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Protocolos das Aulas Laboratoriais de

Bioquímica e Biologia Molecular


Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Lic. Engenharia Biológica
Mestrado Integrado em Engenharia Química
Lic. Engenharia Química
Lic. em Química
Lic. em Engenharia dos Materias

2º Semestre. 2006/2007





Arsenio Fialho
Leonilde Moreira
Alvaro Tavares
Jorge H. Leitão
Marilia Mateus
Isabel Sa-Correia



Instituto Superior Técnico


Protocolos das Aulas Laboratoriais de

Bioquímica e Biologia Molecular



TP1.- Análise de proteínas por electroforese em Gel de SDS-Poliacrilamida
(SDS-PAGE)

TP2.- Caracterizacão cinética da enzima invertase

TP3.- Extraccão do DNA cromossómico de Escherichia coli e cálculo da sua
concentracão. Extraccão rápida e em pequena escala de DNA plasmídico
(método da lise alcalina).

TP4. - Digestão do DNA cromossómico e plasmídico com endonucleases de
restricão; separacão e visualizacão de fragmentos de restricão por
electroforese em gel de agarose.


TP.1 - ANÁLISE DE PROTEINAS POR ELECTROFORESE EM GEL DE
SDS-POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)


Introducão

As proteinas constituem uma vasta classe de biomoleculas que desempenham na celula Iuncões
muito diversas. Para analisar simultaneamente um tão grande e variado grupo de compostos. e
necessario recorrer a tecnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos.
mas que simultaneamente evidenciem pequenas variacões no seu comportamento. de modo a que
as varias moleculas seiam diIerenciadas.
As tecnicas de electroIorese caem nesta categoria. e são largamente utilizadas pois baseiam-se no
Iacto de todas as proteinas apresentarem uma carga electrica global quando colocadas num meio
de pH diIerente do seu ponto isoelectrico. Deste modo e possivel provocar a migracão de
proteinas sugeitando-as a um campo electrico. Essa migracão variara de acordo com a proteina.
uma vez que e inIluenciada pelo tamanho. carga. Iorma e composicão quimica de cada molecula.
Grosseiramente. pode-se considerar que a migracão electroIoretica duma molecula e apenas
Iuncão da sua densidade de carga. ou seia . da respectiva razão carga/massa. Assim as proteinas
separar-se-ão de acordo com o respectivo valor desta razão: quanto maior ela Ior. maior sera a
velocidade de migracão da molecula.

A electroIorese em gel de poliacrilamida (PAGE) e um metodo rapido e sensivel para analisar
a composicão de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em que os
monomeros de acrilamida. ao polimerizarem. Iormam longas cadeias. as quais se ligam entre si
por crosslinking ('ligacões cruzadas¨). atraves dos residuos de bis-acrilamida. tambem nelas
incorporados. O processo de polimerizacão consiste numa reaccão em cadeia de radicais livres.
iniciada pelo persulIato de amonio (PSA) e pelo N.N.N`.N`-tetrametilinediamina (TEMED). os
quais se encontram presentes na mistura de polimerizacão. O PSA activa o TEMED. deixando-o
com um electrão desemparelhado. Este radical reage então com uma molecula de acrilamida.
transIormando-a tambem num radical. Este. por sua vez. reage com um outro monomero de
acrilamida (ou. ocasionalmente. com a bis-acrilamida). dando origem a novo radical. e assim
sucessivamente ate se Iormar um polimero com ligacões cruzadas (crosslinked). O numero de
ligacões cruzadas (quantidade de crosslinking). controla o tamanho dos poros do gel e
consequentemente determina o intervalo de massa molecular das proteinas que podem ser
separadas nesse gel. Isto quer dizer que. consoante o numero de ligacões cruzadas. assim se
separam as proteinas com baixa massa molecular ou com elevada massa molecular. O conteudo
total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30°. correspondendo o valor da percentagem
ao total das moleculas de acrilamida (i.e. acrilamida e bis-acrilamida. p/v).
A separacão de uma mistura de proteinas no sistema SDS-PAGE e pois um reIlexo da
diIerenca dos respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) proteina(s) em questão pode ser
estimada por comparacão da respectiva mobilidade electroIoretica (R
I
). com a de proteinas de
massa molecular conhecida (padrões).
A simplicidade e rapidez desta tecnica. adicionadas ao Iacto de que apenas e necessaria uma
pequena quantidade de amostra (alguns microgramas). tornam a electroIorese em gel de
poliacrilamida no metodo mais utilizado para a analise de misturas proteicas complexas. Uma vez
que as proteinas de praticamente todas as origens são Iacilmente solubilizadas pelo SDS. a
tecnica possui aplicacão generalizada.
As proteinas separadas no gel de poliacrilamida podem ser Iacilmente coradas com uma
solucão contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades de proteina
da ordem de 0.1 µg. Apesar deste metodo permitir detectar praticamente todos os constituintes da
maior parte das amostras proteicas. surgem por vezes situacões em que e necessaria uma maior
sensibilidade. a qual pode ser alcancada recorrendo-se ao metodo de coloracão com nitrato de
prata.



