
63,3 55,41 901,62 69,3 61,64 887,29
63,4 55,51 901,39 69,4 61,75 887,05
63,5 55,61 901,15 69,5 61,85 886,80
63,6 55,72 900,92 69,6 61,96 886,55
63,7 55,82 900,69 69,7 62,07 886,31
63,8 55,92 900,46 69,8 62,17 886,06
63,9 56,02 900,23 69,9 62,28 885,81

64,0 56,12 899,99 70,0 62,39 885,56

64,1 56,23 899,76 70,1 62,49 885,31
64,2 56,33 899,53 70,2 62,60 885,06
64,3 56,43 899,29 70,3 62,71 884,82
64,4 56,53 899,06 70,4 62,81 884,57
64,5 56,64 898,83 70,5 62,92 884,32
64,6 56,74 898,59 70,6 63,03 884,07
64,7 56,84 898,36 70,7 63,13 883,82
64,8 56,94 898,12 70,8 63,24 883,57
64,9 57,05 897,89 70,9 63,35 883,32

65,0 57,15 897,65 71,0 63,46 883,06

65,1 57,25 897,42 71,1 63,56 882,81
65,2 57,36 897,18 71,2 63,67 882,56

754 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

71,3 63,78 882,31 77,3 70,39 866,67

71,4 63,89 882,06 77,4 70,51 866,40
71,5 63,99 881,81 77,5 70,62 866,13
71,6 64,10 881,55 77,6 70,73 865,86
71,7 64,21 881,30 77,7 70,85 865,59
71,8 64,32 881,05 77,8 70,96 865,32
71,9 64,43 880,79 77,9 71,07 865,05

72,0 64,53 880,54 78,0 71,19 864,78

72,1 64,64 880,29 78,1 71,30 864,50
72,2 64,75 880,03 78,2 71,41 864,23
72,3 64,86 879,78 78,3 71,53 863,96
72,4 64,97 879,52 78,4 71,64 863,69
72,5 65,08 879,27 78,5 71,76 863,41
72,6 65,19 879,01 78,6 71,87 863,14
72,7 65,29 878,75 78,7 71,98 862,86

5. Textos gerais
72,8 65,40 878,50 78,8 72,10 862,59
72,9 65,51 878,24 78,9 72,21 862,31

73,0 65,62 877,99 79,0 72,33 862,04

73,1 65,73 877,73 79,1 72,44 861,76
73,2 65,84 877,47 79,2 72,56 861,49
73,3 65,95 877,21 79,3 72,67 861,21
73,4 66,06 876,96 79,4 72,79 860,94
73,5 66,17 876,70 79,5 72,90 860,66
73,6 66,28 876,44 79,6 73,02 860,38
73,7 66,39 876,18 79,7 73,13 860,10
73,8 66,50 875,92 79,8 73,25 859,83
73,9 66,61 875,66 79,9 73,36 859,55

74,0 66,72 875,40 80,0 73,48 859,27

74,1 66,83 875,14 80,1 73,60 858,99
74,2 66,94 874,88 80,2 73,71 858,71
74,3 67,05 874,62 80,3 73,83 858,43
74,4 67,16 874,36 80,4 73,94 858,15
74,5 67,27 874,10 80,5 74,06 857,87
74,6 67,38 873,84 80,6 74,18 857,59
74,7 67,49 873,58 80,7 74,29 857,31
74,8 67,60 873,32 80,8 74,41 857,03
74,9 67,71 873,06 80,9 74,53 856,75

75,0 67,82 872,79 81,0 74,64 856,46

75,1 67,93 872,53 81,1 74,76 856,18
75,2 68,04 872,27 81,2 74,88 855,90
75,3 68,15 872,00 81,3 74,99 855,62
75,4 68,26 871,74 81,4 75,11 855,33
75,5 68,38 871,48 81,5 75,23 855,05
75,6 68,49 871,21 81,6 75,34 854,76
75,7 68,60 870,95 81,7 75,46 854,48
75,8 68,71 870,68 81,8 75,58 854,19
75,9 68,82 870,42 81,9 75,70 853,91

76,0 68,93 870,15 82,0 75,82 853,62

76,1 69,04 869,89 82,1 75,93 853,34
76,2 69,16 869,62 82,2 76,05 853,05
76,3 69,27 869,35 82,3 76,17 852,76
76,4 69,38 869,09 82,4 76,29 852,48
76,5 69,49 868,82 82,5 76,41 852,19
76,6 69,61 868,55 82,6 76,52 851,90
76,7 69,72 868,28 82,7 76,64 851,61
76,8 69,83 868,02 82,8 76,76 851,32
76,9 69,94 867,75 82,9 76,88 851,03

77,0 70,06 867,48 83,0 77,00 850,74

77,1 70,17 867,21 83,1 77,12 850,45
77,2 70,28 866,94 83,2 77,24 850,16

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 755

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

83,3 77,36 849,87 89,3 84,76 831,48

83,4 77,48 849,58 89,4 84,89 831,15
83,5 77,60 849,29 89,5 85,02 830,82
83,6 77,72 848,99 89,6 85,15 830,50
83,7 77,84 848,70 89,7 85,28 830,17
83,8 77,96 848,41 89,8 85,41 829,84
83,9 78,08 848,11 89,9 85,54 829,51

84,0 78,20 847,82 90,0 85,66 829,18

84,1 78,32 847,53 90,1 85,79 828,85
84,2 78,44 847,23 90,2 85,92 828,52
84,3 78,56 846,93 90,3 86,05 828,19
84,4 78,68 846,64 90,4 86,18 827,85
84,5 78,80 846,34 90,5 86,31 827,52
84,6 78,92 846,05 90,6 86,44 827,18
84,7 79,04 845,75 90,7 86,57 826,85
5. Textos gerais

84,8 79,16 845,45 90,8 86,71 826,51

84,9 79,28 845,15 90,9 86,84 826,17

85,0 79,40 844,85 91,0 86,97 825,83

85,1 79,53 844,55 91,1 87,10 825,49
85,2 79,65 844,25 91,2 87,23 825,15
85,3 79,77 843,95 91,3 87,36 824,81
85,4 79,89 843,65 91,4 87,49 824,47
85,5 80,01 843,35 91,5 87,63 824,13
85,6 80,14 843,05 91,6 87,76 823,78
85,7 80,26 842,75 91,7 87,89 823,44
85,8 80,38 842,44 91,8 88,02 823,09
85,9 80,50 842,14 91,9 88,16 822,74

86,0 80,63 841,84 92,0 88,29 822,39

86,1 80,75 841,53 92,1 88,42 822,04
86,2 80,87 841,23 92,2 88,56 821,69
86,3 81,00 840,92 92,3 88,69 821,34
86,4 81,12 840,62 92,4 88,83 820,99
86,5 81,24 840,31 92,5 88,96 820,63
86,6 81,37 840,00 92,6 89,10 820,28
86,7 81,49 839,70 92,7 89,23 819,92
86,8 81,61 839,39 92,8 89,37 819,57
86,9 81,74 839,08 92,9 89,50 819,21

87,0 81,86 838,77 93,0 89,64 818,85

87,1 81,99 838,46 93,1 89,77 818,49
87,2 82,11 838,15 93,2 89,91 818,12
87,3 82,24 837,84 93,3 90,05 817,76
87,4 82,36 837,52 93,4 90,18 817,40
87,5 82,49 837,21 93,5 90,32 817,03
87,6 82,61 836,90 93,6 90,46 816,66
87,7 82,74 836,59 93,7 90,59 816,30
87,8 82,86 836,27 93,8 90,73 815,93
87,9 82,99 835,96 93,9 90,87 815,55

88,0 83,11 835,64 94,0 91,01 815,18

88,1 83,24 835,32 94,1 91,15 814,81
88,2 83,37 835,01 94,2 91,29 814,43
88,3 83,49 834,69 94,3 91,43 814,06
88,4 83,62 834,37 94,4 91,56 813,68
88,5 83,74 834,05 94,5 91,70 813,30
88,6 83,87 833,73 94,6 91,84 812,92
88,7 84,00 833,41 94,7 91,98 812,54
88,8 84,13 833,09 94,8 92,13 812,15
88,9 84,25 832,77 94,9 92,27 811,77

89,0 84,38 832,45 95,0 92,41 811,38

89,1 84,51 832,12 95,1 92,55 810,99
89,2 84,64 831,80 95,2 92,69 810,60

756 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

95,3 92,83 810,21 97,8 96,51 799,80

95,4 92,98 809,82 97,9 96,66 799,35
95,5 93,12 809,42
95,6 93,26 809,02 98,0 96,81 798,90
95,7 93,41 808,63 98,1 96,97 798,45
95,8 93,55 808,23 98,2 97,12 798,00
95,9 93,69 807,82 98,3 97,28 797,54
98,4 97,43 797,08
96,0 93,84 807,42 98,5 97,59 796,62
96,1 93,98 807,01 98,6 97,74 796,15
96,2 94,13 806,61 98,7 97,90 795,68
96,3 94,27 806,20 98,8 98,06 795,21
96,4 94,42 805,78 98,9 98,22 794,73
96,5 94,57 805,37
96,6 94,71 804,96 99,0 98,38 794,25
96,7 94,86 804,54 99,1 98,53 793,77

5. Textos gerais
96,8 95,01 804,12 99,2 98,69 793,28
96,9 95,16 803,70 99,3 98,86 792,79
99,4 99,02 792,30
97,0 95,31 803,27 99,5 99,18 791,80
97,1 95,45 802,85 99,6 99,34 791,29
97,2 95,60 802,42 99,7 99,50 790,79
97,3 95,75 801,99 99,8 99,67 790,28
97,4 95,90 801,55 99,9 99,83 789,76
97,5 96,05 801,12
97,6 96,21 800,68 100,0 100,0 789,24
97,7 96,36 800,24

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 757

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.6. AFERIO DOS

INTERFERES
5.6. Aferio dos interferes 761

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 759

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)
5.6. AFERIO DOS
INTERFERES
O captulo seguinte publcado a ttulo de informao.
1. INTRODUO
As monografias relativas aos interferes humanos incluem,
geralmente, uma aferio biolgica fundamentada na
aco inibidora, exercida pelos interferes, sobre o efeito
citopatognico de um vrus sobre uma cultura celular.
Entretanto, geralmente, no do especificaes pormenorizadas
no que se refere ao vrus, linha celular e tcnica a utilizar, de
modo a permitir uma certa flexibilidade, indispensvel nos casos
em que a monografia inclui vrias subclasses de interferes.
A presente monografia tem por finalidade fornecer ao analista
indicaes gerais sobre a tcnica, a optimizao e a validao deste
tipo de ensaios, uma vez escolhida uma combinao apropriada
de linha celular e vrus citopatognico. Descreve em pormenor, a
ttulo de exemplo de mtodo apropriado, um processo analtico
aplicvel a uma aferio de actividade anti-vrica particular,
fornecendo informaes sobre outras combinaes vrus-linha
celular e indicaes sobre as modalidades de adaptao e de
validao do processo para essas outras combinaes.
2. AFERIO DA ACTIVIDADE ANTIVRICA
(REDUO DO EFEITO CITOPATOGNICO)
A aferio da actividade antivrica dos interferes humanos
baseia-se na avaliao da resposta induzida em clulas
humanas pelos interferes que suprimem ou reduzem
o efeito citopatognico produzido nessas clulas por um
vrus infeccioso. A actividade do interfero avaliada por
comparao da sua capacidade de proteger clulas da aco
citopatognica de um vrus com a de uma preparao padro
apropriada, calibrada em Unidades Internacionais.
3. AFERIO DE UM INTERFERO POR MEIO DE
CLULAS Hep2c E DO VRUS DA ENCEFALOMIOCARDITE
INFECCIOSA
O mtodo de aferio que se descreve a ttulo de exemplo baseia-
-se na reduo do efeito citopatognico. Utiliza clulas humanas
Hep2c que so infectadas com o vrus da encefalomiocardite
infecciosa (EMC) com a finalidade de avaliar a actividade de
diferentes preparaes de interfero humano. Este mtodo foi
empregado desde que foram feitos estudos patrocinados pela
Organizao Mundial de Sade (OMS) para estabelecimento
de padres internacionais dos interferes humanos alfa, beta e
gama e a sua sensibilidade, fiabilidade e reprodutibilidade para
estimulao da actividade desses diferentes tipos de interferes
humanos foram demonstrados por variadas vezes.
Para as culturas de clulas de mamferos, todas as operaes
so conduzidas segundo os mtodos padronizados
estabelecidos para estas culturas celulares. Os volumes de
reagentes a utilizar so aqui indicados para culturas efectuadas
em frascos de 75 cm2; podem utilizar-se outros tipos de
recipientes (frascos ou caixas de cultura) e, nesse caso os
volumes devem ser, ento, consequentemente adaptados.
3.1. CULTURA E PREPARAO DAS CLULAS HEP2C
As clulas Hep2c so mantidas e repicadas em meio de
cultura A.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
5.6. Aferio dos interferes
As clulas so conservadas na forma congelada seguindo
mtodos padronizados. Podem ser mantidas em cultura at,
no mximo, 30 passagens aps o que devem preparar-se novas
culturas a partir dos lotes congelados.
Para iniciar a aferio, proceda recolha das clulas quando
os tapetes celulares apresentarem uma confluncia de 90
por cento, pelo mtodo de tratamento com tripsina que se
descreve a seguir:
remova o meio de cultura dos frascos,
junte a cada frasco 5 ml de soluo de tripsina aquecida a
37C, preparada extemporaneamente por diluio a 1/50
com tampo salino de fosfato a partir de uma soluo-
-me concentrada contendo 4 mg/ml de tripsina R e
4 mg/ml de edetato de sdio R. Rolhe os frascos e agite com
movimentos circulares para lavar o tapete celular. Elimine
o excesso de soluo de tripsina,
5. Textos gerais
coloque os frascos na incubadora a 37C durante 5-10
min. Proceda a um exame visual ou microscpico para
observar os sinais de separao das clulas. Ao microscpio,
estas aparecem ou aglutinadas ou separadas flutuando
livremente. Agite energicamente os frascos para separar
todas as clulas e, de seguida, junte cerca de 5 ml de
meio de cultura A. Agite energicamente para obter uma
suspenso de clulas separadas,
para preparar as suspenses celulares para a aferio,
disperse as clulas com precauo aspirando e expirando
com uma pipeta para desfazer os agregados celulares e
conte as clulas ajustando a concentrao das suspenses
em 6 105 clulas por mililitro.
3.2. MULTIPLICAO DO VRUS EMC
O vrus EMC multiplicado em clulas L-929 de murganho
de modo a obter-se uma suspenso-me do vrus. A
manuteno das clulas L-929 deve ser efectuada por
tratamento com tripsina e repicagem como se descreve para
as clulas Hep2c (NOTA: em caso de crescimento celular
fraco, pode ser necessrio substituir o soro de vitela recm-
-nascida por soro fetal de vitela).
Tome vrios frascos contendo culturas confluentes de
clulas L-929. Retire o meio de cultura contido nos frascos.
Introduza em cada frasco 2 ml de suspenso do vrus EMC,
previamente diludo at uma concentrao de cerca de
2,5 108 UFP/ml com meio de cultura B. Em cada frasco
contendo 4-6 l07 clulas L-929 a multiplicidade da infeco
ser aproximadamente de 10 UFP/clula. Disperse com
precauo a suspenso vrica na superfcie de um tapete
celular, agitando com movimentos circulares, e coloque de
novo na incubadora durante cerca de 1 h. Mantenha o pH do
meio entre 7,4 e 7,8.
Aps a adsoro do vrus EMC, junte a cada frasco cerca de
40 ml de meio de cultura B e volte a colocar na incubadora a
37C durante cerca de 30 h. Mantenha o pH do meio entre 7,4
e 7,8 para obter um rendimento mximo em vrus. Recolha o
sobrenadante da cultura e conserve-o a cerca de 4C.
Coloque os frascos a -20C para congelar os tapetes celulares
e, de seguida, aquea at temperatura ambiente. Junte
cerca de 5 ml de meio de cultura e agite para romper as
membranas celulares. Passe o contedo de cada frasco para o
recipiente que contm o sobrenadante da cultura e transfira
esta mistura para tubos de centrfuga de plstico de 50 ml
e centrifugue a cerca de 500 g durante, aproximadamente,
761
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.6. Aferio dos interferes
10 min, para separar os resduos celulares. Reparta o
sobrenadante lmpido em tubos de vidro de tampa roscada
em fraces de 20, 10, 5, 1, 0,5 ou 0,2 ml por tubo, segundo
as necessidades. Conserve a -70C. Os volumes mais altos
podem ser descongelados e divididos em quantidades
mais pequenas e recongelados, se necessrio. Convm,
entretanto, notar que esta suspenso-me do vrus EMC no
conserva o seu ttulo inicial a no ser que seja conservada
ininterruptamente a cerca de -70C; ciclos de congelao-
-descongelao repetidos ou a conservao a temperaturas
mais elevadas (por exemplo, da ordem de -20C) conduzem a
uma perda progressiva do ttulo.
3.3. MTODO DE AFERIO
3.3.1. Determinao do intervalo de medida
5. Textos gerais
Preparao das solues de interfero
Dilua o padro de interfero apropriado (por exemplo, um
padro OMS de um subtipo de interfero especfico) no meio
de cultura A de modo a obter uma srie de diluies de razo
10 cobrindo o intervalo de doses de 1 000-0,001 U.I./ml.
Utilize placas de microtitulao de 96 cavidades. Introduza
em cada cavidade 100 l de meio de cultura A. Junte a todas
as cavidades, com excepo das que serviro de testemunhas
vrus, cerca de 100 l de cada uma das diluies da
preparao padro. Misture cuidadosamente o contedo das
cavidades com uma pipeta multicanais regulada para 100 l.
Distribuio da suspenso celular
Verta numa placa de Petri estril a suspenso de clulas
Hep2c ajustada de modo a conter cerca de 6 105 clulas por
mililitro de meio de cultura A e reparta o contedo da placa
de Petri nas cavidades da placa de microtitulao utilizando
uma pipeta multicanais regulada para 100 l.
Coloque as placas na incubadora a 37C em atmosfera com 5
por cento de CO2, durante cerca de 24 h.
Infeco pelo vrus
Nesta etapa, verifique ao microscprio que os tapetes
de clulas Hep2c so confluentes, que apresentam uma
distribuio celular relativamente uniforme, que a
morfologia est correcta e que as clulas esto de boa sade.
Esvazie, ento, a maior parte do meio de cultura contido nas
cavidades, procedendo do seguinte modo: inverta a placa,
sacuda-a e seque-a com papel absorvente (deve proceder-se
sempre do mesmo modo para esvaziar o lquido contido nas
cavidades). Dilua a suspenso-me do vrus EMC com meio
de cultura A fresco de modo a obter um ttulo infeccioso de
cerca de 3 x 107 UFP/ml (NOTA: so necessrios cerca de
20 ml de vrus diludo para cada placa, mais 5-10 por cento
de volume suplementar). Coloque a suspenso diluda numa
placa de Petri estril de 9 cm e, de seguida, com uma pipeta
multicanais regulada para 200 l, reparta o contedo da
placa por todas as cavidades (compreendendo as que servem
de testemunhas vrus), com excepo das previstas como
testemunhas clulas; nestas ltimas, junte cerca de 200 l
de meio de cultura A que no contenha vrus.
Volte a colocar as placas na incubadora a 37C, em atmosfera
com 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h.
Colorao
Examine as placas ao microscpio para confirmar o
efeito citopatognico produzido pelo vrus EMC sobre as
762
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)
testemunhas vrus. O tempo necessrio para obter um
efeito citopatognico mximo pode variar de uma aferio
para outra devido variabilidade intrnseca da reaco das
clulas Hep2c prova vrica num determinado perodo da
cultura em contnuo.
Remova a maior parte do meio de cultura contido nas
cavidades para uma soluo descontaminante apropriada
(por exemplo, hipoclorito de sdio). Junte nas cavidades
soluo salina tamponada de pH 7,4 R e remova-a para uma
soluo descontaminante. Introduza em cada cavidade
150 l de soluo de colorao e deixe a colorao das clulas
efectuar-se durante cerca de 30 min temperatura ambiente;
de seguida, remova a soluo de colorao para uma soluo
descontaminante. Junte nas cavidades cerca de 150 l de
soluo de fixao, deixe agir durante 10 min temperatura
ambiente e remova a soluo de fixao para uma soluo
descontaminante. Lave os tapetes celulares colocando as
placas num recipiente de plstico em gua corrente. Seque
superficialmente as placas com papel absorvente. Seque, de
seguida, a uma temperatura compreendida entre 20 e 37C
at evaporao total da humidade.
Junte em cada cavidade 150 l de hidrxido de sdio 0,1 M.
Elua o corante agitando suavemente as placas ou batendo
com elas repetidas vezes na palma da mo. Assegure-se que a
repartio da colorao uniforme no conjunto das cavidades
antes de proceder s determinaes espectrofotomtricas.
Determine a absorvncia em 610-620 nm usando um leitor
de placas de microtitulao, utilizando como branco uma
cavidade, ou uma linha de cavidades, que no contenham
clulas mas 150 l de hidrxido de sdio 0,1 M. Calcule as
concentraes do padro de interfero que corresponde,
respectivamente, reduo mxima e reduo mnima
do efeito citopatognico. Estas concentraes definem o
intervalo de medida que ser utilizado para a aferio.
3.3.2. Aferio
Efectue a aferio segundo o mtodo que antes se descreveu,
utilizando:
como solues problema, uma srie de diluies a 1/2
da amostra em meio de cultura A, cujas concentraes
nominais preencham o intervalo de medida da aferio,
como solues padro, uma srie de diluies a 1/2 em
meio de cultura A do padro apropriado (por exemplo, um
padro OMS de um subtipo de interfero especfico), cujas
concentraes nominais preencham o intervalo de medida
da aferio.
3.3.3. Anlise dos resultados
Os resultados das aferies da actividade antivrica ajustam-
-se geralmente a uma curva dose-resposta de tipo sigmide,
quando se constri o grfico da concentrao em interfero
(logaritmo do inverso da diluio) em funo da absorvncia.
Construa a curva da concentrao em interfero (logaritmo do
inverso da diluio) em funo da absorvncia determinada,
para as solues padro e para as solues problema.
Considerando s a zona linear da curva, calcule o teor em
interfero da amostra por comparao das respostas obtidas
com as solues problema e as solues padro, segundo
os mtodos estatsticos habituais para os ensaios em linhas
paralelas.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)

