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Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16

UD 15-16. Tcnicas diagnsticas basadas en la reaccin Ag-


Ac. Diagnstico y seguimiento serolgico de infecciones.
La respuesta inmunitaria es uno de los mecanismos de defensa anti-infecciosa de los
vertebrados, se desencadena frente a protenas o polisacridos microbianos que son
reconocidos como extraos. Esta respuesta tiene dos ramas: la humoral, que da lugar a la
produccin de anticuerpos y la celular, que consiste en la activacin de diversas clulas con
funciones defensivas.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas, segn las diferencias del fragmento Fc pueden


dividirse en cinco clases: IgM, IgA, IgG, IgE e IgD, siendo las ms importantes la IgM, IgA e IgG,
las dos primeras se producen en la fase inicial del estmulo antignico, en fases posteriores en
lugar de producirse IgM se produce IgG.

El antgeno y el anticuerpo son dos estructuras complementarias, como una llave y su


cerradura; es decir si se dispone de un antgeno determinado, se puede detectar la presencia
de sus anticuerpos en el suero y si se dispone de un Ac, se puede detectar su antgeno en una
muestra clnica.

La reaccin antgeno-anticuerpo no es visible, in vitro se puede poner de manifiesto


por diversas tcnicas con numerosa variantes.

1. DETECCIN DE ANTGENOS MICROBIANOS


La deteccin del microorganismo causante de una infeccin puede hacerse por
examen microscpico y por cultivo, pero tambin detectando antgenos especficos del
microorganismo mediante pruebas inmunolgicas.

Las tcnicas inmunolgicas para la deteccin de antgeno son variadas y en algunos


casos se han demostrado muy tiles para el diagnstico, bien como tcnicas rpidas, que
despus son confirmadas por otras, o incluso como tcnicas de referencia por su elevada
eficacia.

Se investiga un nico microorganismo en cada prueba. No es posible, por razones


tcnicas y econmicas, realizar una batera indiscriminada de pruebas sin una seleccin y
jerarquizacin de las mismas.

Este tipo de pruebas tiene en comn que todas requieren un anticuerpo (antisuero)
para detectar un antgeno especfico del microorganismo buscado. Segn el procedimiento
usado para poner de manifiesto la reaccin Ag-Ac, existen diferentes tcnicas: aglutinacin,
inmunofluorescencia, enzimoinmunoanlisis o inmunocromatografa, inmuno-PCR, algunas de
ellas fcilmente automatizable.

1.1. Antisueros
La mayora de los antisueros para la deteccin de antgenos se hallan comercializados,
generalmente formando parte de un kit listo para el empleo.
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Hay sueros de dos tipos:

Policlonales: se obienen de animales inmunizados con un antgeno policlonal.


Se trata de una mezcla de Ac de anticuerpos de clases diferentes (IgM, IgG,
etc.) al estar producidos por diferentes clulas plasmticas del animal.

Monoclonales: se obtienen mediante hibridomas. Son siempre iguales y


poseen una gran especificidad.

Todos los anticuerpos pueden fijarse por su fragmento Fc a la base de un pocillo de


plstico o a la superficie de una membrana o de partculas inertes.

Las inmunoglobulinas se pueden marcar uniendo al fragmento Fc diversas sustancias,


como enzimas, molculas fluorescentes, lumnicas, fragmento de ADN o molculas radiactivas.

Las enzimas unidas a los anticuerpos, al actuar sobre un sustrato, lo transforman en un


producto de diferente color.

Tanto los marcadores fluorescentes como lumnicos emiten luz, que puede ser
observada y cuantificada. La diferencia es que las sustancias fluorescentes emiten luz cuando
son excitadas al incidir sobre ellas radiacin ultravioleta y las lumnicas emiten luz por accin
de una reaccin qumica (quimioluminiscencia).

Los fragmentos de ADN podrn ser amplificados y observados por electroforesis. Estos
marcadores han superado en sensibilidad a los marcadores radiactivos, por lo que se estn
imponiendo debido al menor riesgo en su utilizacin.

1.2. Tcnicas de deteccin de antgeno


Esquemticamente puede decirse que si en una muestra clnica, como el LCR,
secrecin respiratoria u orina, est presente un determinado microbio, al aadir los
anticuerpos marcados especficos contra l se fijarn al microbio y se producir el efecto o la
seal correspondiente, como aglutinacin, cambio de color de un sustrato, fluorescencia o luz,
dependiendo del marcador utilizado; si, por el contrario, el microbio buscado no est presente
en la muestra los anticuerpos no podrn unirse a l y no se producir la seal. Las tcnicas ms
utilizadas para deteccin de antgenos microbianos son:

Aglutinacin indirecta o pasiva


Inmunofluorescencia (IF)
Enzimoinmunoanlisis (EIA)
Inmunocromatografa (IC)

1.2.1. Aglutinacin indirecta o facilitada


Consiste en utilizar anticuerpos adheridos, por sus Fc, a partculas grandes de ltex u
otras partculas inertes que facilitan la observacin de la aglutinacin al formarse grumos de
gran tamao como los formados con Ag celulares. Estas pruebas permiten la deteccin de Ag

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solubles pero tambin pueden emplearse para la deteccin de Ag particulados como los de las
bacterias hongos y virus.

