Establecimiento de cultivos de clulas mixtas primarias a partir de tumores mamarios

caninos espontneos: Caracterizacin de molculas clsicas y nuevas asociadas al

cncer

Resumen
Hay muchos factores que hacen cncer canino como el cncer en los seres humanos. Entre
estos factores figuran la aparicin de tumores mamarios espontneos en perros de
compaa, gentica tumoral, objetivos moleculares y exposicin a los mismos factores de
riesgo ambientales. Por lo tanto, el estudio del cncer canino puede proporcionar
informacin til al campo de la oncologa. Este estudio tuvo como objetivo establecer y
caracterizar un panel de cultivos de clulas mixtas primarias obtenidos a partir de tumores
mamarios caninos espontneos. Se analizaron ocho cultivos celulares establecidos
obtenidos de una glndula mamaria normal, un adenoma complejo, un adenoma mixto, dos
carcinomas complejos y dos carcinomas mixtos. Se evaluaron los niveles de expresin
gnica de los actores clsicos del cncer molecular, como el receptor del factor de
crecimiento de fibroblastos (FGFR) 2, el cncer de mama (BRCA) 1, BRCA2 y el receptor
de estrgenos (ESR) 1. Por primera vez, se estudiaron tres receptores nucleares hurfanos,
receptores relacionados con los estrgenos (ERR) , y en el cncer mamario canino. El
mayor nivel de expresin de ERR se observ en el complejo de clulas derivadas de
carcinoma de cultivo, mientras que los ms altos niveles de ERR y se observaron en las
clulas derivadas de un carcinoma mixto. Mientras tanto, los carcinomas complejos
presentaron los niveles ms altos de expresin de ESR1, BRCA1 y FGFR2 entre todas las
muestras. Se encontr BRCA2 exclusivamente en adenomas complejos. El factor de
transcripcin GATA3 tuvo sus niveles ms altos en muestras de carcinoma mixto y sus
niveles ms bajos en el adenoma complejo. Tambin se realizaron ensayos de proliferacin
para evaluar la respuesta de cultivos celulares mixtos a ligandos ER, genistena y DES,
tanto en normoxia como en condiciones hipxicas. Nuestros resultados demuestran que los
estudios morfolgicos y funcionales de los cultivos de clulas mixtas primarias derivadas
de tumores mamarios caninos espontneos son posibles y proporcionan valiosa herramienta
para el estudio de diversas etapas del desarrollo del cncer mamario.