5.6. Aferio dos interferes

4. VALIDAO DE OUTROS MTODOS 4.4. VALIDAO DO PLANO DE ENSAIO

4.1. ESCOLHA DA LINHA CELULAR E DO VRUS
Para a aferio da actividade antivrica dos interferes podem
ser utilizados um certo nmero de outras combinaes
linha celular/vrus, por exemplo, o vrus EMC com clulas
do epitelioma pulmonar A549, o vrus Forest Semliki (vrus
SF) ou o vrus Sindbis com fibroblastos humanos, o vrus da
estomatite vesicular com fibroblastos diplides humanos, a
linha celular amnitica humana WISH ou a linha de clulas
renais bovinas de Madin-Darby. A combinao linha celular/
/vrus escolhida deve ser, geralmente, aquela cuja resposta
preparao de interfero a titular apresentar a sensibilidade
mxima e que permita obter respostas paralelas com
preparaes da amostra e do padro do interfero.
Como para todas as aferies em placas de microtitulao,
necessria uma validao do plano do ensaio utilizado.
importante, nomeadamente, despistar os erros resultantes de
uma ordem de distribuio no aleatria nas cavidades ou o
efeito de margem da placa, e elimin-los efectuando um plano
de aferio aleatria ou evitando utilizar cavidades das margens.
5. REAGENTES E MEIOS DE CULTURA
Meio de cultura A (soro de vitela recm-nascida: 10 por cento)
Meio de cultura RPMI 1640, se necessrio adicionado
de antibiticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina
10 ng/ml) 450 ml
L-Glutamina, 200 mM, estril 5 ml

5. Textos gerais
Soro de vitela recm-nascida 50 ml

4.2. ESCOLHA DA TCNICA DE COLORAO VITAL Meio de cultura B (soro fetal de vitela: 2 por cento)
Meio de cultura RPMI 1640, se necessrio adicionado
A tcnica de colorao atrs descrita permite determinar o de antibiticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina
nmero residual de clulas viveis. Podem ser igualmente 10 ng/ml) 490 ral
utilizadas outras tcnicas, nomeadamente a colorao com L-Glutamina, 200 mM, estril 5 ml
violeta de metilo ou com violeta de cristal, ou o mtodo de Soro fetal de vitela 10 ml
converso do azul de tiazol (MTT). Em todos os casos, o
Soluo de colorao
critrio de escolha do mtodo deve ser a obteno, entre a
colorao e o nmero de clulas viveis, de uma relao que Negro de naftaleno 0,5 g

apresente uma linearidade e uma sensibilidade satisfatrias. cido actico glacial 90 ml

Acetato de sdio anidro 8,2 g
gua q.b.p 1 000 ml
4.3. VALIDAO ESTATSTICA
Soluo de fixao
Como todas as aferies biolgicas efectuadas segundo o Formaldedo (40 por cento) 100 ml
modelo de linhas paralelas, a aferio da actividade antivrica cido actico glacial 90 ml
deve satisfazer s condies estatsticas habituais de Acetato de sdio anidro 8,2 g
linearidade da resposta, de paralelismo e de varincia. gua q.b.p. 1 000 ml

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 763

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.7. QUADRO
DAS CARACTERSTICAS
DOS RADIONUCLIDOS
CITADOS NA
FARMACOPEIA

5. Textos gerais
PORTUGUESA
5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos
citados na Farmacopeia Portuguesa 767

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 765

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

5.7. QUADRO DAS ** PTB (Physikalisch-Technishe Bundesanstalt,

CARACTERSTICAS DOS
RADIONUCLIDOS CITADOS NA
FARMACOPEIA PORTUGUESA
O quadro seguinte publicado para completar a monografia
geral Preparaes radiofarmacuticas.
Os valores foram obtidos a partir da base de dados
do National Nuclear Data Center (NNDC) situado no
Brookhaven National Laboratory, Upton, NY, Estados Unidos
da Amrica, directamente acessvel pela Internet: eA
http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html.
Se for preferida uma outra fonte de informaes (valores
mais recentes), deve ser mencionada explicitamente.
Braunschweig, Alemanha),
*** NPL (National Physical Laboratory, Teddington,
Middlesex, Reino Unido).
A incerteza da semi-vida dada entre parntesis. Em
princpio, o nmero entre parntesis o valor numrico
da incerteza-padro dos ltimos dgitos correspondentes
ao valor indicado (Guide to the Expression of Uncertainty
in measurement, International Organisation for
Standardisation (ISO), 1993, ISBN 92-67-20188-3).
So utilizadas as abreviaturas seguintes:
= electres Auger,
ec = electres de converso,
= electres,

5. Textos gerais
Outras fontes de dados: + = positres,
* DAMRI (Dpartement des Applications et de la Mtrologie = raios gama,
des Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, X = raios X
Frana),

Emisso electrnica Emisso fotnica

Radionuclido Semi-vida Probabilidade Probabilidade

de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

Azoto-13 (13N) 9,965 (4) min + 0,492 (I) (mx: 1,198) 99,8 0,511 199,6 (II)

Carbono-11 (11C) 20,385 (20) min + 0,386 (I) (mx: 0,960) 99,8 0,511 199,5 (II)

30,04 (3) anos eA 0,026 0,8 X 0,005 1

0,032-0,036 7
Csio-137 (137Cs)
em equilbrio ec 0,624 8,0
com Brio-137m (137mBa: 0,656 1,4 0,662 85,1
(137mBa) 2,552 (1) min)
0,174 (I) 94,4
0,416 (I) 5,6

9,33 (3) h eA 0,055 3 X 0,070-0,073 69

0,083 19
ec 0,246 8,5
0,276 2 0,331 79
0,316 2,3 0,361 9,9
0,406 2,0
Chumbo-201 ( 201Pb)
0,585 3,6
(produz Tlio-201
0,692 4,3
radioactivo)
0,767 3,2
0,826 2,4
0,908 5,7
0,946 7,9
1,099 1,8
1,277 1,6

51,873 (9) h eA 0,055 3,0 X 0,010 37,0

0,071-0,073 69,6
ec 0,194 13,3 0,083 19,4
Chumbo-203 ( 203Pb)
0,279 80,8
0,401 3,4

(I) Energia mdia do espectro .

(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 767

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

77,27 (3) dias eA 0,006 47 X 0,006-0,007 25

+ 0,179 (I) 0,9 0,511 38,0 (II)

0,631 (I) 18,1 0,847 100,0
1,038 14,1
1,175 2,2
1,238 66,1
Cobalto-56 ( 56Co)
1,360 4,3
1,771 15.5
2,015 3,0
2,035 7,8
2,598 17,0
3,202 3,1
5. Textos gerais

3,253 7,6

271,79 (9) dias eA + ec 0,006-0,007 177,4 X 0,006-0,007 57

ec 0,014 7,4 0,014 9,2

Cobalto-57 ( 57Co)
0,115 1,8 0,122 85,6
0,129 1,3 0,136 10,7
0,692 0,15

70,86 (7) dias eA 0,006 49,4 X 0,006-0,007 26,3

+ 0,201 (I) 14,9 0,511 29,9 (II)

Cobalto-58 ( 58Co)
0,811 99,4
0,864 0,7
1,675 0,5

5,2714 (5) anos 0,096 (I) (mx. 0,318) 99,9 1,173 100,0
Cobalto-60 ( 60Co)
1,333 100,0

13,10 (3) s ec 0,176 26,4 X 0,012-0,014 17,0

Crpton-81m ( 81mKr) 0,189 4,6
0,190 67,6

27,7025 (24) dias eA 0,004 67 X 0,005 22,3

Crmio-51 ( 51Cr)
0,320 9,9

Enxofre-35 ( 35S) 87,51 (12) dias 0,049 (I) (mx: 0,167) 100

Estrncio-89 ( 89Sr) 50,53 (7) dias 0,583 (I) (mx: 1,492) 99,99 0,909 0,01
em equilbrio com
trio-89m ( 89mY) ( 89mY: 16,06 (4) s)

Estrncio-90 ( 90Sr) 28,74 (4) anos 0,196 (I) (mx: 0,546) 100
em equilbrio com
trio-90 ( 90Y) ( 90Y: 64,l0 (8) h)

Flor-18 (18F) 109,77 (5) min + 0,250 (I) (mx: 0,633) 96,7 0,511 193,5 (II)

Fsforo-32 ( 32P) 14,26 (4) dias 0,695 (I) (mx: 1,71) 100

Fsforo-33 ( 33P) 25,34 (12) dias 0,076 (I) (mx: 0,249) 100

(I) Energia mdia do espectro .

(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

768 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

9,49 (7) h eA 0,008 21 X 0,009-0,010 19,1

+ 0,157 (I) 1 0,511 112 (II)

0,331 (I) 0,7 0,834 5,9
0,397 (I) 3,8 1,039 37
0,782 (I) 0,3 1,333 1,2
1,90 (I) 50 1,919 2,1
2,190 5,6
Glio-66 ( 66Ga)
2,423 1,9
2,752 23,4
3,229 1,5
3,381 1,5
3,792 1,1

5. Textos gerais
4,086 1,3
4,295 4,1
4,807 1,8

3,2612 (6) dias eA 0,008 62 X 0,008-0,010 57

ec 0,082-0,084 30,4 0,091-0,093 42,4

0,090-0,092 3,6 0,185 21,2
Glio-67 ( 67Ga)
0,175 0,3 0,209 2,4
0,300 16,8
0,394 4,7
0,888 0,15

67,629 (24) min eA 0,008 5,1 X 0,009-0,010 4,7

Glio-68 ( 68Ga)
+ 0,353 (I) 1,2 0,511 178,3
0,836 (I) 88,0 1,077 3,0

270,82 (27) dias eA 0,008 42,4 X 0,009-0,010 44,1

Germnio-68 ( 68Ge)
em equilbrio com
( 68Ga: 67,629 (24) min) + 0,353 (I) 1,2 0,511 178,3
Glio-68 ( 68Ga)
0,836 (I) 88,0 1,077 3,0

4,9 (1) h eA 0,019 13,4 X 0,023-0,026 70,5

0,642 25,9
ndio-110 (110In) 0,658 98,3
0,885 92,9
0,938 68,4
0,997 10,5

69,1 (5) min eA 0,019 5,3 X 0,023-0,026 27,8

ndio-110m (110m In) + 1,015 (I) 6,1 0,511 123,4 (II)

0,658 97,8
2,129 2,1

2,8047 (5) dias eA 0,019 15,6 X 0,003 6,9

0,023-0,026 82,3
ec 0,145 7,8
ndio-111 (111In)
0,167-0,171 1,3 0,171 90,2
0,219 4,9 0,245 94,0
0,241-0,245 1,0

49,51 (1) dia ec 0,162 40 X 0,023-0,027 36,3

0,186-0,190 40
ndio-114m (114mIn)
em equilbrio com
0,190 15,6
ndio-114 (114 In)
* 0,777 (I) (mx: 1,985) 95 0,558 3,2
(114In: 71,9 (1) s) 0,725 3,2

(I) Energia mdia do espectro .

(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 769

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

13,27 (8) h eA 0,023 12,3 X 0,004 9,3

0,027-0,031 86,6
0,127 13,6
0,154 1,8 0,159 83,3
Iodo-123 (123I) 0,158 0,4 0,346 0,1
0,440 0,4
0,505 0,3
0,529 1,4
0,538 0,4

59,402 (14) dias eA + ec 0,004 80 X 0,004 15,5

0,023-0,035 33 0,027 114
5. Textos gerais

Iodo-125 (125I) 0,031 26

0,035 6,7

13,11 (5) dias eA 0,023 6 X 0,027-0,031 42,2

ec 0,354 0,5 0,388 34

0,634 0,1 0,491 2,9
0,511 2,3 (II)
Iodo-126 (126I)
0,109 (I) 3,6 0,666 33
0,290 (I) 32,1 0,754 4,2
0,459 (I) 8,0 0,880 0,8
1,420 0,3
+ 0,530 (I) 1

8,02070 (11) dias ec 0,46 3,5 X 0,029-0,030 3,9

0,330 1,6

0,069 (I) 2,1 0,080 2,6

Iodo-131 (131I)
0,097 (I) 7,3 0,284 6,1
0,192 (I) 89,9 0,365 81,7
0,637 7,2
0,723 1,8

20,8 (1) h 0,140 (I) 3,8 0,530 87

Iodo-133 (133I)
0,162 (I) 3,2 0,875 4,5
(produz Xnon-133
0,299 (I) 4,2 1,298 2,4
radioactivo)
0,441 (I) 83

*0,527
6,57 (2) h 0,140 (I) 7,4 13,8
0,237 (I) 8 0,547 7,2
0,307 (I) 8,8 0,837 6,7
Iodo-135 (135I) 0,352 (I) 21,9 1,039 8,0
(produz Xnon-135 0,399 (I) 8 1,132 22,7
radioactivo) 0,444 (I) 7,5 1,260 28,9
0,529 (I) 23,8 1,458 8,7
1,678 9,6
1,791 7,8

trio-90 ( 90Y) 64,10 (8) h 0,934 (I) (mx: 2,280) 100

65,94 (1) h 0,133 (I) 16,4 X 0,018-0,021 3,6

0,290 (I) 1,1

Molibdnio-99 ( 99Mo) 0,443 (I) 82,4 0,041 1,1

em equilbrio com 0,141 4,5
Tecncio-99m ( 99mTc) 0,181 6
0,366 1,2
0,740 12,1
( 99mTc: 6,01(1) h) 0,778 4,3

(I) Energia mdia do espectro .