POÇOS PARA APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS
ESQUEMA DE UM GEL DE POLIACRILAMIDA
(AS PROTEÍNAS MIGRARÃO DE CIMA PARA BAIXO)

GEL CORADO COM AZUL DE COOMASSIE
(as proteinas são visiveis nas diIerentes pistas)
1 2 3
1 – PROTEÍNAS PADRÃO
2 mistura complexa
3 proteina pura
220kDa -
160kDa -
97kDa -
54kDa -
18 kDa -
Separacão electroforética de proteínas por SDS-PAGE

1- Preparar o sistema para Iazer o gel.
2- Preparar o gel de resolucão (12.5° de acrilamida). iuntando:
-1.25 ml de solucão I (Tabela II)
-2.08 ml de solucão de acrilamida
-1.64 ml de agua destilada
-8 µl de TEMED
-33 µl de persulIato de amonio 10°
Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a solucão entre as placas de vidro e silica
ate uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma camada de 1 ml de isopropanol de
Iorma a obter uma superIicie plana. Deixar polimerizar.
3- Apos polimerizacão remover o isopropanol com papel absorvente.
4- Preparar o gel de concentracão (6° de acrilamida) iuntando:
-0.4 ml de solucão II (Tabela II)
-0.4 ml de solucão de acrilamida
-1.2 ml de agua destilada
-4 µl de TEMED
-12 µl de persulIato de amonia 10°
Misturar cuidadosamente. encher as placas com esta solucão e colocar o pente. Deixar
polimerizar.
5- Montar o sistema de electroIorese e preencher os tanques com tampão de electroIorese 1x
(Tabela II)
6- Preparar as amostras para aplicacão no gel. iuntando 20 µl de cada uma das Iraccões de
puriIicacão com 5 µl de tampão da amostra. Ferver durante 5 min.
7- Proceder a electroIorese aplicando uma voltagem constante de 150 volts. durante 1h.
8- Retirar o gel e coloca-lo numa solucão corante (Tabela II). Levar ao micro-ondas 30 s e
agitar 10 min.
9- Colocar o gel numa solucão descorante (Tabela II). Levar ao micro-ondas 30 s e agitar 10
min. Findo este tempo devem-se ver as bandas de proteinas.


Tabela II- Solucões usadas para a electroIorese de proteinas em gel de poliacrilamida em condicões
desnaturantes.
SOLUCÃO REAGENTES OBSERVACÕES
Tampão do gel de resolucão (I) 1.5 M Tris base
0.4° SDS
pH 8.8-9.0
Tampão do gel de concentracão
(II)
0.5 M Tris base
0.4° SDS
pH 6.6-6.8
Solucão de acrilamida
(bisacrilamida)
30° acrilamida
0.8° bisacrilamida

Tampão de electroIorese Tris-
Glicina 10x
0.25 M Tris base
1.92 M glicina
1° SDS
pH 6.6-6.8
Diluir 1:10 antes de usar
Tampão de aplicacão em SDS-
PAGE
20° glicerol
4° SDS
100 mM Tris.Cl pH 6.8
0.2° azul de bromoIenol
200 mM DTT

Solucão corante 2 g Coomassie blue R-250
100 ml acido acetico
475 ml etanol
425 lm agua

Solucão descorante 80 ml acido acetico
210 ml etanol
510 ml agua






Preparacão e aplicacão das amostras no gel.