Introduccin
La disponibilidad de modelos animales preclnicos para el cncer de mama humano
representa un desafo relevante en la investigacin de este tipo de neoplasia. Los modelos
in vivo con ratones transgnicos o ratones portadores de tumores con lneas celulares
neoplsicas humanas, aunque son ampliamente utilizados, han fracasado en la reproduccin
de algunos aspectos del cncer de mama humano tales como la heterogeneidad, el
microambiente tumoral y el crecimiento dependiente de hormonas esteroideas. Ms all de
la distancia evolutiva entre humanos y ratones, pueden originarse diferencias adicionales a
partir de modificaciones genticas inducidas, como en ratones transgnicos, o de la
presencia modificada de componentes de tejido adyacente normal, como en el caso de
trasplantes de tumores en ratones. Por lo tanto, la limitacin de los modelos de ratones para
el campo de la oncologa es un obstculo a superar.
Una alternativa para este problema se basa en el hecho de que los cnceres de origen
natural en perros y seres humanos comparten muchas caractersticas, incluyendo el aspecto
histolgico, la gentica del tumor, los objetivos moleculares, el comportamiento biolgico y
la respuesta a las terapias convencionales. El estudio de perros con cncer es probable que
proporcione una perspectiva valiosa que es distinta de la generada por el estudio de los
cnceres de roedores solo. Para muchas familias de genes, particularmente los asociados
con el cncer, las similitudes entre las secuencias de genes de perro y el hombre son ms
estrechas que las de los ratones. En los carcinomas mamarios, la expresin modificada de
los genes ERBB2 y TP53 fue similar en las dos especies, lo que sugiere funciones similares
en la carcinognesis. Adems, los anlisis histolgicos comparativos indican que la
heterogeneidad intratumoral observada en tumores mamarios humanos tambin ocurre en
tumores caninos.
Las consecuencias naturales de esta heterogeneidad son algunos aspectos de los pronsticos
desfavorables en el cncer, como la resistencia adquirida a la terapia, la recurrencia y la
metstasis. En contraste con los ratones generados en el laboratorio, los perros comparten el
medio ambiente con seres humanos y estn expuestos a algunos de los mismos
carcingenos. Adems, al igual que en seres humanos, el tratamiento con progesterona,
edad avanzada, obesidad y dieta, tambin representan factores de riesgo para el desarrollo
de cncer de mama en perros.
Varios estudios se han centrado en nuevas vas de sealizacin, mediadas por los receptores
relacionados con los estrgenos (ERR) en el desarrollo de cncer de mama. Los ERR son
receptores constitutivamente activos que comparten un alto grado de homologa con los
receptores estrognicos clsicos (ERs). Sin embargo, no se unen al estrgeno, mientras que
las ER lo hacen. ERRs estn involucrados en el desarrollo de vas alternativas que
conducen al desarrollo de cncer y se consideran como potenciales dianas teraputicas para
el tratamiento del cncer de mama que no responden a las terapias convencionales. La
familia ERR est compuesta por tres miembros, ERR (o NR3B1), ERR (o NR3B2) y
ERR (o NR3C3). Los ERR son receptores nucleares hurfanos sin identificar ningn
ligando natural. Sin embargo, la estructura cristalogrfica de ER con su ligando natural
indic que muchos residuos de aminocidos cruciales para el reconocimiento de estradiol se
conservan entre los miembros de las familias de ERs y ERRs, lo que sugiere que algunos
ligandos de ER y ERR podran estar estructuralmente relacionados. Recientemente, se han
estudiado las funciones de los ERR en los carcinomas mamarios y endometriales humanos,
cncer de ovario y cncer de prstata, incluyendo lneas celulares y tejidos.
Los genes BRCA1 y BRCA2 codifican protenas ubicadas en el ncleo celular y
desempean un papel esencial en el mantenimiento estructural y la estabilidad numrica de
los cromosomas durante la divisin celular. La inestabilidad cromosmica iniciada por la
inactivacin de los genes BRCA es la principal causa de carcinognesis en la glndula
mamaria debido a su participacin en la reparacin del ADN y la regulacin de la
citocinesis. Considerados genes supresores de tumores, la inactivacin de BRCA1 y
BRCA2 despus de la prdida de heterocigosidad confiere un riesgo de 56 a 87% del
desarrollo de cncer de mama en mujeres y las mutaciones somticas de BRCA2 se asocian
con metstasis agresiva en ganglios linfticos en humanos.
GATA-3 es un factor de transcripcin que orquesta el perfil de expresin gnica de varios
tejidos durante la embriognesis. Particularmente en el tejido mamario, este gen es
responsable de la diferenciacin de las clulas luminales en las glndulas mamarias.
Considerado un posible gen supresor de tumores, GATA-3 parece controlar la
diferenciacin y la proliferacin de las clulas cancerosas mamarias, ya que la mayora de
los tumores de mama humanos se originan en clulas luminal epiteliales. Los estudios
experimentales con ratones demuestran que la prdida de expresin de GATA-3 est
asociada con tumores de alto grado histolgico, ganglios linfticos positivos, ausencia de
receptores de estrgeno y progesterona con sobreexpresin de HER2. Por otro lado, su
presencia es suficiente para inducir la diferenciacin tumoral y evitar la diseminacin del
cncer de mama, caracterizando este marcador como un fuerte factor predictivo e
independiente del resultado clnico en este tipo de cncer.
El objetivo del presente estudio fue caracterizar la expresin de molculas relacionadas con
la progresin del cncer en cultivos de clulas mixtas primarias obtenidas de tumores
mamarios caninos espontneos. Los tumores se clasificaron de acuerdo con los criterios
propuestos anteriormente. En resumen, los tumores se dividieron en dos categoras
histolgicas, adenomas y carcinomas, con subtipos denominados simples, complejos o
mixtos. Los adenomas muestran lesiones nodulares no filtrantes bien delimitadas mientras
que los carcinomas muestran proliferacin maligna epitelial. Las diferencias entre los
subtipos son la presencia de proliferacin benigna de clulas mioepiteliales (tumores
complejos) y / o presencia de cartlago y / o hueso y / o tejido adiposo, posiblemente en
combinacin con tejido fibroso (tumores mixtos). El mtodo de aislamiento utilizado en
este estudio permiti la separacin de los fibroblastos del componente epitelial /
mioepitelial de los tejidos mamarios, responsable del origen de los adenomas y los
carcinomas. Por lo tanto, cada cultivo celular primario representa un tipo histolgico
diferente y, como consecuencia, su respectiva complejidad ambiental, preservando las
interacciones entre las clulas epiteliales y mioepiteliales.

AQU VA METODOLOGIA. NO OLVIDE TRADUCIRLO

Resultados
Las clulas primarias de los tumores mamarios y el tejido mamario normal se aislaron
mediante tripsinizacin diferencial (Fig. 1). Los cultivos celulares resultantes fueron
compuestos por clulas con morfologa variada, que incluyen poblacin de clulas
primarias mixtas (organoides), clulas epiteliales y mesenquimales (Fig. 2). Todos los
experimentos se realizaron en el componente adherente de los cultivos celulares mixtos
primarios despus de haber sido sometidos tres veces a la tripsinizacin diferencial como se
inform en el apartado Aislamiento de cultivos de clulas mixtas primarias de lesiones
mamarias espontneas en la seccin de caninos.
La evaluacin del ciclo celular ha revelado perfiles de proliferacin muy similares para los
carcinomas mixtos con aproximadamente el 80% de las clulas en la fase G1 y el 10% de
las clulas en la fase sub G1; para los carcinomas complejos con casi el 80% de las clulas
en G1 y el 10% de las clulas en la fase S. En paralelo, el adenoma mixto y el carcinoma
simple presentaron similitud con el 75% de las clulas en la fase G1 y el 14% de las clulas
en la fase S, mientras que el adenoma complejo tuvo el 89% de las clulas en la fase G1 y
el 5% de las clulas en la fase S Fig. 3).