(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

770 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

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5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

Oxignio-15 (15O) 122,24 (16)s + 0,735 (I) (mx: 1,732) 99,9 0,511 199,8 (II)

4,576 (5) h eA 0,011 31,3 X 0,013-0,014 57,2

ec 0,176 25,0 0,190 64

Rubdio-81 ( 81Rb)
0,188 4,3 0,446 23,2
em equilbrio com
0,457 3,0
Cripton-81m ( 81mKr)
+ 0,253 (I) 1,8 0,510 5,3
0,447 (I) 25,0 0,511 54,2
( 81mKr: 13,10 (3) s) 0,538 2,2

39,26 (2) dias eA + ec 0,017 12 X 0,020-0,023 9,0

5. Textos gerais
Rutnio-103 (103Ru)
ec 0,030-0,039 88,3 0,497 91
em equilbrio
0,610 5,8
com Rdio-103m
0,031 (I) 6,6
(103mRh)
(103mRh:
56,144 (20) min) 0,064 (I) 92,9

26,1 (1) h ec 0,285 3,4 X 0,010 32,0

0,353 1,4 0,069-0,071 63,3
0,08 17,5
+ 0,495 (I) 0,3
0,368 87,2
0,579 13,8
Tlio-200 (200Tl)
0,828 10,8
1,206 29,9
1,226 3,4
1,274 3,3
1,363 3,4
1,515 4,0

72,912 (17) h ec 0,016-0,017 17,7 X 0,010 46,0

0,027-0,029 4,1 0,069-0,071 73,7
0,052 7,2 0,080 20,4
Tlio-201 (201Tl) 0,084 15,4

0,153 2,6 0,135 2,6

0,167 10,0

12,23 (2) dias eA 0,054 2,8 X 0,010 31,0

0,069-0,071 61,6
Tlio-202 (202Tl) ec 0,357 2,4 0,080 17,1

0,440 91,4

Tecncio-99 ( 99Tc) 2,11 105 anos 0,085 (I) (mx: 0,294) 100

6,01(1) h ec 0,002 74 X 0,018-0,021 7,3

eA 0,015 2,1 0,141 89,1

Tecncio-99m ( 99mTc)
ec 0,120 9,4
0,137-0,140 1,3

**19,16 (5) dias eA 0,022 11,6 X 0,026-0,030 75,6

0,470 1,4
Telrio-121 (121Te)
0,508 17,7
0,573 80,3

(I) Energia mdia do espectro .

(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 771

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5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

154,0 (7) dias eA 0,003 88,0 X 0,026-0,031 50,5

0,022-0,023 7,4
Telrio-121m (121mTe)
em equilbrio com
ec 0,050 33,2 0,212 81,4
Telrio-121 (121Te)
(121Te: 19,16(5) dias 0,077 40,0 1,102 2,5
0,180 6,1

Trtio ( 3H) *12,33 (6) anos * *0,006 (I) (mx: 0,019) *100

11,84 (7) dias eA 0,025 6,8 X 0,004 8,3

0,030 44,0
ec 0,129 61 0,034 10,2
Xnon-131m (131m Xe)
0,159 28,5
5. Textos gerais

0,163 8,3 0,164 2,0

5,243 (1) dias eA 0,026 5,8 X 0,004 6,3

0,031 40,3

Xnon-133 (133m Xe) ec 0,045 55,1 0,035 9,4

0,075-0,080 9,9
0,080 38,3
0,101 (I) 99,0

2,19 (1) dias eA 0,025 7 X 0,004 7,8

0,030 45,9
Xnon-133m (133m Xe)
(produz Xnon-133 ec 0,199 64,0 0,034 10,6
radioactivo) 0,228 20,7

0,232 4,6 0,233 10,0

ec
9,14 (2) h 0,214 5,5 X 0,031-0,035 5,0
Xnon-135 (135Xe)
0,171 3,1 0,250 90,2
0,308 96,0 0,608 2,9

(I) Energia mdia do espectro .

(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

772 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.8. HARMONIZAO DAS

FARMACOPEIAS
5.8. Harmonizao das Farmacopeias 775

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 773

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.8 HARMONIZAO DAS FARMACOPEIAS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.8 HARMONIZAO DAS FARMACOPEIAS (NDICE)
5.8. HARMONIZAO DAS
FARMACOPEIAS
Este captulo geral serve somente como informao.
Contm indicaes sobre o grau de harmonizao e, por
consequncia, da possibilidade de intermutao dos diversos
captulos gerais e monografias da Farmacopeia dos Estados
Unidos da Amrica do Norte, da Farmacopeia Europeia e da
Farmacopeia Japonesa. No modifica em nada o estatuto
das monografias e captulos gerais que fazem f em caso de
dvida ou litgio quando a conformidade com a Farmacopeia
Europeia solicitada.
A Comisso da Farmacopeia Europeia reconhece a utilidade
de uma cooperao com outras farmacopeias para a
elaborao de monografias e captulos gerais harmonizados.
Esta harmonizao totalmente compatvel com os
objectivos da Comisso e apresenta diversas vantagens,
nomeadamente a simplificao e a racionalizao dos
mtodos de controlo da qualidade e os processos de registo.
Alis, esta harmonizao auxilia positivamente os trabalhos
da Conferncia Internacional sobre a Harmonizao (ICH) e a
Cooperao Internacional sobre a Harmonizao Veterinria
(VICH) na medida em que certas notas explicativas dependem
dos captulos gerais da Farmacopeia para a sua aplicao.
Os trabalhos de harmonizao so realizados de uma forma
bem definida, mas informal, no Grupo de Discusso das
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
5.8. Harmonizao das Farmacopeias
Farmacopeias (PDG) que associa a Farmacopeia dos Estados
Unidos, a Farmacopeia Europeia e a Farmacopeia Japonesa.
Informaes sobre os pontos que sero tratados pelo PDG
figuraro nas verses posteriores do presente captulo.
A harmonizao dos captulos gerais tem como fim a
obteno de mtodos ou normas intercambiveis; tal
implica que a conformidade estabelecida com ajuda de uma
das farmacopeias ser exactamente a mesma se o captulo
correspondente de uma qualquer das outras farmacopeias
tiver sido utilizado. Qualquer diferena residual entre os
captulos gerais harmonizados das trs farmacopeias ser
descrita nas sucessivas verses do presente captulo.
A harmonizao das monografias tem como fim obter normas
idnticas para todas as caractersticas de uma substncia. A
harmonizao integral de certas monografias pode revelar-
-se difcil por causa, por exemplo, de diferenas de estatuto
jurdico ou de interpretaes divergentes. Se tal acontecer, a
5. Textos gerais
PDG decidiu aprovar e publicar monografias em que o maior
nmero possvel de elementos tero sido harmonizados.
Os elementos divergentes que subsistem nas monografias
harmonizadas sero descritos nas sucessivas verses do
presente captulo.
As trs farmacopeias decidiram no modificar
unilateralmente as monografias e captulos gerais
harmonizados; as revises sero efectuadas simultaneamente
pelas trs farmacopeias segundo o processo mais
conveniente.
775
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.8 HARMONIZAO DAS FARMACOPEIAS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.9. POLIMORFISMO
5.9. Polimorfismo 779

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 777

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.9 POLIFORMISMO (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.9. POLIMORFISMO
O polimorfismo (ou polimorfismo cristalino) a capacidade
de um composto no estado slido se apresentar em vrias
formas cristalinas diferentes enquanto que a sua composio
qumica no varia. O estado slido de uma molcula pode
apresentar-se igualmente numa forma no cristalina
designada pelo termo amorfa.
Quando o fenmeno observado para um corpo simples
ou elemento (enxofre, por exemplo) o termo polimorfismo
substitiu-se por alotropia.
O termo pseudopolimorfismo utilizado para os solvatos
(incluindo os hidratos) nos quais um solvente participa na
malha cristalina em propores estequiomtricas; por vezes,
por extenso, este termo empregado igualmente para os
compostos de incluso nos quais o solvente est englobado
na malha em propores variveis. Por isso, o termo
pseudopolimorfismo ambguo dada a sua utilizao em
situaes diferentes; , portanto, prefervel s reter os termos
solvatos e hidratos.
Quando uma monografia indica que a substncia apresenta
polimorfismo, pode tratar-se de um polimorfismo cristalino
verdadeiro, da existncia de um solvato, de alotropia ou da
existncia de uma forma amorfa.
A constncia da composio qumica implica que todas as
formas cristalinas e a forma amorfa de uma dada espcie
apresentam um comportamento qumico idntico em soluo
ou na fuso; pelo contrrio, as suas caractersticas fsico-
-qumicas e fsicas (solubilidade, dureza, compressibilidade,
massa volmica, ponto de fuso, etc.) e, por consequncia,
a sua reactividade e a sua biodisponibilidade podero ser
diferentes no estado slido.
Quando uma molcula apresenta polimorfismo, a forma
mais estvel termodinamicamente aquela cuja entalpia
livre mnima a uma dada temperatura e presso. As outras
formas encontram-se num estado chamado metastvel.
Nas condies normais de temperatura e presso, uma
forma no estado metastvel pode manter-se imutvel
ou pode representar uma transio para uma forma
termodinamicamente mais estvel.
Se existem vrias formas cristalinas, uma de entre elas
termodinamicamente mais estvel a uma certa presso e
temperatura. Uma dada forma cristalina pode constituir uma
fase que susceptvel de se encontrar em equilbrio com
outras fases slidas e tambm com as fases lquida e gasosa.
Se cada uma das formas cristalinas a mais estvel a
determinada temperatura, a passagem de uma para outra
reversvel: neste caso, a transio chamada de
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.9 POLIFORMISMO (NDICE)
5.9. Polimorfismo
enanteotrpica. Ao contrrio, se s uma das formas estvel
a qualquer temperatura, a transio irrreversvel ou
monotrpica. A passagem de uma fase a outra um equilbrio
de varincia 1 o que explica que a uma dada presso este
estado caracterizado por uma temperatura chamada de
temperatura de transio.
As formas cristalinas diferentes ou solvatos podem ser
geradas por variao das condies de cristalizao
(temperatura, presso, solvente, concentrao, velocidade de
cristalizao, induo do meio de cristalizao, presena e
concentrao de impurezas, etc.).
O estudo do polimorfismo pode ser realizado utilizando as
seguintes tcnicas:
difraco de raios X dos ps (2.9.33),
difraco de raios X de um s cristal,
5. Textos gerais
anlise trmica (2.2.34) (calorimetria diferencial,
termogravimetria, termomicroscopia),
microcalorimetria,
anlise de absoro da gua,
microscopias ptica e electrnica,
ressonncia magntica nuclear no estado slido,
espectrofotometria de absoro no infravermelho (2.2.24),
espectrometria de Raman (2.2.48),
determinao da solubilidade e da velocidade intrnseca de
dissoluo,
determinao da massa volmica.
Estas tcnicas so muitas vezes complementares e
indispensvel utilizar vrias.
Os diagramas presso/temperatura e energia/temperatura
baseados nos dados analticos so ferramentas teis para
conhecer as relaes energticas (enanteotropismo,
monotropismo) e a estabilidade termodinmica de cada
modificao de um composto polimrfico.
No caso dos solvatos, a anlise calorimtrica diferencial e
a termogravimetria devem ser privilegiadas, associadas a
determinaes da solubilidade e da velocidade intrnseca de
dissoluo e difraco de raios X.
No caso dos hidratos, o estabelecimento das isotrmicas
de absoro/desabsoro da gua deve ser efectuado para
conhecer as zonas de estabilidade relativa.
Em geral, os hidratos so menos solveis na gua que as
formas anidras e os solvatos so menos solveis no seu
solvente que as formas no solvatadas.
779
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.9 POLIFORMISMO (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.10. CONTROLO
DAS IMPUREZAS NAS
SUBSTNCIAS PARA USO
FARMACUTICO
5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso

