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UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE

MXICO
FACULTAD DE QUMICA

LABORATORIO DE BIOQUMICA BSICA

PROFESORA: QFB. CYNTHIA ELENA ENRQUEZ


GARCA

REPORTE 7: CUANTIFICACION D EPROTEINA POR EL


METODO DE LOWRY

INTEGRANTES:
- ALEJANDRA SNCHEZ PIA
- JANETTE MARIE ARIZMENDI BECERRA
- ADRIANA PLATA BECERRIL
- YARITZA GONZALEZ CEDILLO

GRUPO: 42
LICENCIATURA: QUIMICO FARMACUTICO BILOGO

FECHA: 20/MARZO/2016
OBJETIVO

Cuant if icar la prot ena obtenida en la pr ctica nmero 6 (la fraccin gama -
globulina obt enida del suero sanguneo) por el mtodo de Lowr y.

MARCO TEORICO

Mtodo de Lowry

El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las


protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn
la ley de Lambert-Beer A= .l.c Este mtodo consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en
medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno
de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro.
Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena,
exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa
de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con
tartrato. 2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los
grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas,
actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-
Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los
grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Gamma globulina.

La gamma globulina es un tipo de globulina denominada as por aparecer en ltimo lugar al


separar las protenas del suero sanguneo. El principal tipo de gamma globulina es el de los
anticuerpos o inmunoglobulinas.

Albmina srica bovina.

La BSA es una protena ampliamente utilizada en la industria biomdica. Muy soluble en


agua y su punto isoelctrico es de 4,78. El peso molecular, basado en la informacin sobre
secuencia aminoacdica, se establece en: 66,430 kD. Es una cadena polipptica simple,
constituida por 583 aminocidos residuales. A pH 5 7 contiene 17 puentes disulfuro
intracadena y 1 grupo sulfhidrilo.
PROCEDIMIENTO

Preparacin de la curva patrn de Lowry

Hacer una 1:200 (tubo nm.


a partir de ella
dilucin 1:100 2), 1:400 (tubo
preparar una TOMAR
de la Albmina nm. 3), 1:800
serie de 5 tubos ALICUOTAS DE
srica bovina (tubo nm. 4),
en donde se 0.2mL DE CADA
(ASB) al 22% 1:1600 (tubo
realicen TUBO
nm. 5), 1:3200
(tubo 1) diluciones
(tubo nm. 6)

A cada Agitar tubos y dejar Agitar tubos y dejar


tubo(adicionados reposar 10 minutos Agregar 0.4 mL de reposar 30 minutos.
0.2 mL) agregar 4mL a temperatura Reactivo B
del Reactivo A ambiente leer tubos 520nm

REACTIVO A REACTIVO B
es una mezcla de Carbonato de es el reactivo de Folin-
Sodio al 2% en NaOH 0.1N con Cicalteau con agua en
el Sulfato de Cobre y el Tartrato una relacin de1:1.
de Sodio y Potasio en una
relacin de 10:0.1:0.1

OBSERVACIONES

Al agregarle a los tubos (con 0.2 mL. de solucin de ACB) el reactivo A, se observ un color
lila, que se fue diluyendo desde el tubo 1 al tubo 6, el tubo 7 fue lila intenso.

Despus a esos mismos tubos ya con el reactivo A, se le agrego un segundo reactivo


(reactivo B), se observ un color azul que se fue diluyendo del tubo 1 al tubo 6, el tubo 7 se
form un color azul intenso, lo cual estaba muy concentrado, por lo tanto se diluyo de 3:1
para que estuviera dentro del rango del color y as poder medir su absorbancia.
RESULTADOS

- CONCENTRACIONES TUBO 4
TUBO 1 0.0055g 1mL
22g 100mL Xg 0.5mL
Xg 0.1mL X= 0.00275g
X= 0.022g
TUBO 5
TUBO 2 0.00275g 1mL
0.022g 1mL Xg 0.5mL
Xg 0.5mL X= 0.001375g
X= 0.011g
TUBO 6
TUBO 3 0.001375g 1mL
0.011g 1mL Xg 0.5mL
Xg 0.5mL X= 0.0006875g
X= 0.0055g