1. Adicione a cada amostra de proteina um volume idêntico de tampão de amostra.
2. Ferva 2min e coloque em gelo ate a aplicacão no gel.
3. Com a aiuda de uma pipeta automatica. aplique as amostras e padrões no gel que Ioi ia
previamente preparado. (Não se esqueca de anotar a ordem de aplicacão das
amostras e padrões).
4. Coloque a solucão de electroIorese (ia diluida) nas tinas superior e inIerior do aparelho
de electroIorese.
5. Coloque a tampa da camara de electroIorese. Iazendo a conexão dos electrodos.
6. Ligue os electrodos a Ionte de electroIorese. tendo em atencão à respectiva
polaridade. (Por convencão. o vermelho e o positivo e o preto e o negativo). As
proteínas irão migrar para o polo positivo.
7. Coloque o botão que regula a voltagem no maximo. de Iorma a esta não ser limitante.
8. Regule o botão da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA por
gel.
9. Deixe que a migracão do azul de bromoIenol atinia o Iim do gel de resolucão.
10. Desligue a Ionte de energia. desligue os electrodos. remova a tampa da câmara. despeie
a solucão de electroIorese. e remova a sanduiche retirando as respectivas molas.
11. Com o auxilio de um espacador (ou de qualquer outro obiecto de plástico). separe as
duas placas (a de vidro e a de alumina).

Colorir as proteínas no gel

1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo solucão corante com azul de
Coomassie.
2. Deixe a corar durante 15-20min.
3. Retire o gel para outra caixa contendo agua destilada. Escorra a agua e lave novamente
com agua destilada.
4. Escorra a agua e adicione solucão descorante. Agite durante 5-10min.
5. Repita o ponto anterior ate observar nitidamente as bandas correspondendo as varias
proteinas.
6. Coloque o gel sobre um pedaco de papel de Iiltro grosso (3MM). cubra com 'LarIilm¨ e
seque no secador de geis.


MARCADOR DE PESO MOLECULAR

LMW (BioRad) 97.0; 66.0; 45.0; 30.0; 20.1; 14.4 kDa




TP2 - CARACTERIZACÄO CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE




Introducão
A enzima invertase (beta-IructoIuranosidase; EC 3.2.1.26) catalisa a hidrolise da sacarose
nos seus dois monomeros constituintes: glucose e Irutose. Existem actualmente varias aplicacões
industriais desta enzima. sobretudo na industria alimentar. onde a enzima usada tem origem na
levedura.
No presente trabalho experimental ira proceder-se a caracterizacão cinetica da enzima. para
o que se estudara o eIeito da concentracão do substrato (sacarose) na actividade da enzima.