5. Textos gerais
farmacutico 783

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 781

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.10 CONTROLO DAS IMPUREZAS (NDICE)
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS
5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico
5.10. CONTROLO DAS
IMPUREZAS NAS SUBSTNCIAS
PARA USO FARMACUTICO
Prembulo
As monografias das substncias para uso farmacutico da
Farmacopeia tm como objectivo assegurar uma qualidade
destas substncias que seja aceite pelos utilizadores. Tendo
em conta a misso que a Farmacopeia desempenha em
matria de sade pblica, indispensvel que as suas
monografias permitam um controlo adequado das impurezas.
As exigncias de qualidade so estabelecidas na base de
consideraes de ordem cientfica, tcnica e regulamentar.
As exigncias relativas s impurezas figuram, por um lado,
nas monografias especficas e, por outro, na monografia
geral Substncias para uso farmacutico que so
complementares: as monografias especficas fixam os
critrios de aceitao das impurezas, enquanto que a
monografia geral define as exigncias relativas qualificao,
identificao e declarao das impurezas orgnicas
eventualmente presentes nas substncias activas.
Os limiares de declarao, de identificao e de qualificao
especificados na monografia geral Substncias para uso
farmacutico aplicam-se a todas as substncias aparentadas.
Entretanto, se uma monografia no inclui ensaio das
substncias aparentadas apoiado num mtodo quantitativo,
a presena de impurezas novas de teor superior a um dos
limites arrisca-se a passar desapercebida porque o ensaio no
permite detect-la.
As exigncias da rubrica Substncias aparentadas
da monografia Substncias para uso farmacutico,
nomeadamente no que respeita aos limiares, no se aplica aos
excipientes, como tambm so excludos das disposies desta
rubrica os produtos biolgicos, os peptidos, os oligoelementos,
os produtos radiofarmacuticos, os produtos de fermentao
e produtos semi-sintticos derivados, os produtos base de
plantas e os produtos brutos de origem animal ou vegetal. Se
os limiares indicados na monografia geral no se aplicam, os
conceitos gerais de declarao, de identificao (na medida do
possvel) e de qualificao das impurezas so em compensao
vlidos para estas classes de substncias.
Bases da elaborao das monografias da Farmacopeia
A elaborao das monografias visa as substncias presentes
nos medicamentos que foram autorizados pelas Autoridades
competentes que aderiram Farmacopeia Europeia. Estas
monografias no incluem, portanto, necessariamente todas
as substncias para uso farmacutico presentes no mercado
mundial.
As impurezas orgnicas e inorgnicas presentes nas
substncias objecto de avaliao pelas Autoridades
competentes so, por este facto, qualificadas do ponto de
vista da sua inocuidade no teor mximo autorizado (dose
diria mxima), a menos que novos dados sobre a inocuidade,
posteriores avaliao, justifiquem limites mais baixos.
As monografias das substncias para uso farmacutico da
Farmacopeia Europeia so elaboradas por grupos de peritos
e grupos de trabalho que funcionam em colaborao com
as Autoridades Nacionais das Farmacopeias, as Autoridades
competentes em matria de autorizao de entrada
no mercado, os laboratrios nacionais de controlo e o
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.10 CONTROLO DAS IMPUREZAS (NDICE)
laboratrio da Farmacopeia Europeia; eles so igualmente
assistidos nas suas tarefas pelos produtores das substncias e/
/ou fabricantes da indstria farmacutica que as utilizam.
Controlo das impurezas nas substncias para uso
farmacutico
A qualidade das substncias no que respeita s impurezas
controlada por um conjunto de ensaios prescritos nas
monografias. Estes ensaios tm como finalidade incluir as
impurezas orgnicas e inorgnicas pertinentes em vista das
origens donde provieram as substncias activas contidas nos
medicamentos autorizados.
O controlo dos solventes residuais objecto das disposies
contidas na monografia geral Substncias para uso
farmacutico e no captulo geral Solventes residuais.
O certificado de conformidade para uma monografia da
Farmacopeia Europeia indica, para uma substncia de uma dada
5. Textos gerais
origem, quais so os solventes residuais controlados assim como
os critrios de aceitao especficos e o mtodo de controlo
validado se for diferente dos mtodos descritos no captulo geral
Identificao e controlo dos solventes residuais.
As monografias das substncias qumicas orgnicas
comportam geralmente um ensaio intitulado Substncias
aparentadas que abarca as impurezas orgnicas pertinentes.
Pode ser completado por outros ensaios, especficos, quando
o ensaio de carcter geral no permite controlar uma dada
impureza ou quando razes particulares (por exemplo, em
relao com a inocuidade) justificam que seja prescrito um
controlo especial.
Quando a monografia cobre substncias que apresentam
perfis de impurezas diferentes, pode conter um ensaio das
substncias aparentadas nico que inclua todas as impurezas
mencionadas na rubrica Impurezas ou incluir vrios
ensaios que permitam o controlo de todos os perfis de
impurezas. , ento, possvel verificar a conformidade da
monografia aplicando somente os ensaios que so pertinentes
com vista ao perfil de impurezas conhecido para a substncia
e a origem consideradas.
Podem, assim, figurar instrues relativas ao controlo
das impurezas na rubrica Produo numa monografia,
por exemplo, quando s um mtodo de controlo de uma
impureza utilizado pelo fabricante porque tecnicamente
demasiado complexo para ser de uso geral ou no pode
ser aplicado substncia farmacutica final e/ou quando a
validao do processo de produo (compreendendo a etapa
de purificao) constitui uma garantia de controlo suficiente.
Rubrica lmpurezas das monografias de substncias
activas
A rubrica Impurezas de uma monografia apresenta a lista
das impurezas (com estrutura e denominao qumica,
na medida do possvel), geralmente orgnicas, de que
se sabe que so detectadas pelos ensaios prescritos na
monografia. Esta informao baseada nos dados disponveis
quando da elaborao ou da reviso da monografia e no
necessariamente exaustiva. A rubrica compreende as
impurezas especificadas e, se for caso disso, as outras
impurezas detectveis.
A todas as impurezas especificadas est associado um
critrio de aceitao que no superior ao autorizado pelas
Autoridades competentes.
As outras impurezas detectveis so impurezas potenciais
de estrutura definida que no so normalmente presentes
783
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico
para alm de um limiar de identificao nas substncias que
entram na composio de medicamentos autorizados pelas
Autoridades competentes. So citadas para informao na
rubrica Impurezas.
Se alm das impurezas especificadas e outras impurezas
detectveis de uma substncia activa aparecer qualquer outra
impureza, incumbe ao utilizador da substncia verificar, em
funo do teor e da natureza dessa impureza bem como da
dose diria mxima e do limiar de identificao/qualificao
apropriado se a sua identificao/qualificao ou no
necessria em termos da monografia geral Substncias para
uso farmacutico, rubrica Substncias aparentadas.
importante notar que limiares especficos so aplicados s
substncias para uso exclusivamente veterinrio.
Interpretao do ensaio das substncias aparentadas nas
5. Textos gerais
monografias das substncias activas
Qualquer monografia especfica de uma substncia para uso
farmacutico deve ser lida e interpretada conjuntamente com
a monografia geral Substncias para uso farmacutico.
Quando uma monografia estabelece, para as impurezas, um
critrio de aceitao geral (qualquer outra impureza, outras
impurezas, qualquer impureza) que equivale a um teor
nominal superior ao limiar de identificao aplicvel para a
substncia considerada (ver monografia geral Substncias
para uso farmacutico) este limite aplica-se unicamente s
impurezas especificadas citadas na rubrica Impurezas. Se
so presentes outras impureza, convm determinar, luz das
disposies da monografia geral, se necessrio identific-las
(na medida do possvel), declar-las, especific-las e qualific-las.
Incumbe ao utilizador da substncia determinar a validade dos
critrios de aceitao para as impurezas no citadas na rubrica
Impurezas ou citadas como outras impurezas detectveis.
Nas monografias existentes, os critrios de aceitao do
ensaio das substncias aparentadas so apresentados de
diferentes modos; o cronograma de deciso da figura junta
pode ser utilizado como ajuda para a interpretao dos
critrios gerais de aceitao e da sua relao com a seco
lmpurezas da monografia.
Os critrios de aceitao aplicveis s outras impurezas so
expressos de diversos modos nas monografias qualquer outra
impureza, outras impurezas, qualquer impureza, outras
manchas, outras bandas, etc. De acordo com a natureza do
princpio activo e o limiar de identificao que lhe aplicvel,
os critrios gerais de aceitao aplicam-se quer unicamente
a certas impurezas especificadas, quer s impurezas no
especificadas e a certas impurezas especificadas. Enquanto se
espera a adaptao redaccional das monografias j publicadas,
para lhes eliminar as ambiguidades de terminologia, o
cronograma de deciso da figura junta pode ser utilizado para
determinar o critrio de aceitao a aplicar.
Recomendaes aos utilizadores de monografias de
substncias activas
As monografias fornecem especificaes que visam garantir
que as substncias cujos perfis de impurezas correspondem
aos tomados em conta quando da elaborao e/ou reviso da
monografia so de qualidade apropriada. Incumbe ao utilizador
da substncia verificar se a monografia permite um controlo
adequado das impurezas para uma substncia de determinada
origem, nomeadamente por meio do processo de certificao
de conformidade das monografias da Farmacopeia.
784
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.10 CONTROLO DAS IMPUREZAS (NDICE)
Uma monografia que inclui um ensaio de substncias
aparentadas baseado num mtodo quantitativo (por exemplo,
a cromatografia lquida, a cromatografia em fase gasosa
e a electroforese capilar) assegura um controlo adequado
das impurezas, para uma substncia de uma determinada
origem, se as impurezas presentes num teor superior ao
limiar de identificao aplicvel so impurezas especificadas
mencionadas na rubrica Impurezas.
Se a substncia contm outras impurezas alm das
mencionadas na rubrica Impurezas, h que verificar se
elas so detectveis pelo mtodo descrito na monografia. Se
no for esse o caso, ser necessrio desenvolver um novo
mtodo e solicitar a reviso da monografia. Segundo os
teores detectados e os limites propostos, ser de encarar a
identificao e/ou a qualificao destas impurezas.
Quando um ensaio de substncias aparentadas nico cobre
vrios perfis de impurezas, s so de mencionar no certificado
de anlise as impurezas pertinentes para o perfil conhecido
associado a uma origem particular, a menos que o detentor da
autorizao de colocao no mercado no utilize substncias
activas que apresentem perfis de impurezas diferentes.
Identificao das impurezas (atribuio dos picos)
Quando uma monografia especifica um limite individual para
uma impureza, muitas vezes necessrio definir um meio
de identificar essa impureza, por exemplo, com a ajuda de
substncias de referncia, de um cromatograma representativo
ou da reteno relativa. O utilizador pode julgar necessrio
identificar impurezas para alm daquelas para as quais a
monografia fornece um meio de identificao, por exemplo,
com o objectivo de verificar a aplicabilidade da especificao
de um determinado perfil de impurezas por comparao com
a rubrica Impurezas. A Farmacopeia no fornece outras
substncias de referncia, cromatogramas representativos ou
informaes sobre as retenes relativas alm dos indicados na
monografia. Cabe, pois, aos utilizadores escolher as tcnicas
cientficas de identificao disponveis.
Novas impurezas/impurezas especificadas presentes num
teor superior ao limite indicado
Quando a utilizao de um novo mtodo de produo ou a
modificao de um processo j utilizado conduz ao aparecimento
de uma nova impureza, necessrio aplicar as prescries da
monografia geral Substncias para uso farmacutico, no que
respeita a identificao e qualificao, e verificar a capacidade da
monografia de permitir o controlo dessa impureza. Os certificados
de conformidade constituem um meio de confirmar, para uma
substncia de determinada origem, que a nova impureza
adequadamente controlada, ou fazer a proposta de um mtodo
de controlo com um critrio de aceitao definido. Neste ltimo
caso, ser determinada uma reviso da monografia.
Quando a utilizao de um novo mtodo de produo ou a
modificao de um processo j utilizado conduz presena
de uma impureza especificada com um teor superior ao
limite especificado, necessrio aplicar as disposies da
monografia geral Substncias para uso farmacutico no
que respeita qualificao.
Mtodos cromatogrficos
O captulo geral 2.2.46. Tcnicas de separao cromatogrfica
trata de diferentes aspectos do controlo das impurezas.
Para todos os fins teis, esto disponveis no site da DEQM
(www.pheur.org) informaes sobre o nome comercial das
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.10 CONTROLO DAS IMPUREZAS (NDICE)

5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico

5. Textos gerais
* As exigncias desta seco aplicam-se aos princpios activos, excepto: aos produtos biolgicos ou biotecnolgicos, peptidos, oligonucleotidos, produtos
radiofarmacuticos, produtos de fermentao e produtos semi-sintticos deles derivados, produtos brutos de origem animal ou vegetal, produtos base de
plantas.
** Aplicao da seco Substncias aparentadas da monografia Substncias para uso farmacutico:
um critrio de aceitao individual deve ser definido para qualquer impureza susceptvel de estar presente num teor superior ao limiar de identificao,
qualquer impureza qual aplicado um critrio de aceitao superior ao limiar de identificao deve ser identificada (na medida do possvel),
qualquer impureza qual se aplica um critrio de aceitao superior ao limiar de identificao deve ser qualificada.

FIGURA 1 Cronograma de deciso relativo interpretao dos critrios gerais de aceitao para as outras impurezas nas monografias

colunas e outros reagentes e equipamentos que
demonstraram serem convenientes quando da elaborao das
monografias.
GLOSSRIO
Outras impurezas detectveis: impurezas potenciais de
estrutura definida de que se sabe que so detectadas pelos
ensaios da monografia mas que no so normalmente presentes
acima do limiar de identificao nas substncias que entram na
composio dos medicamentos autorizados pelas Autoridades
competentes. Fazem parte das impurezas no especificadas e
so, portanto, limitadas por um critrio de aceitao global.
Concentrao nominal: concentrao de uma impureza
calculada a partir da concentrao da soluo padro
prescrita e tendo em conta o factor de correco prescrito.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 785

 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico
Impureza: numa substncia para uso farmacutico, qualquer
composto alm da entidade qumica definida como sendo
essa substncia.
Impureza identificada: impureza cuja caracterizao
estrutural foi realizada.
Impureza no identificada: impureza cuja caracterizao
estrutural no foi realizada e que unicamente definida
por propriedades analticas de ordem qualitativa (reteno
relativa, por exemplo).
Impureza no especificada: impureza limitada por um
critrio de aceitao global e no individualmente citada com
um critrio de aceitao especfico.
Impureza potencial: impureza teoricamente susceptvel de
5. Textos gerais
aparecer quando da produo ou da conservao. Pode ou
no estar efectivamente presente na substncia. Quando se
sabe que uma impureza potencial detectada pelos ensaios da
monografia mas no normalmente presente nas substncias
que entram na composio dos medicamentos autorizados
pelas Autoridades competentes, ela ser citada para informao
na rubrica Impurezas nas Outras impurezas detectveis.
Impureza especificada: impureza individualmente citada
e limitada numa monografia por um critrio de aceitao
786
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.10 CONTROLO DAS IMPUREZAS (NDICE)
especfico. Uma impureza especificada pode ser ou no ser
identificada.
Limite de excluso: nos ensaios cromatogrficos, teor
nominal at ao dos picos/sinais no so considerados para
o clculo da soma das impurezas. O limite de excluso
e o limiar da declarao tm geralmente o mesmo valor
numrico.
Qualificao: processo de aquisio e de avaliao dos dados
que estabelecem a inocuidade biolgica de uma impureza
especificada ou de um determinado perfil de impurezas no
teor ou teores especificados.
Limiar de declarao: limite a partir do qual uma impureza
deve ser declarada.
Limiar de qualificao: limite a partir do qual tem lugar a
qualificao de uma impureza.
Limiar de identificao: limite a partir do qual uma impureza
deve ser identificada.
Substncias aparentadas: nas monografias, ttulo dado aos
ensaios de carcter geral para as impurezas orgnicas.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.11. CARACTERSTICAS
NAS MONOGRAFIAS
5.11. Caractersticas nas monografias 789

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 787

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.11 CARACTERSTICAS DAS MONOGRAFIAS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.11 CARACTERSTICAS DAS MONOGRAFIAS (NDICE)
5.11. CARACTERSTICAS NAS
MONOGRAFIAS
Como se indica nas Prescries Gerais, as indicaes que
figuram na rubrica Caractersticas no so para interpretar
de modo rigoroso e no constituem exigncias. A ttulo de
informao para os utilizadores, os mtodods recomendados
pelos autores das monografias como base para as indicaes
dizendo respeito higroscopicidade, cristalinidade e
solubilidade so apresentadas a seguir.
HIGROSCOPICIDADE
Este mtodo para ser realizado nos produtos em cuja
monografia se exige que satisfaam aos ensaios de perda por
secagem ou de gua. D indicao da higroscopicidade da
substncia sem ser uma verdadeira determinao desta.
Utilize uma caixa de pesagem de vidro de 50 mm de dimetro
externo e 15 mm de altura. Pese a caixa e a tampa (m1).
Introduza a quantidade de substncia especificada no ensaio
de perda por secagem ou gua e pese de novo (m2). Coloque
a caixa no fechada num exsicador apropriado contendo uma
soluo saturada de cloreto ou de sulfato de amnio, a 25C,
ou numa estufa climtica regulada para 25 1C e 80 2 por
cento de humidade relativa. Deixe em repouso durante 24 h.
Coloque a tampa na caixa e pese (m3).
Calcule o aumento de massa em percentagem usando a
expresso:
mm
3 2
100
m2 m1
O resultado expresso do seguinte modo:
deliquescente: absoro de gua suficiente para que haja
formao de uma soluo,
muito higroscpico: aumento de massa superior ou igual a
15 por cento,
higroscpico: aumento de massa inferior a 15 por cento e
superior ou igual a 2 por cento,
ligeiramente higroscpico: aumento de massa inferior a 2
por cento e superior ou igual a 0,2 por cento.
CRISTALINIDADE
Este mtodo empregado para estabelecer a caracterstica
cristalina ou amorfa de uma substncia.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
5.11. Caractersticas nas monografias
Numa lmina de vidro limpa coloque algumas partculas
da amostra em leo mineral. Examine ao microscpio
polarizante. As partculas cristalinas apresentam uma
birrefringncia e observam-se posies de extino quando da
rotao do suporte da lmina.
SOLUBILIDADE
A quantidade mxima de substncia necessria para este
ensaio de 111 mg (para cada solvente) e o volume mximo
de solvente de 30 ml.
Procedimento de dissoluo
Agite energicamente durante 1 min e coloque numa manta
termostatada temperatura de 25,0 0,5C durante 15 min.
Se a dissoluo da amostra for incompleta, agite novamente
5. Textos gerais
durante 1 min e coloque na manta termostatada durante
mais 15 min.
Mtodo
Pese para um tubo com rolha esmerilada (16 mm 160 mm)
100 mg da amostra finamente pulverizada (90). Junte 0,1 ml
do solvente e proceda como descrito no procedimento de
dissoluo. Se a dissoluo for completa, a amostra muito
solvel.
Se a dissoluo for incompleta, junte 0,9 ml do solvente e
proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a
dissoluo for completa a amostra facilmente solvel.
Se a dissoluo for incompleta, junte 2,0 ml do solvente e
proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a
dissoluo for completa a amostra solvel.
Se a dissoluo for incompleta, junte 7,0 ml do solvente e
proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a
dissoluo for completa a amostra ligeiramente solvel.
Se a dissoluo for incompleta, pese 10 mg da amostra
finamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte
10,0 ml do solvente e proceda como descrito no
procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a
amostra pouco solvel.
Se a dissoluo for incompleta, pese 1 mg da amostra
finamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte
10,0 ml do solvente e proceda como descrito no
procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a
amostra muito pouco solvel.
789
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.11 CARACTERSTICAS DAS MONOGRAFIAS (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.12. PADRES DE
REFERNCIA
5.12. Padres de referncia 793