Por ejemplo, en el LCR puede detectarse un meningococo del grupo C utilizando Ac


anti-meningococo C unido a partculas de ltex, observndose la reaccin tanto si el
polisacrido C se halla formando parte de la cpsula de un meningococo intacto como si el
meningococo est lisado y el polisacrido se halla como una macro molcula libre.

Las tcnicas de aglutinacin facilitada suelen ser menos sensibles que las de EIA, por lo
que, salvo excepciones no son adecuadas para la deteccin de antgenos vricos que
acostumbran a estar en menor cantidad que los bacterianos.

Muestra A

Latex sensibilizado con Ac

Muestra B

La muestra A no aglutina, da resultado negativo, carece del Ag que se busca.


La muestra B si aglutina, da resultado positivo, tiene el Ag que se busca.

1.2.2. Inmunofluorescencia.

Las pruebas de inmunofluorescencia permiten la observacin, mediante un


microscopio de fluorescencia, de los microorganismos al haberse fijados a ellos Ac especficos
marcados con fluorescena u otra sustancia fluorescente.

La inmunofluorescencia directa se utiliza para investigar la existencia de Ag en una


muestra. Consiste en mezclar anticuerpos marcados con fluorocromos, con la muestra
(sta tendr o no antgenos). Si en la muestra hay Ag habr reaccin Ag-Ac entre los Ag de
la muestra y los Ac marcados con fluorocromos. Antes de valorar la existencia de reaccin
antgeno-anticuerpo se realiza un lavado, eliminando as el sobrante de anticuerpos
marcados. Para valorar la existencia de reaccin Ag-Ac, se observa, con el microscopio de
fluorescencia, la existencia o no de fluorescencia.

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Si se efecta en un portaobjetos una extensin de un esputo, de un lavado


nasofarngeo u otra muestra respiratoria, podr detectarse una bacteria como la legionela
utilizando anticuerpos antilegionela marcados con fluorescena, si la legionela est en el
esputo, los anticuerpos fluorescentes se fijan a ella recubrindola, y, al observar la preparacin
con un microscopio de fluorescencia la bacteria se ve brillante (fluorescente) contra un fondo
oscuro.
Frotis de esputo

Frotis de esputo

Aunque por su tamao los virus no pueden observarse directamente, cuando se


estn multiplicando en una clula se sintetiza una gran cantidad de protenas vricas
que se localizan en el citoplasma o el ncleo. Mediante anticuerpos especficos para
esas protenas vricas marcados con fluorescena se detectan las clulas infectadas, y ,
por tanto se visualiza indirectamente el virus con el microscopio de fluorescencia. De
este modo puede detectarse el virus de la gripe, el virus respiratorio sincitial o los virus
parainfluenza en las clulas de una muestra respiratoria o el HHV1 o el de la varicela
en una extensin cutnea.
Frotis de esputo

Frotis de esputo

La inmunofluorescencia indirecta es un procedimiento alternativo al anterior


para no tener que marcar cada uno de los distintos anticuerpos. Consiste en detectar
los diferentes antgenos con su anticuerpo especfico no marcado (IgG) y a
continuacin revelarlo mediante un anticuerpo anti-IgG marcado. As, con un solo
anticuerpo marcado se pueden revelar los diferentes anticuerpos especficos no
marcados.

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1.2.3. Enzimoinmunoanlisis

Las pruebas inmunoenzimticas se basan en la existencia de sustancias qumicas


(sustratos) que por la accin de una enzima son transformadas en un producto coloreado que
emite luz o fluorescencia; la intensidad del color y de la radiacin lumnica o fluorescente
puede cuantificarse mediante instrumentos de medida.

El proceso de la prueba es el siguiente: en un pequeo pocillo de plstico se han fijado


anticuerpos (Ac) dirigidos contra el antgeno que se desea detectar. Cuando en la muestra que
se introduce en el pocillo se halla el antgeno del microbio buscado (Ag), los anticuerpos de la
placa lo fijan (se forman complejos Ac-Ag). A continuacin se aade un anticuerpo dirigido
contra el antgeno, igual al fijado en la placa, pero marcado con un enzima (AcE) que se fija al
antgeno (se forman pues complejos Ac-Ag- AcE). Posteriormente se aade el sustrato incoloro,
que es transformado por la enzima, apareciendo un color cuya intensidad es medida mediante
un colormetro. Cuando en la muestra no existe el antgeno buscado el AcE no es retenido en el
pocillo y es eliminado mediante lavado, por la que al aadir el sustrato no se produce color.

Algunas pruebas se hallan disponibles en el mercado, en formatos muy


sencillos, para detectar diversos microorganismos, en particular virus.