Parte experimental
Executar o seguinte ensaio para cada uma das solucões de sacarose
1.- Medir 25ml de solucão de sacarose para o reactor. e termostatiza-la a 45ºC com agitacão
(basta esperar cerca de 5 minutos). Executar os ensaios por ordem crescente de concentracão
da sacarose.
2.- Preparar o numero de tubos de ensaio requeridos para cada ensaio. marcando os tubos e
colocando em cada 0.5ml do reagente de DNS.
3.- Retirar uma amostra de 0.5ml do reactor. correspondente ao tempo zero. para um tubo de
ensaio ia preparado.
4.- Adicionar ao reactor 0.5ml da solucão de invertase. marcando simultaneamente o inicio da
contagem do tempo.
5.- Retirar amostras de 0.5ml do reactor de minuto a minuto ate se completarem 7 minutos de
reaccão. As amostras devem ser colocadas imediatamente nos tubos de ensaio que ia contêm
reagente de DNS. garantindo que todo e qualquer elemento de volume da amostra se mistura
com o reagente (para paragem da reaccão enzimatica. devido ao simultâneo aumento do valor
de pH da solucão). Cobrir os tubos que contêm amostra com uma tampa solta.
6.- Preparar um tubo de ensaio com solucão tampão e reagente de DNS. nas mesmas quantidades
e proporcões que as dos tubos que contêm as amostras. a que se chamara de 'branco¨.
Colocar-lhe tambem uma tampa.
7.- Apos a colheita e preparacão das 8 amostras e do branco. reIerentes ao estudo cinetico.
colocar os respectivos tubos no banho de agua a 100ºC durante 5 minutos (para que se dê a
reaccão com o DNS).
8.- Ao Iim dos 5 minutos os tubos devem ser arreIecidos em agua Iria.
9.- Adicionar 5ml de agua destilada a cada tubo arreIecido. Agitar cada tubo no vortice.
10.- Ler a absorvência de cada solucão a λ÷540nm. contra o branco de tampão acetato pH 4.5
que soIreu o mesmo tratamento.

Solucões fornecidas:
- Solucões de substrato (sacarose) a 15. 30. 45. 60. 75 e 100 g/L. Estas solucões estão
preparadas em tampão acetato 20mM pH 4.5. contendo 1° (p/v) de cloreto de calcio.
- Solucão enzimatica de invertase (0.10mg/ml) |grau-V. da Sigma-Aldrich Co.|. em tampão
acetato a pH 4.5.

Recta de calibracão (DNS)
1.- A partir de uma solucão de 1.0 g/L de glucose em tampão acetato 20mM pH 4.5. eIectuar
diluicões para 0.8 g/L; 0.6 g/L; 0.4 g/L e 0.2 g/L de glucose no mesmo tampão (preparar 2ml
de cada diluicão).
2.- Aplicar o metodo do DNS
|1|
a estas 5 solucões padrão e tracar a recta de calibracão obtida. O
metodo consiste na execucão do protocolo acima indicado substituindo as amostras pelas
solucões de glucose.
Atencão: A recta de calibracão pode tambem ser construida com solucões de qualquer outro acucar
redutor ou com misturas destes. pois o produto que e detectado a λ÷540nm resulta da reaccão com
qualquer acucar redutor.

Tratamento dos resultados
1.- Determinar as velocidades iniciais de reaccão para cada concentracão inicial de sacarose.
|expressas em moles de substrato hidrolisado / (volume reaccional × tempo)|. para o sistema
ensaiado.
2.- Calcular as constantes cineticas. atraves da representacão graIica de Lineweaver-Burk.
3.- Comentar os resultados obtidos
|2|
.

Sugestão de consulta bibliográfica
|1| Miller. G.L. (1959). 'Use oI dinitrosalicylic acid reagent Ior determination oI reducing sugar¨.
Analvtical Chemistrv. 31:426-428.

|2| Bahar. T. e Tuncel. A. (2004). 'Concanavalin A carrying reactive beads Ior yeast invertase
puriIication¨. Reactive & Functional Polvmers. 61: 203-210.

TP3.- Extraccão do DNA cromossómico de Escherichia coli e cálculo da sua
concentracão. Extraccão rápida e em pequena escala de DNA plasmídico
(método da lise alcalina).