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 791

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.12. PADRES DE
REFERNCIA
Este captulo publicado a ttulo informativo.
1. INTRODUO
O termo padro de referncia empregado neste captulo
para designar o conjunto das substncias de referncia, as
preparaes de referncia e os espectros de referncia.
Os padres de referncia so muitas vezes necessrios para
realizar um adequado controlo da qualidade das substncias
para uso farmacutico e das preparaes farmacuticas.
Os padres de referncia so estabelecidos de acordo com
procedimentos apropriados e a sua aptido permanente
para a utilizao controlada de acordo com um programa
predefinido. Se for necessrio um padro de referncia,
ele faz parte integrante da monografia da Farmacopeia ou
da especificao do fabricante. Se uma monografia ou um
captulo geral remeterem para um padro de referncia da
Farmacopeia Europeia, ele ser o nico padro oficial em
caso de dvida ou de litgio.
Os materiais de referncia e os materiais de referncia
certificados encontram-se definidos mais adiante, mas no
so tratados neste captulo.
Em vrias partes deste captulo, as substncias qumicas
de referncia so objecto de informaes pormenorizadas,
ao contrrio das preparaes biolgicas de referncia. Os
princpios gerais aqui indicados aplicam-se igualmente s
preparaes biolgicas de referncia mas, devido natureza
heterognea destas e sua frequente complexidade em
relao s substncias qumicas de referncia, este captulo
no contm informaes relativas sua utilizao, ao seu
estabelecimento ou aos programas de recontrolo que lhes
so aplicados. No caso dos padres de referncia de peptidos
e de protenas, utilizam-se ensaios especficos para certos
aspectos, nomeadamente o estabelecimento de um teor
declarado; este captulo no trata desse assunto particular.
2. TERMINOLOG1A
Padro primrio. um padro que foi estabelecido por
apresentar propriedades apropriadas utilizao considerada,
fazendo-se a demonstrao da sua conformidade sem se
comparar com qualquer padro existente.
Padro secundrio. Padro estabelecido por comparao com
um padro primrio.
Padro internacional. Padro internacional um padro
primrio que define uma Unidade Internacional (U.I.). A
correspondncia entre um padro internacional e uma
Unidade Internacional indicada pela Organizao Mundial
de Sade.
Padro de referncia da Farmacopeia Europeia. Padro de
referncia estabelecido sob a gide e aprovado pela Comisso
da Farmacopeia Europeia.
Substncia Qumica de Referncia da Farmacopeia Europeia
(SQR). Substncia ou mistura de substncias destinadas a ser
utilizadas de acordo com as indicaes de uma monografia
ou de um captulo geral da Farmacopeia Europeia. As
Substncias Qumicas de Referncia da Farmacopeia
Europeia so padres primrios; exceptuam-se os que
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
5.12. Padres de referncia
(nomeadamente nos antibiticos) so expressos em Unidades
Internacionais. Estes ltimos so padres secundrios,
ligados ao padro internacional.
Preparao Biolgica de Referncia da Farmacopeia
Europeia (PBR). Substncia ou mistura de substncias
destinadas a ser utilizadas de acordo com as indicaes de
uma monografia ou de um captulo geral da Farmacopeia
Europeia. As Preparaes Biolgicas de Referncia da
Farmacopeia Europeia ou so padres secundrios que se
expressam em Unidades Internacionais (U.I.), ou padres
primrios que podem servir para definir Unidades da
Farmacopeia Europeia (U. Ph. Eur.). Podem, igualmente,
ser utilizados outros valores referidos como, por exemplo, o
ttulo em vrus ou o nmero de bactrias.
Material de Referncia (MR). Materiais ou substncias
de que um ou vrios valores da(s) propriedade(s) (so)
suficientemente homogneo(s) para permitir a sua utilizao
5. Textos gerais
para a calibrao de um aparelho, a avaliao de um mtodo
de medida ou a atribuio de valores aos materiais.
Material de Referncia Certificado (MRC). Materiais de
referncia acompanhados de um certificado em que um
ou vrios valores da(s) propriedade(s) (so) certificado(s)
por um procedimento que estabelece o ajustamento para
uma realizao exacta da unidade em que os valores da
propriedade so expressos e para a qual cada valor certificado
acompanhado de uma incerteza num nvel de confiana
indicado.
NOTA: os padres de referncia das farmacopeias distinguem-
-se dos materiais de referncia e dos materiais de referncia
certificados que podem ser utilizados para fins quantitativos,
em contextos diversos e por meio de diferentes tcnicas
analticas. A utilizao de materiais de referncia exigida ou
recomendada num certo nmero de monografias e captulos
gerais da Farmacopeia, nomeadamente para a calibrao ou a
verificao da satisfatria eficcia dos instrumentos.
A especificidade dos padres de referncia da Farmacopeia foi
oficialmente recomendada na introduo do Guia ISO 34
General requirements for the competence of frequence
material producers (Second Edition 2000): Os padres e
substncias das farmacopeias so estabelecidos e distribudos
pelas autoridades da Farmacopeia seguindo o princpio
geral do presente guia. Deve notar-se, no entanto, que as
autoridades da Farmacopeia tomam uma atitude diferente
para dar ao utilizador as informaes fornecidas pelo
certificado de anlise e as datas de validade. Por outro lado,
a incerteza relativa aos valores assinalados no indicada
porque negligencivel em relao aos limites definidos
para os doseamentos, de acordo com o mtodo especfico da
Farmacopeia em que so utilizados.
3. UTILIZAO DOS PADRES DE REFERNCIA
Os padres de referncia so utilizados para identificao,
controlo da pureza e doseamento/aferio das substncias
para uso farmacutico e das preparaes farmacuticas. Est
demonstrado que os padres de referncia so adequados
para o uso a que se destinam; no so necessariamente
adequados a outras utilizaes. Se um padro de referncia
for utilizado num doseamento diferente daquele para o qual
foi estabelecido, deve ser confirmada a sua conformidade para
a nova utilizao. Qualquer valor indicado para um padro
de referncia vlido para a utilizao qual se destina, mas
no necessariamente para outra utilizao.
793
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.12. Padres de referncia
Um padro de referncia da Farmacopeia Europeia com um/a
teor/actividade determinado/a e destinado ao doseamento/
/aferio de uma substncia para uso farmacutico pode
servir para determinar o teor desta substncia numa
preparao farmacutica, se forem preenchidas todas as
condies seguintes:
o mtodo de doseamento cromatogrfico utilizado o
descrito na monografia da substncia activa,
o utilizador verifique que o mtodo aplicvel preparao
farmacutica considerada (ausncia de interferncias),
qualquer tratamento prvio da amostra (extraco, por
exemplo) seja validado para a preparao farmacutica
considerada,
a utilizao esteja aprovada pela Autoridade competente.
Os padres de referncia so, igualmente, estabelecidos para a
5. Textos gerais
determinao do teor dos componentes dos frmacos vegetais
e das preparaes base de frmacos vegetais. Tanto podem
ser as prprias substncias activas, compostos marcadores
usados para quantificao, ou extractos. Os padres de
referncia sob a forma de extractos so estabelecidos com
auxlio de uma amostra bem definida de substncias activas
ou de compostos marcadores.
poltica da Farmacopeia Europeia o fornecimento de
padres de referncia em quantidades adequadas destinadas
utilizao imediata aps a abertura do recipiente. Qualquer
utilizao noutras condies da responsabilidade do
analista. Se um recipiente no tiver sido aberto e se for
conservado nas condies recomendadas, continua apto
para ser utilizado enquanto o respectivo lote estiver em
vigor. As informaes relativas aos nmeros de lote em vigor
so fornecidos na lista de padres de referncia disponvel
atravs do Directrio Europeu da Qualidade do Medicamento
(DEQM) do Conselho da Europa. A conservao das solues
padro de referncia no recomendada, a no ser que o
utilizador demonstre que ela apropriada.
Padres secundrios. Um padro secundrio pode ser utilizado
em ensaios de rotina no controlo da qualidade em cada uma
das utilizaes atrs descritas para os padres primrios, com
a reserva de que ele estabelecido em relao ao respectivo
padro primrio. Usam-se padres secundrios para reduzir
a utilizao de padres primrios que necessitam de uma
caracterizao e de uma avaliao mais aprofundadas e que
pode no estar disponvel seno em quantidade limitada. Um
padro secundrio utilizado apenas para o mesmo fim que o
padro primrio em relao ao qual foi estabelecido.
4. ESTABELECIMENTO DOS PADRES DE REFERNCIA
4-1. PADRO PRIMRIO
Uma substncia ou uma preparao destinada ao
estabelecimento de um padro primrio caracterizada
por uma variedade de tcnicas analticas escolhidas para
demonstrar a sua aptido para utilizao.
Para as substncias para uso farmacutico e respectivas
impurezas so geralmente aplicadas as seguinte partes
apropriadas do programa de ensaios:
Caracterizao da substncia (esclarecimento da estrutura)
pelos atributos qumicos apropriados, como a frmula de
estrutura, a frmula emprica e a massa molecular. Entre as
tcnicas que podem ser utilizadas, figuram:
794
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
a espectrometria de ressonncia magntica nuclear,
a espectrometria de massa,
a espectrofotometria de absoro no infravermelho,
a anlise da composio elementar.
Determinao da pureza:
determinao do teor em impurezas orgnicas por
uma tcnica de separao apropriada ou, nos casos
apropriados, por um mtodo espectromtrico,
determinao quantitativa da gua,
determinao do teor em solventes residuais,
determinao da perda por secagem que pode, em certas
circunstncias, substituir as determinaes da gua e
dos solventes residuais,
determinao das impurezas inorgnicas (ensaio dos
metais pesados, cinzas sulfricas, espectrometria
de absoro atmica, espectrometria em plasma por
acoplamento indutivo, fluorescncia-X) ; os resultados
obtidos no servem para a determinao de um teor
significativo, salvo se tiverem uma influncia aprecivel
sobre ele,
determinao da pureza por um mtodo absoluto (por
exemplo calorimetria diferencial com varrimento ou,
nos casos apropriados, anlise da solubilidade por fase;
os resultados destas determinaes so fornecidos em
apoio e confirmao dos resultados obtidos com as
tcnicas de separao; no so includos no clculo do
valor indicado).
No caso de uma substncia qumica de referncia primria
estabelecida para fins do doseamento, o teor indicado ,
geralmente, calculado a partir dos resultados das anlises
efectuadas para a determinao das impurezas (orgnicas,
inorgnicas, gua e solventes), aplicando o princpio da
comparao das massas; so igualmente utilizados outros
mtodos apropriados.
elaborado e aprovado por uma pessoa qualificada um
relatrio do estabelecimento relativo ao padro de referncia.
4-2. PADRES DE REFERNCIA DA FARMACOPEIA
EUROPEIA
Os padres candidatos so submetidos a ensaios que
implicam uma grande variedade de mtodos analticos. O
desenvolvimento dos ensaios e o nmero de laboratrios
envolvidos depende da utilizao do padro de referncia.
geralmente exigida a conformidade respectiva monografia,
salvo excepes justificadas.
Se, durante o estabelecimento de um padro de referncia,
surgir um estudo subsidirio, este distribudo a cada
participante, mas s os resultados obtidos de acordo com o
protocolo so utilizados para estabelecer um determinado
valor ou confirmar a conformidade.
Para as substncias qumicas de referncia so geralmente
aplicadas as seguinte partes apropriadas do programa de
ensaios.
4-2-1. Identificao. Em geral, suficiente um lote
seleccionado a partir da produo normal da substncia. Est
estabelecido que ele satisfaz s exigncias da monografia; o
estudo completo da estrutura efectuado para o primeiro lote.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
4-2-2. Ensaio das substncias aparentadas. Um padro de
referncia correspondente a uma impureza caracterizado
pela identidade e a pureza. Se um padro de referncia
servir para a determinao do teor de uma dada impureza,
o teor mnimo , de preferncia, de 95,0 por cento; se se
verificar este teor, considera-se como de 100,0 por cento; esta
aproximao aceitvel porque no ter efeitos sensveis na
determinao das impurezas. Se no for possvel obter aquele
teor mnimo, determinado o valor do padro.
Se uma impureza no estiver disponvel em quantidade
suficiente para estabelecer um padro de referncia, existem
outras possibilidades:
a preparao de um padro de referncia contendo uma
mistura do(s) composto(s) e da(s) impureza(s),
a preparao de um padro de referncia contendo uma
mistura de impurezas especificadas.
Se a mistura for igualmente utilizada para determinar o
teor de uma dada impureza, o teor da impureza no padro
de referncia determinado pelos mtodos de separao
apropriados e determina-se o valor do padro de referncia
4-2-3. Doseamento
4-2-3-1. Doseamento qumico. Se um padro de referncia
se destinar determinao quantitativa de uma substncia
activa ou de um excipiente (padro de doseamento), os
ensaios so mais aprofundados. De uma maneira geral, vrios
laboratrios trabalham em colaborao para examinar a
substncia proposta, seguindo um protocolo pormenorizado
onde se descrevem os procedimentos a seguir. Os resultados
obtidos servem para determinar um teor. Se se efectuar
um doseamento selectivo particularmente importante
quantificar as impurezas. Neste caso, prefervel examinar
a substncia proposta atravs de procedimentos analticos
suplementares cientificamente justificados e, se possvel, com
mtodos absolutos.
Se exigido um padro de referncia para um mtodo
de doseamento cromatogrfico (colorimetria ou
espectrofotometria de absoro no ultravioleta, por exemplo),
as reactividades relativas ou as absorvncias relativas das
impurezas presentes na substncia devem ser verificadas para
garantir que no so muito diferentes das da substncia.
preparado um protocolo que deve ser estritamente seguido
pelos participantes do estudo subsidirio para atribuio do
teor. Esse protocolo compreende, em geral:
determinao do teor em gua (ou da perda por secagem),
estimativa das impurezas orgnicas (compreendendo os
solventes residuais, nos casos apropriados) utilizando as
tcnicas de separao prescritas,
eventualmente, determinao do teor da substncia
por um mtodo absoluto; esta determinao, que no
necessariamente efectuado por todos os participantes,
realizada a ttulo de confirmao e os resultados no so
utilizados no clculo do valor determinado.
Alm disso, o protocolo indica os ensaios de conformidade do
sistema e os critrios de aceitao para cada um dos ensaios
efectuados.
Salvo indicao em contrrio, determina-se o valor da
substncia ou da preparao que apresentada no recipiente
e o contedo no deve ser seco antes da utilizao. No
que diz respeito aos padres de doseamento preparados
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
5.12. Padres de referncia
por liofilizao, o teor da substncia pura indicada em
miligramas ou em Unidades Internacionais por frasco.
4-2-3-2. Doseamento microbiolgico. Em primeiro lugar, deve
ser demonstrada a conformidade monografia dum padro
de referncia destinado a um doseamento microbiolgico. No
caso de resultados satisfatrios, efectuado um doseamento
microbiolgico subsidirio, utilizando o padro internacional.
A actividade expressa em Unidades Internacionais. Se no
existir um padro internacional, utilizam-se as Unidades da
Farmacopeia Europeia. A actividade determinada tendo por
base os resultados do ensaio subsidirio. So aplicados diversos
critrios de validao, como o paralelismo, a linearidade e o
ajustamento quadrtico, de acordo com os procedimentos
estatsticos habituais (5.3). A actividade determinada e os
limites de confiana associados so calculados a partir dos
resultados estatisticamente vlidos.
5. Textos gerais
4-2-3-3. Doseamento dos componentes dos frmacos
vegetais e das preparaes base de frmacos vegetais. O
desenvolvimento dos ensaios a que so submetidos os padres
de referncia utilizados nas monografias relativas aos frmacos
vegetais varia de acordo com o tipo de padro de referncia.
Um composto activo ou um composto marcador avaliado
e caracterizado pela identidade e a pureza.
Um extracto serve de padro de referncia se a substncia
activa ou o marcador no estiverem disponveis em
quantidade suficiente. O teor do extracto estabelecido por
meio de um ensaio subsidirio, utilizando uma amostra
bem caracterizada da substncia activa (ou do marcador), a
que se determina o valor.
4-2-4. Relatrio do estabelecimento. elaborado um
relatrio contendo os resultados do estudo do
estabelecimento assim como as informaes que dizem
respeito utilizao do padro de referncia. Um relatrio
relativo a um padro de doseamento qumico apresenta,
alm disso, o valor determinado para a substncia, com a
justificao da atribuio desse valor. A incerteza estimada
relativa ao teor determinado calculada e, se for inferior a
um valor predefinido considerado como negligencivel em
relao aos critrios de aceitao fixados para o doseamento,
o estudo aceite. Caso contrrio, o ensaio repetido, no todo
ou em parte ou, ento, os limites definidos para a substncia
farmacutica podem ser alargados. A incerteza relativa ao
valor determinado no figura nas informaes fornecidas
com o padro de referncia porque, no momento em que
se fixa(m) o(s) limite(s) numa monografia tida em conta
a preciso do mtodo e a incerteza correspondente ao valor
atribudo ao padro de referncia.
4-3. PADRO SECUNDRIO
Um padro secundrio deve apresentar a(s) mesma(s)
propriedade(s) que o padro primrio no que se refere
ao(s) ensaio(s) para o(s) qual(is) foi estabelecido. O
desenvolvimento dos ensaios de controlo no aqui to
importante como o que exigido para o estabelecimento
de um padro primrio. O padro secundrio estabelecido
por comparao com o padro primrio ao qual diz respeito.
Sempre que possvel, para o estabelecimento de um padro
secundrio utiliza-se um padro primrio oficial.
795
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
5.12. Padres de referncia
Identificao
Para utilizao em espectrofotometria de absoro no
infravermelho as bandas de absoro correspondem, no que
se refere posio e dimenses, s respectivas bandas do
padro primrio.
Para utilizao em tcnicas de separao: a distncia de
migrao, o tempo de migrao e os tempos de reteno
do padro secundrio so os mesmos que os do padro
primrio no que se refere, respectivamente, cromatografia
em camada fina ou electroforese, electroforese capilar e
cromatografia lquida ou em fase gasosa.
Ensaio de pureza. Para a utilizao em tcnicas de
separao: como o indicado para a identificao mas,
se o padro for utilizado para quantificao, deve ser
estabelecido um teor em funo da determinao com o
5. Textos gerais
padro primrio.
Doseamento. Os padres secundrios so doseados em
relao a um padro primrio com um/a teor/actividade
determinado/a. A propriedade para a qual deve ser
determinado o padro secundrio semelhante, quanto
sua amplitude, ao padro primrio de comparao.
Independentemente das determinaes a efectuar e dos
critrios de aceitao, deve ser predefinido o nmero de
repeties.
5. PRODUO, ROTULAGEM, CONSERVAO E
DISTRIBUIO
5-1. PRODUO
Todas as operaes so efectuadas de acordo com as boas
prticas para garantir a traabilidade e a integridade do
padro de referncia. O registo de produo compreende
as informaes relativas a enchimento, rotulagem e
conservao. Os padres de referncia so repartidos pelos
recipientes com enchimento e fecho apropriados, para
garantir a integridade do padro de referncia. Os recipientes
usados podem ser para unidose ou para multidose, mas
prefervel usar recipientes para unidose para reduzir, tanto
quanto possvel, os riscos de decomposio, de contaminao
ou de introduo de humidade.
5-2. ROTULAGEM
No rtulo indica-se:
o nome do padro de referncia,
o nome do fornecedor,
o nmero do lote,
qualquer outra informao necessria para uma correcta
utilizao do padro de referncia.
Se o padro de referncia for utilizado como padro de
doseamento, so igualmente fornecidas as seguintes
informaes:
o teor por cento determinado,
o teor em miligramas ou mililitros da entidade qumica
contida no recipiente,
796
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
a actividade determinada (para as titulaes biolgicas ou
microbiolgicas), em unidades por miligrama ou por frasco.
Para os padres de referncia de fabricante, indica-se
no rtulo a data do recontrolo ou de aprovao. Para
os padres de referncia da Farmacopeia Europeia, no
se indica nenhuma data de recontrolo ou de aprovao,
porque o programa de recontrolo (ver adiante) assegura a
monitorizao para garantir, permanentemente, a sua aptido
para utilizao.
Nota informativa. Pode juntar-se uma nota explicativa
contendo as informaes necessrias para uma correcta
utilizao do padro de referncia. A nota informativa
considerada como fazendo parte do rtulo e, se a monografia
o indicar, compreende um cromatograma.
5-3. CONSERVAO E DISTRIBUIO
Os padres de referncia so conservados e distribudos em
condies apropriadas para garantir uma estabilidade ptima.
Padres de referncia da Farmacopeia Europeia. Os padres
de referncia da Farmacopeia Europeia so, na sua maioria,
conservados no frio a uma temperatura de 5 3C. Porm,
um certo nmero de padres de referncia relativamente
instveis so conservados a -20 5C ou, em alguns casos
(por exemplo, preparaes de vrus vivos), a -80 10C; as
culturas celulares so conservadas em azoto lquido (-180C).
Para reduzir o risco de possveis danos provocados pelo
transporte utilizado um acondicionamento especial.
Normalmente, os padres de referncia conservados
a 5 3C so distribudos por correio normal, porque
breves interrupes das condies de temperatura numa
conservao de prazo longo no so nocivas ao padro de
referncia. Os padres de referncia conservados a -20C so
acondicionados em gelo e enviados por correio expresso. Os
padres de referncia conservados a -80C ou os conservados
em azoto lquido so acondicionados em dixido de carbono e
enviados por correio expresso.
6. PROGRAMA DE RECONTROLO
estabelecido e posto em execuo um sistema para garantir
permanentemente a aptido dos padres de referncia para
a sua utilizao. Normalmente, aplicado um programa de
recontrolo que tem em conta as propriedades fsico-qumicas
e os dados conhecidos sobre a estabilidade do padro
de referncia. Os padres de referncia so submetidos
regularmente a ensaios de estabilidade durante o perodo de
conservao. Aplica-se um programa de controlo com ajuda
de tcnicas analticas apropriadas que visa descobrir, o mais
precocemente possvel, qualquer sinal de decomposio.
Os mtodos empregados so escolhidos entre os que foram
utilizados durante a fase de estabelecimento, para se poder
dispor dos dados iniciais.
A periodicidade e o desenvolvimento dos ensaios de
recontrolo dos padres de referncia depende de um certo
nmero de factores, como:
a estabilidade,
o recipiente e o respectivo sistema de fecho,
as condies de conservao,
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS
a capacidade higroscpica,
a forma fsica,
a utilizao prevista,
a apresentao (unidose ou multidose).
A maior parte dos padres de referncia apresentam-se na
forma de p slido, mas alguns so solues. De preferncia
os padres de referncia devem apresentar-se em forma
unitria. Se um padro apresentado num recipiente para
multidose e a substncia for higroscpica ou sensvel ao
oxignio, o recontrolo poder ser mais frequente. Os mtodos
de ensaio compreendem a determinao do teor em gua
e dos produtos de decomposio (se forem conhecidos). O
perodo de recontrolo pode ser alargado, se existirem dados
suficientes que o justifique. A variao mxima autorizada,
em relao ao valor determinado, deve ser predefinido e, em
caso de o ultrapassar, o lote deve ser novamente sujeito a um
processo de estabelecimento ou ser substitudo.
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
5.12. Padres de referncia
Padres de referncia da Farmacopeia Europeia. O programa
de monitorizao do EDQM compreende uma escolha entre
os seguintes ensaios, por serem rpidos, sensveis e aplicveis
a pequenas quantidades:
determinao do teor em gua, perda por secagem e/ou
termogravimetria,
determinao das impurezas por tcnicas de separao
indicadoras da estabilidade,
determinao da pureza molar por calorimetria diferencial,
com varrimento, se for caso disso,
aplicao de outros ensaio especficos que permitam
descobrir impurezas.
Qualquer diferena significativa observada em relao
ao ltimo exame acarreta um exame mais aprofundado
do lote e, se necessrio, o estabelecimento de um lote de
5. Textos gerais
substituio.
797
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.12 PADRES DE REFERNCIA (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.14. MEDICAMENTOS DE
TERAPIA GENTICA PARA
USO HUMANO
5.14. Medicamentos de terapia gentica
para uso humano 801

