You are on page 1of 7

Esencialmente la SPE es considerada como una cromatografa, en la cual se

tiene como objetivo realizar la separacin de ciertos componentes de una muestra


mediante su distribucin en dos fases: una estacionaria y otra mvil. La estacionaria
es principalmente un slido o un slido con caractersticas gomosas retenido sobre
un soporte, mientras que la fase mvil es lquida

En la SPE la mayora de la aplicaciones emplean cartuchos que son


pequeas columnas, generalmente de plstico (usualmente polipropileno), que
contienen un relleno con cantidades variables (100-500 mg) de materiales similares
a los usados como fase estacionaria en cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC)., Sin embargo, la principal diferencia radica en el tamao de la partcula,
que
puede ser de 40 m, en lugar de 5 m, que es la usualmente empleada en HPLC

Las fases estacionarias empleadas pueden ser clasificadas segn Len-


Gonzlez y Prez-Arribas (2000) en no polares, polares y de intercambio inico. Las
no polares son aquellas que tienen grupos metilo, octilo (C8) u octadecilo (C18),
unidas a una superficie de slica, se les conoce tambin como de fase reversa o
fase
inversa (RP), mientras que las polares son slica sin modificacin, o unida a grupos
ciano, amino o diol. Finalmente los rellenos de intercambio inico estn constituidos
por grupos funcionales catinicos o aninicos e inclusive resinas "Amberlite" y
"Porapaq Q", as como tambin fases estacionarias de carbn activado (Hennion,
2000; Rodrguez, et al. 2000). La capacidad de retencin de solutos dentro de una
columna SPE depende del tipo de material de relleno, tamao de la columna, tipo
de
analito y condiciones de extraccin. Segn Majors, (2002 a,b) se usan en un 90%
con rellenos en fase reversa (slica modificada), de los cuales un 55% corresponde
a
slica unida a grupos C18, mientras que el uso de fases normales (slica sin
modificar) es de solamente un 10%.

Usos
1.- Eliminacin de interferencias de muestras
2.- Concentracin de muestras
3.- Fraccionamiento de una mezcla compleja, en grupos o compuestos.
4.-Almacenamiento de analitos inestables.
5.- Como base para la realizacin de reacciones de formacin de derivados.
Reactivos utilizados y usos
Otra variante del SPE se logra mediante el uso de reactivos de par-inico
para el control de la ionizacin de un compuesto. Usualmente se debe trabajar con
substancias altamente hidroflicas, bases o cidos orgnicos, que se mantienen en
forma inica dentro de los rangos habituales o recomendados para preservar la
integridad de la fase estacionaria de un relleno

TABLA 2. Aplicaciones de par-inico (IPC) con extraccin en fase slida (SPE) en


alimentos.
2.5.- Equipos para la SPE.
Los equipos empleados para la SPE, se muestran en la FIGURA 8. Estos
pueden emplear la fuerza de gravedad para el paso de la muestra, sin embargo este
flujo es generalmente muy bajo, razn por la cual se puede utilizar una jeringa para
forzar el lquido a travs del cartucho o disco. Este procedimiento puede ser
dificultoso en muestras viscosas o que contienen partculas en suspensin. Otra
alternativa consiste en aplicar vaco con embudo de filtracin o bombas.