Os cromossomas de procariotas são geralmente moleculas circulares covalentemente
Iechadas. embora em alguns casos se tenham observado cromossomas lineares. O tamanho de
um cromossoma bacteriano varia entre algumas centenas de kb (1 kb ÷ 1000 pares de base)
(7.8 x 10
5
para Mvcoplasma pneumoniae) e aproximadamente 10000 kb (9.5 x 10
6
para
Mvxococcus xanthus). contendo cada celula apenas uma copia. O cromossoma bacteriano
contem genes essenciais para as diversas Iuncões celulares e ainda genes especiIicos da
especie. Devido a inexistência de membranas celulares internas em bacterias. o DNA
cromossomico encontra-se agregado numa região citoplasmatica a qual se denominou
nucleoide. Para alem do cromossoma. as celulas bacterianas apresentam ainda outros
elementos geneticos tais como plasmideos. transposões. elementos de insercão e virus.
Plasmideos de ocorrência natural apresentam uma variacão de tamanho entre 1 kb e
algumas centenas de kb. Possuem replicacão autonoma e a maioria deles são circulares.
embora algumas especies bacterianas apresentem plasmideos lineares. Os plasmideos contêm
genes essenciais para a sua manutencão na celula (iniciacão e controlo da replicacão) e ainda
genes que em determinados ambientes. conIerem vantagem selectiva ao hospedeiro. Assim.
os plasmideos podem ter genes que conIerem resistência a antibioticos. responsaveis por
processos de virulência. toxinas. producão de antibioticos. sistemas de modiIicacão/restricão.
vias metabolicas degradativas. inducão de tumores em plantas ou a Iixacão de azoto. Pode-se
aIirmar que os plasmideos de ocorrência natural são os responsaveis pela grande variedade
Iisiologica em bacterias. A partir destes elementos geneticos naturais. e possivel por
manipulacão genetica. construir no laboratorio vectores de clonagem. os quais são depois
utilizados como veiculos para clonagem de genes. Estes elementos geneticos. contem de um
modo geral. entre outros. um local de clonagem com diIerentes locais unicos para
determinadas enzimas de restricão. um ou mais genes que codiIicam para enzimas que
conIerem resistência a antibioticos e regiões promotoras.
Neste trabalho laboratorial pretende-se extrair o cromossoma (trabalho 3A) e dois
plasmideos/vectores de clonagem (pET29b e pUgdG) (trabalho 3B) da estirpe Escherichia
coli HB101 e sua posterior restricão (trabalho 4A) e visualizacão apos separacão dos
Iragmentos de DNA em gel de agarose (trabalho 4B) onde sera estimado o peso molecular
aproximado desses plasmideos.



3A- Extraccão do DNA cromossómico da estirpe Escherichia coli HB101

Procedimento experimental

Diagrama para a preparacão de DNA cromossómico

1 ml centriIugar Adicionar
Ressuspender 250 µl
sedimento em solucão lisozima
250 µl 20° sacarose
E. coli HB101 Vortex 15 min
a 37ºC


Adicionar TransIerir vortex Adicionar Adicionar 30 min 37ºC Adicionar 100 µl
igual volume Iase superior 70 µl acetato pronase
cloroIormio novo tubo centriIugar 300 µl de sodio
10 min Ienol/cloroIormio
CentriIugar

TransIerir Adicionar 700 µl centriIugar Lavar sedimento
Iase superior isopropanol a -20ºC
novo tubo 15 min 70
°
EtOH
Secar a 60
o
C
5 min
Guardar 4
o
ressuspender
em 100 µl TE



1- Inocular a estirpe E. coli HB101 em 50 ml de meio LB (composicão em anexo) e inocular
durante a noite a 37°C com agitacão.

2- Pipetar 1 ml para um tubo de microcentriIuga e centriIugar 3 minutos a 13000 rpm. Remover
completamente o sobrenadante e adicionar 250 µl de uma solucão 20° de sacarose em
tampão TE. Ressuspender por vortex.

3- Adicionar 250 µl de uma solucão de lisozima (5 mg/ml em tampão TE) e misturar
cuidadosamente. Incubar 15 minutos a 37°C.

4- Adicionar 100 µl de pronase E (5 mg/ml em 10° N-lauroilsarcosine) e misturar. Incubar 30
min a 37°C.

5- Adicionar 70 µl de acetato de sodio 3 M (pH 5.3) e misturar.

6- Adicionar seguidamente 300 µl de Ienol/cloroIormio/alcool isoamilico (25:24:1). Misturar e
centriIugar 10 min. Recolher a Iase aquosa (superior) novo tubo. Repetir o passo 6.