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 799

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
5.14. MEDICAMENTOS DE
TERAPIA GENTICA PARA USO
HUMANO
Este captulo publicado a ttulo informativo.
Este captulo geral contm uma srie de textos relativos aos
medicamentos de terapia gentica para uso humano. Os
textos definem as especificaes aplicveis produo e ao
controlo destes produtos. Para um medicamento especfico,
a aplicao destas especificaes e a necessidade eventual
de ensaios suplementares so decididos pela Autoridade
competente. Os textos foram concebidos para serem
aplicados aos produtos aprovados: a necessidade da sua
aplicao parcial ou total aos produtos utilizados no decurso
das diferentes fases dos ensaios clnicos decidida pela
Autoridade competente. As disposies deste captulo no
excluem a utilizao de mtodos alternativos de produo e
de controlo aceites pela Autoridade competente.
A Nota explicativa relativa qualidade e aos aspectos pr-
-clnicos e clnicos dos medicamentos de terapia gentica
(CPMP BWP 3088 99) e a Nota explicativa relativa ao
desenvolvimento e produo de vectores lentivricos
(CHMP BWP 2458 03) do Comit de medicamentos para
uso humano (assim como as revises posteriores destes
documentos), fornecem recomendaes suplementares
detalhadas para os medicamentos de terapia gentica.
DEFINIO
Para efeitos deste captulo, entende-se por medicamento de
terapia gentica qualquer produto obtido por um conjunto
de mtodos de fabrico que visam a transferncia, in vivo
ou ex vivo de um gene profiltico, de diagnstico ou
teraputico (a saber, um fraco de cido nucleico), atravs
de clulas humanas/animais e sua consequente expresso
in vivo. A transferncia gentica implica um sistema de
expresso chamado vector, que pode ser de origem vrica ou
no vrica. Este vector pode tambm ser includo numa clula
humana ou animal.
Vectores recombinantes, como os vectores vricos ou
plasmdicos. Os vectores recombinantes so ou injectados
directamente no corpo do paciente (transferncia gentica
in vivo) ou transferidos para clulas hospedeiras
antes da administrao destas clulas geneticamente
modificadas ao homem (transferncia gentica ex vivo).
Os vectores vricos so derivados de diversos vrus (por
exemplo, adenovrus, poxvrus, retrovrus, lentivrus, vrus
adeno-associados, herpesvrus). Os vectores podem ser
replicativos, no replicativos ou replicativos condicionais.
Os vectores plasmdicos incluem os cidos nucleicos
numa formulao simples (por exemplo, ADN livre) ou
complexados a diversas molculas (vectores sintticos como
os lpidos ou os polmeros). O material gentico transferido
pelos medicamentos de terapia gentica constitudo por
sequncias nucleotdicas que podem codificar os produtos
do gene, os produtos da transcrio anti-sentido ou os
ribozimas. Os oligonucletidos sintetizados quimicamente,
no esto cobertos por este captulo geral. Aps transferncia,
o material gentico pode manter-se tanto no citoplasma ou
como epissoma ou ser integrado no genoma de uma clula
hospedeira consoante o estatuto do vector (integrativo ou no).
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
Clulas geneticamente modificadas. As clulas
geneticamente modificadas so modificadas por vectores para
expressarem um produto pretendido.
PRODUO
Substncias utilizadas na produo. Nos casos apropriados, as
matrias-primas utilizadas no processo de fabrico, incluindo
o estabelecimento do lote semente vrico e dos bancos de
clulas. so qualificadas. Salvo excepo justificada, todas as
substncias utilizadas so produzidas no mbito de um sistema
reconhecido de segurana da qualidade, atravs da utilizao
de instrumentos de produo apropriados. Estabelecem-se
especificaes adequadas para, nomeadamente, controlar
a identidade, a actividade (nos casos apropriados), a pureza
e a inocuidade em termos de qualidade microbiolgica e a
5. Textos gerais
contaminao por endotoxinas bacterianas. A qualidade da
gua utilizada satisfaz s monografias especficas relevantes
(gua purificada, gua altamente purificada, gua
para preparaes injectveis). Durante a produo, evita-se,
sempre que possvel, a utilizao de antibiticos.
Segurana vrica. Aplicam-se as exigncias do captulo 5.1.7
Segurana vrica.
Encefalopatias espongiformes transmissveis (5.2.8).
Efectua-se uma avaliao do risco de encefalopatias
espongiformes transmissveis ligadas ao produto e tomam-se
medidas apropriadas para reduzir estes riscos ao mnimo.
Vectores recombinantes
PRODUO
DISPOSIES GERAIS
No caso de vectores vricos, a produo baseia-se, sempre que
possvel, num sistema de lote semente de banco de clulas e
num sistema de lote semente vrica.
No caso dos vectores plasmdicos, a produo baseia-se num
sistema de lote semente de clulas bacterianas.
Estabelece-se que o mtodo de produo utilizado d origem,
de forma reprodutvel, a um vector com qualidade suficiente
para garantir a sua eficcia e inocuidade no homem.
Salvo excepo justificada e autorizada, o vector contido
no produto final no foi submetido, aps o lote semente
primrio, a um nmero de passagens ou subculturas superior
ao que foi utilizado para preparar o vector que satisfez aos
ensaios clnicos em termos de inocuidade e eficcia.
Os substratos utilizados satisfazem s especificaes
apropriadas da Farmacopeia Europeia (5.2.2, 5.2.3 e seco
Clulas bacterianas utilizadas na produo de vectores
plasmdicos para uso humano que figuram no final deste
captulo geral).
CARACTERIZAO DO VECTOR
Os dados histricos da construo do vector so
acompanhados por dados justificativos; entre estes dados
801
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
figuram a origem do vector e sua manipulao posterior,
nomeadamente as regies suprimidas ou modificadas.
Caracteriza-se o vector atravs de mtodos apropriados e
validados.
Avalia-se, atravs de mtodos apropriados, a estabilidade
gentica do vector no nvel ou para alm do nvel mximo de
passagem utilizada para a produo.
MULTIPLICAO E COLHEITA
Qualquer manipulao do banco de clulas e das culturas
celulares dele originadas efectuada num local onde
nenhuma outra clula nem nenhum outro vector so
manipulados ao mesmo tempo. Qualquer material de origem
humana ou animal utilizado na preparao de suspenses
celulares e de meios de cultura qualificado. Verifica-se
5. Textos gerais
a pureza da colheita atravs de ensaios apropriados como
definido nas seces especficas correspondentes.
COLHEITA PURIFICADA
A substncia activa a granel define-se como um lote de
vectores recombinantes purificados (vectores vricos,
plasmdeos livres ou complexados).
LOTE FINAL
Salvo justificao e autorizao contrrias, a formulao e
a distribuio do granel final efectuam-se em condies de
assepsia e utilizando recipientes estreis (3.2).
Avalia-se a estabilidade do lote final atravs de protocolos de
estabilidade entre os quais se incluem a durao, as condies
de conservao, o nmero de lotes a examinar, o programa de
ensaios e os doseamentos a efectuar.
DOSEAMENTO E ENSAIO
Os medicamentos de terapia gentica satisfazem ao
doseamento e aos ensaios descritos nas seces especficas
correspondentes.
Clulas geneticamente modificadas
No que respeita s clulas destinadas a serem modificadas
com um vector recombinante, os dados relativos ao
vector recombinante esto detalhados em Vectores
recombinantes.
PRODUO
SUBSTRATO CELULAR
No que respeita s clulas xenognicas, incluindo as
bacterianas, estabelece-se um sistema de banco de clulas
compreendendo um banco de clulas primrio e banco de
clulas de trabalho.
No que respeita s clulas autlogas e alognicas, estabelece-
-se, sempre que possvel, um sistema de banco de clulas
compreendendo um banco de clulas primrio e um banco de
clulas de trabalho.
802
TRANSFECO/TRANSDUO
As clulas so transduzidas ou transfectadas por meio de um
vector recombinante (plasmdico ou vrico) qualificado, como
descrito em Vectores recombinantes; o mtodo validado.
So manipuladas em condies de assepsia, num local
onde nenhuma outra clula nem nenhum outro vector so
manipulados ao mesmo tempo. Todos os reagentes utilizados
nas etapas de manipulao das clulas so inteiramente
qualificados. Salvo excepo justificada e autorizada, evita-se
a utilizao de antibiticos. A transfeco ou a transduo
efectuam-se em condies de assepsia.
LOTE FINAL
Nos casos de conservao por congelao, a viabilidade
das clulas geneticamente modificadas avalia-se antes da
congelao e aps descongelao.
Se as clulas no forem utilizadas num curto espao de
tempo, determina-se a estabilidade verificando a viabilidade
celular e a expresso do inserto gentico.
Nos casos de encapsulamento das clulas geneticamente
modificadas antes da implantao no homem, qualquer
componente utilizado na cpsula considera-se como fazendo
parte do produto final. objecto de um controlo de qualidade
e inteiramente caracterizado (por exemplo, integridade
fsica, permeabilidade selectiva, esterilidade).
DOSEAMENTO E ENSAIO
Entre os controlos das clulas xenognicas, alognicas ou
autlogas figuram os seguintes controlos:
identidade, contagem e viabilidade da clulas,
integridade global, funcionalidade, nmero de cpias por
clula, transferncia e eficcia da expresso do inserto
gentico,
controlos microbiolgicos (2.6.1 ou 2.6.27), teor em
endotoxinas, contaminao por micoplasmas (2.6.7),
contaminao por vrus parasitas e, nos caos apropriados,
gerao de vectores replicativos.
Se necessrio, a Autoridade competente pode aprovar um
programa de controlos reduzido devido a uma disponibilidade
limitada de clulas. Se necessrio, devido a constrangimentos
de tempo, o produto pode ser libertado para utilizao antes
do final de alguns ensaios.
VECTORES ADENOVRICOS PARA
USO HUMANO
DEFINIO
Os vectores adenovricos para uso humano so preparaes
lquidas ou liofilizadas de adenovrus recombinantes,
geneticamente modificados para transferir o material gentico
s clulas somticas humanas in vivo ou ex vivo.
PRODUO
CONSTRUO DO VECTOR
Existem diferentes abordagens possveis para a configurao e
construo do vector adenovrico. A abordagem ptima depende
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
da aplicao clnica pretendida. O mtodo escolhido permite
reduzir ao mnimo o risco de gerao de vectores adenovricos
competentes para a replicao ou eliminar efectivamente os
vrus auxiliares eventuais utilizados durante a produo.
PRODUO DO VECTOR
Estabelece-se que o mtodo de produo utilizado d origem,
de forma reprodutvel, a um vector com qualidade suficiente
para garantir a sua eficcia e inocuidade no homem.
Salvo excepo justificada e autorizada, o vector contido
no produto final no foi submetido, aps o lote semente
primrio, a um nmero de passagens ou subculturas superior
ao que foi utilizado para preparar o vector que satisfez aos
estudos clnicos em termos de inocuidade e eficcia.
Avalia-se por mtodos apropriados a estabilidade gentica e
fenotpica do vector hbrido no nvel ou para alm do nvel
mximo de passagens utilizado para a produo.
SUBSTRATO DE MULTIPLICAO DO VECTOR
O vector multiplica-se em linhas celulares contnuas (5.2.3)
com base num sistema de banco de clulas. A presena de
adenovrus competentes para replicao (ACR) pode ser
significativa se existirem grandes regies de homologia entre
o genoma vrico e o genoma das clulas de complementao.
Esta presena pode ser reduzida, atravs da reduo da
homologia entre os 2 genomas. Recomenda-se para a
produo clulas desprovidas de qualquer homologia de
sequncia com o vector.
LOTE SEMENTE DO VECTOR
A produo do vector baseia-se num sistema de lote semente.
A estirpe de adenovrus utilizada identificada por dados
histricos, que incluem informaes sobre a sua origem e
manipulao posterior, nomeadamente as regies suprimidas
ou modificadas. Fornece-se uma informao detalhada
do(s) inserto(s) gentico(s) que compreende os detalhes da
sequncia nucleotdica do(s) gene(s) respeitante(s) assim como
das regies flanqueadoras de controlo. Descreve-se o mtodo
atravs do qual o inserto gentico foi introduzido no vector.
S um lote semente que satisfaz aos ensaios descritos a
seguir pode ser utilizado na produo do vector.
Identificao. Por mtodos imunoqumicos (2.7.1) ou por
tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21),
identifica-se o vector no lote semente primrio e em cada um
dos lotes semente de trabalho.
Caracterizao gentica e fenotpica. Efectuam-se os
seguintes ensaios:
Sequencia-se o genoma inteiro do vector no nvel de
passagem comparvel ao de um lote de produo e a
sequncia determinada analiticamente comparada
sequncia terica estabelecida, tendo em conta a
construo do vector e as bases de dados disponveis.
Efectua-se uma anlise de restrio no ADN do vector do
lote semente primrio, de cada lote semente de trabalho e
de um lote de produo. Extrai-se o ADN vrico, purifica-
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
-se e digere-se com uma resoluo suficiente. Separam-se
por electroforese em gele ou por electroforese capilar os
fragmentos digeridos, e o mapa de restrio observado
comparado com o mapa de restrio terico estabelecido
tendo em conta a construo do vector.
Controla-se um nmero apropriado de subclones isolados
para pesquisa da expresso do(s) produto(s) do inserto
gentico para se determinar a actividade biolgica no nvel de
passagem comparvel ao de um lote de produo. Os sublotes
que apresentam um fraco nvel de expresso ou de actividade
biolgica necessitam de uma caracterizao mais aprofundada.
Concentrao do vector. Determina-se o ttulo de vector
infeccioso ou a concentrao em partculas do vector no lote
semente primrio e em cada um dos lotes semente de trabalho.
5. Textos gerais
Agentes estranhos (2.6.16). O lote semente primrio e cada
um dos lotes semente de trabalho satisfazem s especificaes
dos ensaios de agentes estranhos.
Adenovrus competentes para a replicao (ACR). Os ACR
so gerados por uma recombinao homloga entre o ADN
vrico recombinante e as sequncias de adenovrus integrados
no genoma das clulas de complementao.
A deteco dos ACR efectuada por um mtodo apropriado
e aprovado pela Autoridade competente. O mtodo
normalmente utilizado uma titulao da infecciosidade por
deteco em linhas celulares sensveis, que no podem ser
complementares no que diz respeito aos genes suprimidos
do vector. Consoante o caso, podem ser utilizados outros
indicadores de replicao vrica.
Se, devido construo do vector e das linhas celulares
utilizadas, no for suposto a amostra conter ACR, efectue, nos
casos apropriados, pelo menos 2, mas 3 ou 4 de preferncia,
passagens sucessivas na linha celular de deteco. A deteco
de um efeito citopatognico no final das passagens revela a
presena de ACR na preparao. Para controlar a sensibilidade,
incluem-se testemunhas positivas em cada titulao.
Se for suposto a amostra conter ACR, podem efectuar-se
titulaes em placa ou titulaes por diluio limite numa
linha celular de deteco.
Qualquer manipulao do banco de clulas e das culturas
celulares originadas efectuada num local com um nvel de
isolamento apropriado em que nenhuma outra clula nem
nenhum outro vector so manipulados ao mesmo tempo.
Qualquer material de origem humana ou animal utilizado na
preparao de suspenses celulares e de meios de cultura
qualificado. O meio de cultura celular pode conter um indicador
de pH como o vermelho de fenol e antibiticos apropriados na
mais baixa concentrao eficaz, sendo prefervel utilizar durante
a produo um substrato isento de antibiticos. Salvo excepo
justificada e autorizada, a penicilina ou a estreptomicina no
so utilizadas em qualquer etapa da produo. Uma parte
das culturas celulares de produo mantida como culturas
celulares no semeadas (clulas testemunhas).
Cada colheita nica que satisfaz aos ensaios descritos a seguir
pode ser utilizada na preparao da colheita purificada.
Identificao. Identifica-se o vector por mtodos
imunoqumicos (2.7.1) ou por tcnicas de amplificao dos
cidos nucleicos (2.6.21).
803
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
Concentrao em vector. Determinam-se o ttulo de vector
infeccioso e a concentrao em partculas do vector nas
colheitas nicas.
Agentes estranhos (2.6.16). A colheita nica satisfaz s
especificaes dos ensaios de agentes estranhos.
Clulas testemunhas. As clulas testemunhas satisfazem a
um ensaio de identificao (5.2.3) e a um ensaio de agentes
estranhos (2.6.16).
COLHEITA PURIFICADA
Podem ser misturadas vrias colheitas nicas antes do
processo de purificao. Valida-se o mtodo de purificao
para demonstrar a eliminao satisfatria das impurezas.
5. Textos gerais
As colheitas purificadas que satisfazem aos ensaios descritos a
seguir podem ser utilizadas na preparao do granel final.
Concentrao em vector. Determinam-se o ttulo de vector
infeccioso e a concentrao em partculas do vector nas
colheitas purificadas.
Identificao. Identifica-se o vector por mtodos
imunoqumicos (2.7.1) ou por tcnicas de amplificao dos
cidos nucleicos (2.6.21).
Integridade genmica. Verifica-se a integridade genmica do
vector por mtodos apropriados como a anlise de restrio.
Protenas residuais da clula hospedeira. Determina-se a
concentrao em protenas residuais da clula hospedeira
por um mtodo imunoqumico apropriado (2.7.1), salvo se a
validao do mtodo demonstrar uma apropriada eliminao
destas substncias.
ADN residual da clula hospedeira. Determina-se a
concentrao em ADN residual da clula hospedeira por um
mtodo apropriado, salvo se a validao do mtodo demonstrar
uma apropriada eliminao desta substncia. Recomenda-se a
tcnica quantitativa de amplificao em cadeia pela polimerase
(PCR) pela sua sensibilidade e especificidade, mas outras
tcnicas apropriadas podem tambm ser utilizadas.
Reagentes residuais. Se durante o mtodo de purificao
forem utilizados reagentes, estes devem ser pesquisados (por
exemplo, cromatografia lquida ou espectrometria de absoro
atmica) na colheita purificada, salvo se a validao do mtodo
demonstrar uma apropriada eliminao destas substncias.
Antibiticos residuais. Se durante o mtodo de produo
forem utilizados antibiticos, determina-se o seu teor
residual por titulao microbiolgica (adaptada do mtodo
2.7.2) ou por outros mtodos apropriados (por exemplo,
cromatografia lquida) salvo se a validao do mtodo
demonstrar uma apropriada eliminao destas substncias.
GRANEL FINAL
Na preparao do granel final podem ser misturadas vrias
colheitas purificadas. Pode ser adicionado um estabilizante e
outros excipientes. Filtra-se o produto formulado atravs de
um filtro antibacteriano.
804
S um granel final que satisfaz ao ensaio descrito a seguir
pode ser utilizado na preparao do lote final.
Esterilidade (2.6.1). Efectuado com 10 ml da preparao em
cada meio, o granel final satisfaz ao ensaio de esterilidade.
LOTE FINAL
S um lote final que satisfaz a cada um dos ensaios descritos em
Identificao, Ensaio e Doseamento pode ser libertado.
Se o ensaio de sero-albumina bovina (quando o soro de
bovino utilizado para fabricar o vector) e dos ACR forem
realizados com resultados satisfatrios no granel final, podem
no ser realizados no lote final.
IDENTIFICAO
Identifica-se o vector por um mtodo imunoqumico (2.7.1)
ou por tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21)
ou por anlise de restrio.
ENSAIO
Osmolalidade (2.2.35): dentro dos limites aprovados.
pH (2.2.3): dentro dos limites aprovados.
Volume extravel (2.9.17). A preparao satisfaz ao ensaio do
volume extravel.
Humidade residual (2.5.12): dentro dos limites aprovados
para a preparao liofilizada.
Sero-albumina bovina: no mximo, o limite aprovado,
determinado por um mtodo imunoqumico (2.7.1), se
durante a produo tiver sido utilizado soro bovino.
Concentrao em adenovrus competentes para a replicao
(ACR): dentro dos limites aprovados.
Agregados de vector. Determinam-se os agregados de vector
por mtodos apropriados (por exemplo, difuso da luz).
Esterilidade (2.6.1). A preparao satisfaz ao ensaio de
esterilidade.
Endotoxinas bacterianas (2.6.14): inferior ao limite
aprovado.
Estabilidade trmica. Mantenha as amostras do lote final
de vector a uma temperatura e por um perodo adaptados
e autorizados para a preparao. Determine a concentrao
total em vector infeccioso aps aquecimento, como descrito
em Doseamento. Determine paralelamente a concentrao
em vector de uma amostra no aquecida. A diferena entre a
concentrao total do vector no aquecido e a do vector aps
aquecimento encontra-se nos limites aprovados para a preparao.
DOSEAMENTO
Concentrao em partculas de vector. A titulao fsica
efectua-se segundo uma tcnica apropriada (por exemplo,
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
cromatografia lquida, medio da absoro ou tcnicas de
amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21)). Utilize um padro
de referncia apropriado do vector para validar cada titulao.
A concentrao em partculas de vector na amostra no
inferior concentrao indicada no rtulo.
Ttulo em vector infeccioso. Titule a amostra atravs da
inoculao em culturas celulares. Titule um vector padro de
referncia apropriado para validar cada doseamento.
A titulao s vlida se
o intervalo de confiana (P = 0,95) do logaritmo da
concentrao em vector for superior ao valor autorizado
pela Autoridade competente,
o ttulo infeccioso do padro de referncia estiver dentro do
limite definido no mapa de controlo.
Relao entre a concentrao em partculas de vector e o
ttulo em vector infeccioso: dentro dos limites aprovados.
Expresso do produto do inserto gentico. Sempre que seja
possvel, determina-se a expresso do(s) produto(s) do inserto
gentico, aps inoculao da preparao considerada em cultura
celular com uma multiplicidade de infeco pr-determinada,
atravs de doseamentos imunoqumicos (2.7.1) ou bioqumicos
apropriados ou por citometria de fluxo (2.7.24).
Actividade biolgica. Salvo excepo justificada e autorizada,
determina-se a actividade biolgica atravs de um ensaio in
vitro ou in vivo.
ROTULAGEM
No rtulo indica-se:
o contedo em substncia activa,
a dose humana recomendada, expressa em concentrao de
partculas do vector,
nas preparaes liofilizadas:
o nome ou a composio e o volume de lquido a
adicionar para a reconstituio,
o prazo de validade aps reconstituio.
VECTORES POXVRICOS PARA
USO HUMANO
DEFINIO
Os vectores poxvricos para uso humano so preparaes
lquidas ou liofilizadas de poxvrus recombinantes,
geneticamente modificados para transferir o material gentico
s clulas somticas humanas in vivo ou ex vivo.
PRODUO
CONSTRUO DO VECTOR
a seguinte a configurao normal corrente de um vector
poxvrico: insere-se o inserto gentico num promotor de
poxvrus. Esta cassete de expresso insere-se no genoma
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0
5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
do poxvrus de forma a interromper um gene vrico no
essencial replicao posicionando-se entre 2 quadros de
leitura do vrus. Na maior parte das estratgias adoptadas
actualmente para a construo do vector, a cassete de expresso
primeiramente inserida no local alvo de um fragmento de
ADN vrico clonado num plasmdeo bacteriano. O plasmdeo
depois introduzido nas clulas hospedeiras cultivadas in
vitro, que simultaneamente so infectadas com poxvrus
parental. A recombinao do ADN produz-se no seio das clulas
infectadas entre as sequncias do genoma vrico e as sequncias
vricas homlogas do plasmdeo de tal modo que o inserto