1.2.4. Inmunocromatografa

La prueba se realiza en una pequea tira de nitrocelulosa con tres zonas clave:
1, en uno de los extremos de la tira, en la que hay, en exceso,
anticuerpos de conejo contra el antgeno buscado marcados con una partcula
de color; en ese lugar se deposita la muestra lquida: LCR, orina, etc. Es la zona
de inoculacin (I).
2, en la mitad de la tira hay una banda de anticuerpos de conejo
fijados a la nitrocelulosa dirigidos contra el mismo antgeno. Es la zona de
resultados (Re)
3, cerca del otro extremo de la tira, hay una banda con anticuerpos
fijados dirigidos contra los anticuerpos de conejo. Es la zona de control (Ct)

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Al aadir la muestra en la zona primera la reaccin tiene lugar segn el siguiente


proceso: si el antgeno buscado est en la muestra, reaccionar con los anticuerpos marcados,
y los complejos Ag-Acmarcado, formados en un contexto fluido, migran por capilaridad al
resto de la tira de nitrocelulosa y son captados en la segunda zona, al reaccionar con los
anticuerpos antiantgeno fijados en la nitrocelulosa. All al quedar captados y muy
concentrados los complejos se observa la banda de los anticuerpos marcados con el colorante.
Los Acmarcados que no han reaccionaron con el Ag siguen migrando hacia la tercera banda
donde quedan captados al reaccionar con los anticuerpos fijados dirigidos contra los
anticuerpos de conejo. La tercera banda es un control para confirmar la correcta migracin y
debe ser siempre positiva.

Resultado -, la
Resultado +, la muestra no tiene
muestra tiene Ag Ag

1.3. Aplicaciones clnicas de la deteccin de antgenos en


microbiologa
En el mercado hay gran nmero de reactivos para la deteccin de antgenos de
numerosos microorganismos, existe la posibilidad de escoger diversas tcnicas para la
deteccin de un mismo microorganismo. Debe seguirse las indicaciones del fabricante de una
manera estricta y no olvidar introducir los controles necesarios.

Los antgenos microbianos se buscan en la muestra clnica obtenida del foco de


infeccin (LCR en caso de meningitis, esputo en caso de neumona), pero en ocasiones, los
antgenos microbianos pasan a la sangre desde el foco de infeccin y se buscan en ella, como
es el caso de la hepatitis y el sida. En otros casos se eliminan por la orina, como en la neumona
causada por a la legionela.

1.3.1. Infecciones respiratorias


IF de muestras respiratorias: legionela, gripe, virus respiratorio sincitial, parainfluenza y
adenovirus. Existe un antisuero polivalente que permite el estudio simultneo de estos
virus en una prueba nica, en caso de positividad hay que repetirla con antisueros
individuales.

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Inmunocromatografa de muestras respiratorias: gripe A y B y virus respiratorio sincitial.


Con esta tcnica no se puede evaluar la calidad de la muestra, con la IF si se puede
constatar la presencia de un n suficiente de clulas del epitelio ciliado evidenciando
que es apta para el estudio.
Inmunocromatografa o EIA de orina: neumona por legionela y neumococo.
1.3.2. Infecciones gastrointestinales
El Helicobacter pylori, se puede detectar en heces por pruebas de EIA, con buena
sensibilidad y especificidad.
La deteccin de las toxinas A y B de Clostridium difficile se pueden detectar en heces por
diversas tcnicas; por ejemplo, EIA automatizadas.
La deteccin de virus causantes de enteritis como rotavirus, adenovirus, calicivirus y
astrovirus pueden efectuarse en muestras de heces mediante varios mtodos:
aglutinacin indirecta, EIA e inmunocromatografa.
Tambin existen pruebas para la deteccin guiardia y criptosporidios en heces, pero no
superan en rapidez y sensibilidad al examen microscpico y adems son ms caras.
Existen pruebas de EIA que permiten la diferenciacin entre Entamoeba histolytica y
otras amebas no patgenas.
1.3.3. Infecciones de transmisin sexual
Deteccin de Clamydias trachomatis mediante pruebas de EIA,
inmunocromatografa o IF.
Deteccin del treponema de la sfilis en la lesin cutnea mediante IF.
1.3.4. Meningitis
La deteccin de los Ag especficos de meningococo, neumococo, Haemopphilus
influenza y criptococo puede hacerse mediante tcnicas de aglutinacin indirecta,
la sensibilidad de estos test no es muy superior al examen directo y Gram pero
permite confirmar la identificacin.
1.3.5. Infecciones mucocutneas
Mediante tcnicas de IF de muestras cutneas se puede diagnosticar y diferenciar
herpes virus simple y varicela.
1.3.6. Hepatitis y sida
Se detecta el Ag de superficie y el Ag e del virus de la hepatitis B.
En el sida se detecta el Ag p24 del VIH (la gp41 es una glicoprotena
transmembrana).

1.3.7. Infecciones sistmicas


Parotiditis y sarampin en muestras nasofarngeas por IF.
En infecciones por citomegalovirus muestras de la capa leucocitaria de las sangre por
IFI.
En leishmaniasis generalizadas, en muestras de mdula sea por IFI.
En el paludismo, en muestras de sangre por EIA, su sensibilidad no supera a la
observacin microscpica.

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2. DIAGNSTICO SEROLGICO
El diagnstico serolgico consiste en poner en evidencia una respuesta inmune del
husped frente a la infeccin por un microorganismo (bacterias, virus, hongos o parsitos). En
la prctica se trata de detectar los anticuerpos especficos dirigidos frente a los antgenos del
microorganismo infectante. Adems del diagnstico de las infecciones, los estudios
serolgicos tambin tienen su aplicacin para conocer el estado inmune de un individuo frente
a un agente infeccioso (embarazadas, estudios previos a una vacunacin), o en estudios
epidemiolgicos en que se quiere conocer el estado inmune de la poblacin.

