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MATERIEL ET METHODES

EN HISTOLOGIE HUMAINE
Les cellules ne sont pas visibles lil nu
(pouvoir de rsolution 0;2 mm)

Loutil de lhistologiste est le microscope:


microscope optique
microscope lectronique
Microscope optique

source lumineuse faisceau de photons


pouvoir de rsolution 0.2

forme et laspect
des cellules,
de leur noyau
des espaces entre les cellules
Microscope lectronique
filament de tungstne faisceau dlectrons
pouvoir de rsolution 0.2 nm

forme et laspect
des cellules,
de leur noyau
des espaces entre les cellules
+ ultrastructure
du noyau
de la membrane cytoplasmique
des organites intra-cellulaires
des espaces intercellulaires
Les chantillons biologiques
obtenus par le clinicien en consultation, au lit du
patient hospitalis, au bloc opratoire.

Echantillons cellulaires
-> talement sur lame (frottis) si forte cellularit
cytocentrifugation si faible cellularit
pas de coupe
fixation sur lame
coloration (MGG pour les frottis sang/moelle)

Echantillons tissulaires
-> fixation immdiate
dshydratation, inclusion et coupe
coloration
Echantillons cellulaires

Liquide biologique
(sang, moelle hmatopotique, LCR, urines)
Liquide pathologique (panchement
dans la plvre, le pritoine, une articulation)
Liquide dexploration
(lavage bronchoalvolaire)
Brossage ou grattage (frottis vaginal)
Cytoponction
Echantillons tissulaires

Biopsies, obtenues
au bistouri lame
au bistouri circulaire (punch)

Organes entiers
(ganglion lymphatique par ex)
obtenus chirurgicalement
La prparation des chantillons
Elle dpend des rsultats attendus :
- description morphologique des structures,
- caractrisation biochimique in situ,
- localisation dARN, dADN, dune protine
et donc
des colorations mettre en uvre :
standards
ou particulires :
histochimie, hybridation in situ
immunofluorescence, immunohistochimie
de loutil de lecture qui sera utilis
microscope optique (MO)
microscope lectronique (ME)
( transmission ou balayage)
Prparation des chantillons tissulaires
pour la MO standard
Fixation (formol, Bouin, AFA)
Dshydratation (alcool, tolune dissolution des
graisses)
Inclusion en paraffine
Coupes au microtome (5 dpaisseur)
Montage entre lame de verre et lamelle
Dparaffinage
Coloration par HE ou HES
hmatine -> noyau violet
osine -> cytoplasme rose
safran -> fibres de collagne jaune orang
Prparation des chantillons tissulaires
pour la ME transmission standard

Fixation (glutaraldhyde) puis post-fixation (acide


osmique qui fixe les graisses)
Dshydratation (alcool, oxyde de propylne)
Inclusion en rsines (Epon ou araldite)
Coupes lultramicrotome
- coupes semi-fines (1) dposes sur lame de verre,
colores par bleu de toluidine safranine
rprage en M0
- coupes ultra-fines (0.1) dposes sur une grille,
colores par actate duranyl et citrate de plomb
lecture au ME transmission (images en N et B)
Autres techniques: la conglation

Permet dviter la fixation, la dshydratation, linclusion


La conglation doit se faire
- temprature trs basse
- trs rapidement,
- avec un cryoprotecteur si besoin
On coupe
- au cryostat pour la MO
- lultracryomicrotome pour la ME
Applications
immunohistologie
histoenzymologie
dtection des graisses
Autres tehniques: immunohistologie (1)

Est devenue une technique de routine

Principe: localiser un antigne (protine en gnral)


grce des anticorps (monoclonaux ou polyclonaux)
dirigs contre cet antigne et marqus
Soit par un fluorochrome (fluorescine)
-> lecture au MO fluorescence
Soit par une enzyme (peroxydase, phosphatase alcaline)
-> lecture au MO standard +/- ME suivant les cas
Soit par lor collodal -> lecture en ME en gnral
Autres tehniques: immunohistologie (2)

Peut se faire
sur coupes au cryostat ou lultracryomicrotome
aprs conglation
sur coupes en paraffine
en bloc avant inclusion standard
pour la ME transmission
sur coupes ultrafines aprs inclusion
en rsines hydrosolubles

Le choix de la technique dpend


de lantigne et de sa localisation
Autres techniques :
colorations spciales en MO
A prciser sur la demande dexamen. Exemples:
PAS (acide priodique ractif de Schiff) -> rsidus
glucidiques
Bleu de toluidine diffrents ph -> mtachromasie:
Orcine +/- oxydation lozone, fuschine-rsorcine
-> rseau lastique des tissus conjonctifs
Imprgnation argentique -> fibres de rticuline,
neurofibrilles
Perls -> fer
Oil red O, noir Soudan, rouge Soudan sur coupes en
conglation -> graisses
Autres techniques: histo-enzymologie

Mettent en vidence lactivit enzymatique


(pas lenzyme elle-mme). Exemples:
DAB (diaminobenzidine)
dtection dune activit peroxydasique
(neutrophiles/monocytes, osinophiles,
anticorps marqus la peroxydase
en immunohistologie)
DOPA raction
dtection de lactivit tyrosinase
dans les mlanocytes
Activit ATPase, NADH-TR, COX
reconnaissance de cellules musculaires
Autre technique: la ME balayage

Prparation des chantillons


Fixation (glutaraldhyde)
Dshydratation trs pousse
Mtallisation
rflexion des lectrons la surface de lchantillon

Applications: tude des


- spermatozodes,
- cils,
- cheveux
Autres

Culture cellulaire
Microscope contraste de phase
examen de cellules vivantes, non colores
Microscope cofocal
Cytomtrie de flux..
A ne jamais oublier
La qualit dune image et son
interprtation dpendent autant
de la prparation de lchantillon
que de loutil utilis pour la visualiser.