gentico seja transferido para o local visado do genoma vrico.
A revelao do ADN alvo inserido verificada por cartografia
de restrio, por tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
(2.6.21) e sequenciao. Para purificar o poxvrus recombinante
a partir da mistura de poxvrus parental e recombinante,
efectuam-se etapas sucessivas de clonagem atravs de
isolamento por placas. Utiliza-se uma variedade de mtodos
5. Textos gerais
para facilitar o reconhecimento e/ou a seleco do poxvrus
recombinante com um fundo constitudo pelo vrus parental
(por exemplo, genes marcadores estranhos, hibridao do ADN,
deteco imunolgica, alteraes fenotpicas no vrus). Se
transitoriamente forem utilizados genes marcadores estranhos,
estes so eliminados do produto final por mtodos apropriados.
Uma estratgia alternativa para criar vectores poxvricos,
consiste em comear pela construo in vitro de um genoma
vrico integral abrigando no local alvo escolhido a cassete
de expresso. O genoma recombinante depois inserido nas
clulas hospedeiras infectadas simultaneamente com poxvrus
auxiliar incapaz de se multiplicar. O vrus auxiliar pode ser
um poxvrus da mesma espcie em que a capacidade de se
multiplicar foi inactivada ou um poxvrus de uma outra espcie
que no se multiplica nas clulas hospedeiras.
A construo de vectores poxvricos no replicativos baseia-
-se em linhas celulares especficas de clulas hospedeiras ou
de clulas primrias naturalmente permissivas ou de linhas
celulares hospedeiras modificadas para expressarem um gene
essencial do poxvrus. As clulas satisfazem s especificaes
gerais relativas produo de medicamentos (5.2.3) e no
permitem a gerao de vectores replicativos.
PRODUO DO VECTOR
Estabelece-se que o mtodo de produo utilizado d
origem, de forma reprodutvel, a um vector com qualidade
suficiente para garantir a sua eficcia e inocuidade no homem.
Salvo excepo justificada e autorizada, o vector contido
no produto final no foi submetido, aps o lote semente
primrio, a um nmero de passagens ou subculturas superior
ao que foi utilizado para preparar o vector que satisfez aos
estudos clnicos em termos de inocuidade e eficcia.
Avalia-se por mtodos apropriados a estabilidade gentica e
fenotpica do vector hbrido no nvel ou para alm do nvel
mximo de passagens utilizado para a produo.
SUBSTRATO DE MULTIPLICAO DO VECTOR
O vector multiplica-se em condies asspticas em linhas
celulares diplides humanas (5.2.3), em linhas celulares
contnuas (5.2.3) ou em clulas de embrio de pinto
provenientes de um bando isento de microrganismos
patognicos especficos (5.2.2). Nos casos em que o vector
preparado em linhas celulares contnuas ou em linhas
celulares diplides humanas implementa-se um sistema de
banco de clulas.
805
 MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.14 MEDICAMENTOS DE TERAPIA GENTICA (NDICE)
5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
LOTE SEMENTE DO VECTOR
A produo do vector baseia-se num sistema de lote semente.
A estirpe de poxvrus utilizada identificada por dados
histricos que incluem informaes sobre a sua origem e
manipulao posterior, nomeadamente as regies suprimidas
ou modificadas. Fornece-se uma informao detalhada do(s)
inserto(s) gentico(s) que compreende os pormenores da
sequncia nucleotdica do(s) gene(s) respeitante(s) assim como
das regies flanqueadoras de controlo. Descreve-se o mtodo
atravs do qual o inserto gentico foi introduzido no vector.
S um lote semente que satisfaz aos ensaios descritos a
seguir pode ser utilizado na produo do vector.
Identificao. Por mtodos imunoqumicos (2.7.1) ou por
tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21),
identifica-se o vector no lote semente primrio e em cada um
5. Textos gerais
dos lotes sementes de trabalho.
Caracterizao gentica e fenotpica. Efectuam-se os
seguintes ensaios:
Sequencia-se o genoma inteiro do vector no nvel de
passagem comprvel de um lote de produo e a
sequncia determinada analiticamente comparada
sequncia terica estabelecida tendo em conta a construo
do vector e as bases de dados disponveis.
Efectua-se uma anlise de restrio no ADN do vector do
lote semente primrio, de cada lote semente de trabalho e
de um lote de produo. Extrai-se o ADN vrico, purifica-
-se e digere-se com uma resoluo suficiente. Separam-se
por electroforese em gele ou por electroforese capilar os
fragmentos digeridos e o mapa de restrio observado
comparado com o de restrio terica estabelecido tendo
em conta a construo do vector.
Controla-se um nmero apropriado de subclones isolados
para pesquisa da expresso do(s) produto(s) do inserto
gentico para se determinar a actividade biolgica no nvel de
passagem comparvel ao de um lote de produo. Os sublotes
que apresentam um fraco nvel de expresso ou de actividade
biolgica necessitam de uma caracterizao mais aprofundada.
Atravs de um painel de clulas permissivas, verificam-se
as propriedades replicativas do vector comparando-as com
as do vrus parental ao nvel de passagem comparvel ao de
um lote de produo.
Ttulo em vector infeccioso. Determina-se o ttulo em vector
infeccioso no lote semente primrio e em cada um dos lotes
de trabalho.
Agentes estranhos (2.6.16). O lote semente primrio e cada
um dos lotes de trabalho satisfazem s especificaes dos
ensaios de agentes estranhos, salvo no caso em que o vector
uma estirpe de interferncia, pelo facto de ser derivado de
uma estirpe citopatognica que no pode ser neutralizada.
Se o ensaio no puder ser efectuado, implemente um mtodo
alternativo apropriado e validado.
MULTIPLICAO E COLHEITA
Qualquer manipulao do banco de clulas e das culturas
celulares dele originadas efectuada num local com um nvel
de isolamento apropriado em que nenhuma outra clula nem
nenhum outro vector so manipulados ao mesmo tempo.
Qualquer material de origem humana ou animal utilizado
806
na preparao de suspenses celulares e de meios de cultura
qualificado. O meio de cultura celular pode conter um
indicador de pH como o vermelho de fenol e antibiticos
apropriados na mais baixa concentrao eficaz, sendo
prefervel utilizar durante a produo um substrato isento
de antibiticos. Salvo excepo justificada e autorizada,
a penicilina ou a estreptomicina no so utilizadas em
qualquer etapa da produo. Uma parte das culturas celulares
de produo mantida como culturas celulares no semeadas
(clulas testemunhas).
Cada colheita nica que satisfaz aos ensaios descritos a seguir
pode ser utilizada na preparao da colheita purificada.
Identificao. Identifica-se o vector por mtodos
imunoqumicos (2.7.1) ou por tcnicas de amplificao dos
cidos nucleicos (2.6.21).
Ttulo em vector infeccioso. Determina-se o ttulo de vector
infeccioso nas colheitas nicas.
Agentes estranhos (2.6.16). A colheita nica satisfaz s
especificaes dos ensaios de agentes estranhos, salvo no
caso em que o vector uma estirpe de interferncia, pelo
facto de ser derivado de uma estirpe citopatognica que no
pode ser neutralizada. Se o ensaio no puder ser efectuado,
implemente um mtodo alternativo apropriado e validado.
Clulas testemunhas. Se forem utilizadas na produo linhas
celulares diplides humanas ou uma linha celular contnua,
as clulas testemunhas satisfazem ao ensaio de identificao
(5.2.3) e satisfazem ao ensaio de agentes estranhos (2.6.16).
COLHEITA PURIFICADA
A manipulao efectua-se em condies de assepsia.
Podem ser misturadas vrias colheitas nicas antes do
processo de purificao. A colheita em primeiro lugar
clarificada para eliminar as clulas e depois, nos casos
apropriados, purificada por mtodos validados.
As colheitas purificadas que satisfazem aos ensaios seguintes
podem ser utilizadas na preparao do granel final.
Ttulo em vector infeccioso. Determinam-se o ttulo em
vector infeccioso e a concentrao em partculas do vector
nas colheitas nicas.
Identificao. Identifica-se o vector por mtodos
imunoqumicos (2.7.1) ou por tcnicas de amplificao dos
cidos nucleicos (2.6.21).
Integridade genmica. Verifica-se a integridade genmica do
vector por mtodos apropriados como a anlise de restrio.
Relao entre o ttulo em vector infeccioso e a concentrao
em protenas totais. Determina-se a concentrao em
protenas totais por um mtodo apropriado (2.5.33).
Calcula-se a relao entre o ttulo em vector infeccioso e a
concentrao em protenas totais.
Protenas residuais da clula hospedeira. Determina-se a
concentrao em protenas residuais da clula hospedeira
por um mtodo imunoqumico apropriado (2.7.1), salvo se a
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validao do mtodo demonstrar uma apropriada eliminao
destas substncias.
ADN residual da clula hospedeira. Determina-se a
concentrao em ADN residual da clula hospedeira por um
mtodo apropriado, salvo se a validao do mtodo demonstrar
uma apropriada eliminao desta substncia. Recomenda-se a
tcnica quantitativa de amplificao em cadeia pela polimerase
(PCR) pela sua sensibilidade e especificidade, mas outras
tcnicas apropriadas podem tambm ser utilizadas.
Reagentes residuais. Se durante o mtodo de purificao
forem utilizados reagentes, estes so pesquisados (por
exemplo, por cromatografia lquida ou espectrometria de
absoro atmica) na colheita purificada, salvo se a validao
do mtodo demonstrar uma apropriada eliminao destas
substncias.
Antibiticos residuais. Se durante o mtodo de produo
forem utilizados antibiticos, determina-se o seu teor
residual por titulao microbiolgica (adaptada do mtodo
2.7.2) ou por outros mtodos apropriados (por exemplo,
cromatografia lquida) salvo se a validao do mtodo
demonstrar uma apropriada eliminao destas substncias.
GRANEL FINAL
Na preparao do granel final podem ser misturadas vrias
colheitas purificadas. Pode ser adicionado um estabilizante e
outros excipientes.
S um granel final que satisfaz ao ensaio descrito a seguir
pode ser utilizado na preparao do lote final.
Esterilidade (2.6.1). Efectuado com 10 ml da preparao em
cada meio, o granel final satisfaz ao ensaio de esterilidade.
LOTE FINAL
S um lote final que satisfaz a cada um dos ensaios descritos
em Identificao, Ensaio e Doseamento pode ser
libertado.
Se foi efectuado no granel final o ensaio de sero-albumina
bovina, quando o soro de bovino utilizado para fabricar o
vector, este pode ser omitido no lote final.
IDENTIFICAO
Identifica-se o vector por um mtodo imunoqumico (2.7.1)
ou por tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21).
ENSAIO
Osmolalidade (2.2.35): dentro dos limites aprovados.
pH (2.2.3): dentro dos limites aprovados.
Volume extravel (2.9.17). A preparao satisfaz ao ensaio do
volume extravel.
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5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
Humidade residual (2.5.12): dentro dos limites aprovados
para a preparao liofilizada.
Sero-albumina bovina: no mximo, o limite aprovado para
a preparao, determinada por um mtodo imunoqumico
(2.7.1), se tiver sido utilizado soro bovino durante a
produo.
Esterilidade (2.6.1). A preparao satisfaz ao ensaio de
esterilidade.
Endotoxinas bacterianas (2.6.14): inferior ao limite
aprovado.
Estabilidade trmica. Mantenha as amostras do lote final
de vector a uma temperatura e por um perodo adaptados e
5. Textos gerais
autorizados para a preparao. Determine a concentrao
total em vector infeccioso aps aquecimento, como descrito
em Doseamento. Determine paralelamente a concentrao
em vector de uma amostra no aquecida. A diferena entre
a concentrao total do vector no aquecido e a do vector
aps aquecimento encontra-se nos limites aprovados para a
preparao.
DOSEAMENTO
Ttulo em vector infeccioso. Titule o contedo de, pelo
menos, 3 frascos da amostra, inoculando em culturas
celulares. Titule o contedo de um frasco de um vector
padro de referncia apropriado para validar cada titulao.
O ttulo em vector da amostra no inferior quantidade
mnima indicada no rtulo. A titulao s vlida se
o intervalo de confiana (P = 0,95) do logaritmo da
concentrao em vector for superior ao valor autorizado
pela Autoridade competente,
o ttulo infeccioso do padro de referncia estiver dentro do
limite definido no mapa de controlo.
Expresso do produto do inserto gentico. Sempre que seja
possvel, determina-se a expresso do(s) produto(s) do inserto
gentico, aps inoculao da preparao considerada em
cultura celular com uma multiplicidade de infeco pr-
-determinada, atravs de doseamentos imunoqumicos (2.7.1)
ou bioqumicos apropriados ou por citometria de fluxo (2.7.24).
Actividade biolgica. Salvo excepo justificada e autorizada,
determina-se a actividade biolgica atravs de um ensaio in
vitro ou in vivo.
ROTULAGEM
No rtulo indica-se:
o ttulo mnimo em vector por dose humana,
a dose humana recomendada,
nas preparaes liofilizadas:
o nome ou a composio e o volume de lquido a
adicionar para a reconstituio,
o prazo de validade aps reconstituio.
807
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5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
VECTORES PLASMDICOS PARA
USO HUMANO
Os vectores plasmdicos para uso humano so formas
circulares de ADN bacteriano com dupla cadeia albergando um
gene de interesse ou uma sequncia nucleotdica codificando
sequncias anti-sentido ou ribozimas e a sua cassete de
expresso; so amplificados nas bactrias com uma localizao
extra-cromossmica. Os vectores plasmdicos servem para
transferir material gentico para clulas humanas somticas
in vivo ou para modificar geneticamente as clulas
autlogas, alognicas, xenognicas ou bacterianas antes da
administrao ao homem. Os vectores plasmdicos podem
apresentar-se sob a forma de ADN livre ou serem formulados
com sistemas sintticos de transferncia como lpidos
(lipoplexos), polmeros (poliplexos) e/ou ligandos peptdicos
que facilitam a transferncia atravs da membrana celular e
5. Textos gerais
libertao na clula, ou que permitem uma libertao atravs
de receptores especficos.
Os plasmdeos formulados com sistemas sintticos de
transferncia no esto abrangidos por esta seco.
PRODUO
CONSTRUO DO PLASMDEO
Um vector plasmdico tpico constitudo
pela estrutura base do vector plasmdico que contm
numerosos locais de reconhecimento pelas endonucleases
de restrio para insero do inserto gentico e dos
elementos bacterianos necessrios para a produo do
plasmdeo como os marcadores genticos selectivos
para a identificao das clulas portadoras do vector
recombinante,
pelos elementos genticos reguladores necessrios para
facilitar a expresso do inserto gentico,
pelo inserto gentico,
por um sinal de poliadenilao.
A estirpe, os meios de isolamento e a sequncia nucleotdica
do inserto gentico, uma descrio completa do ADN
plasmdico incluindo a sua sequncia nucleotdica. So
declaradas as informaes relativas estirpe e funo
dos componentes do plasmdeo, como sejam a origem da
replicao, os promotores vricos e eucariotas e os genes
codificando os marcadores selectivos.
DISPOSIES GERAIS
Banco de clulas. A produo dos vectores plasmdicos
baseia-se num sistema de banco de clulas bacterianas
com gerao e caracterizao de um banco de clulas
primrio (BCP), de bancos de clulas de trabalho (BCT)
e de clulas destinadas produo (CFP), que satisfazem
seco Clulas bacterianas utilizadas para o fabrico de
vectores plasmdicos para uso humano, que figura no final
do captulo geral. As matrias-primas utilizadas durante o
fabrico, incluindo o estabelecimento dos bancos de clulas,
so qualificadas.
Tcnicas de seleco. Salvo excepo justificada e autorizada,
no se incluem no vector plasmdico os genes de resistncia
808
aos antibiticos utilizados como marcadores genticos
selectivos, em particular no caso dos antibiticos de utilidade
clnica. So preferveis outras tcnicas de seleco do
plasmdeo recombinante.
Padres de referncia. Caracteriza-se completamente um
lote apropriado de plasmdeo formulado que de preferncia
tenha sido objecto de avaliao clnica e conserva-se para
servir de padro de referncia, se necessrio, nos ensaios de
controlo de rotina.
MULTIPLICAO E COLHEITA
Transfere-se o ADN plasmdico para clulas bacterianas da
estirpe hospedeira e utiliza-se um clone nico de bactrias
transformadas para criar o BCP. O BCT deriva depois do BCP.
As CFP obtm-se a partir do BCT atravs de fermentao nas
condies de produo.
Isola-se o ADN plasmdico a partir das clulas colhidas,
atravs de uma etapa de extraco e purifica-se para obter o
produto a granel.
Salvo excepo justificada e autorizada, no so utilizados na
produo os gradientes de densidade cloreto de csio-
-brometo de etdio.
PLASMDEO PURIFICADO
Optimiza-se o mtodo de produo para suprimir de forma
reprodutvel as impurezas, preservando a actividade do
produto. As especificaes de controlo de uma determinada
impureza dependem do seguinte:
capacidade dos mtodos de fabrico e de purificao em
suprimir ou inactivar a impureza, demonstrada por uma
validao e utilizando mtodos especficos de quantificao,
potencial toxicidade associada impureza,
potencial diminuio da eficcia do produto do inserto
gentico associada impureza.
Se for utilizada para a seleco a resistncia selectiva a
antibiticos especficos, exigem-se dados de estudos de
validao dos mtodos de purificao utilizados para se
demonstrar a capacidade de eliminao dos antibiticos
residuais.
Efectuam-se controlos apropriados durante a produo,
como, por exemplo, o controlo da quantidade e da forma
do plasmdeo aps as etapas de extraco ou controlo da
quantidade em endotoxinas, aps as etapas de extraco, para
garantir que o mtodo est sob contnuo controlo.
S pode ser utilizado um lote de plasmdeo purificado que
satisfaz aos ensaios descritos a seguir.
Identidade e integridade do plasmdeo purificado. A identidade
e a integridade do plasmdeo purificado estabelecem-se por
mtodos apropriados como a sequenciao ou tcnicas de
amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21); a anlise por
digesto de restrio pode ser utilizada se for suficiente para
detectar eventuais modificaes crticas no plasmdeo e
confirmar a identidade do plasmdeo.
ADN plasmdico. A ttulo de exemplo fornecem-se as
seguintes indicaes:
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Determinam-se as concentraes em ADN inferiores a
500 ng/ml atravs da medio da absorvncia em 260 nm.
Uma soluo de ADN com cadeia dupla a 50 g/ml apresenta
uma absorvncia de 1 (absorvncia especfica de 200).
Determinam-se as concentraes em ADN inferiores a
500 ng/ml aps incubao com corantes fluorescentes que se
ligam de forma especfica ao ADN de dupla cadeia, utilizando
um padro de referncia para estabelecer uma curva de
calibrao.
A cromatografia lquida pode tambm ser utilizada para
determinar a concentrao em ADN plasmdico utilizando
um padro de referncia. Em alguns casos, a electroforese
capilar tambm aceitvel.
Formas do ADN. Utilizando mtodos analticos apropriados,
cujos exemplos se do a seguir, o ADN plasmdico caracteriza-
-se em termos de propores entre as formas super enroladas,
multimricas, monmeros distendidos e lineares. Podem
utilizar-se para a quantificao das formas super enroladas,
a cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC) por troca
aninica e a electroforese capilar. A electroforese capilar serve
tambm para a quantificao de outras formas.
ADN residual da clula hospedeira. Determina-se a
concentrao em ADN residual da clula hospedeira por
um mtodo apropriado, salvo se a validao do mtodo
demonstrar uma apropriada eliminao desta substncia.
Recomenda-se a tcnica quantitativa de amplificao
em cadeia pela polimerase (PCR) pela sua sensibilidade
e especificidade, mas outras tcnicas apropriadas podem
tambm ser utilizadas.
ARN residual. Determina-se a concentrao em ARN
residual, salvo se a validao do mtodo demonstrar uma
eliminao apropriada desta substncia. Se for necessrio
um limite de deteco mais baixo, pode ser utilizada a
cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC) em fase
inversa ou a tcnica quantitativa de amplificao em cadeia
pela polimerase (PCR) aps transcrio inversa (2.6.21).
Protenas residuais da clula hospedeira. Determina-se a
concentrao em protenas residuais da clula hospedeira
atravs de um doseamento normalizado das protenas (2.5.33),
por electroforese SDS-PAGE seguida de colorao com prata
ou por um doseamento imunolgico especfico como o ensaio
western blot ou ELISA, salvo se a validao do mtodo
demonstrar uma apropriada eliminao destas substncias.
Controlo microbiolgico. Consoante a preparao, satisfaz
ao ensaio de esterilidade (2.6.1) ou determina-se a carga
microbiana (2.6.12).
Endotoxinas bacterianas (2.6.14): inferior ao limite aprovado.
GRANEL FINAL
Na preparao do granel final podem ser misturadas vrias
colheitas purificadas. Pode ser adicionado um estabilizante e
outros excipientes. Filtra-se o produto formulado atravs de
um filtro antibacteriano.
S um granel final que satisfaz ao ensaio descrito a seguir
pode ser utilizado na preparao do lote final.
Esterilidade (2.6.1). Efectuado com 10 ml da preparao em
cada meio, o granel final satisfaz ao ensaio de esterilidade.
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5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano
IDENTIFICAO
Identifica-se o vector plasmdico atravs de uma anlise por
digesto de restrio por sequenciao. O ensaio de actividade
biolgica serve tambm para identificar o produto.
ENSAIO
Entre os ensaios efectuados no lote final figuram os
seguintes:
Aspecto.
pH (2.2.3): dentro dos limites aprovados.
Volume extravel (2.9.7). A preparao satisfaz ao ensaio do
5. Textos gerais
volume extravel.
Humidade residual (2.5.12): dentro dos limites aprovados
para a preparao liofilizada.
Formas de ADN. Determina-se a percentagem da forma
especfica monomrica super enrolada como descrito em
plasmdeo purificado.
Esterilidade (2.6.1). A preparao satisfaz ao ensaio de
esterilidade.
Endotoxinas bacterianas (2.6.14): inferior ao limite aprovado
para a preparao.
DOSEAMENTO
ADN plasmdico: no mnimo, a quantidade indicada no
rtulo, determinado, por exemplo, por um dos seguintes
mtodos:
Determinam-se as concentraes em ADN inferiores a
500 ng/ml atravs da medio da absorvncia em 260 nm.
Uma soluo de ADN com cadeia dupla a 50 g/ml apresenta
uma absorvncia de 1 (absorvncia especfica de 200).
Determinam-se as concentraes em ADN inferiores a
500 ng/ml ps incubao com corantes fluorescentes que se
ligam de forma especfica ao ADN de dupla cadeia utilizando
um padro de referncia para estabelecer uma curva de
calibrao.
A cromatografia lquida pode tambm ser utilizada para
determinar a concentrao em ADN plasmdico utilizando
um padro de referncia. Em alguns casos, a electroforese
capilar tambm aceitvel.
Actividade biolgica. Avalia-se, sempre que possvel, a
actividade biolgica atravs de doseamentos biolgicos in
vitro ou in vivo. necessrio como testemunha positiva
para o doseamento, um padro de referncia representativo
bem definido. Os doseamentos biolgicos utilizados para medir
a actividade dos vectores plasmdicos geralmente implicam a
transfeco in vitro de uma pertinente linha celular, seguida
de algumas medies funcionais do inserto gentico expresso.
Estes doseamentos funcionais do mais informaes da
actividade do produto codificado pelo inserto gentico do que
do nvel de expresso do prprio inserto gentico.
809
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5.14. Medicamentos de terapia gentica para uso humano

