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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR

INFORME DE LABORATORIO N: 04

TEMA:

Identificacin morfolgica y clasificacin de bacterias segn tincin Gram a partir


de muestras de mucosa bucal, superficies, soluciones y placas preparadas
previamente

INTEGRANTES: Paula Alarcn


Michelle Apunte
Cristhian Pacheco

NCR: 1285

DOCENTE: Karina Ponce

27 de Junio del 2015


Sangolqui - Ecuador
1. TITULO

Identificacin morfolgica y clasificacin de bacterias segn tincin Gram a


partir de muestras de mucosa bucal, superficies, soluciones y placas preparadas
previamente.

2. INTRODUCCIN

La tincin Gram es una de las maneras ms prcticas y cmodas para poder


teir las bacterias en muestras previamente preparadas para una completa
observacin de las mismas Barrera, H y Crdenas, R. 1997). A continuacin se
va a explicar la metodologa de esta tincin para poder hacer la correcta
observacin de las bacterias que van a ser vistas.

Hacer el extendido con un palillo de madera.


Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres
veces aproximadamente).
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un
minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos segn la
concentracin del reactivo (parte crtica de la coloracin). (las gram - se
decoloran, las gram + no)
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar un
minuto. Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias gram
negativas.

El cristal violeta penetra en todas las clulas bacterianas (tanto gram positivas
como gram negativas) a travs de la pared bacteriana (Gonzalez M.; Caballero
M.; Olivares ; Santistebar A.; Serrano M.P. (2003).. El lugol hace que se fije los
compuestos de la placa, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana Barrera, H y Crdenas, R. 1997)..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin.
Luego de esto los organismos gram positivos no se decoloran, mientras que los
gram negativos s lo hacen.

Para las gram negativas van a quedar de color rojo por efecto de la safranina
o la fucsina. Despus de la coloracin se da lugar a que las clulas gram
negativas son rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.

3. HIPTESIS

Constan bacterias presentes en la cavidad bucal de los estudiantes.

Existe la presencia de bacilos en la muestra de yogurth.

4. OBJETIVO GENERAL:

Identificar la morfologa y clasificacin de las bacterias empleando la tincin


Gram desde muestras de mucosa bucal, superficies, soluciones y placas
preparadas previamente.

5. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Evaluar con criterio y en forma grupal, la informacin investigada acerca
de la tincin Gram y clulas procariotes (bacterias).
Realizar adecuadamente un frotis con la muestra seleccionada.
Discutir sobre las propiedades de la pared celular de las bacterias Gram
positivas y negativas para retener colorante, en base a bibliografa
confiable.
Identificar morfolgicamente y clasificar bacterias segn tincin
diferencial: Gram, a partir de muestras fciles de obtener en base a
bibliografa confiable.
Discutir sobre la funcin de cada uno de los colorantes y reactivos
utilizados en la tincin Gram de bacterias en base a bibliografa cientfica.
6. INTRUMENTOS:

Muestras: Muestras de la mucosa bucal de los estudiantes de la clase,


superficies, soluciones y cultivos puros preparados en placas previamente.
Equipos: Microscopios pticos de campo claro, (lente objetivo 100x con
aceite de inmersin).
Materiales de proteccin personal: Mandil, guantes, mascarillas.
Reactivos: Reactivos para tincin Gram: (Cristal violeta, lugol, alcohol-
cetona y safranina), aceite de inmersin, agua destilada, alcohol antisptico,
alcohol potable para mecheros.
Materiales e insumos: Placas portaobjetos, pipetas desechables, mecheros
de alcohol, papel especial para limpieza de microscopios, algodn, fsforos
o fosforera, palillos de dientes estriles, hisopos de madera estriles, picetas
con agua destilada, vaso de precipitacin 500mL, vasos de precipitacin
50mL, papel toalla, bandeja para tinciones.
Organismos: Bacterias presentes en flora normal, superficies, soluciones,
placas preparadas previamente.