Las pruebas serolgicas, como en el caso de la deteccin de antgeno, requieren la


existencia de una hiptesis diagnstica relativamente precisa, no se puede enfrentar el suero a
los numerosos microorganismos de forma arbitraria.
El tipo de anticuerpo o Ig que se detecte puede indicar una infeccin reciente (IgM, IgA,
IgG de baja afinidad) o pasada (IgG de alta afinidad).
Generalmente de tres a seis semanas despus de producirse la infeccin se produce el
mximo nivel de anticuerpos (IgM+IgA+IgG), y el aumento de la concentracin de stos entre
dos muestras separadas en el tiempo (2-4 semanas) tambin es indicativo de infeccin
reciente.
Normalmente se buscan en el suero del paciente, pero tambin se pueden utilizar otros
lquidos orgnicos (LCR, saliva).

2.1. Antgenos utilizados


La mayora de los antgenos utilizados en serologa estn comercializados. Se presentan
en diversos formatos segn a tcnica en que se vayan a utilizar y el grado de automatizacin,
es frecuente la existencia de kit para el desarrollo de la prueba. El modo de conservacin y la
caducidad vienen indicados por el fabricante.

Hay varios tipos de antgenos para las pruebas serolgicas:


Naturales, estn constituidos por los microorganismos ntegros o extractos antignicos
ms o menos purificados obtenidos de ellos.
Antgenos recombinantes, son aquellos que se obtienen por ingeniera gentica,
introduciendo el gen que codifica la protena antignica en una bacteria o levadura
que lo expresa.
Antgenos sintticos (pptidos sintticos), se obtienen por sntesis qumica.

2.2. Pruebas serolgicas


En la actualidad, muchas de estas pruebas diagnsticas estn altamente automatizadas
Esquemticamente puede decirse que si en un suero est presente un determinado
anticuerpo, al aadir los antgenos especficos habr reaccin Ag-Ac y se producir el efecto o
la seal correspondiente, como aglutinacin, cambio de color de un sustrato, etc., depender

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la tcnica utilizada. Si, por el contrario, el anticuerpo buscado no est presente en la muestra
no se podrn fijar al antgeno y no se producir la seal.
En todas ellas conviene cuantificar los anticuerpos, los resultados se dan como ttulo de
anticuerpos. El ttulo de anticuerpos se determina de forma distinta segn el tipo de prueba.

Las tcnicas ms utilizadas para las pruebas serolgicas son las de:
Aglutinacin directa e indirecta. En la primera se usan antgenos particulados, es decir
los antgenos forman parte de microorganismos (bacterias protozoos). En la segunda
los Ag se han fijados a la superficie de partculas inertes.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Pruebas de enzimoinmunoensayo (ELISA)).
La tcnica de fijacin de complemento y la tcnica de neutralizacin, son cada vez
menos empleadas en los laboratorios clnicos.

2.2.1. Fijacin de complemento


Los complejos antgeno-anticuerpo tienen la capacidad de activar el sistema del
complemento y, una vez activado, el complemento es capaz de producir lisis celular. La
tcnica de fijacin de complemento aprovecha estas propiedades del complemento
para poner de manifiesto la reaccin antgeno-anticuerpo.

Para realizarla se utilizan los siguientes elementos:


Suero problema en el que se busca los anticuerpos.
Antgenos especficos de los anticuerpos que se buscan en el suero.
Sistema de Complemento.
Sistema indicador, denominado sistema ltico, que est constituido por
hemates de carnero unidos a anticuerpos antihemates de carnero
(hemolisinas). Los hemates se lisarn si el complemento se fija a las
hemolisinas.
Si hay anticuerpos, se producen complejos Ag-Ac. Al aadir el complemento, los
complejos fijan el complemento de forma que no queda complemento libre en la
mezcla. Cuando se aadan los hemates recubiertos de hemolisinas, al no quedar
complemento, no se produce hemlisis.

Si el suero problema no tiene los anticuerpos buscados, no se forman complejos


Ag-Ac, no se consume el complemento y, al aadir los hemates de carnero con
sus anticuerpos, se produce la hemlisis.

Por tanto, la presencia de los anticuerpos buscados en la muestra se manifiesta


por la ausencia de hemlisis. Si no hay anticuerpos en la muestra, hay hemlisis.

2.2.2. Pruebas de neutralizacin

Se basan en que la accin citoptica de un virus o una toxina, sobre una lnea
celular, puede ser bloqueada si los virus o la toxina se enfrentan previamente a
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anticuerpos especficos para ellos. En las pruebas de neutralizacin se sigue el


siguiente procedimineto: se enfrenta el virus o la toxina bacteriana al suero de un
paciente, despus esa mezcla se inocula a un sistema celular adecuado, y se observa la
existencia o no de efecto citoptico. Si en el suero existen anticuerpos contra el virus o
la toxina, quedan neutralizados, y al inocular la mezcla al sistema celular, no se
producen los efectos citopticos. Por el contrario, si no hay anticuerpos contra el virus
o la toxina, al inocular la mezcla al sistema celular, se produce el efecto citoptico
caracterstico. La cantidad de anticuerpos puede determinarse realizando la prueba
con varias diluciones del suero.