Fragmentos de tejido mamario

Colagenasa IV + Hialuronidasa + Tripsina

Tumor mamario
Cultivos primarios mixtos
(clulas epiteliales y mesenquimales)

Tripsinizacin diferencial

Clulas estromales Clulas epiteliales

< 10 minutos 10-15 minutos

Fig. 1. Esquema del mtodo de cultivo. Ilustracin esquemtica del mtodo de obtencin de
cultivo mixto a partir del tumor grueso que contiene todos los tipos celulares presentes en el
tejido mamario y una mayor purificacin con tripsinizacin diferencial.
Se evaluaron los niveles de expresin de un marcador para una mucina asociada a la
superficie celular epitelial (MUC1) y de un marcador de msculo liso especfico de las
clulas mioepiteliales, la cadena pesada de miosina 11 (MYH11) para analizar el fenotipo
de cultivos de clulas mixtas primarias. El marcador epitelial MUC1 tuvo sus niveles ms
altos en carcinoma simple y complejo 1, mientras que el marcador de msculo liso,
MYH11, present los niveles de expresin ms altos en adenoma mixto, carcinoma
complejo 2 y carcinoma mixto 1 (Fig. 4A y 4B). Es interesante observar que todos los
cultivos celulares presentaron clulas epiteliales y mioepiteliales con diferentes
proporciones. En orden descendente, el nivel de expresin de las transcripciones MUC1 fue
el carcinoma complejo 1, el carcinoma simple y el carcinoma mixto 2. En orden
descendente, el nivel de expresin del ARNm de MYH11 fue adenoma mixto, carcinoma
mixto 1, carcinoma complejo 2 y epitelio mamario normal (Fig. 4A y 4B). El anlisis de la
relacin entre los marcadores epiteliales y mioepiteliales en todas las muestras indic una
correlacin inversa entre los marcadores epiteliales y mioepiteliales en el epitelio mamario
normal: mayor expresin de las transcripciones de MYH11 en MAd; mayor expresin de
transcritos MUC1 en SCa; mayor expresin de transcritos MUC1 en CCa1; cantidad
equilibrada de marcadores epiteliales y mioepiteliales en CCa2 y MCa1, y mayor expresin
de transcritos MUC1 en MCa2. Estos resultados muestran que los carcinomas complejos y
mixtos tienen diferentes ratios dentro del mismo subtipo tumoral, lo que aumenta la
posibilidad de que la prevalencia de un tipo de clula en el otro pueda interferir en el
comportamiento de esos cultivos de clulas mixtas primarias.
El anlisis de la expresin gnica en todas las lneas celulares aisladas de los siete tumores
mamarios revel el mayor nivel de expresin del receptor nuclear ERR en la muestra del
complejo carcinoma 1 (CCa1), mientras que en el resto de las lneas celulares los niveles
fueron ms bajos que en el epitelio mamario, con los niveles ms bajos en esas clulas
obtenidas de los adenomas y el carcinoma simple (Fig. 5A). En cuanto a los niveles de
expresin para ERR y , los resultados mostraron perfiles similares entre las lneas
celulares. Ambos receptores nucleares se expresaron altamente en el mismo carcinoma
mixto (MCa1). Sin embargo, los niveles de transcripcin para ERR fueron ms altos en
carcinomas complejos en comparacin con ERR. Curiosamente, los niveles de
transcripcin para ERR fueron los ms altos entre los ERR en todos los tejidos analizados
(Fig. 5A 5C). En cuanto a los niveles de expresin de ER, los carcinomas complejos
presentaron los niveles ms altos entre las muestras tumorales, mientras que todos los
tumores revelaron una expresin ms baja que la encontrada en la muestra del epitelio
mamario (Fig. 5D).
Fig. 2. Morfologa de cultivos de clulas mixtas primarias. A-C. Cultivo primario mixto
(organoide) derivado de carcinoma mixto, aumento de 100x. D-E. Clulas epiteliales
derivadas por tripsinizacin diferencial de adenoma, cultivadas en MEM avanzado
complementado con suplemento de crecimiento epitelial mamario (MEGS), aumento de
100x. F. Clulas mesenquimales (fibroblastos) derivadas por tripsinizacin diferencial de
carcinoma mixto, cultivadas en MEM avanzado suplementado con FBS al 10%, aumento
de 200x. G-I. Organoide derivado del tejido mamario normal por disociacin enzimtica
con colagenasa y hialuronidasa IV, aumento de 100x.
Los niveles de expresin ms altos de BRCA1 y 2 se verificaron en las muestras de
carcinomas complejos y en el adenoma complejo exclusivamente para BRCA2 (Fig. 6). El
factor de transcripcin GATA3 tuvo sus niveles ms altos en muestras de carcinoma mixto
y sus niveles ms bajos en adenoma complejo (Fig. 6C). Los niveles de expresin de
transcripcin para FGFR2 mostraron los valores ms altos para las muestras de carcinoma
complejo (Fig. 6D).
De acuerdo con los resultados obtenidos del anlisis de proliferacin de cuatro cultivos de
clulas mixtas primarias, en clulas derivadas del tejido mamario normal, hubo un aumento
observado de la proliferacin celular con los tres tratamientos (DES, genistena y genistena
ms DES) en condiciones basales de normoxia. El tratamiento con genistena indujo los
niveles ms elevados de proliferacin (40%) y cuando se agrega DES a este tratamiento, los
niveles proliferativos disminuyeron a 30%. Adems, el tratamiento con el cloruro de
cobalto inductor de hipoxia qumica (CoCl2) aument la proliferacin de clulas mamarias
normales mientras que el tratamiento con DES inhibi parcialmente esta proliferacin y el
tratamiento con genistena potenci el efecto de inhibicin del DES (Fig. 7A, Fig. S3).
 Porcentaje %

