Prctica No.

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Centrifugacin diferencial

Objetivo
Realizar un procedimiento de centrifugacin diferencial para la obtencin de clulas
mononucleares.

Introduccin

Diversas pruebas requieren de preparaciones purificadas enriquecidas de un tipo celular, por

ejemplo, los linfocitos requieren ser purificados de la sangre perifrica para recuento de Linfocitos
T y B. La tcnica de centrifugacin por gradiente de densidad es un mtodo que aprovecha las
diferencias de densidades/tamao entre las clulas que componen a una misma muestra. Cuando
una muestra con distintos tipos de clulas es sometida a centrifugacin en una solucin con un
gradiente de densidad (formado por molculas como la sucrosa), cada clula migrar a una fase
(anillo) diferente que se formar despus de la centrifugacin, de acuerdo a su densidad/tamao.

El aislamiento de clulas mononucleares de sangre perifrica puede llevarse a cabo mediante una
centrifugacin por gradiente de densidad empleando Ficoll-Hypaque para formar el gradiente. El
Ficoll-Hypaque est compuesto por diatrizoato de sodio y Ficoll. El Ficoll por su parte, es un
polmero de sucrosa de alto peso molecular (gravedad especfica, 1.076 1.078) que contribuye a
la viscosidad de la solucin, mientras que, el Hypaque es un compuesto orgnico iodado utilizado
comnmente como medio de contraste radiogrfico que incrementa la
viscosidad de la solucin. Cuando estn mezclados (Ficoll-Hypaque), la
solucin resultante tiene una gravedad especfica de 1.077 a temperatura
ambiente y es ms densa que los linfocitos, monocitos y plaquetas, pero
menos densa que los granulocitos y los glbulos rojos, permitiendo una
separacin exitosa de estas poblaciones celulares.

Por tanto, despus de una centrifugacin de una muestra de sangre perifrica

en solucin Ficoll-Hypaque, las clulas mononucleares y plaquetas son
menos densas y se encontrarn en la capa superior al Ficoll-Hypaque; por el
contrario, los glbulos rojos y granulocitos poseen una mayor densidad al
Ficoll-Hypaque y por tanto, se encontraran en la capa inferior, como se muestra en la figura. Los
valores esperados mediante esta tcnica son los siguientes: Para linfocitos, se esperan 95 5% de
clulas presentes en la fraccin de clulas mononucleares, 95 5 % de viabilidad, 60 20% de
linfocitos recuperados de la muestra sangunea original. Para otras clulas, se esperan 3 2% de
granulocitos, 5 2% de eritrocitos, <0.5 % de plaquetas de la muestra sangunea original.
Reactivos biolgicos/qumicos y materiales
Sangre perifrica Pipetas Pasteur
Etanol Solucin Salina Balanceada
Ficoll-Hypaque Torniquete
Cmaras de Neubauer Torundas
Cubreobjetos Tubos 13 x 100
Microtubos Tubos con EDTA o heparina
Portaobjetos

Procedimiento
A. Preparacin de la muestra.
1. Obtener 4 mL de sangre perifrica en tubo con anticoagulante (heparina o EDTA).
2. Agregar a un tubo de 13 x 100 2 mL de sangre perifrica recin colectada y agregar 2 mL de
una solucin salina balanceada (volumen final: 4mL).
3. Mezclar la solucin para homogenizar.

B. Centrifugacin por gradiente con Ficoll-Hypaque

1. Mezclar la solucin Ficoll-Hypaque para asegurar que est homognea.
2. Agregar 3 mL de la solucin de Ficoll-Hypaque a un tubo de 13 X 100.
3. Agregar cuidadosamente, de forma estratificada (por las paredes del tubo), 4 mL de la muestra
diluida anteriormente.
4. Centrifugar a 400 x g durante 30 minutos a 18-20 C.
5. Retirar cuidadosamente el tubo de la centrfuga evitando que las capas formadas sean
mezcladas.
6. Retirar la capa correspondiente al plasma.
7. Cuidadosamente, retirar el anillo correspondiente a clulas mononucleares (ver figura) y
colocarlas en otro tubo de 13 x 100.

C. Preparacin de clulas mononucleares

1. Agregar, al tubo que contiene las clulas mononucleares, al menos 3 volmenes de solucin
salina balanceada.
2. Mezclar gentilmente para resuspender las clulas.
3. Centrifugar de 60-100 x g por 10 minutos a 18-20 C.
4. Remover el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
5. Resuspender la pastilla celular en 500 L de solucin salina balanceada y colocar la suspensin
celular en un microtubo de 1.7 mL.

D. Conteo de Mononucleares
1. Realizar conteo celular mediante cmara de Neubauer y reportar el nmero de clulas totales
en la muestra y de clulas obtenidas por mL de sangre.
2. Realizar un recuento diferencial reportando el % de clulas mononucleares y % de otras
clulas.
Resultados
Nmero de Mononucleares totales de la muestra: ______________________________________
Nmero de Mononucleares totales por mL: ___________________________________________
Porcentaje de clulas mononucleares: _______________________________________________
Porcentaje de otras clulas: _______________________________________________________

Observacin de la muestra enriquecida con clulas

mononucleares

Notas:

Discusiones

Observaciones
Conclusiones

Cuestionario

1. Adems de la centrifugacin diferencial, qu otras tcnicas existen para la

separacin de organelos?

2. Describir el fundamento de la centrifugacin diferencial.

3. Cules son las ventajas y las desventajas de trabajar con las clulas enteras y
con las clulas fraccionadas.
a. Clulas enteras
i. Ventajas:_________________________________________________
________________________________________________________
ii. Desventajas:______________________________________________
________________________________________________________
b. Clulas fraccionadas
i. Ventajas:_________________________________________________
_______________________________________________________
ii. Desventajas:______________________________________________
________________________________________________________

4. A partir de un artculo cientfico (menor a cinco aos de antigedad), en donde

hayan utilizado centrifugacin diferencial realizar lo siguiente: a) leer el
artculo, b) describir el procedimiento realizado de la centrifugacin
diferencial, b) qu organelos o clulas separaron mediante esta tcnica y c)
cul fue el propsito de la investigacin descrita en el artculo.
NOTA: Agregar como anexo el artculo cientfico utilizado.

Bibliografa
Fuss I.J., Kanof M.E., Smith P.D., Zola H. (2009) Isolation of Whole Mononuclear Cells from Peripheral Blood and
Cord Blood. Current Protocols in Immunology 7.1.1-7.1.8. Doi: 10.1002/0471142735.im0701s85.