2.2.3. Pruebas de enzimoinmunoensayo EIA

Las pruebas EIA para detectar anticuerpos son de tipo indirecto o heterogneo (ELISA
=Prueba de inmunoabsorcin ligado a enzimas).
Hay una modalidad de tipo competitivo que tiene mayor sensibilidad.
Con las pruebas de ELISA se puede detectar la existencia de IgM, o IgA.

La intensidad de color, permite determinar la cantidad relativa de Anticuerpos

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Para detectar la presencia de IgM o IgA lo que hay que hacer es usar una anti-IgM o anti-
IgA humana marcada con la enzima. El procedimiento es similar a cualquier ELISA, por ejemplo
si se busca la existencia de IgM contra un antgeno en una muestra el procedimiento sera el
siguiente: sobre los pocillos en donde se encuentran fijados los antgenos se echa una cantidad
de muestra en la que se investigan la existencia de anticuerpos IgM, seguidamente se aade
anti-IgM humana que se fijar a los IgM de la muestra, se realiza un lavado; si en la muestra
haba IgM contra el antgeno, en el pocillo quedar fijados al antgeno y a ellos se fija IgM de la
muestra.arn los anti- IgM humana marcados con la enzima, al aadir el sustrato la cantidad
de producto ser proporcional a la cantidad de Ig M que hubiera en la muestra. En el caso de
que en la muestra tambin hubiera IgG u otro tipo de Ig contra el antgeno habrn reaccionado
con los antgenos pero al aadir la anti-IgM marcada con la enzima no se unir al complejo
Ag- Ac y por tanto en los resultados dar que no existe Ig M en la muestra (fijarse en el ltimo
grfico).

2.2.4. Pruebas de inmunofluorescencia indirecta

Se realizan sobre portaobjetos en los que estn adheridos los antgenos. Este
portaobjetos puede estar dividido en zonas para que en cada zona se eche suero a una
dilucin determinada. Despus de lavar el porta, se aade una solucin de anticuerpos anti-Ig
G humana marcada con un producto fluorescente. Alternativamente se pueden usar anti-IgM
humana marcada o Anti-IgA humana marcada, para detectar si los anticuerpos contra el
antgeno son de tipo IgG, IgM o IgA.

2.3. Titulaciones de anticuerpos


Los resultados serolgicos se suelen dar dan como ttulo de anticuerpos.
El ttulo de anticuerpos es la dilucin mayor del suero en la que se la prueba da
positiva (es decir se detectan anticuerpos), esto es as en las pruebas de aglutinacin,
inmunofluorescencia, fijacin de complemento, neutralizacin.

En los enzimoinmunoensayos la cantidad de producto obtenida ser directamente


proporcional a los Ac presente en la muestra. Excepto en los de tipo competitivo que la
cantidad de producto ser inversamente proporcional a la cantidad de Ac en la muestra.
Existen tablas de correlacin que relacionan estos resultados con las titulaciones de
anticuerpos. Los resultados de los EIA se expresan en U/mL.

De todas formas siempre se seguirn las instrucciones del fabricante de los productos
para dar los resultados.

La existencia de Ac no siempre indica enfermedad, es indicativo de que en algn


momento ha habido respuesta inmune contra el microorganismo que se estudia, por
enfermedad, infeccin sin enfermedad infecciosa o vacunacin.

La seroconversin es el paso de una negatividad en los resultados del estudio de


anticuerpos a una positividad en las pruebas.
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2.4. Diagnstico serolgico de las enfermedades


infecciosas.

Infeccin estreptoccica
El estreptococo betahemoltico del grupo A, produce infecciones farngeas. El
diagnstico por cultivo es poco especfico, puede completarse estudiando el ttulo de
antiestreptolisina O (ASTO o ASO) y antiDNAsa.
En la prctica diaria la determinacin de ASO tiene escaso valor en la fase aguda de la
enfermedad, pero s es til en la deteccin de las complicaciones: fiebre reumtica y
glomerulonefritis aguda.

Infecciones respiratorias
En el diagnstico serolgico de infecciones por virus respiratorios (virus de la gripe,
virus respiratorio sincitial, parainfluenza y adenovirus) se usan tcnicas de fijacin de
complemento (FC), ELISA e IF. El diagnstico de infeccin aguda requiere demostrar una
seroconversin, pero la deteccin de un ttulo de IgM es tambin bastante especfico.

En las infecciones pulmonares por micoplasma: FC, ELISA, de varios tipos para IgG e
IgM , IF, hemaglutinacin, y aglutinacin pasiva. Lo recomendable es ver una seroconversin,
pero un ttulo alto del primer suero con una clnica compatible suele ser diagnstico.

En las infecciones respiratorias por Clammydia trachomatis se da en el recin nacido y


se diagnostica detectando IgM por IF o ELISA.