Cuando se procesan varias muestras se puede emplear un sistema de vaco,


en el cual una bandeja removible con varios puestos para tubos de recoleccin se
encuentra en el interior del equipo, una vez completada la extraccin, se puede
remover la bandeja con las muestras extradas. Generalmente estos dispositivos
poseen vlvulas y medidores que controlan el vaco aplicado, en unidades ms
sofisticadas puede haber controles individuales de vaco para cada uno de los
cartuchos.
Un equipo de los ms populares lo constituye la estacin de trabajo de 96
(8x12), puestos, o sistema SPE-96, con un espaciado de 9 mm entre cada puesto,
que permite procesar numerosas muestras en paralelo y acoplar, por medio de
interfaces, a un equipo de HPLC, inclusive se han diseado estaciones de hasta
384
puestos (16x24) con espaciado entre ellos de 4,5 mm, para extraccin por SPE. Sin
embargo de este ltimo se ha sealado que se debe tener precaucin, ya que la
gran cantidad de muestras, requiere de una manipulacin muy precisa, que de otra
manera, puede generar problemas tales como: secado en algunos cartuchos,
variabilidad en los flujos de solventes, e inclusive formacin de nebulizacin con
posible contaminacin cruzada de muestras (Majors, 2000). El empleo de la
estacin
de 96 puestos ha permitido la automatizacin en equipos de anlisis, segn Rossi
y
Zhang, (2000) de un total de 10 equipos comerciales, seis de ellos con las mayores
velocidades de procesamiento, emplean los mdulos de 96 puestos.
2.6.- Metodologa para la extraccin por SPE
Para la preparacin de las muestras, se sigue bsicamente el siguiente
procedimiento:
1.- Lavado y activacin de la columna, esta operacin se realiza con el objeto
de solvatar los grupos funcionales del material de relleno de la columna. Esta paso
es necesario para activar su superficie, especialmente en el caso de emplear fase
reversa, la cual debe "estirarse" para lograr la interaccin. Para C8, C18 o fenil, que
se han dejado secar, estas pueden tener una menor capacidad de retencin, por
esto es necesario una fase de lavado que permita la completa solvatacin. Por otra
parte este lavado permite eliminar impurezas, que pueden estar presentes en el
dispositivo o que fueron recolectadas del ambiente del laboratorio durante el
almacenamiento hasta su uso (Quattrocchi et al. 1992; Fritz y Macka,.2000).
En fase reversa, la activacin se realiza pasando aproximadamente dos
volmenes equivalentes a la columna con un solvente orgnico y luego dos
volmenes con agua o buffers. El primer paso se emplea adems para eliminar las
substancias provenientes de muestras anteriores, que puedan estar retenidas en la
columna, y se realiza con metanol u otros solventes menos polares como acetonitrilo
o tetrahidrofurano. El segundo paso se utiliza para equilibrar la columna con un
solvente igual o similar al empleado, para disolucin de las muestras.
Majors y Slack, (2003) sealan que el metanol es frecuentemente empleado
para acondicionar SPE en fase reversa o rellenos con fases estacionarias polares
tales como ciano, amino y diol. En el caso de SPE en fase normal, el metanol puede
desactivar la superficie activa de slica, razn por la cual se emplea cloruro de
metileno, para este proceso de acondicionamiento y lavado.
Despus que el lecho de relleno es acondicionado, el exceso de solvente
puede ser eliminado por una corriente de aire a travs del dispositivo, hasta que no
se produzca goteo del solvente, tomando la precaucin de no llegar a producir un
secado. En el caso de SPE en fase reversa se prefiere remover el exceso de
solvente empleado para el lavado y activacin, mediante la incorporacin de otro
solvente miscible con el primero (soluciones acuosas o buffers), preferiblemente si
ste es el que se emplear en la fase de extraccin del analito o es de la misma
composicin de la fase en la cual se encuentra disuelta la muestra.
2.- Aplicacin de la muestra, se emplea un caudal generalmente entre 1 a 10
mL/min, este paso debe efectuarse lentamente, ya que flujos rpidos pueden
producir efectos cinticos en el relleno que conducen a bajas recuperaciones del
analito. Quattrocchi et al. (1992) seala que se pueden aplicar las siguientes
modalidades:
2.1.- Aplicacin directa de la solucin a inyectar para lograr la extraccin
rpida del analito, pero provocando la retencin de impurezas, que posean una
mayor afinidad por el relleno de la fase estacionaria del dispositivo. En este caso lo
que se desea es retener la impurezas y dejar que el compuesto de inters pase
libremente. Esta opcin no produce concentracin, sino soluciones ms limpias con
menor nmero de interferencias o substancias que produzcan dao a la columna
cromatogrfica.
2.2.- Retencin del analito en la columna, utilizando un solvente dbil, en
general seguido de un lavado con un solvente particular que no extraiga el analito,