Tipos histolgicos

Adenoma complejo (CAd)

Adenoma mixto (MAd)
Carcinoma simple (SCa)

Carcinoma complejo 1 (CCa1)

Carcinoma complejo 2 (CCa2)

Carcinoma mixto 1 (MCa1)

Carcinoma mixto 2 (MCa2)

Fig. 3. Anlisis del ciclo celular para clulas derivadas de lesiones de la glndula mamaria
canina. fases del ciclo celular sub G1, G1, S y G2 / M y sub G1 estn representados. La
siguiente tabla muestra valores que indican el porcentaje de la poblacin celular para cada
fase del ciclo celular. Adenoma complejo (CAd), Adenoma mixto (MAd), Carcinoma
simple (SCa), Carcinoma complejo 1 (CCa1), Carcinoma complejo 2 (CCa2), Carcinoma
mixto 1 (MCa1), Carcinoma mixto 2 (MCa2).
Nivel de expresin de MUC1

Nivel de expresin de MYH11

Fig. 4. Nivel de expresin de mRNA en cultivos de clulas mixtas primarias obtenidas de
muestras de tumores de tejidos. A. MYH11 donde * P <0.05 versus NME, ** P <0.05
versus CAd, *** P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus SCa, ++ P <0.05 versus CCa1,
+++ P <0.05 versus CCa2, ++++ P <0.05 versus MCa1. B. MUC1 donde * P <0.05 versus
NME, ** P <0.05 versus CAd, *** P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus SCa, ++ P <0.05
versus CCa1, +++ P <0.05 versus CCa2, ++++ P <0.05 versus MCa1. Epitelio mamario
normal (NME), Adenoma complejo (CAd), Adenoma mixto (MAd), Carcinoma simple
(SCa), Carcinoma complejo 1 (CCa1), Complejo arcinoma 2 (CCa2), Carcinoma mixto 1
(MCa1), Carcinoma mixto 2 ( MCa2).
Nivel de expresin de ERRbeta
Nivel de expresin de ERRalfa
Nivel de expresin de ERRgama

Nivel de expresin de ERRalfa

Fig. 5. Nivel de expresin de ARNm en cultivos de clulas mixtas primarias obtenidas de
muestras de tumores de tejidos. A. ERR donde * P <0.05 frente a CAd, ** P <0.05 frente
a MAd, *** P <0.05 frente a SCa, + P <0.05 frente a CCa1, ++ P <0.05 frente a MCa2. B.
ERR donde * P <0.05 frente a CAd, ** P <0.05 frente a MAd, *** P <0.05 frente a SCa, +
P <0.05 frente a CCa1, ++ P <0.05 frente a CCa2, +++ P <0.05 frente a MCa1, ++++ P
<0.05 versus MCa2. C. ERR donde * P <0.05 frente a CAd, ** P <0.05 frente a MAd, ***
P <0.05 frente a SCa, + P <0.05 frente a CCa1, ++ P <0.05 frente a CCa2, +++ P <0.05
frente a MCa1, ++++ P <0.05 versus MCa2. D. ER donde * P <0.05 versus NME, ** P
<0.05 versus CAd, *** P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus SCa, ++ P <0.05 versus
CCa1, +++ P <0.05 versus CCa2.Normal Mamaria epitelio (NME), adenoma Complejo
(CAD), adenoma mixto (MAD), carcinoma simple (ACS), carcinoma complejo 1 (CCA1),
carcinoma Complejo 2 (CCA2), carcinoma mezclada 1 (MCA1), carcinoma mixto 2
(MCa2).
Con respecto a la proliferacin de clulas derivadas de la muestra de carcinoma simple, los
datos mostraron que las clulas obtenidas de carcinoma simple tenan una tasa de
proliferacin 30 veces mayor que las clulas normales y, bajo condiciones normxicas, el
tratamiento con DES inhibi esta proliferacin mientras no hubo efecto de genistena en
este parmetro. Adems, en condiciones hipxicas, hubo una disminucin en la
proliferacin de estas clulas en ausencia o presencia de moduladores farmacolgicos (Fig.
7B, S4 Fig.). Los dos complejos de muestras de carcinoma demostraron ser algo similares
en su comportamiento, proliferando ms que las clulas normales. En el cultivo celular
derivado del carcinoma complejo 1, hubo una disminucin en la proliferacin basal con el
tratamiento con DES. Curiosamente, cuando esas clulas se trataron con DES y genistena,
se bloque el efecto inhibidor de DES sobre la proliferacin. La disminucin de la
proliferacin celular se observ en condiciones hipxicas, pero ninguno de los tratamientos
indujo un cambio en la tasa proliferativa en esas condiciones (Fig. 7C, Fig. S5). El
comportamiento de las clulas derivadas de la muestra de carcinoma complejo 2 (CCa2)
fue similar al descrito anteriormente con la diferencia de que, adems del tratamiento con
DES, DES y el tratamiento con genistena tambin inhiban la proliferacin celular que no
mostraba efecto de genistena sobre la proliferacin celular en presencia de DES (Fig. 7D,
Fig. S6).
 Nivel de expresin de BRCA2
Nivel de expresin de BRCA1
Nivel de expresin de GATA3