En la infecciones por legionela, se usa una tcnica de IF en dos sueros, la


seroconversin se produce de forma tarda, en el 90% de los casos a la cuarta semana. La
tcnica de ELISA se usa para cribado de la poblacin en periodo de convalecencia.

Infecciones gastrointestinales

El diagnstico de infeccin por Helicobacter pylori se realiza mediante la deteccin de


IgM por ELISA.

En el diagnstico de enteritis la serologa solo se utiliza para detectar la infeccin


invasiva por Entamoeba Histolytica.

En el diagnstico de Salmonelosis se hace diagnostico serolgico solo en caso de


fiebre tifoidea, se usan tcnicas de aglutinacin pero da lugar a muchos falsos positivos.

Se puede optar tambin por la deteccin por ELISA de los Ac anti Vi (IgG, IgA e IgM),
con sensibilidad y especificidad de alrededor del 90% en casos probados de fiebre tifoidea.

Brucellosis
Cuando un individuo presenta los primeros sntomas clnicos e brucelosis ya tiene
anticuerpos en el suero, en particular anti-LPS, se detectan por aglutinacin (prueba del Rosa
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de Bengala), tambin existen pruebas de Coombs para detectar Ac no aglutinantes y pruebas


de ELISA para detectar IgM, inmunocromatografa para IgG, IgM e igA.
Recientemente se ha introducido el dipstick, que detecta anticuerpos especficos de
clase IgM con una sensibilidad similar a la aglutinacin, pero con la ventaja de una mayor
facilidad y rapidez. Es una prueba colormetra en tira: una cinta de nitrocelulosa impregnada
de anticuerpos monoclonales anti-IgM humana; la prueba se cuantifica en cruces, ha
demostrado ser muy sensible y especfica, se considera especialmente apropiada para el
diagnstico en lugares con pocos recursos.

Mononucleosis infecciosa
La prueba fundamental para establecer el diagnstico de la MNI por VEB es el test de
Paul-Bunnel-Davidshon (PBD) que detecta la presencia de anticuerpos heterfilos.
En la actualidad existen mtodos comercializados de aglutinacin en porta
(MonospotR) basados en el test de PBD, considerndose positivos ttulos superiores a 1:2. Los
anticuerpos heterfilos son un grupo heterogneo de anticuerpos (expresin de la
transformacin linfocitaria de los linfocitos B tras la infeccin por el VEB).Aparecen a las dos
semanas de la infeccin y persisten durante 8-12 semanas, en algunos casos hasta 1 ao.
Tambin se estudian tres tipos de anticuerpos: anti-VCA, anti-EBNA, anti-EA mediante tcnicas
de IFI y ELISA.

Infecciones por herpesvirus


Existen pruebas serolgicas para el estudio de las infecciones de herpes simple 1 y 2 y
citomegalovirus de fijacin de complemento, neutralizacin, aglutinacin de ltex, IF y ELISA.

Rubeola
Para el diagnstico de rubeola, la inhibicin de hemaglutinacin ha sido una tcnica
clsica para el diagnstico de rubola. Hoy en da los mtodos inmunoenzimticos ELISA para
deteccin de inmunoglobulinas (IgG e IgM) son los ms empleados.
La determinacin de anticuerpos IgG se utiliza como marcador de exposicin previa
(asumiendo su positividad como sinnimo de inmunidad). En Espaa, desde hace varios aos,
se realiza un control de IgG durante el embarazo recomendndose la vacunacin posparto de
las mujeres seronegativas.
El diagnstico serolgico de infeccin se basa en la determinacin de IgM, la
seroconversin de IgG (cambio de negativo en una muestra tomada en la fase aguda de la
enfermedad a positivo en una muestra tomada en la fase convaleciente) o el serorefuerzo de
IgG (aumento al menos cuatro veces el ttulo en la segunda muestra en un estudio en paralelo
con la primera).

Sfilis
Para el diagnstico serolgico de sfilis existen dos tipos de pruebas serolgicas, las no
treponmicas y las treponmicas. Las no treponmicas detectan los Ac denominados
inespecficos o reagnicos; las treponmicas detectan los Ac especficos o treponmicos.

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Se recomienda efectuar ambos tipos de pruebas si existe sospecha de sfilis. Para