- CURVA PATRN
Concentracin Absorbancia
0.022 0.77
0.011 0.425
0.0055 0.316
0.00275 0.254
0.001375 0.221
0.0006875 0.133
Absorvancia
0.9
0.8
ABSORVANCIA 0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
CONCENTRACIN

El tubo 7 contena la gammaglobulina, tuvo una absorbancia de


0.531, la diluimos 3:1 con agua destilada, tuvo una
concentracin de 0. 014g obtenida de la grf ica, se mult iplico
por 3 para obtener la concentracin de la gammaglobulina sin
diluir y f ue de 0.042g.

CONCLUSIONES

Cuanto mayor sea la concentracin de protena de la muestra ms intenso ser el color


formado porque existirn ms enlaces peptdicos para formar el complejo de coordinacin
y habr ms tirosinas y triptfanos que reduzcan el reactivo de Folin.

Mediante una recta patrn elaborada enfrentando la absorcin a la concentracin de


protena y conociendo la absorcin de la muestra problema, se puede determinar la
concentracin de protena, para lograr esto, se requiri diluir 3:1 la concentracin obtenida
de la protena, ya que su absorcin no se interpolaba dentro de la recta.

Algunas de las caractersticas del mtodo de Lowry para la determinacin de protenas en


solucin son: es de 10 a 20 veces ms sensible que la estimacin por absorcin a 280 nm,
es varias veces ms sensible que la reaccin con Ninhidrina y tambin es 100 veces ms
sensible que la reaccin de Biuret. Presenta pocas interferencias, aunque hay que tener en
cuenta que el triptfano, la tirosina, la mayor parte de los fenoles, el cido rico, la guanina
y la xantina reaccionan con el reactivo de Folin para producir color.

Una desventaja que presenta es que la intensidad del color vara con las diferentes
protenas. En este sentido es menos constante que la reaccin de Biuret pero ms que la
absorcin a 280nm.
CUESTIONARIO
1. Qu otros mtodos existen para cuantif icar protenas sricas?
- Mtodos de absorcin
- Mtodos Derivados color imtricos
Biur et
Lowr y
Bradf ord
BCA
- Mtodos der ivados Fluor imtricos
O-f talaldehido
2. Cules son las vent ajas y las desventajas de usar el mtodo de Lowr y?
- Ventajas: Tiene bastante sensibilidad.
- Desventajas: No todas las protenas reaccionan igual muestra muchas interferencias
como detergentes no inicos, sulfato amnico etc.
3. Por qu se deben realizar las lecturas en el espectrof otmetro a 520
nm?
- Porque la absorcin se mide en 500 y 520nm y es visible par a el ojo
humano.
Ejercicios de integracin

1. Reporte los clculos realizados para obtener las concentraciones de


Albmina sr ica bovina que se empelaron para realizar la cur va patrn.
Los clculos se encuentran en el apartado de r esultados de la prctica
correspondiente.
2. Qu propsit o tiene realizar una cur va patrn?
La curva de calibracin permite estimar, a partir de una absorcin o transmitancia dada,
la concentracin de una solucin.
3. Si no tuviera Albm ina srica bovina, q ue otra protena se r ecomienda
para obtener las concentraciones de la curva patrn.
-Globulina
4. Explique qu quier e decir extr accin por precipitacin salina (salting
out)?
Es un fenmeno fsico-qumico basado en las interacciones electrolito-no electrolito, en
el cual a altas concentraciones salinas (o alta fuerza inica) algunos solutos
como protenas o polmeros precipitan debido al aumento de las interacciones
hidrofbicas entre ellos. Este fenmeno est vinculado al fenmeno cosmotrpico
ejercido por algunas sales. La concentracin salina y el tipo de sal requerida para la
precipitacin varan de soluto a soluto. Este fenmeno es empleado para la separacin
de protenas.
BIBLIOGRAFIA

O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. (1951)
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology.
Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which
is more generally applicable. Analytical Biochemistry.