Nivel de expresin de FGFR2

Fig. 6. Nivel de expresin de ARNm en cultivos de clulas mixtas primarias obtenidas de

muestras de tumores de tejidos. A. BRCA1 donde * P <0.05 versus NME, ** P <0.05
versus CAd, *** P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus SCa, ++ P <0.05 versus CCa1,
+++ P <0,05 frente a CCa2. B. BRCA2 donde * P <0.05 versus NME, ** P <0.05 versus
CAd, *** P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus SCa, ++ P <0.05 versus CCa1, +++ P
<0.05 versus CCa2. C. GATA3 donde * P <0.05 versus NME, ** P <0.05 versus CAd, ***
P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus SCa, ++ P <0.05 versus CCa2. D. FGFR2 donde * P
<0.05 versus NME, ** P <0.05 versus CAd, *** P <0.05 versus MAd, + P <0.05 versus
SCa, ++ P <0.05 versus CCa1. Normal Mamaria epitelio (NME), adenoma Complejo
(CAD), adenoma mixto (MAD), carcinoma simple (ACS), carcinoma complejo 1 (CCA1),
carcinoma Complejo 2 (CCA2), carcinoma mezclada 1 (MCA1), carcinoma mixto 2
(MCa2).

Discusin
En los estudios de medicina veterinaria, la descripcin de los roles de ERR est restringida
hasta ahora al desarrollo de la glndula mamaria en el ganado donde la expresin de ER,
PR, ERR y ERR se evalu mediante qPCR e inmunohistoqumica en terneros y vacas en
varias etapas de lactancia y reproduccin. Se observaron niveles elevados de ERR, ER y
PR en todas las etapas fisiolgicas de la glndula mamaria en el ganado bovino, en
contraste con niveles muy bajos de expresin de ERR, lo que sugiere una regulacin
comn de los tres principales receptores nucleares en la fisiologa de la glndula mamaria.
Con respecto a las patologas de las glndulas mamarias caninas, como las neoplasias, no
 existen registros cientficos que aclaren el papel de los ERR en esta especie. Por esta razn,
la discusin se realiz comparando los hallazgos en pacientes humanos con cncer de
mama, as como en estudios experimentales, con los resultados actuales en perros hembras.
El adenoma se considera una neoplasia benigna de clulas epiteliales mioepiteliales o bien
diferenciadas, mientras que los carcinomas se consideran neoplasmas malignos y se
clasifican en varios tipos, incluidos el carcinoma simple, el carcinoma complejo y el
carcinoma mixto. Los carcinomas simples presentan solo proliferacin maligna de clulas
epiteliales, mientras que los carcinomas complejos presentes, adems de la proliferacin
maligna de clulas epiteliales, presentan proliferacin benigna de clulas mioepiteliales.
Finalmente, los carcinomas mixtos muestran proliferacin maligna de clulas epiteliales,
con proliferacin benigna de clulas mioepiteliales y presencia de metaplasia sea y / o de
cartlago.

Proliferacin %
Proliferacin %
Proliferacin %

Proliferacin %

Control Control
CoCl2 300M CoCl2 300M
DES 10M DES 10M
Genistena 0.1M Genistena 0.1M

Fig. 7. Ensayos de proliferacin en cultivos celulares mixtos primarios. El DES y el efecto