estudio de la poblacin (por ejemplo: donantes) se usan las pruebas no treponmicas como
cribado inicial y las treponmicas para confirmar los resultados.
Pruebas no treponmicas. Estas pruebas detectan anticuerpos de tipo IgG e IgM
dirigidos contra antgenos lipoideos producidos en los tejidos del husped daados por
el treponema (o por otras enfermedades), capaces de reaccionar in vitro con
complejos de cardiolipina-colesterol-lecitina. Un 1% de la poblacin presenta falsos
positivos, aunque en general a ttulos bajos por lo que los positivos deben ser
confirmados con una prueba treponmica. Los falsos negativos son raros, excepto en
fases muy precoces, o si los ttulos muy elevados originan fenmenos de prozona
(menos del 2% de los casos de sfilis secundaria), por lo que es conveniente realizar
diluciones mayores si existe una sospecha fundada. Los ms utilizados son el RPR
(rapid plasma reagin), es una prueba de aglutinacin y el VDRL (venereal disease
research laboratory).
Las pruebas no treponmicas se vuelven reactivas entre 1 y 4 semanas tras la aparicin
del chancro, y son casi siempre positivas en la sfilis precoz; posteriormente los ttulos
caen, y el 30% de los pacientes con sfilis terciaria dan resultado negativo.
Pruebas treponmicas. Estas pruebas detectan anticuerpos especficamente dirigidos
contra T. pallidum. Se trata de pruebas cualitativas, por lo que los resultados se
expresan como reactivo o no reactivo. Los falsos positivos son raros (menos del 1%) y
prcticamente no presentan falsos negativos, por lo que una prueba treponmica
negativa indica ausencia de infeccin pasada o presente. Existen varias: las
tradicionales son el FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absortion), de IF, y el
TPHA (treponema pallidum haemoaglutination assay) de aglutinacin. Ms actual es
la prueba de ELISA (IgG) posee buena sensibilidad y especificidad, se propone para
confirmar el cribado con pruebas reagnicas, tambin se acepta lo contrario cribar con
ELISA y confirmar con RPR.

Infecciones parasitarias
Las pruebas serolgicas son el principal mtodo diagnstico de la toxoplasmosis. La
inmunoglobulina G (IgG) anti-toxoplasma aparece entre 1-3 semanas tras la infeccin,
alcanzando el nivel mximo a las 6-8 semanas y disminuyendo progresivamente durante los
dos aos siguientes, aunque permanece positiva durante toda la vida. La inmunoglobulina M
(IgM) aparece durante la primera semana de la infeccin, y disminuye e incluso desaparece en
los siguientes meses (a veces puede persistir positiva durante aos). Para el diagnstico es
importante la existencia de seroconversin: elevacin del ttulo de anticuerpos en muestras
separadas 3 semanas (tanto de IgM como IgG), o en la presencia de IgM en ausencia de IgG.

El diagnstico de hidatidosis se puede confirmar con pruebas serolgicas: deteccin de


Ig M, Ig G e IgA. Las pruebas ELISA y hemaglutinacin pasiva pueden usarse como cribado,
confirmando la positividad con Western blot o inmunodifusin en gel.

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Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16

En el diagnstico de Leishmaniasis visceral se usan pruebas de IFI y ELISA que utilizan


mezclas antignicas de diferentes especies, la positividad no informa sobre la especie.
Tambin existen kits de ELISA e IFI para el estudio de la enfermedad de Chagas.

Para el diagnstico de paludismo hay pruebas de IF que llevan antgenos de las cuatro
especies, son muy sensibles y de alta especificidad pero no permiten identificar la especie ni
entre infeccin actual o pasada. Tambin hay kits de ELISA. LA serologa no es la prueba
diagnstica recomendable, es ms til el examen directo.
Para el diagnstico de amebiasis hay tcnicas de ELISA o IFI, antes haba de
hemaglutinacin.

Las pruebas serolgicas tambin son tiles para el diagnstico de triquinosis y


esquistosomiasis.

Infecciones fngicas

En los laboratorios clnicos no son comunes la pruebas serolgicas para el diagnstico


de las micosis. Existen pruebas de Inmunodifusin, ELISA, aglutinacin de ltex y fijacin de
complemento, su utilidad es limitada por la falta de especificidad de los antgenos y por la
lentitud de los resultados en los pacientes inmunodeprimidos (casos graves de infecciones
fngicas), no se puede esperar a que las pruebas serolgicas den positivo para iniciar
tratamiento.

Aunque se han desarrollado muchas pruebas serolgicas para la deteccin de


anticuerpos frente a C. albicans, solo la deteccin de anticuerpos contra antgenos del micelio
de C. albicans por IFI tiene la sensibilidad o especificidad necesarias para el diagnstico y
seguimiento de la candidiasis invasora. Las tcnicas inmunolgicas para la identificacin de
componentes celulares circulantes de Candida, como el manano, parecen prometedoras.

Infecciones por Rickettsia

El diagnstico serolgico es un mtodo adecuado para las ricketsiosis graves (fiebre


botonosa, fiebre Q, etc.). Existen pruebas de IFI, ELISA, aglutinacin de ltex.

Infecciones congnitas
Las infecciones congnita causadas por virus de la rubola, citomegalovirus, parvovirus
19, toxoplasma, listeria y treponema de la sfilis se pueden diagnosticar detectando
anticuerpos IgM en la sangre de cordn (fetal) evitando la contaminacin por sangre materna.

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Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16

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Hepatitis , A, B y C

Es el diagnstico serolgico de la hepatitis A se estudia la presencia de anticuerpos


anti-VHA de clase IgM. Este anticuerpo aparece al principio de los sntomas y permanece
durante 6 meses. Los anticuerpos IgG anti-VHA aparecen desde el principio de la enfermedad
y permanecen durante dcadas, por lo que no tienen valor para el diagnstico de la
enfermedad.

El diagnstico serolgico de la hepatitis C se realiza mediante la deteccin en suero de


los anticuerpos anti-VHC tipo IgG, indicadores de infeccin presente o resuelta. La
determinacin de IgM no es vlida, dado que en la infeccin aguda la aparicin de anti-VHC
(seroconversin) se produce entre 6 y 12 semanas tras la exposicin (periodo de ventana).
El estudio de anticuerpos anti-VHC se acompaa de la determinacin de ARN-VHC y la
determinacin de valores de la transaminasa GPT.