Para avaliar a integridade e a quantidade do produto expresso, IDENTIDADE E PUREZA

pode ser necessrio completar o doseamento biolgico com
doseamentos atravs de western blot e ELISA. Viabilidade. Determina-se o nmero de clulas viveis
atravs de sementeira em meio apropriado de uma parte
alquota diluda da cultura bacteriana e depois contagem
ROTULAGEM
das colnias.
No rtulo indica-se:
Caracterizao bioqumica e fisiolgica da estirpe bacteriana.
a concentrao em ADN plasmdico, Consoante a estirpe bacteriana utilizada na produo, efectua-
a dose humana recomendada, -se uma caracterizao bioqumica e fisiolgica da estirpe para
confirmar a identidade das clulas ao nvel da espcie.
nas preparaes liofilizadas:
o nome ou a composio e o volume de lquido a Genotipagem/fenotipagem. Pela determinao dos
adicionar para a reconstituio, marcadores fenotpicos especficos adequados ou atravs de
o prazo de validade aps reconstituio. uma anlise gentica apropriada, verifica-se o genotipo das
clulas bacterianas.
5. Textos gerais

CLULAS BACTERIANAS UTILIZADAS Presena do plasmdeo.

NA PRODUO DE VECTORES Sequenciao. Verifica-se integralmente a sequncia
PLASMDICOS PARA USO HUMANO nucleotdica do plasmdeo.

A produo dos vectores plasmdicos para uso humano Nmero de cpias. A partir de um nmero conhecido de
baseia-se na utilizao de um sistema de banco de clulas clulas bacterianas, isola-se e purifica-se o ADN plasmdico e
bacterianas, com gerao e caracterizao de um banco de determina-se o nmero de cpias por um mtodo apropriado
clulas primrio (BCP), de bancos de clulas de trabalho
como a tcnica quantitativa de amplificao em cadeia pela
(BCT) e de clulas destinadas produo (CFP). Um banco
polimerase (PCR).
de clulas bacterianas destinadas produo de vectores
plasmdicos composto por um conjunto de frascos contendo Mapa de restrio. Efectua-se uma fragmentao com uma
clulas bacterianas com composio uniforme, conservadas endonuclease de restrio, com uma resoluo suficiente
em condies definidas e obtidas de uma mistura de clulas para permitir verificar a ausncia de alterao da estrutura
provenientes de um nico clone de uma estirpe hospedeira plasmdica nas clulas bacterianas.
transformada. O BCP dispe de uma histria conhecida e
documentada; de preferncia so provenientes de estirpe Percentagem de clulas mantendo o plasmdeo. Elementos
depositada e qualificada. Produz-se o BCT por subcultura de bacterianos integrados no plasmdeo, por exemplo
um ou de vrios frascos que constituem o BCP. Os mtodos e marcadores genticos seleccionveis, utilizam-se para
reagentes utilizados para estabelecer o banco e as condies determinar a percentagem de bactrias que retm o
de conservao so documentados. plasmdeo.
Os BCP e BCT so qualificados atravs de ensaios efectuados
numa parte alquota do material contido no banco ou numa AGENTES ESTRANHOS E VRUS ENDGENOS
subcultura do banco de clulas.
O quadro seguinte indica os ensaios a efectuar em cada etapa Pureza por sementeira em placa. Efectua-se a deteco de
da produo. potenciais contaminantes bacterianos atravs de cultura
das clulas bacterianas em meios apropriados e incubao
Ensaio
Estirpe
BCP BCT CFP* nas condies requeridas. Verifica-se a ausncia de inibio
hospedeira
de crescimento dos microrganismos contaminantes atravs
Identidade e pureza de ensaios complementares efectuados em presena
Viabilidade + + + + de uma quantidade definida de bactrias de referncia
Catacterizao da estirpe bacteriana + + - + apropriada (testemunhas positivas). Examina-se um
Genotipagem/Fenotipagem + + - +
nmero apropriado de colnias; no se detecta qualquer
Presena do plasmdeo
contaminao.
Sequncia do ADN plasmdico - + - +
Nmero de cpias - + + +
Mapa de restrio - + + + Presena de bacterifagos. Pesquisa-se a presena de
Percentagem de clulas que bacterifagos atravs da sementeira e incubao das
retiveram o plasmdeo - + + + clulas bacterianas em meio que permita a proliferao
Agentes estranhos
de bacterifagos. Valida-se o ensaio com uma estirpe
Pureza por sementeira em placa + + + + de bacterifagos de referncia e de clulas sensveis
Presena de bacterifagos + + - + (testemunhas positivas). Examina-se um nmero apropriado
de colnias; no se detecta qualquer contaminao.
* Os CFP so culturas no nvel de passagem, pelo menos equivalente ao
utilizado na produo. Os controlos so efectuados uma vez para validar
cada novo BCT salvo para a pureza que controlada em cada fermentao.

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