del tratamiento con genistena sobre la proliferacin basal y proliferacin en presencia de
clulas CoCl2 derivadas de NME (A), SCa (B), CCa1 (C) y CCa2 (D). La proliferacin se
evalu 48 horas despus de los tratamientos. Los grficos representan un experimento
independiente con la media y la desviacin estndar de triplicados. A. * P <0.05 versus
control, ** P <0.05 versus CoCl2, *** P <0.05 versus DES 10M, + P <0.05 versus
genistena 0.1M, ++ P <0.05 versus genistena + CoCl2. B. * P <0.05 versus control. C. *
P <0.05 versus control, ** P <0.05 versus DES 10M. D. * P <0.05 versus control, ** P
<0.05 versus DES 10M. Epitelio Mamario Normal (NME), Carcinoma Simple (SCa),
Carcinoma Complejo 1 (CCa1), Carcinoma Complejo 2 (CCa2).
El anlisis de expresin gnica de ERR en ocho cultivos de clulas obtenidos a partir de
un tejido normal de mama, usado como control, y siete tumores mamarios revelaron el
nivel de expresin ms alto de este receptor nuclear en una muestra de carcinoma complejo
(CCA1). Los niveles ms bajos de transcripcin de ERR, mientras tanto, se observaron en
adenoma y carcinoma simple. En cuanto a los niveles de expresin para ERR y , los
resultados han mostrado perfiles similares entre las lneas celulares. Ambos receptores
nucleares se expresaron altamente en el mismo carcinoma mixto (MCa1). Sin embargo, los
niveles de transcripcin de ERR fueron ms altos en carcinomas complejos en
comparacin con ERR. Curiosamente, los niveles de transcripcin para ERR fueron los
ms altos entre los ERRs en todos los tejidos analizados.
La importancia de las ERR en el cncer de mama humano se ha estudiado comparando sus perfiles
de ARNm con los signos patolgicos clnicamente establecidos, los perfiles de ARNm de ER y los
miembros de la familia ErbB. Los niveles de mRNA de ERalpha, ERbeta, receptor del factor de
crecimiento epidrmico, ErbB2, ErbB3, ErbB4, ERR, ERR y ERR se determinaron en tumores
de mama primarios no seleccionados y clulas epiteliales mamarias normales enriquecidas con
mamoplastias de reduccin. ERR mostr potencial como biomarcador de resultados clnicos
desfavorables y, posiblemente, insensibilidad hormonal. El aumento de los niveles de ERR se
asoci con ER-negativo y PgR-estado del tumor negativo. Los niveles de ERR tambin se
correlacionaron con la expresin de ErbB2, un indicador del comportamiento agresivo del tumor. A
diferencia de ERR, ERR mostr potencial como biomarcador de curso clnico favorable y,
posiblemente, sensibilidad hormonal. ERR se sobre expres en el 75% de los tumores.
La sobreexpresin de ERR se asoci con el estado reactivo hormonalmente ER- y PgR positivo.
Adems, la expresin de ERR se correlacion con los niveles de ErbB4, un indicador probable del
curso clnico preferido y se asoci con tumores tipogrficos diploides. Por lo tanto, el estado de
ERR y ERR puede ser predictivo de sensibilidad a la terapia de bloqueo hormonal, y el estado de
ERR tambin puede ser predictivo de la terapia basada en ErbB2 como herceptin. El papel de
ERR en los cnceres de mama invasivos humanos obtenidos mediante mastectoma radical se bas
en el anlisis inmunohistoqumico. Se detect inmunoreactividad nuclear de ERR en el 79% de los
casos y se correlacion con el estado de los ganglios linfticos. No se observaron asociaciones
significativas con otras caractersticas clinicopatolgicas, incluidos los niveles de expresin de los
receptores de estrgeno y progesterona. Por lo tanto, considerando la clasificacin histopatolgica,
los resultados de este estudio indican que se encuentran niveles ms elevados de expresin de ERR
en muestras de carcinomas, mientras que el nivel de expresin fue el ms bajo en aquellas clulas
obtenidas de adenomas complejos y mixtos, lo que corrobora las estipulaciones de la literatura que
indica este receptor como un marcador relacionado con neoplasias de mal pronstico, como los
carcinomas.
Con respecto a los niveles de expresin de ERR y mRNA , los resultados han mostrado un perfil
similar para los receptores en los cultivos de clulas mixtas primarias obtenidos a partir de
carcinomas mixtos (MCa1 e MCa2). Aunque los niveles de transcripcin para ERR fueron
mayores en comparacin con ERR, ambos receptores nucleares muestran el mismo patrn de
expresin en los dos carcinomas mixtos. El papel de ERR en el cncer de mama es controvertido.
Un estudio demostr ERR inducida resistencia al tamoxifeno (TAM) en ER + modelos de cncer
de mama, y que la actividad transcripcional de este receptor se modifica mediante la activacin de
la ruta ERK / MAPK. El mismo grupo de investigacin tambin determin si los genes diana de
ERR se asociaron con una supervivencia libre de metstasis a distancia reducida (DMFS) en el
cncer de mama ER + tratado con TAM. Los datos indicaron que la sealizacin ERR se asoci
con DMFS pobres en ER +, cncer de mama tratado con TAM, lo que sugiere hiperactividad o
sobreexpresin de ERR induce un programa transcripcional a favor de la supervivencia que
perjudica la capacidad de TAM para inhibir el crecimiento del cncer de mama ER +. Por otro lado,
ERR se ha implicado en la activacin de la expresin de un programa gentico caracterstico de