El diagnstico serolgico de la hepatitis B consiste en determinar la presencia de


anticuerpos antiHBc de tipo IgM e IgG, antiHBe y antiHBs. Estas determinaciones se
acompaan de las determinaciones del Ag de superficie y Ag e del VHB, la determinacin de un
marcador de dao heptico, la GPT, adems del estudio de ADN-VHB.

Hepatitis B aguda
HBsAg HBeAg IgM antiHBc IgG antiHBc antiHBe antiHBs ADN-VHB GPT
Fase inicial + + + - - - +++ +++
Curacin - - - + + + +/- -

Hepatitis B crnica

HBsAg HBeAg antiHBe ADN-VHB GPT


Inmunotolerancia + + + Normal
Hepatitis crnica + - -/+ ++ +++

Portador inactivo + - + - Normal

Sindrome de Inmuno-Deficiencia Adquirido (SIDA)


El SIDA es una enfermedad en la que el ser humano no es capaz de ofrecer una
respuesta inmune adecuada contra las infecciones, debido a la inmunodeficiencia provocada
por el VIH. El VIH, es un virus ARN perteneciente a la familia de los retroviridae. Su genoma es
una cadena de ARN monocatenario que debe copiarse provisionalmente a ADN para poder
multiplicarse e integrarse en el genoma de la clula que infecta. Su parte exterior es la
"cubierta", una membrana que originalmente perteneca a la clula de donde el virus emergi.
En la cubierta se encuentra una protena del virus, la gp41, o "glicoprotena transmembrana".
Conectada a la gp41 est la gp120, la cual puede unirse al receptor CD4 localizado en la

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Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16

superficie de los linfocitos T para penetrar en ellos. En la nucleocpside se encuentra las


protenas p24, p9, p17 y p7.
El diagnstico serolgico es lo ms utilizado para el diagnstico de sida, aunque la
combinacin con mtodos directos (aislamiento y cultivo del VIH, deteccin de antgenos
virales en sangre, sobre todo Ag p24 y deteccin de material gentico del virus mediante PCR)
se realiza en casos de primoinfeccin o seroconversin reciente, y en la infeccin perinatal; en
estos casos el uso de mtodos serolgicos es insuficiente.
Dentro de las pruebas serolgicas, distinguimos entre pruebas de screening y pruebas
de confirmacin.
Pruebas de screening: el mtodo ms utilizado es el enzimoinmunoanlisis (EIA) para la
deteccin de anticuerpos frente al VIH-1 y VIH-2 en suero (anti-gp41, anti-gp24, etc.).
En la actualidad hay ms de 130 pruebas comerciales de EIA de tercera y cuarta
generacin, con mayor sensibilidad y rapidez diagnstica que las pruebas iniciales.
Existen pruebas serolgicas rpidas que utilizan antgenos recombinantes o pptidos
sintticos del VIH-1, de realizacin muy sencilla por lo que pueden practicarse en
cualquier laboratorio, las ms utilizadas son las de aglutinacin de ltex y las de ELISA
de membrana (dot-blot). Poseen una aceptable sensibilidad y especificidad, pero
inferiores a las tcnicas de EIA. Recientemente se han introducido tcnicas de
inmunocromatografa.
Pruebas de confirmacin: el Western blot (WB), line inmunoassay (LIA) o recombinant
inmunoblot assay (RIBA). En stas pruebas se enfrenta el suero del paciente a los
antgenos purificados y separados en una tira de nitrocelulosa. Para los Centros para
el Control y la Prevencin de Enfermedades (CDC), se consideran positivos cuando se
detectan anticuerpos contra dos de las tres protenas de envoltura del virus
(gp160/120, gp 41 y p24.
o El Western blot se realiza en tres etapas: las protenas se separan mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfieren a papel de nitrocelulosa,
finalmente las bandas de protenas se visualizan especficamente con
anticuerpos marcados; es el mtodo ms empleado para la confirmacin de
los resultados obtenidos con las pruebas de screening.
Un inconveniente de las pruebas serolgicas es el llamado "perodo ventana", que es
como se denomina al tiempo que tardan en aparecer los anticuerpos que han de ser
detectados por dichas pruebas, y que se estima en una duracin de hasta tres meses. Por ello,
se recomienda la realizacin de dos pruebas serolgicas separadas por tres meses entre s,
siempre que no se repita la prctica de riesgo, para descartar de forma definitiva la infeccin
por VIH.
3. Reactantes de fase aguda en caso de infecciones
Los reactantes de fase aguda son aquellas pruebas de laboratorio cuyos resultados estn
aumentados cuando existe un proceso inflamatorio sea de tipo infeccioso o autoinmune.
Los reactantes de fase aguda son varios, los ms utilizados son la velocidad de
sedimentacin globular (VSG), la protena C reactiva y el factor reumatoide. Son totalmente
inespecficos pero son indicativos del curso de la enfermedad. El FR alto indica enfermedad
autoinmune.
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