7- A Iase aquosa recolhida. adicionar 300 µl de cloroIormio/alcool isoamilico. Misturar e
centriIugar.

8- TransIerir a Iase aquosa (superior) para um novo tubo e precipitar o DNA cromossomico por
adicão de 700 µl de isopropanol (mantido a -20°C) e misturar ate aparecimento do DNA.
CentriIugar 15 min e remover o sobrenadante.

9- Lavar o sedimento de DNA cromossomico com 500 µl de etanol a 70°. CentriIugar durante
5 min. remover o sobrenadante e secar o DNA a 60°C durante 5 minutos.

10- Ressuspender o sedimento de DNA cromossomico em 100 µl de tampão TE (10 mM Tris.Cl
pH 8.0; 1 mM EDTA). Conservar a 4°C ate posterior utilizacão.








3B- Extraccão do DNA plasmídico da estirpe Escherichia coli HB101
recorrendo à técnica da lise alcalina


Existem varios metodos de extraccão de DNA plasmidico. O metodo utilizado neste
trabalho consiste numa modiIicacão do metodo de Birmboin & Doly (1979). O processo
inicia-se pelo crescimento das celulas ate inicio da Iase estacionaria. Segue-se a recolha do
sedimento de celulas por centriIugacão e a sua ressuspensão numa solucão contendo glucose e
lisozima e adicão de uma solucão de hidroxido de sodio e SDS (dodecil sulIato de sodio). Este
tratamento provoca a lise celular. dissolucão da membrana plasmatica. desnaturacão de
macromoleculas (proteinas e DNA) e hidrolise do RNA. Adiciona-se então uma solucão de
acetato de potassio (KAc) 3M (pH÷4.5) que promove a precipitacão do complexo SDS-
proteinas. O pH acido da solucão KAc permite ainda neutralizar o pH do lisado. Iortemente
alcalino devido a presenca de NaOH. Este reequilibrio do pH leva a renaturacão do DNA
plasmidico. restabelecendo a sua conIormacão original. Contudo. o DNA cromossomico.
devido as suas dimensões. não consegue voltar a sua Iorma nativa. permanecendo sob a Iorma
de agregados complexos. Apos a adicão do KAc. e pois possivel. por centriIugacão. separar
um sedimento constituido por membranas. proteinas e DNA cromossomico de um
sobrenadante onde o DNA plasmidico se encontra dissolvido. Uma desproteinizacão mais
proIunda desse sobrenadante e posteriormente levada a cabo utilizando uma mistura de Ienol-
clorIormio de modo a obter DNA plasmidico suIicientemente puro e assim adequado a servir
de substrato para as enzimas de restricão. Por Iim. o DNA plasmidico e precipitado com
etanol. seco. e ressuspenso em tampão TE.

Birnboin. H.C.. & Doly. 1. 1979. A rapid alkaline extraction procedure Ior screening
recombunant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.


Procedimento experimental


Diagrama para a preparacão de DNA plasmídico (método da lise alcalina)

1 ml centriIugar 5 min Adicionar
Ressuspender 200 µl
Sedimento em em gelo solucão II
200 µl solucão I
E. coli HB101/pET 29b Vortex
E. coli HB101/pUgdG 5 min
Temp amb

Adicionar TransIerir vortex Adicionar TransIerir 10 min gelo Adicionar 200 µl
igual volume Iase superior sobrenadante solucão III
cloroIormio novo tubo centriIugar igual volume novo tubo CentriIugar
Ienol/cloroIormio
CentriIugar

TransIerir Adicionar colocar 15 min centriIugar Lavar sedimento
Iase superior 70

° EtOH
novo tubo 500µl EtOH a -70
o
C
Secar a 60
o
C
5 min
Guardar 4
o
C ressuspender
em 50 µl TE


1- Inocular as estirpes E.coli HB101 contendo os plasmideos pET29b e pUgdG. em 50 ml de
meio LB (composicão em anexo) e incubar durante a noite a 37
o
C com agitacão.