mesenquimal a transicin epitelial (MET) con induccin de E-cadherina y supresin del crecimiento
del cncer, confiriendo un papel protector para este receptor nuclear contra la invasividad del
cncer. Los datos obtenidos en este estudio parecen indicar que no hay correlacin entre ERR y
ER, con bajos niveles de expresin para ER y altos niveles de expresin para ERR en todos los
cultivos de clulas mixtas estudiados.
La sobreexpresin de ERR en pacientes con cncer de mama se correlaciona con un mejor
pronstico y una mayor supervivencia libre de recadas, y el nivel de ARNm de ERR se
correlaciona inversamente con la fraccin de fase S de las clulas de pacientes con cncer de mama.
ERR tambin acta como una posible molcula supresora de tumores en el cncer de mama y de
prstata. La cascada de eventos de sealizacin de ERR puede conducir a un bloqueo de la
transicin G1 / S e inhibicin de la transicin epitelial a mesenquimatosa (EMT) a travs de la
regulacin de la cadherina E. En cuanto a la correlacin inversa entre la fase S y el nivel de
expresin de ERR, los resultados confirman los datos en la literatura con cultivos celulares mixtos
obtenidos de carcinomas mixtos que presentan los niveles de expresin ms altos del receptor
nuclear y la fraccin de la fase S ms baja.
Teniendo en cuenta el conjunto de evidencias cientficas con respecto a ER y ERR, los datos
actuales demuestran que, al menos en las muestras analizadas, todos los cultivos celulares mixtos
presentaron niveles de expresin de ER inferiores a los niveles de expresin de ERR y ERR, sin
mostrar una correlacin clara entre una expresin superior de ERR en tumores con bajos niveles
de transcripciones de ER o mayor expresin de ERR y alta expresin de ER. De hecho, los datos
han demostrado que ER y ERR muestran bastante el mismo patrn de expresin en cultivos
celulares mixtos obtenidos a partir de carcinomas complejos (CCa1 y CCa2) con los niveles de
expresin ms altos de ambos receptores entre los tumores. Adems, en todos los tumores malignos,
ERR que se expresa ms es ERR, lo que indica que no hay dualismo aparente entre las isoformas
ERR como se ha visto en humanos.
Los carcinomas que exhiben una expresin reducida de BRCA1 generalmente se diferencian
pobremente con una alta tasa proliferativa e inversamente se correlacionan con el grado histolgico.
En los perros, el estudio de la expresin del gen BRCA1 demostr que la prdida de la expresin de
BRCA1 se asoci con un aumento del marcador de proliferacin de Ki67 y la ausencia de
receptores de estrgenos (RE) y otros tumores malignos. Aunque las mutaciones hereditarias en el
gen BRCA1 se asocian con el cncer de mama familiar, la mayora de los carcinomas mamarios
presentan una aparicin espordica. Aunque las mutaciones en BRCA1 son raras en carcinomas
mamarios no familiares, es comn que haya prdida de expresin en 40 a 50% de los tumores
mamarios espordicos, posiblemente a travs de alteraciones epigenticas, especficamente la
hipermetilacin del promotor. En este estudio, los resultados de qPCR indicaron que los niveles ms
altos de BRCA1 se presentan en un carcinoma complejo (CCa1), mientras que las clulas cultivadas
obtenidas de un adenoma complejo mostraron los niveles ms altos de BRCA2, seguidos de
carcinomas complejos. Todos los cultivos de clulas mixtas presentaron valores bajos para la fase
G2 / M: 2,5 para CAd, 2,4 para CCa1 y 1,45 para CCa2. Adems, los niveles de expresin ms
bajos para BRCA1 se verificaron en MAd, SCa, MCa1 y MCa2, que son cultivos celulares mixtos
obtenidos a partir de ER de baja expresin y tumores de porcentaje de fase alta de G2 / M,
corroborando los datos encontrados en la literatura.
Los estudios experimentales en ratones han demostrado que la prdida de expresin de GATA-3
est asociada con tumores de alto grado histolgico. Hasta ahora, no hay expresin o estudios
epigenticos sobre el factor de transcripcin GATA-3 en perros. Los resultados indican que se
observaron niveles ms bajos de GATA3 en el adenoma complejo y el carcinoma simple, mientras
que los niveles ms altos de expresin fueron entre los carcinomas complejos y mixtos, tumores con
alto grado histolgico.
Los receptores de la tirosina quinasa comprenden una familia de molculas de sealizacin
implicadas en diversos procesos fisiolgicos que regulan la proliferacin celular, la diferenciacin y
la apoptosis, que comnmente estn desreguladas en el cncer. Las alteraciones en las vas de
FGFR, como las amplificaciones y la sobreexpresin, se observan en 5 a 30% de los tumores
mamarios en mujeres. En un estudio preclnico realizado sobre carcinomas de mama humanos de 58
pacientes, se observ que la accin del 17--estradiol alteraba la expresin y / o localizacin de
FGFR2 y que el 62% de las clulas tumorales mostraban un marcado de FGFR2 de moderado a
intenso en su citoplasma. Varios autores han informado sobre la aparicin de polimorfismos de un
solo nucletido (SNP) en FGFR2 como un factor de riesgo de cncer de mama en mujeres y el
estudio de su expresin con valor pronstico en relacin con la supervivencia y el perodo libre de
enfermedad y su aumento de expresin est asociado con pobre resultado clnico. Hasta la fecha, no