7. METODOLOGA:

Toma, frotis y fijacin de muestras


1. Con un palillo estril s tomo una muestra de la mucosa bucal, frotando la
mejilla interna de la boca.
2. Se prepar soluciones a partir de las muestras obtenidas en el laboratorio.
3. Con la ayuda de un hisopo, palillo estril o pipeta desechable, se tom
muestras de superficies o soluciones seleccionadas.
4. Se hizo un frotis y expandir cada una de las muestras tomadas sobre una
placa portaobjetos, se aadi una gota de agua destilada, se rotulado en el
esmerilado.
5. Se fij la muestra al calor, pasando la placa portaobjetos varias veces por la
llama azul del mechero, cuidando de no sobrecalentarla. Si sobrecalienta
esperar que se enfre para volver a pasarla por la llama.
Tincin Gram
1. Se deposit la placa con la muestra previamente fijada sobre la bandeja para
tinciones.
2. Se aplic sobre la muestra, el primer reactivo de la tincin Gram: cristal violeta
o violeta de genciana, cubrindola por 1 minuto
3. Sobre la bandeja de tinciones, lse lavo con agua la placa desde una piceta o
pipeta desechable, para eliminar el exceso de Cristal violeta.
4. Se aplic el segundo reactivo de la tincin Gram: Lugol, cubriendo toda la
muestra, durante 1 minuto.
5. Se lav con agua desde una piceta o pipeta desechable, para eliminar el
exceso de lugol.
6. Se aplic decolorante (alcohol-cetona), cubriendo la muestra durante unos
segundos y se elimin. Se hizo esto hasta que dejara de salir el agua de color
violeta.
7. Se lav con agua desde una piceta o pipeta desechable.
8. Se aplic el colorante de constaste: Safranina, cubriendo la muestra, durante
30 segundos.
9. Se enjuago la muestra con agua desde una piceta o pipeta desechable.
10. Se sec la placa a la llama azul del mechero, para acelerar el proceso de
secado. En su defecto se sec al aire libre.
11. Se coloc una gota de aceite de inmersin en la placa preparada en clases.
12. Se observ al microscopio directamente con lente objetivo 100x. Para ello
colocar el lente objetivo 100x moviendo el revlver del microscopio, se subio
la platina hasta que el lente objetivo quedo sumergido en el aceite de
inmersin. Y se observ.
13. Se identific la morfologa de las bacterias presentes y se las clasifico segn
su tincin.
8. RESULTADOS

100X 100X

Diplococos Muestra de mucosa Muestra de Yogurt Tony


Bacilo
Clula con diplococos bacilos

Ncleo

9. DISCUSIN

Bacterias Gram-negativas se decoloran por la alcohol, perder el color prpura


de cristal violeta. Bacterias Gram-positivas no se decoloran y permanecen
prpura (Benson, 2001). En la prctica se logr observar los 2 diferentes colores
que se dan en el proceso de las tinciones Gram tanto positivas como negativas
con la respectiva coloracin que tiene cada una de ellas como en la saliva se
daba tincin Gram positiva.

Estas diferencias en la tincin de Gram se deben a diferencias en la estructura


de la pared celular de las bacterias gran positivas y Gram negativas (Parker
2004). Gracias a estas diferentes coloraciones se puedo distinguir cada bacteria
por la coloracin que tuvieron como en el vinagre, que tom el color purpura aqu
exista la presencia de bacilos.

La mayora de las bacterias Gram-positivas son inofensivos, de vida libre, pero


la mayora de los grupos principales incluyen patgenos de humanos, otros
animales y plantas. Algunas bacterias Gram-positivas son muy importante en las
industrias de alimentos y productos lcteos (Prescott, 2008). Una de las
bacterias que se lograron observar fue la del lactobacilo que se la encontr en la
muestra del yogurt.

10. CONCLUCIONES
Se realiz un frotis adecuado para la muestra seleccionada.
Se discuti sobre las propiedades de la pared celular de las bacterias Gram
positivas y negativas que permite la retencin del colorante.
Se identific morfolgicamente y se clasifico las bacterias segn tincin
diferencial: Gram, a partir de muestras fciles de obtener.
Se discutio sobre la funcin de cada uno de los colorantes y reactivos
utilizados en la tincin Gram de bacterias

11. BIBLIOGRAFA

Junqueira, L.C, Carneiro Jos. 1998 Biologa celular y molecular. Sexta


Edicin Ed. Mac Graw Hill. Chile. Pg. 24, 25.

Barrera, H y Crdenas, R. 1997. El microscopio ptico. Editorial Plaza y


Valdes, Mxico. Pg 45-46.

WELSCH, U. (2008). Histologa en U. Welsch, Histologa panamericana.

AUDESIRK, T., AUDESIRK, G., & BYERS, B. (2003). La Vida en la Tierra


(Quinta ed.). Pearson Educacin, Colorado.

Plantsand theology (2015) history and parts.(pag 143-150)

PRESCOTT, HARLEY & KLEINS (2008). Microbiology (sptima ed.). Higuer


education, Estados Unidos.

Brown, Alfred. Bensons Microbiological Applications: Laboratory Manual in


General Microbiology. Mc. Graw Hill. Octava Edicin. EE.UU. 2001.