2- Pipetar 1 ml para um tubo e centriIugar 3 minutos a 15000 rpm. 4 ºC. Remover
completamente o sobrenadante e adicionar 200 µl de solucão I (50 mM glucose. 10 mM
EDTA. 25 mM Tris.Cl pH 8; 10 mg/ml lisozima) e ressuspender. Incubar 5 min em gelo.

3- Adicinou 200 µl de solucão II (0.2 M NaOH; 1° SDS). Misturar suavemente por inversão
do tubo e coloca-lo durante 10 min a temperatura ambiente.

4- Adicionar 200 µl de solucão III (3 M acetato de potassio pH 4.5 aiustado com acido
acetico glacial). Misturar por inversão do tubo e coloca-lo durante 10 min em gelo.

5- CentriIugar o lisado durante 15 min a 15000 rpm. 4
o
C. TransIerir o sobrenadante para
novo tubo e adicionar um volume igual de Ienol/ cloroIormio/ alcool isoamilico (25: 24:
1). Vortex e centriIugar durante 5 min.

6- TransIerir a Iase aquosa (superior) para um novo tubo e adicional um volume igual de
cloroIormio: alcool isoamilico (24:1). Vortex e centriIugar durante 5 min.

7- TransIerir a Iase superior aquosa para um novo tubo. Precipitar o DNA plasmidico por
adicão de 500 µl etanol absoluto colocado a -20
o
C. Deixar 15 min a -70 ºC. CentriIugar 15
min a 4 ºC e remover o sobrenadante.

8- Lavar o sedimento de DNA plasmidico com 500 µl de etanol a 70°.

9- Separar o precipitado por centriIugacão (15000 rpm. 5 min). remover o sobrenadante e
secar o DNA plasmidico a 60ºC durante 5 min.

10- Ressuspender o sedimento de DNA em 50 µl de tampão TE (10mM Tris.Cl. pH8; 1 mM
EDTA). Conservar a temperatura de 4ºC ate posterior utilizacão.

TP4. - Digestão do DNA cromossómico e plasmídico com endonucleases de
restricão; separacão e visualizacão de fragmentos de restricão por
electroforese em gel de agarose.


4 A- Restricão do DNA cromossómico e dos plasmídeos pUC19 e pSUP102
de E. coli HB101 por accão de endonucleases


Endonucleases são enzimas que reconhecem sequências especiIicas de bases no DNA
e são capazes de hidrolisar as cadeias de DNA. Uma vez que essa hidrolise ocorre em ambas
as cadeias. os sistemas de reparacão celular não Iuncionam. permitindo dessa Iorma a
destruicão de acidos nucleicos invasores (ex: virus). Para alem da sua Iuncão protectora na
celula. as enzimas de restricão têm tambem extrema importância em investigacão cientiIica.
nomeadamente em processos de clonagem de genes. execucão de mapas de restricão ou a
determinacão do tamanho de moleculas de DNA.


Procedimento experimental

plasmídeos
pET29b/pUgdG
DNA cromossómico
DNA 5 µl 10 µl
Tampão do enzima 1x 2 µl 2 µl
Água 12 µl 7 µl
Enzima de restricão
HindIII
1 µl 1 µl


1- Adicionar em cada tubo de microcentriIuga os volumes indicados na tabela anterior. com
a seguinte ordem: DNA (plasmidico ou cromossomico). tampão da enzima 1x. agua e
Iinalmente a enzima de restricão.

2- Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h.

3- Guardar a -20ºC ate posterior utilizacão.