existen estudios sobre la expresin de FGFR2 en neoplasmas mamarios en las especies caninas. Los
resultados actuales mostraron que los cultivos de clulas mixtas obtenidos a partir de carcinomas
complejos presentaron los niveles de expresin ms altos de FGFR2, mientras que la muestra de
adenoma complejo present el nivel de expresin ms bajo. Por lo tanto, el FGFR2 canino parece
correlacionarse con el mismo receptor en humanos en trminos de aumento de la expresin en
tumores de pronstico desfavorables. Sin embargo, otros estudios que analicen los SNP seran tiles
para proporcionar informacin adicional sobre el papel biolgico de este receptor en el cncer de
mama canino.
La genistena se encuentra entre las principales isoflavonas de soja y presenta similitudes
estructurales y funcionales con el 17--estradiol y puede unirse a los receptores de estrgeno alfa
(ER) y beta (ER). Esto explica su relacin con la familia de fitoestrgenos, una clase de
fitoqumicos no esteroideos que actan como compuestos similares a los estrgenos. Debido a la
semejanza estructural con 17--estradiol, la genistena media la mayor parte de sus efectos
biolgicos a travs de la modulacin de las vas de sealizacin de ER. En los tejidos dependientes
de hormonas, los estrgenos desempean un papel importante en muchos procesos fisiolgicos,
como la proliferacin celular, la diferenciacin o la apoptosis. Sin embargo, los altos niveles de
estrgenos son un factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades dependientes de
hormonas, como el cncer de mama o de prstata. Todava no est del todo claro por qu los
estrgenos endgenos o sintticos aumentan el riesgo de cncer de mama, mientras que los
fitoestrgenos, compuestos estructuralmente similares, parecen tener el efecto contrario. Se ha
demostrado que la genistena inhibe la proliferacin celular tanto en las lneas celulares de cncer
de mama ER-positivas como ER-negativas. Induce la apoptosis y la detencin del ciclo celular G2 /
M y disminuye la motilidad celular. Tambin se ha demostrado que la genistena desempea un
papel en varias vas de sealizacin indicadas en la carcinognesis, reduciendo la expresin y / o la
activacin de varias protenas procarcinognicas, como ciclina D1, Akt y erbB2 y aumentando la
expresin del supresor de tumores, fosfatasa y tensina homlogo (PTEN).
Diethylstilbestrol (DES) es un estrgeno sinttico no esteroideo que se prescribi para las mujeres
desde 1947 hasta 1971 para prevenir abortos espontneos. Sin embargo, el frmaco no solo fue
teraputicamente ineficaz para reducir la incidencia de abortos involuntarios, pero los informes han
establecido que las mujeres expuestas en el tero a DES mostraron una mayor incidencia de un tipo
raro de cncer vaginal. Un estudio reciente mostr que las mujeres expuestas al DES en el tero
mayores de 40 aos mostraron un aumento estadsticamente significativo en el riesgo relativo de
desarrollar cncer de mama.
Teniendo en cuenta estas caractersticas antagnicas de DES y genistena, se seleccionaron cuatro
cultivos celulares mixtos para el ensayo de proliferacin funcional: el cultivo obtenido a partir de
tejido mamario normal (NME) y, debido a la malignidad y ausencia de metaplasia, el cultivo
derivado del carcinoma simple (SCa ) y dos cultivos obtenidos a partir de carcinomas complejos
(CCa). El efecto de DES y / o genistena en la proliferacin basal y la hipoxia se observ en cultivos
mixtos derivados de tejido mamario normal, carcinoma simple y carcinoma complejo. Diversos
tratamientos fueron efectivos para reducir la proliferacin de clulas desarrolladas a partir de
carcinomas simples y complejos. Teniendo en cuenta la accin inhibidora de la genistena y el
efecto estimulador de DES sobre la proliferacin neoplsica, los datos han demostrado que los
cultivos celulares mixtos evaluados respondieron a esos frmacos de una manera diferente.
Probablemente, las diferencias en esas respuestas se deben a la accin de estos frmacos en ERR y
son necesarios ms estudios para revelar los mecanismos moleculares desarrollados en este proceso.
En cuanto al papel de ERR en la capacidad proliferativa de las lneas celulares derivadas de
carcinoma simple y carcinomas complejos, el bloqueo de las tres isoformas de los ERR, con el
tratamiento DES, conduce a una disminucin de la proliferacin basal de las tres lneas celulares.
Sin embargo, el tratamiento con el agonista ERR, genistena, no fue efectivo en la modificacin de
la tasa de proliferacin de estas clulas. Sin embargo, el tratamiento con genistena no ha
demostrado ningn efecto sinrgico con el tratamiento DES. Estos resultados indican que, al menos
directamente, ERR no estimula la proliferacin celular en estas lneas celulares, y que esta funcin
estimuladora de la proliferacin puede ser realizada por otra isoforma del receptor (ERR o ).
En conjunto, los resultados apuntan a un papel diferenciado de ERR en el cncer mamario canino,
donde su expresin parece incrementarse en carcinomas mixtos, seguidos de carcinomas complejos.
En cuanto a la proliferacin de clulas neoplsicas, ERR parece no estar implicado en la
estimulacin de la tasa de proliferacin en estas clulas.