para posteriormente realizar la extraccin con otro solvente ms fuerte. Este mtodo
es el ms habitual y puede utilizarse para preconcentrar muestras, pasando grandes
volmenes a travs de la columna.
En la SPE en fase reversa, en la cual la muestra est disuelta en un solvente
que muestra una baja afinidad por el analito, es de esperar que ste se retenga en
el
dispositivo. En general se recomienda emplear soluciones con un bajo porcentaje
de
componente orgnico (< 10%), de manera de facilitar la retencin. El paso de la
solucin es usualmente realizado, con la aplicacin de vaco (en el extremo terminal
del cartucho, o aplicando presin en la cabeza del dispositivo (Fritz y Macka, 2000)
3.- Lavado de la columna, se refiere a la eliminacin de las impurezas
retenidas en el paso anterior, utilizando un solvente relativamente dbil con el cual
el
analito no es extrado. El lavado de la columna no es indispensable, pero en general
es recomendable ya que produce muestras con menos interferencias.
Para la eliminacin de interferencias, se emplea un solvente con una fuerza
intermedia, de tal manera que no extraiga el analito de inters. En teora, el punto
ptimo constituye aquel en el cual se tiene una condicin en que el analito est casi
justo por empezar a salir del dispositivo, obtenindose que compuestos que son
ms
dbilmente retenidos por el relleno de la columna son eliminados.
Sin embargo esta condicin de idealidad segn Majors y Slack, (2003) no
siempre puede ser obtenida y debe por lo tanto evaluarse un procedimiento para
determinar el porcentaje de recuperacin que se puede obtener con la SPE. Por
otra
parte se ha sealado que existe variabilidad en la capacidad de separacin entre
cartuchos, con lo cual se debe disponer de un volumen o margen de "seguridad",
en
las cantidades empleadas para la remocin de interferencias.
4.- Extraccin del analito, finalmente el analito se extrae con un solvente, que
posea la fuerza necesaria, empleando entre 5 a 20 volmenes de columna.
Si el propsito consiste en detectar trazas, el analito debe ser recuperado
preferiblemente en la menor cantidad posible de solvente, esto puede lograrse
mediante la extraccin con un solvente fuerte, de tal manera que el factor de
capacidad sea igual a cero (k = 0 ). Es factible tambin en el caso de necesitar un
mayor volumen para recobrar el analito, el empleo posterior de un proceso de
evaporacin de solvente, tomando las precauciones o consideraciones del grado de
susceptibilidad trmica del analito. Esta evaporacin puede ser por tratamiento
trmico o por corriente de un gas inerte (nitrgeno), con o sin aplicacin de vaco
etc. El residuo o la fraccin reducida de volumen puede ser disuelta o retomada
preferiblemente en la fase mvil en la cual se va a emplear para la determinacin
por
HPLC. En este punto se debe tener la precaucin de no emplear para la extraccin
del analito por medio de la SPE, de solventes que tengan una gran afinidad por el
compuesto de inters, en relacin a la fase mvil que se emplear para la
determinacin por HPLC, ya que, la introduccin al equipo de estos solventes junto
al analito, puede llegar a comprometer la eficiencia para la resolucin que pueda
tener la fase estacionaria de la columna.
En caso de muestras que posteriormente sern analizadas por GC puede
aplicarse aire o nitrgeno a travs del cartucho de manera de eliminar al mximo
los
solventes en los cuales estaba disuelta la muestra, a continuacin se extrae con un
solvente orgnico de bajo punto de ebullicin, de manera que este no produzca una
interferencia en el cromatograma (Fritz y Macka, 2000)
Dependiendo del diseo de las columnas y de las necesidades del analista, el
solvente puede pasarse por medio de una jeringa o aplicando vaco. Durante toda
la
metodologa de extraccin las columnas deben mantenerse hmedas y no se
pueden secar, lo cual conducira a bajas recuperaciones y a la formacin de canales
por los cuales no se producira la extraccin.
Un ejemplo de un mtodo de la SPE es reportado por Young et al. (2001)
para la determinacin de funguicidas (thiabendazol y carbendazima) en jugo de
manzana, como se muestra en el ESQUEMA 3. Se emplearon cartuchos "Oasis
MCX", de fase reversa e intercambiador catinico fuerte, relleno de 150 mg y de 30
m. Brevemente, el procedimiento comienza con un acondicionamiento de la
columna empleando 2 mL de metanol y 3 mL de solucin de hidrxido de amonio
(0,15M), de manera de activar la superficie inica del relleno, se introduce la
muestra, y se procede a realizar dos lavados para eliminar substancias
interferentes,
a continuacin se aade 2 mL de solucin de cido clorhdrico (0,1 M), para cambiar
a su forma cationica el analito, se vuelve a lavar con 2 mL de metanol, para
finalmente extraer con 3mL de metanol e hidrxido de amonio (0,3 M).