4B- Visualizacão do DNA cromossómico e plasmídico por electroforese em
gel de agarose


ElectroIorese e uma tecnica onde moleculas com carga são capazes de migrar por
aplicacão de um campo electrico. sendo a sua separacão eIectuada com base no peso
molecular. A separacão de acidos nucleicos que se encontram carregados negativamente
(grupos IosIato) e eIectuada geralmente em geis de agarose. A agarose Iorma uma matriz
porosa (cuio tamanho do poro pode ser controlado) e atraves do qual as moleculas de acidos
nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente da massa (pb) e conIormacão
das moleculas. A velocidade de migracão depende ainda da sua composicão nucleotidica. da
concentracão da matriz de agarose utilizada. do campo electrico aplicado ao sistema (V/cm) e
ainda da composicão do tampão utilizado na electroIorese.
Apos migracão dos acidos-nucleicos em gel de agarose. e possivel visualizar estas
moleculas. imergindo o gel numa solucão de brometo de etideo. pois este composto intercala-
se nas suas cadeias e e Iluorescente quando irradiado com radiacão ultravioleta. permitindo
desta Iorma a sua deteccão.

Procedimento Experimental

Dissolver deixar verter numa solidiIicar colocar gel adicionar
0.8 g agarose Iorma com tina
TAE 1x por arreIecer pente electroIoretica TAE 1x
Iervura

Colocar 2 h mergulhar 15 min visualizacão
amostras gel gel solucão plasmideos IotograIar
100 V TAE com brometo com luz UV
etideo


DNA plasmidico com ou sem restricão ¹ 2 µl corante
DNA cromossomico com ou sem restricão ¹ 2 µl corante
1 µl padrão DNA ¹ 2 µl corante



1- Preparar um gel de agarose com concentracão de 0.8° em tampão TAE (1x) (composicão
deste tampão em anexo). Apos suspensão da agarose no tampão. Ierver ate obter uma
mistura homogenea. ArreIecer ate 50º C antes deitar a mistura liquida dentro do molde
contendo um pente de 8 dentes de modo a Iormar 8 câmaras com a possibilidade de
aplicacão de 25 µl da solucão de DNA. Deixar solidiIicar o gel durante ~ 30 min.

2- Remover cuidadosamente o pente e colocar o gel (ainda sobre o molde) na tina horizontal
de electroIorese e encher a unidade com tampão TAE (1x) ate que o nivel do tampão
cubra e ultrapasse em 1 mm a superIicie do gel.

3- Aplicar em cada uma das câmaras presentes no gel. as amostras de DNA cromossomico e
plasmidico. onde se adicinou previamente 2 µl de uma solucão corante com elevada
densidade (40° sacarose; 0.25° azul de bromoIenol; 0.25° xilenocianol). Como
reIerência aplicar tambem uma amostra contendo uma mistura de Iragmentos de peso
molecular conhecido (1 kb DNA ladder) (ver anexo).

4- Iniciar a electroIorese por aplicacão de um campo electrico (100 V) (não esquecer que os
acidos nucleicos migram para o ânodo).

5- Apos separacão electroIoretica. colocar o gel numa solucão de brometo de etideo (1
mg/ml) preparada em tampão TAE 1 x. durante 15 min.

6- Retirar o gel do tampão anterior usando luvas (o brometo de etideo e cancerigeno) e
remover o liquido em excesso.

7- Visualizar o DNA plasmidico pela Iluorescência emitida pelo brometo de etideo a estes
associado. quando irradiado com radiacão UV (cuidado: usar oculos para UV).

8- FotograIar o gel sob radiacão ultravioleta.


ANEXO

Meio LB (g/l)

- 10 g Peptona
- 5 g Extracto de levedura
- 5 g NaCl

Tampão TAE (50x) (TP4)

-242 g TRIS base
-57.1 ml acidi acetico glacial
-100 ml de solucão de EDTA 0.5 M (pH 8.0)
-H
2
O ate 1 litro
Aiustar o pH a 8.0.

Padrão de pesos moleculares (TP4)




Tampão de transferência (TP5):
Glicina 39 mM
Tris base 48 mM
SDS 0.037°
20° metanol
(para preparar um litro de tampão (pH 8.3) misture 2.9 g de glicina. 5.8 g de Tris base. 0.37 g
de SDS e 200ml de metanol)

PBST :
PBS ¹ 0.5° Tween 20

Mapa de restricão